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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des
Methylierungsmusters von DNA insbesondere unter Verwendung von elektronisch
adressierbaren Biochips.
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Die Methylierung von DNA spielt in der Natur eine wichtige Rolle. Insbesondere
die Aktivität von Genen wird mit Hilfe der Methylierung von einzelnen Cytosinen in
der DNA reguliert. Um die Aktivität und Regulation einzelner Gene besser
beurteilen zu können, besteht ein großes Interesse an Verfahren, mit denen sich
solche Methylierungen einfach nachweisen lassen. Aus diesem Grunde wurden
inzwischen mehrere Methoden entwickelt, die zur Bestimmung der
Methylierungsrate und des Methylierungsmusters in der DNA geeignet sind.
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Eine Methode benutzt Restriktionsenzyme, die methylierte Schnittstellen nicht als
Substrat erkennen können (z. B. beschrieben in Analysis of DNA methylation and
DNAse I sensitivity in gene-specific regions of chromatin; Ginder, Gordon;
Methods Hematol. Bd. 20 1989 S. 111-123). Mit diesen Verfahren können
allerdings nur Methylierungen aufgespürt werden, die an den
Restriktionsschnittstellen auftreten.
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Darüber hinaus gibt es weitere Verfahren, bei denen mit Hilfe der PCR die
Methylierung von DNA-Sequenzen ermittelt wird (MethylLight: a high-througput
assay to measure DNA methylation; Cindy A. Eads, Kathleen D. Danenberg,
Kazuyuki Kawakami, et. al.; Nucleic Acids Rearch 2000 Vol. 28. No 8.). Bei
diesem Verfahren muss allerdings für jede Methylierungsposition eine
entsprechende Farbstoff markierte Probe synthetisiert werden, was technisch sehr
aufwendig ist.
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Neben den beschriebenen biotechnologischen Ansätzen kann auch durch die
chemische Umsetzungen mit Chloroacetaldehyd die Methylierung von DNA
quantitativ bestimmt werden. Der Nachweis der Methylierung erfolgt bei diesem
Verfahren mit Hilfe eines Spektrometers im Bereich zwischen 300 und 400 nm.
(Quantification of 5-Methylcytosine in DNA by the Chloroacetaldehyde Reaction;
Biotechniques 27, 744-752 October 1999, Oakeley E. J, Schmitt F, Jost J. P.)
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Bei einer alternativen Methode wird das Methylierungsmuster mit Hilfe von Bisulfit
SSCP ermittelt, wobei nicht methyliertes Cytosin in Uracil umgewandelt wird. Mit
Hilfe eines DNA-Sequenzers kann dann die Sequenz der untersuchten DNA-
Probe bestimmt werden (Quantitative DNA Methylation analysis by fluorescent
ploymerase chain reaction single strand conformation polymorphism using an
automated DNA sequencer; Hiromu Suzuki, Fumio Itoh, Minoru Toyota Tekefumi
KiKuchi Electrophoresis 2000 21, 904-908).
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Der Erfindung liegt folglich die Aufgabe zugrunde ein einfaches Verfahren zur
Bestimmung des Methylierungsmusters von DNA-Sequenzen bereitzustellen.
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Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, dass folgende Verfahrensschritte
umfasst:
- a) Chemische Umwandlung von in Ausgangs-DNA enthaltenem nicht
methylierten Cytosin zu Uracil, wobei die Sequenz der Ausgangs-DNA
bekannt ist,
- b) Hybridisierung von einzelsträngigen, nach Schritt a) behandelter DNA mit
einzelsträngigen Detektor-DNA-Sequenzen, die komplementär zur Sequenz
der Ausgang-DNA oder deren Teilsequenzen sind, wobei die Guaninbasen
gegen Adeninbasen ausgetauscht sein können,
- c) Fixierung von einzelsträngiger Detektor-DNA oder von einzelstrangigen nach
Schritt a) behandelten DNA-Sequenzen vor oder während der Hybridisierung
oder von Heteroduplices aus Detektor-DNA und nach Schritt a) behandelter
DNA nach oder während der Hybridisierung, wobei die Fixierung ortsaufgelöst
auf einem Träger erfolgt, so dass jeder Detektor-DNA-Sequenz ein
bestimmter Ort zuzuordnen ist,
- d) Inkubation mit einem Guanin/Uracil- oder Adenin/Methylcytosin-
Fehlpaarungen erkennenden Substrat und Detektion der Substratbindungen.
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Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "Ausgangs-DNA",
eine DNA oder ein DNA-Fragment mit bekannter Sequenz verstanden, dessen
Methylierungsmuster bestimmt werden soll.
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Unter dem Begriff "Detektor-DNA" fallen DNA-Polynucleotide, die zu
Teilsequenzen der Ausgangs-DNA-Sequenz komplementär sind, wobei bevorzugt
alle Guaninbasen gegen Adeninbasen ausgetauscht sind.
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Der Begriff der "ortsaufgelösten" Fixierung besagt, dass einer bestimmten
Detektor-DNA-Sequenz ein definiert Ort auf einem Träger zugeordnet werden
kann. Die Beladung des Trägers kann dabei passiv, z. B. unter Einsatz von
Pipettiergeräten oder aktiv, über elektronische Adressierung erfolgen. Verfahren
zu Herstellung solcher Träger sind dem Fachmann bekannt. Zur Herstellung
elektronisch adressierbarer Trägeroberfläche sind entsprechende Verfahren z. B.
in Radtkey et al., Nucl. Acids Res. 28, 2000, e17, R. G. Sonowsky et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1119-1123; 1994 P. N. Gilles et al., Nature Biotechnol. 17,
365-370, 1999 beschrieben, wobei auch die Herstellung selbst mittels
elektronischer Adressierung durchgeführt werden kann.
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Die zu untersuchende Ausgangs-DNA kann z. B. ein, aus dem Zellkern isoliertes,
Gen oder Genfragment sein, dessen Nucleotidsequenz bekannt ist. Die
Ausgangs-DNA kann zur besseren Handhabung weiter fragmentiert werden. Die
Fragmentierung kann unspezifisch z. B. durch Scherkräfte oder spezifisch z. B.
durch einen Restriktionsverdau erfolgen. Die so erhaltenen DNA-Fragmente
können anschließend für die chemische Umwandlung denaturiert werden.
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Die chemische Umwandlung von nicht methyliertem Cytosin in den Ausgangs-
DNA-Sequenzen erfolgt dabei bevorzugt durch Verwendung von Bisulfiten, wobei
Methylcytosin bei der Reaktion nicht umgesetzt wird. Die so behandelte DNA-
Sequenz kann nun mit einer Detektor-DNA-Sequenz hybridisiert werden, wobei
die Detektor-DNA-Sequenz komplementär zu der chemisch unbehandelten
Ausgangssequenz sein kann. Bei der Hybridisierung der chemisch behandelten
DNA-Sequenz mit der Detektor-DNA-Sequenz ergeben sich folglich
Guanin/Uracil-Fehlpaarungen an den Sequenz-Positionen, an denen in der
Ausgangssequenz ein nicht methyliertes Cytosin vorhanden war.
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In einer bevorzugten Ausführungsform werden allerdings Detektor-DNA-
Sequenzen verwendet deren Sequenz komplementär zu der chemisch
unbehandelten Ausgangssequenz ist, wobei die Guaninbasen durch Adeninbasen
ersetzt sind. Bei der Hybridisierung der Detektor-DNA-Sequenz mit der chemisch
behandelten DNA-Sequenz werden somit Adenin/Methylcytosin-Fehlpaarungen
erhalten. Diese Verfahrensvariante eignet sich insbesondere zur Bestimmung des
Methylierungsmusters von gering methylierten DNA-Sequenzen, wie sie zumeist
bei Säugern oder Pflanzen vorkommen Sauger DNA weist eine Methylierungsrate
von 3 bis 10% auf, die von Pflanzen bis zu 50%. Viren weisen demgegenüber
einen Methylierungsgrad von bis zu 100% auf, hier kann auch der direkte
Nachweis der nicht methyliert vorliegenden Cytosine über die entsprechenden
Guanin/Uracil-Fehlpaarungen vorteilhaft sein.
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Auch die parallele Durchführung beider Verfahrensvarianten ist möglich.
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Als Detektor-DNA-Sequenzen können z. B. synthetisch zugängliche
Polynucleotide, bevorzugt mit einer Länge zwischen 5 und 100, besonders
bevorzugt zwischen 12 und 35 Nucleotiden, verwendet werden. Die Detektor-
DNA-Sequenzen lassen sich dazu aus der bekannten Ausgangs-DNA-Sequenz
direkt ableiten. Die einzelnen Detektor-DNA Sequenzen können sich dabei
überlappen, so dass letztlich immer eine auftretende Fehlpaarung einem
bestimmten Ort innerhalb der Ausgangs-DNA-Sequenz zugeordnet werden kann.
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Die Fehlpaarungen können schließlich mit Fehlpaarung erkennenden Substanzen,
wie z. B. mutS nachgewiesen werden.
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Die chemische Umwandlung nicht methylierter Cytosinbasen in DNA-Sequenzen
erfolgt bevorzugt an Einzelsträngen, die z. B. durch Denaturierung von
doppelsträngigen DNA-Proben im alkalischen gewonnen werden können. Die
umgewandelte DNA kann dann, falls nötig, weiter aufgearbeitet, dass heißt
abgetrennt, erneut denaturiert, neutralisiert, prezipitiert und entsalzt werden.
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Verfahren zur chemischen Umwandlung von Cytosin in Uracil sind z. B.
beschrieben in "Bisulfite methylation analsis of single DNA-Strand", Tech. Tips
Online 1998 BioMednet, Kimberely D Tremblay, Deaprtment of Biology, University
of Pennsylvania, Philadelphia, PA 19104 USA und in "Promoter methylation
analysis on microdissected paraffin-embedeed tissues using bisulfite treatment
and PCR-SSCP", Biotechniques 30: 66-72 (January 2001) S. 66-72. Dabei wird
die umzuwandelnde methylierte Cytosinbasen enthaltende DNA in Wasser gelöst
und anschließend durch Zugabe einer Natriumbisulfit-Hydroquinon-Lösung im
alkalischen unter erhöhter Temperatur unter Lichtausschluss umgesetzt. Nach
Abschluss der Umsetzung kann die erhaltene DNA chromatographisch gereinigt
werden.
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Die Hybridisierung der chemisch umgewandelten DNA-Nucleotide mit der
Detektor-DNA kann an jeder Oberfläche stattfinden, an die die Hybride
ortsaufgelöst gebunden werden können. Dazu stehen bekannte Möglichkeiten,
wie z. B. die Anbindung von Nucleinsäuren über Disulfidbrücken an
Goldoberflächen oder die Bindung von biotinylierten Nukleinsäuren an mit Avidin
belegte Oberflächen zur Verfügung. Die Hybridisierung selbst kann passiv oder
aktiv elektronisch beschleunigt erfolgen, wie dies z. B. mit einem Chip der Firma
Nanogen Inc. (San Diego/USA) möglich ist. Die elektronische Adressierung erfolgt
dabei durch Anlegen eines elektrischen Feldes, bevorzugt zwischen 1,5 V und 2,5 V
bei einer Adressierungsdauer zwischen 1 bis 3 Minuten. Aufgrund der
elektrischen Ladung der zu adressierenden Nucleotidsequenzen wird deren
Wanderung durch Anlegen eines elektrischen Feldes stark beschleunigt. Die
Adressierung kann dabei ortsaufgelöst erfolgen, wobei an unterschiedlichen
Zonen der Chipoberfläche nacheinander adressiert wird. Dabei können an den
einzelnen Orten unterschiedliche Adressierungs- und Hybridisierungsbedingungen
eingestellt werden.
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Nach erfolgter Hybridisierung können sowohl die Guanin/Uracil- als auch die
Adenin/Methylcytosin-Fehlpaarungen mit Fehlpaarungen erkennenden Substraten
nachgewiesen werden. Geeignete Substrate sind z. B. Basenfehlpaarungen
bindende Proteine wie mutS oder mutY, bevorzugt aus E.coli, T.thermophilus
oder T.aquaticus, MSH 1 bis 6, bevorzugt aus S. cerevisiae, 51-Nuclease, T4-
Endonuclease, Thyminglykosylase, Cleavase oder Fusionsproteine enthaltend
eine Domäne dieser Basenfehlpaarungen-bindenden Proteine.
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Das Fehlpaarungen erkennende Protein kann außer farbstofftragenden,
lumineszierenden und fluoreszierenden Gruppen auch polymere Marker (J.
Biotechnol. 35, 165-189, 1994), Metallmarker, enzymatische oder radioaktive
Markierungen oder Quantum dots (Science Vol 281, 2016, 25. Sep. 1998)
enthalten. Die Enzymmarkierung kann dabei z. B. eine direkte Enzymkupplung
oder ein Enzymsubstrattransfer oder eine Enzym-Komplementation sein. Zur
enzymatischen Markierung eignen sich vor allem die Chloramphenicol-
Acetyltransferase, die alkalische Phosphatase, die Luciferase oder die
Peroxydase.
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Insbesondere die Substratmarkierung mit Farbstoffen, die im Bereich zwischen
400 und 800 nm Licht absorbieren oder emittieren ist bevorzugt. Unter den zur
Markierung geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen sind vor allem CyTM3, CyTM5 (von
Amersham Pharmacia), Oregon Green 488, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532,
Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, Bodipy 558/568, Bodipy
650/665, Bodipy 564/570 (z. B. von der Firma Mobitec, Deutschland), S 0535, S
0536 (z. B. von der Firma FEW, Deutschland), Dy-630-NHS, Dy-635-NHS,
EVOblue30-NHS (z. B. von der Firma Dynomics, Deutschland), FAR-Blue, FAR-
Fuchsia (z. B. von der Firma Medway, Schweiz), Atto 650 (von der Firma Atto
Tech, Deutschland), FITC oder Texas Red zu bevorzugen. Neben den direkt
markierten Substraten können auch markierte Antikörper verwendet werden, die
direkt gegen mutS oder gegen eine fusionierte Peptiddomäne, wie z. B. MBP,
gerichtet sind.
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Da jedem Ort der Trägeroberfläche eine definierte Nucleotidsequenz zugeordnet
werden kann, kann aus den erhaltenen Fluoreszenzsignalen, in den Fällen in
denen an jedem Ort auf dem Träger genau eine mögliche Fehlpaarung auftreten
kann, direkt in das entsprechende Methylierungsmuster übersetzt werden. In der
Regel sind aber an jedem Ort auf der Trägeroberfläche mehrere potentielle
Fehlpaarungspositionen (Cytosine in der entsprechende Teilsequenz der
Ausgangs-DNA) enthalten. Zur Ermittlung des Methylierungsmusters anhand der
Fluoreszenzsignale ist es dann zweckmäßig sich in ihrer Sequenz überlappende
Detektor-DNA-Sequenzen einzusetzen. Die Auswertung erfolgt dann nach der
"Clustering analysis"-Methode (beschrieben in Eisen, M. B, Spellman, PT, Brown
P. O., Botstein D 1998, Cluster analysis and display of genome wide expression
pattern, Proc. Natl. Acad Sci USA95, 14863-14868; Review: Discovering Pattern
in Microarray Dat Molecular Diagnosis Vol. 5 No. 4 2000 Harry Burke. S349) oder
der "Principal Components analysis"-Methode (beschrieben in Hilsenbeck SG,
Friederichs WE, Schiff R., Statistical analysis of array expression data as applied
to the problem of tamoxifen resistance J. Natl Cancer Institut 1999 91 453-459).
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Die Spezifität der Messung von Fehlpaarungen mit mutS, einem bevorzugten
Fehlpaarungen erkennenden Substrat kann weiter durch die Zugabe von
Tensiden oder durch Zugabe von BSA, dass unspezifische Bindungsstellen an
den Hybriden blockiert erhöht werden. MutS besitzt darüber hinaus den Vorteil,
dass eine Messung auch unter Niedrigsalzbedingungen bis zu einer
Salzkonzentration von 10 mM erfolgen kann.
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Um die Zuverlässigkeit des Verfahrens weiter zu verbessern können durch einen
Zwischenschritt etwaige, nach dem Hybrdisierungsschritt auf dem Träger fixierte,
einzelsträngige Nucleotidsequenzen durch Zugabe einer Nuclease, bevorzugt
einer Mung Bean Nuclease oder S1-Nuclease, abgebaut werden.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Methylierungsmuster von DNA-
Fragmenten mit bekannter Sequenzen einfach und schnell bestimmt werden.
Insbesondere durch die Verwendung von aktiven, elektronisch adressierbaren
Chips kann die Messdauer weiter gesenkt und die Zuverlässigkeit der Messung,
durch die sehr gute elektrische Kontrollierbarkeit der Hybridisierung, verbessert
werden. Die einmal mit Detektor-DNA belegten Träger sind darüber hinaus
wiederverwendbar, die gemessene DNA kann einfach dehybridisiert und von der
Oberfläche abgewaschen werden. Dies ermöglicht einen hohen Probendurchsatz
mit einem belegten Träger.
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Zur Erläuterung des beanspruchten Verfahrens sind die einzelnen
Verfahrensschritte in Fig. 1 beispielhaft schematisch wiedergegeben. In Schritt I)
ist die chemische Umsetzung von Ausgangs-DNA-Oligonucleotiden gezeigt. Die
Oligonucleotide sind strichförmig dargestellt, wobei das linke Oligonucleotid ein
Methylcytosin (5mC), das rechte Oligo an der gleichen Stelle ein nicht methyliertes
Cytosin (C) enthält. Bei der Umsetzung werden die nicht methylierten
Cytosinbasen in Uracil umgewandelt. Im Anschluss werden die Oligonucleotide
auf eine Chipoberfläche aufgetragen, die Detektor-DNA mit einer Adeninbase an
der zu den Positionen 5mC und C komplementären Stelle auf dem Detektor-DNA-
Oligonucleotid, enthält (Schritt II)). Schritt III) zeigt die Hybridisierung der
aufgetragenen Oligonucleotide mit der Detektor-DNA-Sequenz, wobei im Falle
des Vorhandenseins eines Methylcytosins an dieser Position eine Fehlpaarung
entsteht, die mit fluoreszenzmarkierten mutS detektiert werden kann.
Ausführungsbeispiele
Nachweis von Methyierten C-Bausteinen in DNA auf einem aktiven elektrischen
Chips und dem Enzym MutS
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In einem ersten Versuch wird gezeigt, dass mit Hilfe des beanspruchten
Verfahrens die Detektion von Adenin/Methylcytosin-Fehlpaarungen mit
fluoreszenzmarkiertem mutS als Fehlpaarungen erkennendes Substrat gelingt.
Wobei zur Hybridisierung.
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Dazu wurden die Oligonucleotide Seq. ID No. 1, 2 und 3 (0.05 µMol Maßstab) mit
Wasser verdünnt, so dass eine Endkonzentration 10 picomol/1 µl vorliegt. Die
wässrige Lösung wurde anschließend in 50 mM Histidin Puffer 1 : 100 gelöst.
Eingesetzte Oligonucleotide
1) Detektor-DNA mit Biotin am 5'-Ende (sense + 2A (5'-biotinyliert))
2) Modell-Verbindungen um MutS-Bindung zu evaluieren (5'-CY3 markiert)
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Die methylmodifizierten Basen sind als 5mC gekennzeichnet.
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Adressierung auf elektrisch adressierbaren Chip mit Hydrogel-Layer:
Das biotinylierte Oligo wurde mit 2 V für 60 s auf die Elektroden des Chips
(Nanogen Inc.) an zwei getrennte Orte auf der Oberfläche des Chips adressiert
und fixiert. Die Hybridisierung der komplementären DNA-Oligos erfolgte
ortsaufgelöst bei 2 V für 120 s in Histidin Puffer. Der Chip wurde für 10 min mit
Puffer A (20 mM Tris/HCL pH, 7.6, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2. 0.01% Tween/20,
1% BSA) gewaschen.
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0.5 µg Alexa Fluor 647 (der Firma Mobitec, Deutschland), markiertes mutS
wurden in 100 µl Puffer A aufgenommen. Der Chip wird mit dem gelösten mutS für
45 Minuten inkubiert. Nach 45 Minuten wird der Chip mit 10 ml Puffer A ohne BSA
gespült und im Anschluss die Fluoreszenz mit einem Scanner bestimmt.
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Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. Die Fluoreszenz zweier unabhängig
voneinander vorgenommenen Messungen lag an dem Ort an dem die
Hybridisierung von Seq. ID No. 1 und 2 zu einer Adenin/Methylcytosin-
Fehlpaarung führte (Balken 1 in Fig. 2) bei 60.3 (Spot 1) und 55. 7 (Spot 2) die
Fluoreszenz lag an den Orten an denen keine Fehlpaarung vorlag bei 47.9 (Spot
3) und 29.5 (Spot 4). In Fig. 2 sind die entsprechenden Mittelwerte der beiden
Messungen abgebildet.
Chemische Modifkation von Cytosin-Bausteinen zu Uracil-Bausteinen
10 µg bzw. 5 µg bzw. 1 µg eines Oligonucleotides Seq. ID No. 4
(Ausgangs-DNA-Oligo, das chemisch behandelt wurde (5'-CY3 markiert))
mit einem Methylcytosin-Baustein wurden in 100 µl Wasser gelöst. Anschließend
erfolgte die Zugabe von 10 µl 3 N wässriger NaOH-Lösung. Die 110 µl Lösung
wurde 30 min. auf 42°C erhitzt und im Anschluss in 1020 µl 40.5%iger
Natriumbisulfit- (pH 5) und 60 µl 10 mM Hydroquinon-Lösung aufgenommen.
Nach Zugabe von weiteren 10 µl Wasser wurde das Gemisch für 16-18 Stunden
bei 55°C unter Lichtausschluss erhitzt. Anschließend wurden 500 µl der
entsprechenden Lösung auf einer NAPS-Säule (Pharmacia) pipettiert, die nach
Herstellerangaben konditioniert wurde. Das entsprechende Oligonucleotid wurde
mit 800 µl Wasser eluiert. Die Umsetzung wird durch Zusatz 3 M NaOH zu der
erhaltenen Oligonucleotid-Fraktion bis zu einer NaOH-Endkonzentration von 0,3
M bei 37°C vervollständigt. Danach werden die erhaltenen chemisch
umgewandelten DNA-Oligonucleotide nochmals durch Chromatographie an einer
NAPS-Säule gereinigt und entsalzt. 50 µl der entsalzten Lösung wurden mit 50 µl
100 mM Histidin-Lösung verdünnt. Es werden DNA-Oligonucleotide erhalten
deren nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt wurden.
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Herstellung der 40.5%igen Natriumbisulfit-Lösung (Sigma. S-8890. 8.1 g/20 ml):
Dazu wurde die Festsubstanz in 17 ml kalten Wasser gelöst und mit 10 N NaOH-
Lösung auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und anschließend auf 20 ml aufgefüllt.
Als Hydroquinon-Lösung wurde eine 10 mM (Sigma H-9003) Lösung verwendet.
(Die chemische Umwandlung von Cytosin in Uracil ist z. B. beschrieben in
"Bisulfite methylation analsis of single DNA-Strand", Tech. Tips Online 1998
BioMednet; Kimberely D Tremblay, Deaprtment of Biology, University of
Pennsylvania, Philadelphia, PA 19104 USA und in "Promoter methylation analysis
an microdissected paraffin-embedeed tissues using bisulfite treatment and PCR-
SSCP", Biotechniques 30: 66-72 (January 2001) S. 66-72)
Unspezifische Markierung von mutS mit Alexa Fluor 647
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Für die Konjugation wird der entsprechende Alexa Fluor 647 Succinimidylester
über eine nukleophile Substitutionsreaktion an Proteinlysinreste unspezifisch
kovalent gemäß dem FluoroLinkTM product specification protocol, Amersham
Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK geknüpft. Dabei erfolgt die
Fluoreszenzmarkierung von mutS durch Inkubation mit einem großen Überschuss
an Fluorophor unter stark basischen Bedingungen (0,1 M Na2CO3, pH 9,3). Das
erhaltene fluoreszenzmarkierte mutS wird gelpermeationschromatographisch
gereinigt.
SEQUENZPROTOKOLL