WO2023089180A1 - Verfahren und testkit zur preiswerten und ressourcensparenden extraktion von nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren und testkit zur preiswerten und ressourcensparenden extraktion von nukleinsäuren Download PDF

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WO2023089180A1
WO2023089180A1 PCT/EP2022/082644 EP2022082644W WO2023089180A1 WO 2023089180 A1 WO2023089180 A1 WO 2023089180A1 EP 2022082644 W EP2022082644 W EP 2022082644W WO 2023089180 A1 WO2023089180 A1 WO 2023089180A1
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reaction vessel
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Timo Hillebrand
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Ist Innuscreen Gmbh
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
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Definitions

  • the subject matter of the invention is a novel means for the resource-saving, rapid and easy-to-carry-out isolation of nucleic acids from a wide variety of starting materials containing nucleic acids, which both guarantees a very high quality of the nucleic acids to be isolated and also enables the isolation of very high nucleic acid yields and beyond Due to the gentle implementation, the extraction of high-molecular DNA is possible.
  • nucleic acids from samples containing nucleic acids which is carried out most frequently worldwide, is well known to the person skilled in the art and is based on the binding of nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions of different chaotropic salts, in which finely ground glass powder (BIO 101, La Jolla , CA), diatomaceous earth (Fa.Sigma) or also silica gels or silica suspensions or glass fiber filters or mineral earths (DE 41 39 664 A1; US Pat. All of these technical solutions are based on the binding of nucleic acids to a mineral carrier material based on glass or silicon in the presence of chaotropic salt solutions.
  • finely ground glass powder BIO 101, La Jolla , CA
  • diatomaceous earth Fe.Sigma
  • silica gels or silica suspensions or glass fiber filters or mineral earths DE 41 39 664 A1; US Pat. All of these technical solutions are based on the binding of nucleic acids to a mineral carrier material based on glass or silicon in the
  • nucleic acids to mineral solid phases can also take place very efficiently by means of so-called anti-chaotropic salts as a component of lysis/binding buffer systems (EP 1135479).
  • anti-chaotropic salts as a component of lysis/binding buffer systems (EP 1135479).
  • nucleic acids with buffers containing a combination of chaotropic and non-chaotropic salts since these buffers also mediate the binding of the nucleic acids to mineral supports.
  • aliphatic alcohols are also used to mediate the bond.
  • the person skilled in the art is also aware that all common commercial products for the isolation and purification of nucleic acids are based on this.
  • the mineral carriers used are in the form of loose beds, in the form of filter membranes or in the form of suspensions.
  • Paramagnetic or magnetic particles are often used to carry out automated extraction processes. These are, for example, siliceous materials that have a magnetic or paramagnetic core or else iron oxide particles whose surface is modified in such a way that they carry the functionalities necessary for binding the nucleic acids.
  • the extraction processes for isolating nucleic acids are also based on the same schemes in principle: lysis of the initial sample to release the nucleic acid, binding of the nucleic acid to the corresponding mineral carrier material, washing of the bound nucleic acid, drying of the carrier material and final elution of the bound nucleic acid from the carrier material. Even if these methods have proven themselves, there are also a number of disadvantages.
  • the binding capacity of the materials used is limited, especially when using spin filter membranes. If the initial sample contains too much nucleic acid, membranes often become clogged as well.
  • the automated process sequences using magnetic particles are complex and, depending on the application, also require a relatively large amount of time. Nucleic acid isolation cannot simply be carried out under field conditions.
  • Patent application WO 2016/169677 A1 discloses a completely different method for extracting nucleic acids.
  • the mineral carrier materials are dispensed with.
  • the nucleic acids are isolated using rough surfaces. Material with a rough or structured surface is used to bind the nucleic acids. In WO 2016/169677 A1, this material is always added to the reaction vessel in which the binding of the nucleic acids takes place, or is already there.
  • the prior art also includes the publications WO 2016/169679 A1 and WO 2016/169678 A1.
  • a material that has grooves or a thread on the inside of a reaction vessel has not previously been described for the attachment of nucleic acids.
  • the invention was based on the object of improving the technical solutions of the publications WO 2016/169677 A1, WO 2016/169679 A1 and WO 2016/169678 A1 with regard to the plastic waste problem.
  • the present invention is based on the task of providing a means for the extraction of nucleic acids, which allows high-quality nucleic acids to be isolated quickly and easily from samples containing nucleic acids, while drastically reducing the plastic waste that has hitherto been produced in the laboratory.
  • the novel agent is based on the findings disclosed in patent application WO 2016/169677 A1 and solves the task in an ideal way.
  • Conventional plastic vessels (1.5 ml, 2.0 ml) are preferably used, although vessels for larger volumes (15 ml or 50 ml) can also be used.
  • a thread is cut into the vessels using a thread cutter. This thread is located in the lower half of the reaction vessels. The thread is preferably not located all the way to the bottom of the vessel, but somewhat above the bottom of the vessel.
  • the thread is preferably cut with a thread cutter with size M7 and with commercially available 2.0 ml
  • a thread cutter preferably size M19
  • the vessels modified by means of the introduced thread are now ideally suited for the extraction of nucleic acids.
  • the entire extraction process, from the lysis to the final desorption of the nucleic acids can be carried out in just one vessel. This significantly reduces the consumption of plastic and the resulting plastic waste from common extraction processes.
  • the extraction of the nucleic acids follows the sequence which is well known to the person skilled in the art and thus follows the steps of lysing-binding-washing-eluting.
  • the steps are binding-washing-eluting - according to claim 1.
  • a lysis step the extraction of nucleic acids from cells using the agent according to the invention is as follows: The cells are placed in the reaction vessel with the thread and lysed using a lysis buffer and with the addition of proteinase K from a commercially available kit (Smart DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH). After cell lysis, isopropanol and Binding Optimizer (also from the kit) are added to the vessel with the lysate. The vessel is incubated on a shaker for 5 min at 1500 rpm. After this step, the sample is poured off.
  • the nucleic acid is now on the thread.
  • the vessel is then washed several times with alcoholic buffers. After removing the ethanol, the bound nucleic acid is detached from the thread by adding water or adding a low-salt buffer and is available for further applications.
  • the process is very gentle, especially for the extraction of DNA. This makes it possible to isolate high molecular weight DNA.
  • binding capacity There are no limitations in terms of binding capacity as is the case with spin filter or magnetic particle based extractions. No centrifugation and no magnetic particle separation is necessary, so no equipment is required for this either.
  • only one vessel is used for the extraction described as an example. Alternatively, however, it is also possible to carry out the lysis step in an additional vessel and only switch to the vessel according to the invention after the lysis has taken place. This is indicated when the samples are not completely lysed and therefore require a centrifugation step to separate insoluble components from the lysate.
  • reaction vessels according to the invention with grooves or a thread on the inside are preferably made of plastic. However, other materials that are equipped with grooves or a thread can also be used. [0009] Resource-saving in the sense of this invention means avoiding plastic waste.
  • Example 1 DNA extraction from nucleated blood cells using a 1.5 ml reaction tube with a thread cut in the reaction tube in comparison with two commercially available reference extraction kits based on spin filter columns (Qiagen; DNeasy Blood&Tissue Kit and IST Innuscreen GmbH innuprep DNA Mini Kit 2.0)
  • Example 2 DNA extraction from nucleated blood cells using a 1.5 ml reaction tube with a thread cut in the reaction tube in comparison with the commercially available reference extraction kit (Qiagen; DNeasy Blood&Tissue Kit) in terms of the amount of plastic waste produced.
  • Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit
  • the reference kit requires 100 reaction vessels for sample lysis, 100 spin filter columns, 300 collection vessels for the spin filter column and 100 reaction vessels for collecting the eluted DNA.
  • the process using the agent of the invention requires 100 threaded reaction vessels.
  • Figure 1 shows the gel electrophoretic analysis of the DNA (0.8% agarose gel) for example 1.
  • the data show that the DNA yield extracted with the agent according to the invention is significantly greater than the yield obtained with the two reference kits was obtained on the basis of filter columns.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Testkit zur preiswerten und ressourcensparenden Extraktion von Nukleinsäuren, wobei unter „ressourcensparend" die weitgehende Vermeidung von Plastik-Müll zu verstehen ist. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Zugabe eines Bindungspuffers zu einer Nukleinsäure enthaltenden Lösung, wobei die Nukleinsäuren an eine feste Phase angebunden werden, Waschen der angebundenen Nukleinsäuren, Eluieren der gewaschenen Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase ein Reaktionsgefäß dient, welche an seiner Innenseite Rillen oder einen Gewindeschnitt aufweist, woran die Anbindung der Nukleinsäuren erfolgt. Vor den Anbinden der Nukleinsäuren können diese mittels einer Lyse aus Zellen freigesetzt werden. Das Testkit umfasst mindestens ein Reaktionsgefäß, das an seiner Innenseite Rillen oder einen Gewindeschnitt aufweist, mindestens einen Bindungspuffer zum Anbinden der Nukleinsäuren an die Innenseite des Reaktionsgefäßes, mindestens einen Waschpuffer zum Waschen der angebundenen Nukleinsäuren, mindestens einen Elutionspuffer zum Eluieren der gewaschenen Nukleinsäuren und ggf. Lysepuffer.

Description

VERFAHREN UND TESTKIT ZUR PREISWERTEN UND RESSOURCENSPARENDEN EXTRAKTION VON NUKLEINSÄUREN
Beschreibung
[0001] Gegenstand der Erfindung ist ein neuartiges Mittel zur ressourcensparenden, schnellen und einfach durchführbaren Isolierung von Nukleinsäuren aus Nukleinsäuren enthaltenden unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien, welches sowohl eine sehr hohe Qualität der zu isolierenden Nukleinsäuren garantiert als auch die Isolierung sehr hoher Nukleinsäure- Ausbeuten ermöglicht und darüber hinaus auf Grund der schonenden Durchführung die Extraktion hochmolekularer DNA ermöglicht.
Stand der Technik
[0002] Die weltweit am häufigsten durchgeführte Extraktion von Nukleinsäuren aus Nukleinsäuren enthaltenden Proben ist dem Fachmann hinlänglich bekannt und basiert auf der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze, bei welchen als Trägermaterial feingemahlene Glaspulver (BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa.Sigma) oder auch Silicagele bzw. Silcasuspensionen oder Glasfaserfilter oder mineralische Erden (DE 41 39 664 Al; US 5,234,809; WO-A 95/34569 DE 4321904; DE 20207793) zum Einsatz kommen. All diese technischen Lösungen basieren auf der Anbindung von Nukleinsäuren an ein mineralisches Trägermaterial auf der Basis von Glas oder Silizium unter Anwesenheit chaotroper Salzlösungen. Des Weiteren kann die Bindung von Nukleinsäuren an mineralische feste Phasen auch mittels sogenannter antichaotrope Salze als Bestandteil von Lyse-/ Bindungspuffer- Systemen sehr effizient erfolgen (EP 1135479). Und es ist auch möglich, Nukleinsäuren mit Puffern, die eine Kombination von chaotropen und nichtchaotropen Salzen enthalten, zu isolieren, da auch diese Puffer die Bindung der Nukleinsäuren an mineralische Träger vermitteln. Zusammenfassend kann man den Stand der Technik also dahingehend beschreiben, dass Nukleinsäuren an mineralische Materialien in Anwesenheit von Puffern, die chaotrope oder antichaotrope Salze enthalten oder auch in Anwesenheit von Puffern die Mischungen chaotroper und antichaotroper Salze enthalten, binden und auf diesem Wege dann auch isoliert werden können. Dabei gibt es auch Vorzugsvarianten, bei denen zusätzlich aliphatische Alkohole zur Bindungsvermittlung eingesetzt werden. Dem Fachmann ist auch bekannt, dass alle gängigen kommerziellen Produkte zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren auf dieser Grundlage basieren. Die eingesetzten mineralischen Träger liegen dabei in Form von losen Schüttungen, in Form von Filtermembranen oder auch in Form von Suspensionen vor. Für die Durchführung von automatisierten Extraktionsabläufen werden häufig paramagnetische oder magnetische Partikel eingesetzt. Dabei handelt es sich z.B. um silikatische Materialien, die einen magnetischen oder paramagnetischen Kem besitzen oder aber auch um Eisenoxydpartikel, deren Oberfläche so modifiziert wird, dass diese die für die Anbindung der Nukleinsäuren notwendigen Funktionalitäten tragen. Die Extraktionsabläufe zur Isolierung von Nukleinsäuren basieren dabei auch auf prinzipiell gleichen Schemata: Lyse der Ausgangsprobe zur Freisetzung der Nukleinsäure, binden der Nukleinsäure an das entsprechende mineralische Trägermaterial, waschen der gebundenen Nukleinsäure, Trocknung des Trägermaterials und finale Elution der gebundenen Nukleinsäure vom Trägermaterial. Auch wenn sich diese Verfahren bewährt haben, gibt es doch auch eine Reihe von Nachteilen. So ist die Bindungskapazität der eingesetzten Materialien begrenzt, insbesondere bei der Verwendung von Spin Filtermembranen. Wenn die Ausgangsprobe zu viel Nukleinsäure enthält, verstopfen Membranen auch oftmals. Die automatisierten Prozessabläufe unter Verwendung von magnetischen Partikeln sind aufwändig und benötigen je nach Anwendung auch einen relativ hohen Zeitaufwand. Die einfache Durchführung einer Nukleinsäure-Isolierung unter Feldbedingungen ist nicht gegeben. Wesentlich ist auch, dass insbesondere bei der manuellen Spin Filter-basierten Durchführung einer Nukleinsäureextraktion im Labor je Präparation eine große Menge an Plastikmüll entsteht. Die Patentanmeldung WO 2016/169677 Al offenbart eine ganz andere Methode zur Extraktion von Nukleinsäuren. Dabei wird auf die mineralischen Trägermaterialien verzichtet. Die Nukleinsäuren werden unter Verwendung von rauen Oberflächen isoliert. Dabei wird Material mit einer rauen oder strukturierten Oberfläche zur Anbindung der Nukleinsäuren verwendet. Dieses Material wird in WO 2016/169677 Al stets in das Reaktionsgefäß, in dem die Anbindung der Nukleinsäuren stattfindet, hineingegeben bzw. befindet sich dort bereits.
[0003] Zum Stand der Technik zählen auch die Druckschriften WO 2016/169679 Al und WO 2016/169678 AL Dort wird auch die Anbindung von Nukleinsäuren an raues bzw.
„strukturiertes“ Material offenbart. Allerdings wird das Material, welches für die Anbindung verantwortlich ist, von einer Flüssigkeit umspült oder befindet sich an der Außenseite von Pipettenspitzen. In DE 10 2019 118 332 Al wird die Bindung von DNA an eine raue feste Phase beschrieben, z.B. an Kunststoff, wobei auch Rillen mitumfasst sind.
[0004] Ein Material, das Rillen oder ein Gewinde an der Innenseite eines Reaktionsgefäßes aufweist, wurde für die Anbindung von Nukleinsäuren bisher nicht beschrieben.
Aufgabe der Erfindung
[0005] Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die technischen Lösungen der Druckschriften WO 2016/169677 Al, WO 2016/169679 Al und WO 2016/169678 Al im Hinblick auf die Plastik-Müll-Problematik zu verbessern.
Lösung der Aufgabe
[0006] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfmdungsgemäß wurden ein Verfahren und ein Testkit bereitgestellt, das den Reaktionsablauf in einem Reaktionsgefäß mit Rillen oder einem Gewinde an deren Innenseite ermöglicht.
[0007] Die vorliegende Erfindung basiert auf der Aufgabenstellung, ein Mittel zur Extraktion von Nukleinsäuren bereitzustellen, welches es erlaubt, schnell und einfach qualitativ hochwertige Nukleinsäuren aus nukleinäurehaltigen Proben zu isolieren und dabei den bisher anfallenden Plastikmüll im Labor drastisch zu reduzieren. Das neuartige Mittel basiert auf den offenbarten Erkenntnissen der Patentanmeldung WO 2016/169677 Al und löst die Aufgabenstellung in idealer Weise. Zum Einsatz kommen vorzugsweise herkömmliche Plastik Gefäße (1.5 ml, 2.0 ml), wobei auch Gefäße für größere Volumen (15 ml oder 50 ml) genutzt werden könnten. Mittels eines Gewindeschneiders wird in die Gefäße ein Gewinde geschnitten. Dieses Gewinde befindet sich in der unteren Hälfte der Reaktionsgefäße. Vorzugsweise befindet sich das Gewinde nicht ganz bis zum Gefäßboden, sondern etwas oberhalb des Gefäßbodens. Dabei reichen wenige Gewindewindungen aus. Im Falle kommerzieller 1.5 ml Reaktionsgefäße wird das Gewinde mit einem Gewindeschneider vorzugsweise mit der Größe M7 geschnitten und bei kommerziell verfügbaren 2.0 ml Reaktionsgefäßen verwendet man einen Gewindeschneider vorzugsweise der Größe M19. Die mittels des eingebrachten Gewindes veränderten Gefäße eignen sich nun in hervorragender Weise zur Extraktion von Nukleinsäuren. Dabei kann in einer speziellen Ausführungsform der gesamte Prozess der Extraktion von der Lyse bis zur finalen Desorption der Nukleinsäuren in nur einem Gefäß durchgeführt werden. Dies reduziert den Verbrauch an Plastik sowie den anfallenden Plastik-Müll gängiger Extraktionsverfahren deutlich. Die Extraktion der Nukleinsäuren folgt dem Ablauf, welcher dem Fachmann hinlänglich bekannt ist und folgt damit den Schritten Lysieren-Binden-Waschen-Eluieren. Für den Fall, dass freie Nukleinsäuren vorliegen und der Lyseschritt entfallen kann, lauten die Schritte Binden- Waschen-Eluieren - gemäß des Anspruchs 1. Mit einem Lyseschritt gestaltet sich die Extraktion von Nukleinsäuren aus Zellen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels wie folgt: Die Zellen werden in das Reaktionsgefäß mit dem Gewinde verbracht und mittels eines Lysepuffers sowie unter Zugabe von Proteinase K aus einem kommerziell verfügbaren Kit (Smart DNA Mini Kit; IST Innuscreen GmbH) lysiert. Nach Zelllyse werden in das Gefäß mit dem Lysat Isopropanol sowie Binding Optimizer (ebenfalls aus dem Kit) zugegeben. Das Gefäß wird auf einem Shaker für 5 min bei 1500 rpm inkubiert. Nach diesem Schritt wird die Probe abgegossen. Die Nukleinsäure befindet sich jetzt am Gewinde. Nachfolgend wird das Gefäß mehrmals mit alkoholischen Puffern gewaschen. Nach Ethanol entfernung wird die gebundene Nukleinsäure vom Gewinde mittels der Zugabe von Wasser oder unter Zugabe eines Niedrigsalzpuffers abgelöst und steht für weitere Anwendungen zur Verfügung. Das Verfahren ist insbesondere für die Extraktion von DNA sehr schonend. Dies ermöglicht es, hochmolekulare DNA zu isolieren. Es gibt keinerlei Limitationen in Hinblick auf Bindungskapazitäten wie dies bei Spin Filter -oder Magnetpartikel-basierten Extraktionen der Fall ist. Es ist keine Zentrifugation und keine Magnetpartikelseparation notwendig, damit ist auch kein Equipment dafür notwendig. Darüber hinaus wird für die exemplarisch beschriebene Extraktion nur ein Gefäß verwendet. Alternativ ist es aber auch möglich, den Lyseschritt in einem zusätzlichen Gefäß zu machen und erst nach erfolgter Lyse in das erfindungsgemäße Gefäß zu wechseln. Dies ist dann angezeigt, wenn es sich um Proben handelt, die nicht vollständig lysiert werden und deshalb einen Zentrifugationsschritt benötigen, um unlösliche Komponenten vom Lysat zu trennen.
[0008] Die erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße mit Rillen oder einem Gewinde an der Innenseite bestehen vorzugsweise aus Kunststoff. Es können aber auch andere Materialien eingesetzt werden, die mit Rillen oder einem Gewinde ausgestattet werden. [0009] Ressourcenschonend im Sinne dieser Erfindung bedeutet die Vermeidung Plastik- Abfall.
[0010] Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben, wobei die Beispiele keine Limitierung der Anwendungen bedeuten.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: DNA-Extraktion aus kernhaltigen Blutzellen mittels eines 1.5 ml Reaktionsgefäßes, mit einem im Reaktionsgefäß eingeschnittenen Gewinde im Vergleich mit zwei kommerziell verfügbaren Referenz-Extraktionskits auf der Basis von Spin Filter Säulen (Qiagen; DNeasy Blood&Tissue Kit und IST Innuscreen GmbH innuprep DNA Mini Kit 2.0)
[0011] Vollblutproben von 3 ml wurden eingesetzt, um aus ihnen die kernhaltigen Zellen zu isolieren. Für die Extraktion wurden dann diese Zellen eingesetzt. Die Extraktionen mit den beiden kommerziell verfügbaren Produkten erfolgte nach Benutzerhandbuch. Die Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Mittels wurde wie folgt durchgeführt. Dabei wurden alle notwendigen Reagenzien aus einem ebenfalls kommerziell verfügbaren Kit (IST Innuscreen GmbH; Smart Blood DNA midi Kit (m)) eingesetzt. Die Zellen wurden in 120 pl 1 x PBS Puffer resuspendiert und in das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe von 200 pl Lysepuffer und 30 pl Proteinase K wurde das Reaktionsgefäß in einem Thermoshaker bei 55°C für 30 min inkubiert. Nach Zelllyse wurden in das Reaktionsgefäß 350 pl Isopropanol und 40 pl Binding Optimizer zugegeben. Das Gefäß wurde danach für 5 min auf einem Shaker bei 1500 rpm inkubiert. Danach wurde die Probe abgegossen. Die am Gewinde gebundenen DNA wurde dreimal mit einem alkoholischen Waschpuffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Gefäß für 10 min mit geöffnetem Deckel bei 40°C inkubiert. Abschließend wurde dem Gefäß 300 pl eines Elutionspuffers (10 mM Tris-HCl) zugegeben und die DNA bei 50°C für ca. 30 min gelöst. Nachfolgend wurde die DNA spektrophotometrisch vermessen und auf einem Agarosegel visualisiert. Dies erfolgte auch mit den extrahierten DNA-Proben aus den beiden Referenz Kits. [0012] Tabelle 1 zeigt die spektrophotometrische Vermessung der DNA.
Figure imgf000008_0001
Tabelle 1
Beispiel 2: DNA-Extraktion aus kernhaltigen Blutzellen mittels eines 1.5 ml Reaktionsgefäßes, mit einem im Reaktionsgefäß eingeschnittenen Gewinde im Vergleich mit dem kommerziell verfügbaren Referenz-Extraktionskit (Qiagen; DNeasy Blood&Tissue Kit) in Bezug auf die anfallende Menge an Plastikmüll.
[0013] Zu Grunde gelegt wurden 100 Reaktionen. Dabei benötigt der Referenz Kit 100 Reaktionsgefäße zur Proben-Lyse, 100 Spin-Filter Säulen, 300 Auffanggefäße für die Spin Filter Säule und 100 Reaktionsgefäße für die Aufnahme der eluierten DNA. Das Verfahren mittels des erfindungsgemäßen Mittels benötigt 100 Reaktionsgefäße mit Gewinde.
Menge Plastikmüll Referenz Kit (100 Reaktionen): 0,6 kg
Menge Plastikmüll erfindungsgemäßes Mittel (100 Reaktionen): 0,1 kg
[0014] Damit ist die Extraktion mittels des erfindungsgemäßen Mittels deutlich mehr ressourcensparend und führt zur drastischen Einsparung von Labormüll.
[0015] Figur ein zeigt die gel elektrophoretische Analyse der DNA (0.8% Agarose Gel) zum Beispiel 1. Die Daten zeigen, dass die mit dem erfindungsgemäßen Mittel extrahierte DNA- Ausbeute deutlich größer ist als die Ausbeute, die mit den beiden Referenz-Kits auf der Basis von Filter-Säulen erhalten wurde.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur ressourcensparenden Extraktion von Nukleinsäuren mit folgenden Schritten: a) Zugabe eines Bindungspuffers zu einer Nukleinsäure enthaltenden Lösung, wobei die Nukleinsäuren an eine feste Phase angebunden werden b) Waschen der angebundenen Nukleinsäuren c) Eluieren der gewaschenen Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase ein Reaktionsgefäß dient, welche an seiner Innenseite Rillen oder einen Gewindeschnitt aufweist, woran die Anbindung der Nukleinsäuren erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt unter la) ein Lyseschritt und ggf. eine Zentrifugation erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäß aus Kunststoff besteht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Rillen oder das Gewinde im unteren Teil des Reaktionsgefäßes befinden.
5. Testkit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend: a) mindestens ein Reaktionsgefäß, das an seiner Innenseite Rillen oder einen
Gewindeschnitt aufweist b) mindestens einen Bindungspuffer zum Anbinden der Nukleinsäuren an die Innenseite des Reaktionsgefäßes c) mindestens einen Waschpuffer zum Waschen der angebundenen Nukleinsäuren d) mindestens einen Elutionspuffer zum Eluieren der gewaschenen Nukleinsäuren.
6. Testkit nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich mindestens einen Lysepuffer aufweist.
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