DE10021204A1

DE10021204A1 - Verfahren zur hochparallelen Analyse von Polymorphismen

Info

Publication number: DE10021204A1
Application number: DE10021204A
Authority: DE
Inventors: Kurt Berlin; Ivo Glynne Gut
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-04-25
Filing date: 2000-04-25
Publication date: 2001-11-08
Also published as: AU2001265759A1; WO2001081620A3; EP1309728A2; DE10191554D2; WO2001081620A2

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen, insbesondere SNPs, das auch für die gleichzeitige oder separate Detektion von DNA-Methylierung eingesetzt werden kann. DOLLAR A Zuerst bindet man einen Satz von Sonden, der mit mindestens einer für die jeweilige Sonde charakteristischen nachweisbaren Markierung versehen ist, an eine adressierte Oberfläche, wobei die erzeugte Bindung der Sonden an die Oberfläche photochemisch, chemisch oder enzymatisch wieder spaltbar ist. Anschließend hybridisiert man eine zu untersuchende Nukleinsäure an diese Sonden, verändert die Sonden in einer allelspezifischen enzymatischen Reaktion und entfernt einen Teil der Sonden, der für die Analyse der allelspezifischen Reaktion bedeutungslos ist. Zuletzt analysiert man die allelspezifischen Produkte anhand der nachweisbaren Markierungen und führt eine Bestimmung der vorhandenen Allele in der abgefragten Nukleinsäureprobe durch.

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Analyseverfahren mit hohem Durchsatz zur parallelen Charakterisierung von Polymorphismen, insbesondere SNPs. Gleichzeitig oder in einem separaten Experiment kann das Verfahren zur Analyse von DNA-Methylierung eingesetzt werden.

Das Humangenomprojekt, die Erstsequenzierung des mensch lichen Genoms, wird in den nächsten Jahren abgeschlossen sein. Durch dieses Projekt wird es möglich werden, alle etwa 100.000 Gene zu identifizieren. Die Sequenzinforma tion öffnet ungeahnte Möglichkeiten für die Aufklärung der Genfunktionen. Dies wiederum eröffnet die Möglich keit, Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zu betreiben. Die Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zielt auf den Einsatz von Medikamenten in Abhängigkeit eines Genotypen. Dadurch soll die Effektivität von Medikamenten gesteigert werden. Der notwendige Zwischenschritt ist die Bestimmung der Polymorphismen und Genotypen, die mit einem bestimm ten Ansprechen assoziiert sind. Verlangt werden deshalb immer effizientere Genotypisierungsmethoden.

Derzeit gibt es zwei Kategorien von polymorphen Markern, die zur Genotypisierung eingesetzt werden, Mikrosatelli ten und Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Mikrosa telliten sind hoch polymorph, d. h. sie haben eine Viel zahl von Allelen. Sie sind dadurch charakterisiert, dass ein repetitives Sequenzelement, mit einer unterschiedli chen Anzahl Wiederholungen für unterschiedliche Allele, von konservierten Sequenzen flankiert ist. Durchschnitt lich gibt es einen Mikrosatellitenmarker pro 1 Million Basen. Eine Karte von 5.000 positionierten Mikrosatelli tenmarkern wurde von CEPH publiziert (Dil. C., et al. Nature, March 14, 1994). Mikrosatelliten werden durch die Grössenbestimmung von Produkten einer PCR mit Primern der konservierten, flankierenden Sequenz genotypisiert. Die fluoreszent markierten PCR Produkte werden auf Gelen aufgetrennt.

Es gibt vergleichsweise wenige beschriebene SNP Marker. Eine Karte mit 300.000 SNP Markern wird derzeit vom SNP Konsortium enwickelt und wird öffentlich zugänglich sein.

Es gibt eine Handvoll Genotypisierungsmethoden für SNPs. Einige basieren auf der Auftrennung von Produkten auf Ge len, wie der oligonucleotide ligase assay (OLA). Er eig net sich daher eher für den mittleren Durchsatz. Andere vertrauen auf reine Hybridisierung, die jedoch nicht die gleiche Stringenz hat. DNA Arrays (DNA chip) eignen sich für die Analyse einer grossen Anzahl SNPs in einer be schränkten Anzahl von Individuen. Bis jetzt sind Beispie le gezeigt worden, in denen 1.500 SNPs auf einem DNA Chip genotypisiert wurden. Die wirkliche Stärke von DNA Chips liegt in Ansätzen, wie der Resequenzierung und der Ex pressionsanalyse. Ansätze, welche Primerverlängerung an wenden sind gezeigt worden. Diese haben den Vorteil, dass wenn mit fluoreszenzmarkierten Terminatorbasen gearbeitet wird, die Resultate mit einem einfachen ELISA Lesegerät gesammelt werden können.

Es gibt einige SNP Genotypisierungsmethoden, die Mas senspektrometrie zur Analyse verwenden. Diese haben den wesentlichen Vorteil, dass die allelspezifischen Produkte eine physische Darstellung der Produkte sind und kein fluoreszierendes Signal, dass indirekt dem Produkt zuge ordnet werden muss.

Eine Methode, die kürzlich vorgestellt wurde, ist der In vader Assay und als Variante davon der Invader Squared (T. Griffin and L. M. Smith Proceedings of the ASMS 1998). Für diese Methode werden mindestens zwei Oligonukleotide verwendet, die einen bekannten SNP abdecken. Ein Oligo nukleotid deckt die Sequenz von der 5'-Seite bis unmit telbar zum SNP hin ab, so dass sich der SNP an das 3'- Ende dieses Oligonukleotids anschliesst. Meistens werden zwei weitere Oligonukleotide, von denen jeder ein Allel des Polymorphismus abdeckt und einen unterschiedliche 5'- Überhang hat, an das System hybridisiert. Eine struktur aktive Endonuklease entfernt vom vollständig komplementä ren Oligonukleotid den 5'-Überhang. Der abgekappte Über hang wird mittels Massenspektrometrie analysiert und zur Identifikation des Allels verwendet. Ein Nachteil der ge zeigten Methode ist, dass die Produkte vor der mas senspektrometrische Analyse gründlich gereinigt werden müssen. Für diese Aufreinigung werden magnetic beads ver wendet, die nicht einfach in der Handhabung sind. Dies ist ein wesentlicher Nachteil von vielen Genotypisie rungsmethoden, die Massenspektrometrie zur Analyse ver wenden.

Eine weitere Genotypisierungsmethode ist der Taq Man As say. In diesem wird allelspezifisch enzymatisch ein Fluo rezenzlöscher von einem fluoreszenzfarbstofftragenden Oligonukleotid getrennt.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight Massenspektrometrie (MALDI) hat die Analytik von Biomolekülen revolutioniert (Karas, M. & Hillenkamp, F. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988)). MALDI ist in verschie denen Varianten zur Analyse von DNA eingesetzt worden. Die Varianten reichen von primer extension bis Sequenzie rung (Liu, Y.-H., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 735-743 (1995); Ch'ang, L.-Y., et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 772-774 (1995); Little, D. P., et al. J. Mol. Med. 75, 745-750 (1997); Haff, L. & Smirnov, I. P. Genome Res. 7, 378-388 (1997), Fei, Z., Ono, T. & Smith, L. M. Nucleic Acids Res. 26, 2827-2828 (1998); Ross, P., Hall, L., Smirnov, I. & Haff, L. Nature Biotech. 16, 1347-1351 (1998); Ross, P. L., Lee, K. & Belgrader, P. Anal. Chem. 69, 4197-4202 (1997); Griffin, T. J., Tang, W. & Smith, L. M. Nature Biote ch. 15, 1368-1372 (1997)). Der grösste Nachteil dieser Methoden ist, dass alle eine gründliche Aufreinigung der Produkte vor der MALDI Analyse bedingen. Spin column Aufreinigung oder der Einsatz von magnetic bead technology oder reversed-phase Aufreinigung sind notwendig.

Die Analyse von DNA im MALDI ist stark abhängig vom La dungszustand des Produktes. Eine 100-fache Verbesserung der Empfindlichkeit in der MALDI Analyse kann dadurch er zielt werden, dass der Ladungszustand auf dem zu analy sierenden Produkt so kontrolliert wird, dass nur eine einzige positive oder negative Überschussladung vorhanden ist. So modifizierte Produkte sind auch wesentlich weni ger anfällig auf die Ausbildung von Addukten (z. B. mit Na und K, Gut, I. G. and Beck, 5. (1995) Nucleic Acids Res., 23, 1367-1373; Gut, I. G., Jeffery, W. A., Pappin, D. J. C. and Beck, S. Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 43-50 (1997)). Ein SNP Genotypisierungsverfahren, welches von diesen Bedingungen Gebrauch macht, mit dem Namen "GOOD Assay" wurde kürzlich vorgestellt (Sauer, S. et al., Nuc leic Acids Research, Methods online, 2000, 28, e13). Nachteil ist, dass das gesamte Verfahren einen beschränk ten Multiplexierungsgrad zulässt, und die Probenvorberei tung immer den Einsatz modernster und teurer Pipettier technologie bedingt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur hochparallelen Genotypisierung von Polymorphismen zur Verfügung zustellen.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen gelöst, wobei man die folgenden Schritte ausführt:

a) man bindet einen Satz von Sonden, der mit mindestens einer für die jeweilige Sonde charakteristischen nach weisbaren Markierung versehen ist, an eine adressierte Oberfläche, wobei die erzeugte Bindung der Sonden an die Oberfläche photochemisch, chemisch oder enzymatisch wie der spaltbar ist;
b) man hybridisiert eine zu untersuchende Nukleinsäure an diese Sonden;
c) man verändert die Sonden in einer allelspezifischen enzymatischen Reaktion;
d) man entfernt einen Teil der Sonden, der für die Analy se der allelspezifischen Reaktion bedeutungslos ist;
e) man analysiert die allelespezifischen Produkte anhand der nachweisbaren Markierungen und führt eine Bestimmung der vorhandenen Allele in der abgefragten Nukleinsäure probe durch.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren wobei die Ad resse der Oberfläche in Schritt a) die Position (Oligo nukleotidarray), eine Farbe, eine Fluoreszenzmarkierung, eine isotopische Markierung, eine chemische Markierung oder eine radioaktive Markierung ist.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Sonden Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, peptide nucleic acids (PNAs), Chimäre dieser Verbindungsklassen oder andere Substanzen sind, die sequenzspezifisch mit DNA wechselwirken.

Auch ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Sonden über reversible Bindungssysteme an die Oberfläche bindet. Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass die zu untersu chende Nukleinsäuren in Schritt b) genomische DNA, klo nierte DNA, cDNA, RNA, PCR Produkte oder Ligationsproduk te sind.

Bevorzugt ist ferner, dass die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybrisierten Templats mittels einer Polymerase und Nukleotidbausteinen zu spe zifischen Produkten, entsprechend Schritt c) umgesetzt werden.

Besonders bevorzugt ist auch, dass man durch gleichzeiti gen Einsatz von Desoxy- und Didesoxynukleotidbausteinen eine Sequenzierung durchführt und nicht nur Polymorphis men detektiert.

Insbesondere ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybrisierten Templats mittels einer Ligase und ei nem phosphorylierten Oligonukleotid zu spezifischen Pro dukten, entsprechend Schritt c) umsetzt.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mittels eines Helferoligo nukleotids und einer strukturaktiven Endonuklease al lelspezifisch schneidet. Weiterhin bevorzugt ist auch, dass man die allelspezifischen Produkte mittels Mas senspektrometrie analysiert.

Ganz besonders ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Mas senspektrometrie (MALDI) oder Elektrospray lonisations Massenspektrometrie zur Analyse verwendet wird.

Dabei ist es bevorzugt, dass die allelspezifischen Pro dukte in einer Art vorliegen, die sich besonders gut zur massenspektrometrischen Analyse eignen.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die al lelspezifischen Produkte gemäss Schritt d) mittels einer enzymatischen oder chemischen Methode verkürzt. Dabei ist besonders bevorzugt, dass die besonders gute Eignung zur massenspektrometrischen Analyse dadurch zustande kommt, dass die allelspezifischen Produkte netto einfach positiv oder einfach negativ geladen sind. Weiterhin ist hierbei bevorzugt, dass eine chemische Reaktion zur Neutralisie rung von Ladungen eingesetzt wird, die ansonsten zu einer neutralen oder mehrfach negativen Nettoladung des Produk tes beitragen würden. Somit ist auch bevorzugt, dass man Phosphatgruppen, Thiophosphatgruppen, oder Dithi ophosphatgruppen des Oligonukleotidrückgrats durch eine selektive Alkylierungsreaktion ladungsneutralisiert. Be sonders ist auch erfindungsgemäß bevorzugt, dass die ein fache Ladung erfindungsgemäß dadurch zu stande kommt, dass man eine chemische Funktion einbringt, welche die Ladung trägt.

Bevorzugt ist insbesondere auch, dass die reversible Bin dungschemie durch einen induzierten Bruch die einfache Ladung zum Produkt beisteuert. Dabei ist bevorzugt, dass der induzierte Bindungsbruch chemisch oder photochemisch zustande kommt. Weiterhin ist dabei bevorzugt, dass der induzierte Bindungsbruch während eines Desorptionsprozes ses des Analysevorgangs stattfindet.

Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt ist es, dass man eine Matrix auf die Oberfläche aufbringt, welche die De sorption im MALDI Prozess unterstützt. Dabei ist wiederum bevorzugt, dass der induzierte Bindungsbruch durch die Matrix induziert wird.

Bevorzugt ist erfindungsgemäß ferner, dass auf einem ad ressierten Analysepunkt der Oberfläche eine Vielzahl von unterschiedlichen Sonden sind. Weiterhin ist bevorzugt, dass allelspezifische Produkte der Sonden durch die al lelspezifische Reaktion nach Schritt c) nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse eine eindeutige Masse als nachweisbare Markierung ergeben. Außerdem ist bevor zugt, dass allelspezifische Produkte der Sonden durch die allelspezifische Reaktion nach Schritt c) nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse ein eindeutiges Muster von Fragmentmassen als nachweisbare Markierung ergeben. Insbesondere bevorzugt ist hierbei, dass die Massen aller Produkte oder Produktfragmente der allelspezifischen Re aktionen einen eindeutigen Rückschluss auf die in der ab gefragten Nukleinsäure vorhandenen Allele zulassen.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass bekannte Poly morphismen in der zu untersuchenden DNA genotypisiert werden.

Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man un bekannte Polymorphismen in der zu untersuchenden DNA i dentifiziert.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch, dass man Cytosin- Methylierungen detektiert und visualisiert.

Ganz besonders ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass man die chemische Behandlung der DNA mit einer Bisulfitlösung (Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.

Bevorzugt ist auch, dass die Amplifikation mittels der Polymerasereaktion (PCR) erfolgt.

Weiterhin ist bevorzugt, dass bekannte Methylierungs muster in der zu analysierenden Probe nach der erfin dungsgemäß vorbehandelten DNA untersucht werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren übertrifft die Effizienz bestehender Verfahren, in Bezug auf die Einfachheit der Handhabung, die Kosten, die Qualität und den Durchsatz, bei weitem.

Die Erfindung beschreibt somit ein Verfahren zur hochpa rallelen Charakterisierung von Polymorphismen.

Im ersten Schritt des Verfahrens wird ein Satz von Sonden an eine adressierte Oberfläche gebunden.

Man setzt als Sonden vorzugsweise Oligonukleotide, modi fizierte Oligonukleotide, peptide nucleic acids (PNAs), Chimäre dieser Verbindungsklassen oder andere Substanzen ein, die sequenzspezifisch mit DNA wechselwirken.

Die jeweilige Sonde ist mit einer charakteristischen nachweisbaren Markierung versehen. Besonders bevorzugt ist diese Markierung die Masse eines Fragments der Sonde.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens ist die Ad ressierung der Oberfläche die Position (Oligonukleotidar ray), eine Farbe, eine Fluoreszenzmarkierung, eine isoto pische Markierung, eine chemische Markierung oder eine radioaktive Markierung.

Die erzeugte Bindung der Sonden an die Oberfläche ist photochemisch, chemisch oder enzymatisch wieder spaltbar.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Sonden über reversible Bindungssysteme an die Oberfläche gebunden.

Im zweiten Verfahrensschritt hybridisiert man die zu un tersuchende Nukleinsäure, die vorzugsweise aus genomi scher DNA, klonierter DNA, vorbehandelter DNA, cDNA, RNA, PCR Produkten oder Ligationsprodukten besteht, an die be sagten Sonden.

Bevorzugt wird die DNA zuvor mit einer Bisulfitlösung (Disulfit, Hydrogensulfit) behandelt.

Im dritten Verfahrensschritt verändert man die Sonden in einer allelspezifischen enzymatischen Reaktion.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mittels einer Polymerase und Nukleotidbausteinen zu spezifischen Produkten umge setzt.

In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Se quenz des daran hybridisierten Templats mittels einer Li gase und einem phosphorylierten Oligonukleotid zu spezi fischen Produkten umgesetzt.

Anschließend werden die Sonden bevorzugt in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridisierten Templats mit einem Helferoligonukleotid und einer struk turaktiven Endonuklease allelspezifisch geschnitten.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens lassen sich dabei Methylierungsmuster in der zu analysie renden vorbehandelten DNA untersuchen.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden SNPs in der zu analysierenden vorbehandelten DNA untersucht.

Auf einem adressierten Analysepunkt der Oberfläche befin den sich vorzugsweise eine Vielzahl von unterschiedlichen Sonden.

Im vierten Verfahrensschritt entfernt man einen Teil der Sonden, der für die Analyse der allelspezifischen Reakti on bedeutungslos ist.

Die allelspezifischen Produkte werden dabei vorzugsweise mit einer enzymatischen oder chemischen Methode verkürzt.

Im fünften Verfahrensschritt analysiert man die allelspe zifischen Produkte anhand der nachweisbaren Markierungen und führt die Bestimmung der vorhandenen Allele in der abgefragten Nukleinsäureprobe durch.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die allelspezifischen Produkte mittels Massenspektrometrie analysiert.

Die allelspezifischen Produkte liegen vorzugsweise in ei ner Art vor, die sich besonders gut zur massenspektro metrischen Analyse eignet.

Bevorzugt kommt die besonders gute Eignung zur mas senspektrometrischen Analyse dadurch zustande, dass die allelspezifischen Produkte netto einfach positiv oder einfach negativ geladen sind.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird eine chemische Reaktion zur Neutralisierung von Ladungen ein gesetzt, die ansonsten zu einer neutralen oder mehrfach negativen Nettoladung des Produktes beitragen würde.

In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens werden Phosphatgruppen, Thiophosphatgruppen oder Dithi ophosphatgruppen des Oligonukleotidrückgrats durch eine selektive Alkylierungsreaktion ladungsneutralisiert.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens kommt die einfache Ladung dadurch zustande, dass eine chemische Funktion eingebracht wird, die die Ladung trägt.

Die reversible Bindungschemie steuert vorzugsweise die einfache Ladung durch einen induzierten Bruch zum Produkt bei.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens kommt der induzierte Bindungsbruch chemisch oder photochemisch zu stande.

In einer weiteren bevorzugten Variante findet der indu zierte Bindungsbruch während des Desorptionsprozesses des Analysenvorgangs statt.

Eine Matrix wird bevorzugt auf die Oberfläche aufge bracht, die die Desorption im MALDI Prozess unterstützt.

In einer weiteren bevorzugten Variante wird der induzier te Bindungsbruch durch die Matrix induziert.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder Elektronenspray lonisa tions Massenspektrometrie zur Analyse verwendet.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens ergeben die Verlängerungsprodukte der Sonden durch die allelspezifi sche Reaktion nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse eine eindeutige Masse als nachweisbare Markie rung. Bekannte Polymorphismen lassen sich damit vorzugs weise in der zu untersuchenden DNA identifizieren.

In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens er geben die Verlängerungsprodukte der Sonden durch die al lelspezifische Reaktion nach Abspaltung von der Oberflä che in der Analyse ein eindeutiges Muster von Fragment massen als nachweisbare Markierung. Unbekannte Poly morphismen lassen sich damit vorzugsweise in der zu un tersuchenden DNA identifizieren.

Die Massen aller Produkte der Reaktionen lassen einen eindeutigen Rückschluss auf die in der abgefragten Nuk leinsäure vorhandenen Allele zu.

Das Verfahren wird abschließend durch die Abbildungen er läutert.

Anhand der Figuren wird die Erfindung näher erläu tert.

Es zeigen:

Fig. 1a und 1b eine Veranschaulichung der Verfahrens schritte an einem Beispiel und

Fig. 2 ein mögliche Immobilisierung der Sonden an der Oberfläche umfassend einen photolabilen Linker.

In den Fig. 1a und 1b werden folgende Schritte darge stellt:

1. Zuerst wird eine Sonde an die adressierte Oberfläche gebunden.
2. Dann hybridisiert man die zu untersuchende Nuklein säure an die Sonde.
3. Darauf verlängert man die Sonden in einer allelspe zifischen Reaktion.
4. Die zu untersuchende Nukleinsäure wird entfernt.
5. Nachfolgend entfernt man einen Teil der Sonden, der für die allelspezifische Reaktion bedeutungslos ist.
6. Abschließend analysiert man den verbleibenden Teil der verlängerten Sonden. Bevorzugt wird zur Analyse ein Massenspektrometer verwendet, das die verlängerten Sonden anhand ihrer Massen identifiziert und das gleichzeitig die Ablösung von der Oberfläche ermöglicht (z. B. photo lytische Reaktion in einem Laser-Desorptions- Massenspektrometer).

Fig. 2 stellt die eine mögliche Verknüpfung der Primer mit der Oberfläche dar. Das abgebildete Nukleotid ist Teil des Primers, welcher der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt ist.

Claims

1. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen, wobei man die folgenden Schritte aus führt:

a) man bindet einen Satz von Sonden, der mit mindes tens einer für die jeweilige Sonde charakteristischen nachweisbaren Markierung versehen ist, an eine adres sierte Oberfläche, wobei die erzeugte Bindung der Sonden an die Oberfläche photochemisch, chemisch oder enzymatisch wieder spaltbar ist;
b) man hybridisiert eine zu untersuchende Nukleinsäu re an diese Sonden;
c) man verändert die Sonden in einer allelspezifi schen enzymatischen Reaktion;
d) man entfernt einen Teil der Sonden, der für die Analyse der allelspezifischen Reaktion bedeutungslos ist;
e) man analysiert die allelespezifischen Produkte an hand der nachweisbaren Markierungen und führt eine Bestimmung der vorhandenen Allele in der abgefragten Nukleinsäureprobe durch.

2. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass die Adresse der Oberfläche in Schritt a) die Position (Oligonukleotidarray), eine Farbe, eine Fluoreszenzmarkierung, eine isotopische Markierung, eine chemische Markierung oder eine radioaktive Mar kierung ist.

3. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass die Sonden Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, peptide nucleic acids (PNAs), Chimä re dieser Verbindungsklassen oder andere Substanzen sind, die sequenzspezifisch mit DNA wechselwirken.

4. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der voranstehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass man die Sonden über reversible Bindungssysteme an die Oberfläche bindet.

5. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass die zu untersuchende Nukleinsäuren in Schritt b) genomische DNA, klonierte DNA, cDNA, RNA, PCR Produkte oder Ligationsprodukte sind.

6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche da durch gekennzeichnet, dass die Sonden in Abhängigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybrisierten Templats mittels einer Polymerase und Nukleotid bausteinen zu spezifischen Produkten, entsprechend Anspruch 1c) umgesetzt werden.

7. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich net, dass man durch gleichzeitigen Einsatz von Deso xy- und Didesoxynukleotidbausteinen eine Sequenzie rung durchführt und nicht nur Polymorphismen detek tiert.

8. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da durch gekennzeichnet, dass man die Sonden in Abhän gigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybri sierten Templats mittels einer Ligase und einem phosphorylierten Oligonukleotid zu spezifischen Pro dukten, entsprechend Anspruch 1c) umsetzt.

9. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da durch gekennzeichnet, dass man die Sonden in Abhän gigkeit von der jeweiligen Sequenz des daran hybridi sierten Templats mittels eines Helferoligonukleotids und einer strukturaktiven Endonuklease allelspezi fisch schneidet.

10. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, da durch gekennzeichnet, dass man die allelspezifischen Produkte mittels Massenspektrometrie analysiert.

11. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich net, dass Matrix-assistierte Laser Desorpti ons/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder E lektrospray Ionisations Massenspektrometrie zur Ana lyse verwendet wird.

12. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 11, dadurch gekennzeich net, dass die allelspezifischen Produkte in einer Art vorliegen, die sich besonders gut zur massenspektro metrischen Analyse eignen.

13. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der voranstehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass man die allelspezi fischen Produkte gemäss Anspruch 1d) mittels einer enzymatischen oder chemischen Methode verkürzt.

14. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 12, dadurch gekennzeich net, dass die besonders gute Eignung zur mas senspektrometrischen Analyse dadurch zustande kommt, dass die allelspezifischen Produkte netto einfach po sitiv oder einfach negativ geladen sind.

15. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 14 dadurch gekennzeich net, dass eine chemische Reaktion zur Neutralisierung von Ladungen eingesetzt wird, die ansonsten zu einer neutralen oder mehrfach negativen Nettoladung des Produktes beitragen würden.

16. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 15, dadurch gekennzeich net, dass man Phosphatgruppen, Thiophosphatgruppen, oder Dithiophosphatgruppen des Oligonukleo tidrückgrats durch eine selektive Alkylierungsreakti on ladungsneutralisiert.

17. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die einfache Ladung von Anspruch 13 dadurch zustande kommt, dass man eine chemische Funktion einbringt, welche die Ladung trägt.

18. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach den Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die reversible Bindungschemie von Anspruch 4 durch einen induzierten Bruch die ein fache Ladung zum Produkt aus Anspruch 13 beisteuert.

19. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 18 dadurch gekennzeich net, dass der induzierte Bindungsbruch chemisch oder photochemisch zustande kommt.

20. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 18, dadurch gekennzeich net, dass der induzierte Bindungsbruch während eines Desorptionsprozesses des Analysevorgangs stattfindet.

21. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach den Ansprüchen 10 bis 20 dadurch gekennzeichnet, dass man eine Matrix auf die Oberflä che aufbringt, welche die Desorption im MALDI Prozess unterstützt.

22. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 21, dadurch gekennzeich net, dass der induzierte Bindungsbruch durch die Mat rix induziert wird.

23. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach den Ansprüchen 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass auf einem adressierten Analyse punkt der Oberfläche eine Vielzahl von unterschiedli chen Sonden sind.

24. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 23, dadurch gekennzeich net, dass allelspezifische Produkte der Sonden durch die allelspezifische Reaktion nach Anspruch 1c) nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse eine eindeutige Masse als nachweisbare Markierung ergeben.

25. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 23, dadurch gekennzeich net, dass allelspezifische Produkte der Sonden durch die allelspezifische Reaktion nach Anspruch 1c) nach Abspaltung von der Oberfläche in der Analyse ein ein deutiges Muster von Fragmentmassen als nachweisbare Markierung ergeben.

26. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach mindestens einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Massen aller Produkte oder Produktfragmente der allelspezifischen Reaktionen einen eindeutigen Rückschluss auf die in der abgefragten Nukleinsäure vorhandenen Allele zu lassen.

27. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der voranstehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass bekannte Poly morphismen in der zu untersuchenden DNA genotypisiert werden.

28. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der Ansprüche 1 bis 26, da durch gekennzeichnet, dass man unbekannte Poly morphismen in der zu untersuchenden DNA identifi ziert.

29. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der voranstehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass man Cytosin- Methylierungen detektiert und visualisiert.

30. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der voranstehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung der DNA mit einer Bisulfitlösung (Disul fit, Hydrogensulfit) durchführt.

31. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach einem der voranstehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasereaktion (PCR) erfolgt.

32. Verfahren zur hochparallelen Charakterisierung von Polymorphismen nach Anspruch 26 dadurch gekennzeich net, dass bekannte Methylierungsmuster in der zu ana lysierenden Probe nach der in Anspruch 30 vorbehan delten DNA untersucht werden.