DE102017222295B4

DE102017222295B4 - Kits und Verfahren zur Entfernung von Verunreinigungen aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe

Info

Publication number: DE102017222295B4
Application number: DE102017222295.6A
Authority: DE
Inventors: Stefan Heymans
Original assignee: Axagarius GmbH and Co KG
Current assignee: Axagarius GmbH and Co KG
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2019-12-05
Anticipated expiration: 2037-12-09
Also published as: DE102017222295A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung von enzyminhibierenden Polyanionen, wie Huminstoffen aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe, die bevorzugt eine biologische Probe oder eine Umweltprobe ist. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe oder Umweltprobe unter Abtrennung von enzyminhibierenden Polyanionen. Die Erfindung umfasst weiterhin Reagenzien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und einen Testkit enthaltend diese Reagenzien. Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung einen Lithiumchlorid- oder Lithiumacetat enthaltenden wässrigen Puffers zur selektiven Elution von Nukleinsäuren von schwachen Anionenaustauschern bei fortgesetzter Anbindung der enzyminhibierenden Polyanionen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung von enzyminhibierenden Polyanionen, wie Huminstoffen aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe, die bevorzugt eine biologische Probe oder eine Umweltprobe ist. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe oder Umweltprobe unter Abtrennung von enzyminhibierenden Polyanionen. Die Erfindung umfasst weiterhin Reagenzien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und einen Testkit enthaltend diese Reagenzien. Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung eines Lithiumchlorid oder Lithiumacetat enthaltenden wässrigen Puffers zur selektiven Elution von Nukleinsäuren von schwachen Anionenaustauschern bei fortgesetzter Anbindung der enzyminhibierenden Polyanionen.
Die mikrobiologischen und molekularbiologischen Zusammenhänge in Böden sind bislang noch kaum erforscht, da die meisten der dort vorkommenden Mikroorganismen nicht im Labor kultivierbar sind. Biodiversität und Stoffwechselleistung können jedoch indirekt über phylogenetische Analysen und Transkriptomanalytik sichtbar gemacht werden, wobei aktuell insbesondere molekularbiologische Methoden wie Next Generation Sequencing zunehmende Bedeutung erlangen. Bei der hierfür notwendigen Isolierung von Nukleinsäuren aus Bodenproben und vergleichbaren huminstoffhaltigen Probenmaterialien ist ein großes Problem die gleichzeitige Aufreinigung von Huminsäuren gemeinsam mit der Nukleinsäure, die die nachfolgenden Analytik von Nukleinsäuren mittels enzymbasierter Verfahren empfindlich stören. Insbesondere die Polymerase Kettenreaktionen (PCR) aber auch weitere enzymbasierte Methoden werden durch Huminstoffe inhibiert. Als kritische Proben sind hier vor allem Bodenproben relevant, weiterhin zum Beispiel forensische Spuren, die durch Bodenpartikel kontaminiert sind.
Huminstoffe sind eine inhomogene Gruppe von Verbindungen, die sich anhand ihres Molekulargewichtes in verschiedene Fraktionen einteilen lassen. Niedermolekulare Verbindungen mit einem Molekulargewicht von bis zu 3.000 Gramm pro Mol und guter Löslichkeit in Wasser werden als Fulvinsäuren oder Fulvosäuren, hochmolekulare Verbindungen mit bis zu mehreren 100.000 Gramm pro Mol und sinkender Löslichkeit in Wasser sowie teilweiser Löslichkeit in Alkali werden als Huminsäuren bezeichnet. Gemeinsam ist den Huminstoffen ein Grundgerüst aus aromatischen Verbindungen, die durch Brücken miteinander verbunden sind. Zur Oberfläche hin überwiegen reaktive, vorwiegend negativ geladene ionische Gruppen, die den Huminsäuren polyanionische Eigenschaften verleihen. In der Kombination dieser Eigenschaften: hohes Molekulargewicht, Polyanion, hydrophober Kern, ähneln die Huminsäuren daher den Nukleinsäuren und lassen sich durch die gängigen Aufreinigungsverfahren, insbesondere auch durch Anionenaustauscher, nicht vollständig von Nukleinsäuren trennen.
Im Stand der Technik sind mehrere Wege beschrieben, um Nukleinsäuren von Huminsäuren zu trennen. Diese sind jedoch meist aufwändig und erfordern weitere Arbeitsschritte.
So lehrt die EP 1 756 136 B1 zur Abtrennung der Huminsäuren von den Nukleinsäuren ein mehrstufiges Ausflockungsverfahren. Dieses Verfahren ist sehr aufwändig und beinhaltet die Gefahr, dass auch Nukleinsäuren durch das Flockungsmittel gefällt werden. Ein anderer Ansatz wird durch EP 2 499 246 B1 verfolgt. Hier wird eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln beschrieben. Neben der Tatsache, dass hier ein zusätzlicher Verfahrensschritt erforderlich ist, hat dieses Verfahren den Nachteil, dass diese Extraktion nicht bei allen Böden funktioniert, da sich die physiko-chemischen Eigenschaften von Nukleinsäure und Huminsäure zu sehr ähneln.
DE 10 2004 006 115 A1 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monodispersen acrylhaltigen Ionenaustauschern einschließlich deren Verwendung zur Abtrennung und Reinigung von biologisch wirksamen Komponenten, wie z.B. Antibiotika, Enzymen, Peptiden und Nukleinsäuren.
WO 2015/154013 A1 betrifft Methoden und Kits zur Extraktion von DNA aus huminsäurehaltigen Proben, wobei die Isolierung bevorzugt aus Bodenproben erfolgt.
Es besteht daher ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Abtrennung von enzyminhibierenden Polyanionen wie Huminstoffen oder Proteinen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Entfernen enzyminhibierender Polyanionen aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe gelöst, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Inkontaktbringen der Probe mit einer Anionenaustauscher-Matrix mit schwachen Anionenaustauschergruppen unter Bedingungen die das Anbinden der Nukleinsäure an die Anionenaustauscher-Matrix erlauben,
b) ein- oder mehrmaliges Waschen der Anionenaustauscher-Matrix mit einem Waschpuffer, wobei die Nukleinsäure an der Anionenaustauscher-Matrix gebunden bleibt, sowie
c) selektive Elution der an der Anionenaustauscher-Matrix gebundenen Nukleinsäure durch eine Lithiumchlorid oder Lithiumacetat enthaltende Elutionslösung.

Das erfindungsgemäße Verfahren vereinigt mehrere entscheidende Vorteile gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Abtrennungs- oder Reinigungsverfahren.
Wie die Erfinder festgestellt haben, vermögen Lithium-Ionen im Elutionspuffer die Nukleinsäuren selektiv von einer schwachen Anionenaustauschermatrix zu desorbieren. Die ebenfalls an der Matrix gebundenen enzyminhibierenden Polyanionen bleiben unter diesen Elutionsbedingungen gebunden und werden somit von den Nukleinsäuren abgetrennt.
Andere Alkali- und Erdalkalihalogenide können diese Trennung nicht bewirken, was insofern überraschend ist, als das bei einer Aufreinigung mittels schwachem Anionenaustauscher neben dem pH-Wert der Lösung vor allem die Art und Konzentration des Anions relevant ist. Der starke Einfluss des Kations ist in diesem Zusammenhang überraschend.
Beachtlicherweise funktioniert die selektive Elution mittels Lithiumsalzen für unterschiedliche Nukleinsäuren, also sowohl für RNA wie auch für DNA.
Weiterhin erlaubt die erfindungsgemäße Elutionslösung durch Veränderung der Lithium-Ionenkonzentration und des pH-Wertes eine mehrstufige Elution mit steigender Elutionskraft, um Nukleinsäuren gemäß ihrer Länge zur fraktionieren. Auch bei dieser mehrstufigen Elution verbleiben die störenden Polyanionen an der Anionenaustauschermatrix gebunden, so dass hochreine Nukleinsäurefraktionen erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Aufreinigungsverfahren stellt eine entscheidende Verbesserung in der Nukleinsäure-Analytik dar, da sie auf einfache und unkomplizierte Weise eine störungsfreie Analytik von Nukleinsäuren möglich macht und dies gerade für den wichtigen Bereich der Umweltproben.
Die Elutionslösung kann mit handelsüblichen Substanzen auf einfache Weise und zudem kostengünstig hergestellt werden.
Die Elutionslösung kann ohne Mehraufwand in die bereits etablierten Nukleinsäure-Aufreinigungsverfahren integriert werden.
So können die herkömmlichen Anionenaustauscher-Matrizes verwendet werden und auch alle weiteren über Jahrzehnte etablierten Prozeßschritte, wie Lyse, Anbindung der Nukleinsäure oder Waschen der Matrix nahezu unverändert beibehalten werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Fähigkeit von Lithium-Kationen enthaltenden wässrigen Lösungen, Nukleinsäuren selektiv von einem schwachen Anionenaustauscher zu desorbieren und damit zu eluieren, wobei die chemisch sehr ähnlichen enzyminhibierenden Polyanionen wie Huminsäuren oder Fulvosäuren an der Anionenaustauscher-Matrix gebunden bleiben.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren abtrennbaren enzyminhibierenden Polyanionen sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Polyphenol, einem Huminstoff, einer Huminsäure, einer Fulvosäure, einem Humin und einem Pflanzenphenol, oder Gemischen hiervon.
Gerade bei Bodenproben liegen komplexe Polyanion-Gemische vor, die neben Humin auch Huminsäure und Fulvosäure umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Probe verwendet, die eine Umweltprobe oder biologische Probe ist, oder von dieser abgeleitet ist.
Besonders bevorzugt wurde diese Probe entnommen von einem Nahrungsmittel, Erdboden, Sediment, Felsen, Gestein, Schlamm, Kompost, verrottenden biologischen Substanzen, einem forensischen Präparat, archäologischen Überresten, Torf, Kompost, Öl, Wasser, terrestrischem Wasser oder unterirdischem Wasser, atmosphärischem und industriellem Wasser, Staub, kommerziellen Töpfermischungen oder Erdbodenveränderungen oder Tiefseeschloten.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem Anionenaustauscher um eine Matrix, die schwache Anionenaustauschergruppen trägt. Bei diesen handelt es sich bevorzugt um primäre, sekundäre oder tertiäre Amine.
Die schwachen Anionenaustauschergruppen sind bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe aufweisend Aminomethyl (AM), Aminoethyl (AE), Methylhydroxyaminoethyl (MAE), Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Diethylaminoethyl (DEAE), Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin, Pentaethylenhexamin, Trimethylamino (TMA), Triethylaminoethyl (TEAE), lineares oder verzweigtes Polyethylenimin (PEI), carboxyliertes oder Hydroxyalkyliertes Polyethylenimin, Jeffamin, Tris, Bis-Tris, Spermin, Spermidin, 3-(Propylamino)propylamin, Polyamidoamin (PAMAM) Dendrimere, Polyallylamin, Polyvinylamin, N-Morpholinoethyl, Polylysin, Tetraazacycloalkane, Zyklische Amine und protonierbare aromatische Amine.
In besonders bevorzugter Weise wird hierbei DEAE und insbesondere MAE verwendet.
Das Anionenaustauschermaterial kann in einer Säule gepackt oder frei in Lösung vorliegen. Bevorzugt ist hierbei die Ausführung als gepacktes Material in einer Säule. Bevorzugte Formate für das Material sind Partikel, Beads, Membranen, Filter, Platten und Kapillarröhrchen.
Das Anionenaustauschermaterial kann zweckmäßigerweise mit einem oder mehreren Vorfiltern versehen sein. Als Filtermaterial können zum Beispiel und nicht ausschließlich Cellulose oder gesintertes Polyethylen verwendet werden.
Die Anionenaustauschergruppe ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren an eine Matrix als feste Oberfläche gebunden. Die Verbindung zwischen der festen Phase und der Anionenaustauschergruppe kann durch einen sogenannten Abstandshalter (sog. Spacer) variabler Länge erfolgen. Ein solcher Spacer, der linear oder verzweigt sein kann, erzwingt einen räumlichen Abstand zwischen der Matrix und der Anionenaustauschergruppe und überwindet damit sterische Störungen der Ligand-Ligat-Interaktion. Der Spacer kann 3 bis 30 C-Atome umfassen.
Als Matrix kann jegliches für Anionenaustausch-Chromatographie geeignetes Material verwendet werden, wie beispielsweise Silica, Borsilikate, organische Polymere, Polysaccharide, Metalloxide, Metalle, Sephadex, Sepharose, Hydrogele wie Agarose.
Bei der Matrix als fester Phase handelt es sich bevorzugt um Kieselgel. Das Kieselgel kann hierbei eine mittlere Korngröße von unter 200 µm, bevorzugt von unter 100 µm und besonders bevorzugt von unter 60 µm haben.
Das Anionenaustauschermaterial und die eventuell verwendeten Filterelemente werden im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt mit einer Lösung äquilibriert, die aus Wasser und einer oberflächenaktiven Substanz, zum Beispiel einem Detergens oder einem C1-C4 Alkohol besteht und auf leicht saure pH-Werte, bevorzugt pH 5,0 bis pH 6,9 eingestellt ist.
Lyseschritt
Die im Verfahren eingesetzte, Nukleinsäure enthaltende Probe wird üblicherweise durch einen Zellaufschluß, der sogenannten „Lyse“ gewonnen.
Zweckmäßigerweise werden die in der Probe, die bevorzugt eine Bodenprobe oder eine mit Boden kontaminierte Probe ist, enthaltenen DNA-haltigen Zellen in einem Lysepuffer durch ein dem Fachmann bekanntes Verfahren, zum Beispiel mit Hilfe von Bead Beating, Mörsern unter flüssigem Stickstoff oder Erhitzen aufgeschlossen, um die in den Zellen enthaltene Nukleinsäure freizusetzen. Hierbei wird durch den Lysepuffer die in diesen Proben gegebenenfalls zusätzlich enthaltene freie Nukleinsäure ebenfalls in Lösung gebracht. Zwangsläufig wird zusätzlich bei entsprechend belasteten Proben die Fraktion der Fulvin- und Huminsäuren mit in Lösung gebracht, welche dann die Nukleinsäure enthaltende Lösung kontaminieren.
Geeignete Lysepuffer sind dem Fachmann bekannt. Der Lysepuffer enthält hierbei mindestens ein Detergens, das bevorzugt ein anionisches Detergens ist. Besonders bevorzugt ist hierbei die Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS).
Das Detergens, das bevorzugt SDS ist, liegt in einer Ausführungsform in einer Konzentration von weniger als 10% (m/v), bevorzugt weniger als 5% (m/v), besonders bevorzugt weniger als 3% (m/v) vor.
Des Weiteren kann der Lysepuffer einen Komplexbildner enthalten, der, zum Beispiel aber nicht ausschließlich, Ethylendiamintetraacetat (EDTA) oder Citrat ist.
Der Chelator, der bevorzugt Citrat oder EDTA ist, ist hierbei in einer Konzentration von weniger als 500 millimol pro Liter (mM), bevorzugt von weniger als 200 mM, besonders bevorzugt weniger als 150 mM in dem Lysepuffer enthalten.
Als weitere Inhaltsstoffe des Lysepuffers können Puffersubstanzen, zum Beispiel Tris, MOPS, Acetat, Citrat, Bis-Tris oder MES in ausreichender Konzentration zur Stabilisierung des pH-Wertes enthalten sein.
Die Konzentration der Puffersubstanz, wobei hier Tris bevorzugt ist, beträgt beispielsweise weniger als 500 mM, bevorzugt weniger als 200 mM und besonders bevorzugt weniger als 150 mM.
Der pH-Wert des Lysepuffers liegt in einem Bereich von pH 5,0 bis 9,0, bevorzugt in einem Bereich von pH 6,0 bis 8,0 und besonders bevorzugt bei pH 7,0.
Der Lysepuffer kann im erfindungsgemäßen Verfahren durch ein organisches Lösungsmittel, zum Beispiel Phenol:Chloroform:lsoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) ergänzt werden.
In einer Ausführungsform haben die zu einem Zellaufschluss mittels Bead Beating verwendeten Beads einen Durchmesser von unter 3,0 mm, bevorzugt von unter 2,0 mm, besonders bevorzugt von unter 1,0 mm.
Die Beads können aus einem der folgenden Materialien bestehen: Stahl, Glas, Keramik oder Korund. Bevorzugt sind hierbei Beads aus Keramik, und besonders bevorzugt aus Zirkonium mit einem Yttriumanteil zwischen 0 und 10%.
Der Zellaufschluss erfolgt besonders bevorzugt in Gegenwart der Probe, des Lysepuffers, gegebenenfalls des organischen Lösungsmittels und der Beads durch Schütteln, zum Beispiel und nicht ausschließlich horizontal bei 30 Hz für 5 min, vertikal bei 5 m/s für 30 s oder orbital bei 2700 Umdrehungen pro Minute mit einem Radius von 3 mm für 5 min.
Optimale Bedingungen sind probenspezifisch und für den Fachmann leicht zu ermitteln.
Im Anschluss an den Zellaufschluss werden ungelöste Bodenpartikel von den gelösten Komponenten abgetrennt, zum Beispiel durch Zentrifugation oder durch Filtration. Der nukleinsäurehaltige klare Überstand kann im erfindungsgemäßen Verfahren mit einer weiteren Lösung versetzt werden, mit der die Bindebedingungen an die Anionenaustauschermatrix definiert werden, sofern dies nicht bereits durch die Zusammensatzung des Lysepuffers erfolgt ist. Hierbei handelt es sich um eine Salzlösung, bevorzugt um eine Carbonsäuresalz-enthaltende Lösung, besonders bevorzugt um eine Kaliumacetatlösung.
Volumen und Konzentration werden hierbei zweckmäßigerweise so gewählt, dass sich in der resultierenden Lösung aus Lyseüberstand und Bindelösung eine Kalium und Acetatkonzentration von mehr als 100 mM, bevorzugt mehr als 200 mM, besonders bevorzugt mehr als 300 mM und bevorzugt weniger als 750 mM, besonders bevorzugt weniger als 500 mM einstellt.
Der resultierende pH-Wert liegt zweckmäßigerweise bei pH 4,0 bis pH 7,0, bevorzugt bei pH 4,5 bis 6,5, besonders bevorzugt bei pH 5,0 bis pH 6,0.
Anbindungsschritt
Der Lyseüberstand, in dem die entsprechenden Bindebedingungen eingestellt wurden, wird mit dem (bevorzugt äquilibrierten) Anionenaustauschermaterial in Kontakt gebracht. In der Ausführungsform als gepacktes Material in einer Säule wird die Lösung über einen Eingang mit dem Anionenaustauschermaterial in Kontakt gebracht und verlässt die Packung über einen in Flussrichtung liegenden Ausgang.
Treibende Kraft können die Erdbeschleunigung (gravity flow) oder ein positiver Druck, zum Beispiel durch eine Pumpe vermittelt, sein. Negativer Druck (Vakuum) wird bevorzugt nicht verwendet. Besonders bevorzugt ist die Ausführungsform als gravity flow Säule.
Liegt das Anionenaustauschermaterial in loser Schüttung vor, so wird dieses mit dem Lyseüberstand in Kontakt gebracht, zum Beispiel durch Suspendieren der Anionenaustauschermatrix im Lyseüberstand. Nach der Bindung wird das Anionenaustauschermaterial zum Beispiel durch Zentrifugation, Filtration oder, falls auf Grund der Wahl der festen Phase möglich, ein magnetisches Feld aus dem Lyseüberstand entfernt. Bei der Bindung werden Polyanionen wie zum Beispiel Nukleinsäuren, Huminsäuren und negativ geladene Proteine wenigstens teilweise an die positiv geladene Anionenaustauschermatrix gebunden.
Falls erforderlich wird ein verwendeter Vorfilter ausgespült, um die dort im Totvolumen enthaltene Nukleinsäure ebenfalls auf die Anionenaustauschermatrix zu binden. Als Spüllösung wird typischerweise eine Lösung verwendet, die in ihrer Zusammensetzung der Lösung entspricht, mit der die Nukleinsäure an den Anionenaustauscher gebunden wurde. Alternativ kann Wasser ohne weitere Zusätze verwendet werden.
Waschschritt
Durch einen Waschschritt werden im erfindungsgemäßen Verfahren erste Kontaminanten, zum Beispiel Proteine oder Fulvosäuren, vom Anionenaustauscher eluiert.
Hierbei wird eine Waschlösung verwendet, die in ihrer Zusammensetzung die Elution niedermolekularer Oligo- oder Polyanionen fördert, hochmolekulare Polyanionen jedoch auf der Säule gebunden hält. Bei einem Anionenaustauscher ist dabei der pH-Wert von entscheidender Bedeutung. Der einsetzbare Konzentrationsbereich des für den Waschschritt verwendeten Salzes wird umso schmaler, je höher der pH-Wert der Lösung ist, da sich die Anzahl positiv geladener Gruppen des Anionenaustauschers in Abhängigkeit vom pKa-Wert der Anionenaustauschergruppe und vom pH-Wert der Lösung verändert. Bei alkalischem pH-Wert sinkt der Anteil protonierter, also positiv geladener Anionenaustauschergruppen, was eine Elution von gebundenen Anionen fördert.
Da im erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt MAE als Anionenaustauschergruppe eingesetzt wird, hat die verwendete Waschlösung bevorzugt einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt von pH 7,0, wobei der pH-Wert durch eine Puffersubstanz, zum Beispiel Tris-Cl abgepuffert wird. In diesem Fall erfolgt eine Elution niedermolekularer Kontaminanten durch eine Salzlösung mit einer Anionenkonzentration von 200 mM bis 600 mM, bevorzugt von 300 mM bis 500 mM, besonders bevorzugt von 450 mM. Als Salz können beispielsweise Halogenide, Phosphate, Sulfate, Cyanate und Acetate eingesetzt werden. Besonders bevorzugt wird Guanidiniumthiocyanat verwendet. Zur besseren Vermittlung einer Grenzflächenaktivität und zur Anpassung der optimalen Polarität der flüssigen Phase enthält die Waschlösung Ethanol in einer Konzentration von 5 bis 25 Vol.-%, bevorzugt von 10 bis 20 Vol.-%, und besonders bevorzugt von 15 Vol.-%.
Elutionsschritt
Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Elution der Nukleinsäure vom Anionenaustauscher durch eine Elutionslösung, die Lithiumchlorid (LiCI) oder Lithiumacetat (LiOAc) als Salz enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Elutionslösung das Lithiumchlorid (LiCI) oder Lithiumacetat als einziges Salz. Dieses Lithiumsalz wird gegebenenfalls ergänzt durch ein Ion in geringer Konzentration, welches eine Funktion als Puffersubstanz für den pH-Wert übernimmt und/oder einen C1-C4 Alkohol zur Anpassung der Polarität.
Falls gewünscht kann die Elution mehrstufig mit steigender Elutionskraft durchgeführt werden, um Nukleinsäuren gemäß ihrer Länge zu fraktionieren.
Soll gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren Gesamtnukleinsäure isoliert werden, so erfolgt bei Verwendung von Lithiumchlorid die Elution pH-Wert abhängig mit 700 mM bis 1500 mM LiCI bei einem pH-Wert von 7,0 bis 10,0, bevorzugt bei pH 7,5 bis 9,0, besonders bevorzugt mit bei pH 8,0 und 850 mM LiCI. Als Puffersubstanz wird hierbei bevorzugt Tris-Cl in einer Konzentration von zum Beispiel 100 mM eingesetzt.
Im erfindungsgemäßen Verfahren mit Fraktionierung erfolgt die Elution kurzer DNA bis ca. 3000 Basenpaare (bp) beziehungsweise von RNA bis ca. 3000 Nukleotide (nt) bei pH 7,0 und einer Salzkonzentration von 1000 mM, längere Nukleinsäure wird mit 850 mM LiCI bei pH 8,0 eluiert. Der pH-Wert wird dabei besonders bevorzugt durch Tris-Cl in einer Konzentration von 100 mM stabilisiert. Bei steigendem pH-Wert erfolgt bei gleicher LiCI-Konzentration eine Elution längerer Nukleinsäuren, so dass die LiCI-Konzentration bei einem höheren pH-Wert abgesenkt werden muss, sofern eine Fraktionierung erforderlich ist. Der Fachmann kann entsprechende Bedingungen durch einfache Experimente ermitteln. Zur besseren Vermittlung einer Grenzflächenaktivität und zur Einstellung der Lösungsmittelpolarität enthält die Elutionslösung optional einen C1-C4-Alkohol, vorzugsweise Ethanol oder Isopropanol, in einer Konzentration von 1 bis 25 Vol.-%, bevorzugt von 10 bis 20 Vol.-%, und besonders bevorzugt von 15 Vol.-%.
Nachbehandlungsschritt
Die Entsalzung und Aufkonzentrierung der eluierten Nukleinsäure erfolgt zum Beispiel durch eine dem Fachmann bekanntes Verfahren, wie beispielsweise durch Fällung mit Isopropanol. Hierzu wird das Anionenaustauschereluat mit 0,7 Volumen Isopropanol versetzt, für 0 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bevorzugt auf einem Glas- oder Quarzfaserfilter („Silicamembran“) abfiltriert. Entsprechende Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt.
Bei dem verwendeten Glasfaserfilter kann es sich zum Beispiel und nicht ausschließlich um einen binderfreien Glasfaserfilter mit einem Gewicht von 120 g/cm², 0,6 mm Dicke und einem mittleren Rückhaltevermögen für Partikel in Lösungen von 1,4 µm handeln, von dem eine oder mehrere Lagen zur Filtration eingesetzt werden. Die Filtration kann mittels Vakuum, Zentrifugation oder durch positiven Druck beschleunigt werden.
Das auf dem Filter zurückgehaltene Nukleinsäurepräzipitat wird durch einen oder mehrere Waschschritte mit Ethanol in einer Konzentration von bevorzugt mehr als 69% in Wasser gewaschen. Verbleibender Ethanol wird durch Zentrifugation oder Lufttrocknung entfernt. Das Nukleinsäurepräzipitat wird anschließend in Wasser, TE-Puffer oder einem beliebigen geeigneten Lösungsmittel gelöst und vom Filter eluiert.
Alternativ kann die Fällung ohne einen Glasfaserfilter direkt in einem dem Fachmann bekannten Reaktionsgefäß erfolgen.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung einen Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren bereit, wobei der Kit Folgendes umfasst:

a) eine Anionenaustausch-Matrix mit schwachen Anionenaustauschergruppen;
b) einen Waschpuffer;
c) einen Lithiumchlorid oder Lithiumacetat enthaltenden Elutionspuffer; und
d) Anweisungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Der Kit zur Isolierung non Nukleinsäuren gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch folgende optionale Komponenten umfassen:

1. einen Lysepuffer
2. Isopropanol
3. Glasfilter oder Silikamembran-Filter
4. Röhrengefäße.

In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Lithiumchlorid-haltigen Elutionspuffers zur Entfernung von enzyminhibierenden Polyanionen aus einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe durch selektive Elution der an einer Anionenaustausch-Matrix mit schwachen Anionenaustauschergruppen gebundenen Nukleinsäuren unter verbleibender Anbindung der enzyminhibierenden Polyanionen an der Anionenaustauscher-Matrix.
Definitionen
Unter einer „einem enzyminhibierenden Polyanion“ wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Polymer verstanden, das bei einem pH-Wert von 7,0 mehrere anionische Gruppen trägt und welches in einer PCR einen negativen Einfluss auf die Amplifikation der Nukleinsäure ausübt.
Gemäß der Erfindung ist eine „Huminsäure“ eine hochmolekulare chemische Verbindung, die neben anderen Huminstoffen während des Abbauprozesses von biologischem Material durch „Humifizierung“ gebildet werden. Der Molmassenbereich der Huminsäure liegt dabei zwischen 2000 und 300.000 Dalton. Sie besteht hauptsächlich aus teilweise abgebautem pflanzlichem Lignin und Cellulose, an die oft auch Proteine und Kohlenhydrate angelagert sind. Die Huminsäure enthält typischerweise unterschiedliche chemische Komponenten wie Chinon-, Phenol-, Zucker- oder Peptidkomponenten enthalten, die miteinander bevorzugt über phenolische Brücken verknüpft sind.
Im Kontext der Erfindung ist eine schwache Anionenaustauschergruppe als ein Anionenaustauscher definiert, der nur in einem eingeschränkten pH-Bereich ionisierbar ist. Diese sind bevorzugt primäre, sekundäre oder tertiäre Amine.
Ausführungsbeispiele
Isolierung von DNA und RNA aus einer Bodenprobe
Das folgende Beispiel beschreibt exemplarisch ein erfindungsgemäßes Aufreinigungsverfahren anhand einer Bodenprobe und zeigt die vorteilhafte Aufreinigung gegenüber Standard-Elutionspuffern.
Testdurchführung
Pro Ansatz wurden 500 mg Bodenprobe in einem Gefäß mit 1,5 g Keramik Beads vorgelegt. Nach Zusatz von 800 µL Lysepuffer und 100 µL Phenol:Chloroform:lsoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) wurden die in der Probe enthaltenen Zellen durch „Bead Beating“ aufgeschlossen. Die Proben wurden durch Zentrifugation in einen nukleinsäurehaltigen Überstand und ein Pellet aus Bodenpartikeln und Beads getrennt. Die Überstände wurden in neue Reaktionsgefäße überführt und mit einem Bindepuffer versetzt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt zur Feinklärung wurden die Überstände in einem gemeinsamen Gefäß zusammengefasst und durch Vortexen zu einem homogenen Masterlysat vermischt. Durch die Lyse bedingte Unterschiede in Nukleinsäurekonzentration und Huminsäurekontamination werden durch diesen Schritt nivelliert. Von diesem Masterlysat mit einheitlicher Nukleinsäure- und Huminsäurekonzentration wurden gleiche Volumina mittels „gravity flow“ auf sieben identische, äquilibrierte MAE-Anionenaustauschersäulen geladen. Durch Zugabe eines Waschpuffers wurden niedermolekulare Kontaminanten entfernt. Die Elution der sieben Säulen erfolgte in zwei Schritten mit den folgenden Lösungen:

Schritt 1 (Fraktion 1)
1. 1. 1000 mM LiCI, 100 mM Tris-Cl, pH 7,0, 15% Ethanol
2. 2. 1000 mM NaCl, 100 mM Tris-Cl, pH 7,0, 15% Ethanol
3. 3. 1000 mM KCl, 100 mM Tris-Cl, pH 7,0, 15% Ethanol
4. 4. 1000 mM NH₄Cl, 100 mM Tris-Cl, pH 7,0, 15% Ethanol
5. 5. 1000 mM Guanidinium-Cl (GuCI), 100 mM Tris-Cl, pH 7,0, 15% Ethanol
6. 6. 500 mM MgCl₂, 100 mM Tris-Cl, pH 7,0, 15% Ethanol
7. 7. 500 mM CaCl₂, 100 mM Tris-Cl, pH 7,0, 15% Ethanol
Schritt 2 (Fraktion 2)
1. 1. 850 mM LiCI, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0
2. 2. 850 mM NaCl, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0
3. 3. 850 mM KCl, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0
4. 4. 850 mM NH₄Cl, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0
5. 5. 850 mM Guanidinium-Cl (GuCI), 100 mM Tris-Cl, pH 8,0
6. 6. 425 mM MgCl_e, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0
7. 7. 425 mM CaCl₂, 100 mM Tris-Cl, pH 8,0

Die Eluate werden aufgefangen und mittels bekannter Isopropanolfällung entsalzt und aufkonzentriert. Hierzu werden zu den Eluaten jeweils 0,7 Volumen Isopropanol gegeben. Durch Filtration auf einen Glasfaserfilter wird das Nukleinsäurepräzipitat aufgefangen und mit einer Lösung von 80% Ethanol in Wasser gewaschen. Nach der Ethanolentfernung durch Trocknung wird die Nukleinsäure in jeweils 100 µL Wasser (H₂O_bidest.) gelöst und für die nachfolgenden Experimente verwendet.
Analyse der Eluate
Photometrische Messung
Eine photometrische Messung der Gesamteluate bei 300 nm zeigt den Grad an Braunfärbung der Eluate an. Je höher die Extinktion bei 300 nm ist, desto brauner sind die Eluate, was auf eine Verschleppung von Huminsäuren hinweist. Bevorzugt sind also möglichst kleine Werte unterhalb von 0,05.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und dargestellt. Diese zeigen, dass nur bei Verwendung von LiCI saubere, photometrisch ungefärbte Eluatfraktionen mit einer Extinktion bei 300 nm von unter 0,05 erhalten werden. Die Verwendung von Natriumchlorid-haltigem Standard-Elutionspuffer führt zu Eluaten mit 3 bis vierfach höherer Huminsäurekonzentration. Tabelle 1: Extinktion der Eluatfraktionen bei 300 nm

LiCl NaCl KCl NH₄Cl GuCl MgCl₂ CaCl₂

Fraktion 1 0,044 0,174 0,248 0,104 0,298 0,671 0,362

Fraktion 2 0,042 0,131 0,221 0,060 0,155 0,123 0,154

(Tabelle 1 und ).
Elelektrophoretische Analyse
20 µL der ersten Elutionsfraktion und 10 µL der zweiten Elutionsfraktion werden auf einem 1%-igen TAE Agarosegel aufgetrennt. Das Gelbild ist in dargestellt. Der Unterschied in der Nukleinsäureelution ist offensichtlich, obwohl in allen Fällen die gleiche Konzentration an Chloridionen vorgelegen hat. RNA lässt sich anhand der ribosomalen Banden von 16S und 23S rRNA erkennen, DNA ist als hochmolekulare Wolke und niedermolekularer „Schmier“ sichtbar. Als Marker ist der GeneRuler^® 1 kb Marker (Fa. Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich, BRD) aufgetragen.
Bei NH4 als Kation ist keine signifikante Nukleinsäureelution feststellbar. Magnesium und Kalzium eluieren vor allem DNA, weniger RNA. Kalium und Guanidinium eluieren verzögert RNA und keine DNA.
Beachtlicherweise ist nur mit dem Lithium-haltigen Puffer eine fraktionierte Aufreinigung von RNA (1. Fraktion) und DNA (2. Fraktion) möglich.
Analyse der Enzyminhibition durch RT-PCT
Zum Nachweis einer enzymatischen Inhibierung wird zunächst eine RT-PCR durchgeführt. Es ist bekannt, dass Huminstoffe thermostabile DNA-Polymerasen wie die TAQ-Polymerase hemmen können.
Im vorliegenden Ansatz wird ein 466 bp großes Stück der 16S rRNA amplifiziert. Durch die Wahl der Primer „331F PCR16“ und „MTY4 PCR Uni“ wird nur RNA amplifiziert. Für die Umschreibung der RNA in die cDNA mittels dem Enzym reverse Transcriptase wird der Primer „MYT4- 797R PCR16“ verwendet.

RT-Primer: MYT4- 797R PCR16
5'-CAGCTTGGTAGAATCGATCAGCTAC/GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3'

PCR-Primer/ Forward Primer: 331F PCR16
 5'-TCCTACGGGAGGCAGCAG-3'

PCR-Primer/ Reverse Primer: MTY4 PCR Uni:
5'-CAGCTTGGTAGAATCGATCAGCTAC-3'

Die Amplifikation und Quantifizierung der Amplifikate erfolgt mittels Realtime-PCR unter Verwendung des „BioLine SensiFAST SYBR low-Rox One Step“ Kits (Fa. Bioline). Das Volumen der RT-PCT-Ansätze beträgt 20 µL.

Die Ergebnisse der RT-PCR für die erste Eluatfraktion sind in dargestellt. Die Eluatfraktion 1 zeigt nur bei Verwendung von LiCI und in der Positivkontrolle (POS) ein deutliches Signal. Bei Verwendung von NaCl zur Elution ist, trotz gelelektrophoretisch vergleichbarer Ausbeute an 16S rRNA (s. ), ein drastisch verzögertes Signal mit nicht exponentieller Amplifikation zu erkennen, was ein Zeichen einer Reaktionsinhibierung ist.

Bei einer PCR verdoppelt sich theoretisch bei jedem Zyklus die Menge an DNA (2ⁿ mit n = Anzahl der Zyklen), so dass ein Unterschied von 12,6 Zyklen (20,91 - 33,51) bis zum Erreichen des Cp-Wertes mathematisch einem Konzentrationsunterschied von Faktor 212,6 = ca. 6000 entspräche. Die Cp-Werte der in gezeigten RT-PCR-für die 1 Elulatfraktion und in gezeigten RT-PCR-für die 2 Elulatfraktion die sind in der folgenden Tabelle dargestellt: Tabelle 2: Cp-Werte der Eluatfraktionen in der 16S rRNA - RT-PCR

	LiCI	NaCI	KCl	NH₄Cl	GuCl	MgCl₂	CaCl₂
Fraktion 1	12,67	20,91	-	33,51	-	-	-
Fraktion 2	14,69	25,24	-	28,11	> 36	23,64	21,51

Ein solcher Konzentrationsunterschied ist im Gelbild nicht zu erkennen, dort wirken die 16S rRNA Banden beider Eluate gleich intensiv. Der große Unterschied in der PCR ist folglich nur dadurch zu erklären, dass nicht bei jedem Zyklus die theoretisch mögliche Verdopplung stattgefunden hat, sondern die Aktivität der Polymerase in der NaCI-Eluatfraktion reduziert war (xⁿ mit x << 2).

Die Analyse der zweiten Eluatfraktion zeigte nur für die Eluate von Lithium, Natrium, Kalium, Guanidinium und Magnesium eine messbares 16S rRNA-Amplifikat (siehe ). Die entsprechende RT-PCR in zeigt erneut nur bei Lithium einen exponentiellen Anstieg. Bei Verwendung der anderen Salze kommen die Signale stark verzögert und mit eher linearem Anstieg, ein klarer Indikator für eine Inhibierung.

Zum Nachweis einer PCR-Inhibierung in der DNA-Fraktion wird das 16S rRNA Gen mit ca. 1,6 kbp komplett amplifiziert. Als Primer hierfür wird das bekannte Primerpaar pA und pH' verwendet.

pA: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

pH': 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'

Die PCR erfolgt mittels Endpunkt-PCR und 35 Zyklen. Die Eluate werden unverdünnt, sowie mit Wasser 1:10 verdünnt in die PCR eingesetzt. Eine PCR Inhibierung zeigt sich darin, dass die PCR erst bei höheren Verdünnungsstufen ein Amplifikat zeigt.

Unverdünnt ist nur bei Verwendung von Lithium ein Signal messbar ( ). Laut wäre jedoch vor allem bei Verwendung von MgCl₂ und CaCl₂ eine hohe DNA-Ausbeute und somit ein intensives PCR Amplifikat zu erwarten gewesen. Die dort auffällige hohe E300 (s. Tabelle 1) und die dadurch angezeigte intensive Braunfärbung der Eluate zeigt folglich eine starke Huminstoffverschleppung und in Folge eine Inhibierung der PCR an.

In einer 1:100 Verdünnung ( ) sind auch bei anderen Proben deutliche Banden zu erkennen. Durch Verdünnung ließ sich also die Amplifizierbarkeit in einer PCR wiederherstellen, was auf eine PCR-Inhibierung der unverdünnten Proben hinweist.

Anhand von photometrischer Bestimmung der Braunfärbung der Eluate (Huminsäureverschleppung) und PCR-Daten lässt sich also eine Verschleppung von Huminsäure aus der Bodenprobe in die Eluate nachweisen. Diese trat bei allen zur Elution verwendeten Salzen auf, nur bei Lithiumchlorid nicht. Die Chloridkonzentration und damit die für einen Anionentauscher relevante Komponente war dabei in allen Proben einheitlich. Der deutliche Einfluss des Kations ist unerwartet und zeigt einen starken positiven Effekt.

Figurenliste

1 zeigt die Ergebnisse der Isolierung von RNA und DNA aus einer Huminsäurehaltigen Bodenprobe gemäß Beispiel 1 unter Analyse der Extinktion der RNA-Eluate (Fraktion 1) und DNA-Eluate (Fraktion 2) bei 300 nm.
2 zeigt die Ergebnisse der Isolierung von RNA und DNA aus einer Huminsäurehaltigen Bodenprobe gemäß Beispiel 1 anhand einer gelektrophoretischen Analyse der Eluate (Fraktion 1 und 2). Dargestellt ist das Ethidiumbromid-gefärbte Agarose-Gel unter UV-Exposition. Als Größenmarker wurde eine 1kb-Leiter mit aufgetrennt.
3 zeigt die Ergebnisse der Isolierung von RNA aus einer Huminsäure-haltigen Bodenprobe gemäß Beispiel 1 anhand einer semiquantitativen RT-PCR-Analyse der Eluate. Dargestellt sind die Amplifikationskurven der einzelnen PCR-Reaktionen.
4 zeigt die Ergebnisse der Isolierung von DNA aus einer Huminsäure-haltigen Bodenprobe gemäß Beispiel 1 anhand einer semiquantitativen RT-PCR-Analyse der Eluate. Dargestellt sind die Amplifikationskurven der einzelnen PCR-Reaktionen.
5 zeigt die Ergebnisse der Isolierung von DNA aus einer Huminsäure-haltigen Bodenprobe gemäß Beispiel 1 anhand einer Endpunkt-PCR-Analyse (35 Zyklen) der unverdünnten Eluate. Dargestellt ist ein Ethidiumbromid-gefärbtes Agarose-Gel der aufgetrennten PCR-Reaktionsansätze. Als Größenmarker wurde die „GeneRuler 1kb DNA ladder“ mit aufgetrennt (Größe in bp: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10.000).
6 zeigt die Ergebnisse der Isolierung von DNA aus einer Huminsäure-haltigen Bodenprobe gemäß Beispiel 1 anhand einer Endpunkt-PCR-Analyse (35 Zyklen) der 1:10 verdünnten Eluate. Dargestellt ist ein Ethidiumbromid-gefärbtes Agarose-Gel der aufgetrennten PCR-Reaktionsansätze. Als Größenmarker wurde die „GeneRuler 1kb DNA ladder“ mit aufgetrennt (Größe in bp: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10.000).
7 zeigt die Ergebnisse der Isolierung von DNA aus einer Huminsäure-haltigen Bodenprobe gemäß Beispiel 1 anhand einer Endpunkt-PCR-Analyse (35 Zyklen) der 1:100 verdünnten Eluate. Dargestellt ist ein Ethidiumbromid-gefärbtes Agarose-Gel der aufgetrennten PCR-Reaktionsansätze. Als Größenmarker wurde die „GeneRuler 1kb DNA ladder“ mit aufgetrennt (Größe in bp: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10.000).

Weitere Varianten der Erfindung und ihre Ausführung ergeben sich für den Fachmann aus der vorangegangenen Offenbarung, den Figuren und den Patentansprüchen.

In den Patentansprüchen verwendete Begriffe wie „umfassen“, „aufweisen“, „beinhalten“, „enthalten“ und dergleichen schließen weitere Elemente oder Schritte nicht aus. Die Verwendung des unbestimmten Artikels schließt eine Mehrzahl nicht aus. Eine einzelne Einrichtung kann die Funktionen mehrerer in den Patentansprüchen genannten Einheiten bzw. Einrichtungen ausführen. In den Patentansprüchen angegebene Bezugszeichen sind nicht als Beschränkungen der eingesetzten Mittel und Schritte anzusehen.

Claims

Verfahren zum Entfernen enzyminhibierender Polyanionen aus einer Nukleinsäure enthaltenden Probe, umfassend die folgenden Schritte: i. Inkontaktbringen der Probe mit einer Anionenaustauscher-Matrix mit schwachen Anionenaustauschergruppen unter Bedingungen die das Anbinden der Nukleinsäure an die Anionenaustauscher-Matrix erlauben, ii. ein- oder mehrmaliges Waschen der Anionenaustausch-Matrix mit einem Waschpuffer, wobei die Nukleinsäure an der Anionenaustauscher-Matrix gebunden bleibt, sowie iii. selektive Elution der an der Anionenaustauscher-Matrix gebundenen Nukleinsäure durch eine Lithiumchlorid oder Lithiumacetat enthaltende Elutionslösung.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die enzyminhibierenden Polyanionen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus einem Polyphenol, einem Huminstoff, einer Huminsäure, einer Fulvosäure, einem Humin und einem Pflanzenphenol, oder Gemischen hiervon.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Umwelt- oder biologische Probe umfasst, die bevorzugt entnommen wurde von einem Nahrungsmittel, Erdboden, Sediment, Felsen, Gestein, Schlamm, Kompost, verrottenden biologischen Substanzen, einem forensischen Präparat, archäologischen Überresten, Torf, Kompost, Öl, Wasser, terrestrischem Wasser oder unterirdischem Wasser, atmosphärischem und industriellem Wasser, Staub, kommerziellen Töpfermischungen oder Erdbodenveränderungen oder Tiefseeschloten.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die schwachen Anionenaustauschergruppen ausgewählt sind aus der Gruppe aufweisend Aminomethyl (AM), Aminoethyl (AE), Methylhydroxyaminoethyl (MAE), Aminoalkyl, Alkylaminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Diethylaminoethyl (DEAE), Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin, Pentaethylenhexamin, Trimethylamino (TMA), Triethylaminoethyl (TEAE), lineares oder verzweigtes Polyethylenimin (PEI), carboxyliertes oder Hydroxyalkyliertes Polyethylenimin, Jeffamin, Tris, Bis-Tris, Spermin, Spermidin, 3-(Propylamino)propylamin, Polyamidoamin (PAMAM) Dendrimere, Polyallylamin, Polyvinylamin, N-Morpholinoethyl, Polylysin, Tetraazacycloalkane, Zyklische Amine und protonierbare aromatische Amine, wobei DEAE bevorzugt und MAE besonders bevorzugt ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix mit den schwachen Anionenaustauschergruppen eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: a) Die schwachen Anionenaustauschergruppen sind über ein Spacer an eine Matrix gebunden, der bevorzugt eine Länge von 3 bis 30 C-Atomen aufweist; b) Die Matrix ist Kieselgel mit einer mittleren Korngröße von unter 200 µm, bevorzugt von unter 100 µm und besonders bevorzugt von unter 60 µm; c) die Matrix mit den schwachen Anionenaustauschergruppen wird vor dem Inkontaktbringen gemäß Schritt i) mit einer Lösung äquilibriert, die aus Wasser, einem Tensid und/oder einen C1-C4 Alkohol besteht und bevorzugt einen pH-Wert von zwischen 4,0 bis 6,9 aufweist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Waschpuffer eine gepufferte Salzlösung ist, die eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: a) eine Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 und bevorzugt von 7,0; b) eine Anionenkonzentration von 200 mM bis 600 mM, bevorzugt von 300 bis 500 mM und besonders bevorzugt von 450 mM; c) als Salzanionen Halogenide, Phosphate, Sulfate, Cyanate Acetate und Thiocyanate; d) als Salz Guanidiniumthiocyanat; e) einen Alkohol, der bevorzugt Ethanol ist in einer Konzentration von 5 - 25 Vol.-%, bevorzugt von 10 bis 20 Vol.-% und besonders bevorzugt von 15 Vol.-%.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Elutionspuffer eine gepufferte Lithiumchlorid oder Lithiumacetat-Lösung ist, die eine der folgenden Eigenschaften aufweist: a) bei Elution von Gesamtnukleinsäure Lithiumchlorid oder Lithiumacetat in einer Konzentration von 700 bis 1500 mM bei einem pH-Wert von 7,0 bis 10,0, bevorzugt bei pH 7,5 bis 9,0 und besonders bevorzugt bei pH 8.0 und 850 mM Lithiumchlorid; b) bei Elution kurzer doppelsträngiger DNA bis ca. 3000 Basenpaare Lithiumchlorid in einer Konzentration von 1000 mM bei einem pH-Wert von 7,0; c) bei Elution von RNA bis ca. 3000 Nukleotide Lithiumchlorid in einer Konzentration von 1000 mM bei einem pH-Wert von 7,0; d) bei Elution langer doppelsträngiger DNA größer von 3000 Basenpaare Lithiumchlorid in einer Konzentration von 850 mM bei einem pH-Wert von 8,0; e) bei Elution von RNA mit mehr als 3000 Nukleotiden Lithiumchlorid in einer Konzentration von 850 mM bei einem pH-Wert von 8,0, wobei bevorzugt Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) als Puffersubstanz und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 100 mM verwendet wird; und wobei der Elutionspuffer gegebenenfalls einen C1-C4-Alkohol, der bevorzugt Ethanol oder Ispopropanol ist, in einer Konzentration von 1 bis 25 Vol.-%, bevorzugt von 10 bis 20 Vol.-% und besonders bevorzugt von 15 Vol.-% aufweist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren vor dem Inkontaktbingen in Schritt i) einen Zellaufschluß durch Behandlung der im Ausgangsmaterial enthaltenen Nukleinsäure-haltigen Zellen mit einem Lysepuffer umfasst, wobei der Zellaufschluß eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: a) der Lysepuffer enthält mindestens ein Detergens, das bevorzugt ein anionisches Detergens und besonders bevorzugt Natriumdodecylsulfat (SDS) ist, b) der Lysepuffer enthält SDS in einer Konzentration von weniger als 10% (m/v), bevorzugt von weniger als 5% (m/v) und besondes bevorzugt von weniger 3% (m/v); c) der Lysepuffer enthält einen Chelator in einer Konzentration von weniger als 500 mM, bevorzugt von weniger als 200 mM und besonders bevorzugt von weniger als 150 mM, wobei Citrat oder EDTA als Chelator bevorzugt sind; d) der Lysepuffer enhält eine Puffersubstanz, die bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe aufweisend Tris, MOPS, Acetat, Citrat, Bis-Tris und MES; e) der Lysepuffer enthält die Puffersubstanz in einer Konzentration von weniger als 500 mM, bevorzugt von weniger als 200 mM und besonders bevorzugt von weniger als 150 mM, f) der pH-Wert des Lysepuffers liegt in einem Bereich von pH 5,0 bis 9,0, bevorzugt zwischen 6,0 und 8,0 und besonders bevorzugt bei pH 7,0. g) dem Lysepuffer kann in ein Gemisch aus Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v) zugesetzt werden; h) die Zellen können durch Bead Beating, Mörsern unter flüssigem Stickstoff oder durch Erhitzen aufgeschlossen werden.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass dieses ferner nach der Elution in Schritt iii) folgendes umfasst: d) die Entsalzung und Aufkonzentrierung der eluieren Nukleinsäure durch Fällung mit Isopropanol, Abfiltration durch einen Glas-, oder Quarzfaserfilter („Silicamembran“) und optionalen Waschschritten mit anschließender Trocknung und Elution von dem Filter und/oder Analyse der Nukleinsäure.
Kit zur Isolierung von Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Kit folgendes umfasst: a) eine Anionenaustauscher-Matrix mit schwachen Anionaustauschergruppen; b) einen Waschpuffer; c) einen Lithiumchlorid oder Lithiumacetat enthaltenden Elutionspuffer; d) Anweisungen zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17.
Verwendung eines Lithiumchlorid-haltigen Elutionspuffers zur Entfernung von enzyminhibierenden Polyanionen aus einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe durch selektive Elution der an einer Anionenaustauscher-Matrix mit schwachen Anionenaustauschergruppen gebundenen Nukleinsäuren unter verbleibender Anbindung der enzyminhibierenden Polyanionen an der Anionenaustauscher-Matrix.