DE102013211075B9 - Biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und Ketonen mit Enzymen des mikrobiellen Styrolabbaus - Google Patents

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Abstract

Verfahren zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II),durch die biokatalytische Umsetzung eines Substrats mit der Formel (III) und/oder Formel (IV) ...

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von substituierten und unsubstituierten Phenylessigsäuren und Ketonen aus Styrolen und bicyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen unter Verwendung von Enzymen des mikrobiellen Styrolabbaus und die Verwendung des Verfahrens.
  • Phenylessigsäuren und strukturell verwandte Verbindungen gehören zu einer industriell bedeutsamen Verbindungsklasse. Neben der Verwendung solcher Verbindungen als Aroma- und Geschmacksstoffe (Fahlbusch et al. [Wiley-VCH 2012, 130]) haben sie aufgrund ihrer meist entzündungshemmenden, antimykotischen und antimikrobiellen Wirkung eine hohe Bedeutung für die Pharmazie und Kosmetikindustrie (Milne et al. [J. Org. Chem. 2011, 76, 9519–9524], Zhu et al. [Food Chem. 2011, 124, 298–302]). Die α-Methylphenylessigsäuren stellen u. a. wichtige Vorstufen bei der Synthese von Hepatitis C-Polymerase-Inhibitoren (Wagner et al. [J. Med. Chem. 2009, 52, 1659–1669]) sowie von Histamin-2-Rezeptor-Antagonisten (Ghorai et al. [J. Med. Chem. 2008, 51, 7193–7204]) dar. So kann aus 4-Chlor-α-methylphenylessigsäure das Anticholinergikum Hyoscyamin synthetisiert werden (Gualtieri et al. [J. Med. Chem. 1994, 37, 1704–1711]). Verschiedene Methyl-, Methoxy-, Chlor-, Fluor- sowie Brom-substituierte Phenylessigsäuren finden ebenso Anwendung als wichtige Synthesevorstufen in der Pharmazie, beispielsweise bei der Darstellung antimykotisch wirksamer Dihydrofurane (Pour et al. [Bioorg. Med Chem. 2003, 11, 2843–5866]). 4-Fluorphenylessigsäuren werden u. a. bei der Herstellung von Medikamenten gegen Störungen des Magen-Darm-Traktes, des Nervensystems, der Blasenfunktion ( US 7,683,068 B2 ) sowie zur Synthese von Präparaten zur Replikationsinhibierung des Picornavirus (Hamdouchi et al. [J. Med. Chem. 2003, 46, 4333–4341]) eingesetzt.
  • 4-Methylphenylessigsäure stellt dagegen u. a. einen wichtigen Präkursor für die Gewinnung von Wirkstoffen gegen Krebs dar (Luo et al. [Bioorg. Med. Chem. 2011, 19, 6069–6076], Wei et al. [J. Med. Chem. 2007, 50, 3674–3680]). Phenylessigsäure und ihre Derivate haben darüber hinaus eine essentielle Bedeutung als Synthesebausteine für Analgetika wie z. B. Ibuprofen und Diclofenac sowie als Vorstufen für die Synthese von Penicillinen. So kann aus p-Hydroxyphenylessigsäure das natürlich vorkommende Penicillin X synthetisiert werden (Corse et al. [J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 2837–3843]), wohingegen die unsubstituierte Phenylessigsäure als Vorstufe für Penicillin G eingesetzt wird (Douma et al. [Biotechnol. Prog. 2012, 28, 337–348]).
  • Aufgrund der vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten von Phenylessigsäure und ihren Derivaten wurden verschiedene chemische Synthesen zur Herstellung dieser Verbindungen etabliert.
  • US 4,237,314 A offenbart ein Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäure durch die Reaktion von Essigsäure und Benzol in Gegenwart von Tellurhalogenid-Katalysatoren, wobei Temperaturen zwischen 100 und 200°C sowie hohe Drücke von bis zu 15 bar notwendig sind. Neben den hohen ökonomischen und ökologischen Nachteilen basierend auf dem erheblichen Energiebedarf entsteht bei dieser Darstellungsvariante stark giftige und ätzende Bromessigsäure als Nebenprodukt.
  • US 4,220,592 A offenbart ein zweistufiges Verfahren, wobei durch Hydrolyse substituierter Acetonitrile die korrespondierende Phenylessigsäure hergestellt wird. Im Rahmen dieser Synthesestrategie lassen sich Ausbeuten von 50 bis 95% realisieren. Der hohe Verbrauch an Mineralsäuren von 60 bis 70 Gew.-% und die notwendigen Reaktionstemperaturen von bis zu 250°C kennzeichnen allerdings die erheblichen ökologischen sowie ökonomischen Nachteile dieser Synthese
  • Taqui Khan et al. (J. Mol. Catal. 1988, 44, 179–181) und Qui et al. (J. Nat. Gas Chem. 2005, 14, 40–46) offenbaren ein Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäuren basierend auf der Carbonylierung von Benzylchlorid unter Verwendung von Ruthenium(III)-EDTA-Komplexen bzw. 2-Chlorbistriphenylphosphin. Aufgrund des Entstehens von Nebenprodukten und des hohe Bedarfs an konzentrierten Säuren ist das Verfahren aus ökologischer Sicht bedenklich. Nickeltetracarbonyl- bzw. Nitrosyltricarbonylferrat-Katalysatoren erlauben ebenso die Umsetzung von Benzylchlorid zu Phenylessigsäure, wobei Ausbeuten von circa 90% erreicht werden. Allerdings erfordert auch diese Umsetzung hohe Drücke von 10 bar und eine Temperatur von 80°C (Bertleff [Wiley-VCH 2005, 13 f.]).
  • Alternativ kann Phenylessigsäure auch durch die chemische Umsetzung von Benzylalkohol bei 175°C und 71 bar in Gegenwart von Rhodiumkatalysatoren gewonnen werden (Bertleff [Wiley-VCH 2005, 13 f.]).
  • Chen et al. (J. Org. Chem. 1999, 64, 9704–9710) offenbaren ein mehrstufiges Verfahren zur Gewinnung von Phenylessigsäure-Derivaten durch die chemische Umsetzung von Styrolen mittels Hydroborierung bei –66°C und anschließender Homologisierung bei –100°C, wobei auch hier der erhebliche Energieaufwand während des Reaktionsverfahrens zu betonen ist.
  • Milne et al. (J. Org. Chem. 2011, 76, 9519–9524) offenbaren ein Verfahren zur Synthese substituierter und unsubstituierter Phenylessigsäuren durch die Jodid-katalysierte Reduktion entsprechender Mandelsäuren, wobei in Abhängigkeit der verwendeten Reduktionsmittel Ausbeuten von 41% bis 100% erzielt werden. Das Verfahren ist allerdings zeit- und energieaufwendig, da die Produkte nach einer dreitägigen Reaktion bei Temperaturen von 95°C über ein mehrstufiges Aufbereitungsverfahren isoliert werden müssen.
  • Bekannte chemische Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäure und ihren Derivaten weisen vielfach große Nachteile auf, da zum einen die Verwendung kostenintensiver Edukte, hoher Reaktionstemperaturen und Drücke sowie teils langwieriger und vielstufiger Verfahren aus ökonomischer Sicht nachteilig und zum anderen der Einsatz großer Volumina an konzentrierten Säuren und Basen ökologisch bedenklich ist. Gleichzeitig werden in vielen Fällen nur geringe Ausbeuten erreicht, wobei z. T. die Bildung toxischer Nebenprodukte in Kauf genommen werden muss.
  • Des Weiteren entstehen bei den bekannten chemischen Verfahren oft racemische Gemische, die beispielsweise für pharmazeutische Anwendung in ihre Enantiomere getrennt werden müssen. Daher sind selektive Synthesen wünschenswert, bei denen ein Enantiomer in hohem Überschuss gebildet wird.
  • Chavda et al. (Chirality 2007, 19, 366–373) offenbaren hierin ein aufwendiges, chemisches Verfahren zur enantioselektiven Synthese von 2-Phenylpropionsäure aus Tetrahydrofuran und Benzophenon.
  • Alternativ zu den vielfältigen chemischen Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäuren existieren auch einige biotechnologische Verfahren.
  • Gilligan et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993, 39, 720–725) offenbaren die Gewinnung von (S)-2-Phenylpropionsäure mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von 99% durch die enzymatische Umsetzung von (R,S)-2-Phenylpropionitril mit den Enzymen Nitril-Hydratase und Amidase aus Rhodococcus equi TG328.
  • Eine Amidase aus Agrobacterium tumefaciens d3 setzt racemisches 2-Phenylpropionamid ebenfalls stereoselektiv zu 95% in (S)-2-Phenylpropionsäure um, wobei lediglich die Hälfte des eingesetzten Eduktes umgesetzt wird (Trott et al. [Microbiology 2001, 147, 1815–1824]).
  • Sosedov et al. (Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76, 3668–3674) offenbaren die direkte Hydrolyse von Arylacetonitril zu Carbonsäuren und Ammoniak mit Hilfe einer aus Pseudomonas fluorescens EBC191 stammenden, rekombinant gewonnenen Arylacetonitrilase. Die benötigten Arylacetonitrile sind jedoch teure Ausgangstoffe.
  • Im Gegensatz dazu gehören Styrole zu einem der industriell wichtigsten Edukte für die Herstellung großtechnischer Erzeugnisse (u. a. für die Herstellung diverser Kunststoffe), weshalb sie eine kostengünstige und verfügbare Alternative zu den o. g. Edukten darstellen. Allein in den USA wurden im Jahre 1990 über 3 Millionen Tonnen Styrol hergestellt, weltweit waren es im Jahre 1996 ca. 14,7 Millionen Tonnen.
  • Es ist deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein biotechnologisches Verfahren zur Umsetzung derartiger Substrate zu substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren zyklischer Derivate bereitzustellen, das ökologisch unbedenklich und ökonomisch vorteilhaft ist.
  • Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein biokatalytisches Verfahren zur Synthese einer substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäure und/oder eines substituierten oder unsubstituierten Ketons und/oder eines bizyklischen Derivates gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder Formel (II)
    Figure DE102013211075B9_0003
    durch die biokatalytische Umsetzung eines Substrates mit der allgemeinen Formel (III) und/oder Formel (IV)
    Figure DE102013211075B9_0004
    wobei:
    • – der Substituent R1 H, OH oder ein verzweigter oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest ist,
    • – der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest ist, wobei * ein Chiralitätszentrum ist,
    • – die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C1 bis C10-Alkylrest ist,
    • – X CH2, O, NH, NRx, S oder SO2 ist,
    • – n die Zahl 0, 1 oder 2 ist und wobei für Substrate der Formel (III) R1 nicht OH ist.
    gelöst, das die folgenden Schritte umfasst:
    • a) Bereitstellung von mindestens einem Typ an Ganzzellkatalysator, enthaltend: i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist,
    in einer wässrigen Komponente,
    • b) Aktivierung des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor und/oder einem Aktivator, der zur Expression der Gene A, B und/oder C führt,
    • c) Kontaktieren des aktivierten Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV), wobei das Substrat mit mindestens einem Enzym definiert in (a) zu einem Reaktionsprodukt der Formel (I) und/oder (II) umgesetzt wird,
    • d) Isolierung mindestens eines gebildeten Reaktionsproduktes der Formel (I) und/oder (II).
  • Überraschend hat sich gezeigt, dass nach der biokatalytischen Umsetzung eines Substrates mit der allgemeinen Formel (III) oder (IV) zu einem Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II) die Reaktionsprodukte in den Ganzzellkatalysatoren nicht weiter verstoffwechselt (d. h. im Stoffwechsel des Ganzzellkatalysators abgebaut) werden und sich in der wässrigen Komponente anreichern.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren hat somit den Vorteil, dass durch die Verwendung von Ganzzellkatalysatoren bevorzugt zwei Enzyme (Styrol-Monooxygenase und Epoxid-Isomerase, 1), besonders bevorzugt alle drei Enzyme (Styrol-Monooxygenase, Epoxid-Isomerase und Aldehyd-Dehydrogenase, 1) simultan für die biokatalytische Synthese von Phenylacetaldehyd-Derivaten als Vorstufe der Phenylessigsäure und/oder ihren Derivaten, besonders bevorzugt von Phenylessigsäure und/oder ihren Derivaten gemäß der Formel (I) bzw. (II) eingesetzt werden können, da die Stabilität der genannten drei Enzyme im Rahmen der biochemischen Synthese erhöht ist und zu einer stabileren Prozessführung beiträgt. Durch die Variation der Prozessführung hinsichtlich der Form der Substratzugabe (bevorzugt über die Gasphase, direkt zum Medium, Zweiphasensystem) kann diese auf die Zelldichte und den verwendeten Organismus angepasst werden, wodurch ein optimaler biokatalytischer Umsatz von Substraten der allgemeinen Formel (III) oder (IV) und eine möglichst lange Prozesslaufzeit ermöglicht wird.
  • Die Styrol-Monooxygenase ist ein Enzym in Bakterien, das die chemische Umsetzung von Styrol mit Flavin-Adenin-Dinukleotid (FADH2) gemäß der Reaktion: Styrol + FADH2 + O2 ↔ (S)-2-Phenyloxiran + FAD + H2O als ersten Schritt des aeroben Styrol-Abbauweges (d. h. in Gegenwart von Sauerstoff) in Bakterien zum Zwischenprodukt (S)-2-Phenyloxiran (Styroloxid) katalysiert. FAD wird dabei von der Reduktase-Untereinheit der Styrol-Monooxygenase unter NADH-Verbrauch wieder regeneriert.
  • Die Epoxid-Isomerase ist ein natürlich vorkommendes Enzym, das zur Klasse der Isomerasen gehört und die chemische Umsetzung des Zwischenproduktes Styroloxid zu Phenylacetaldehyd katalysiert.
  • Die Aldehyd-Dehydrogenase ist eine Oxidoreduktase und ist ausgewählt aus einer Gruppe von Enzymen, die im Stoffwechsel von Lebewesen Aldehyde zu Carboxylaten oxidieren.
  • Bei der Epoxid-Isomerase handelt es sich um ein Cofaktor(NADH und FAD)-unabhängiges Enzym. Styrol-Monooxygenasen sind dagegen Cofaktor-abhängig, wobei FADH2 zu FAD enzymatisch umgesetzt wird. FADH2 als Energieträger im Rahmen der biokatalystischen Reaktion geht jedoch nicht verloren, da es über den enzymatischen Umsatz mit einer Aldehyd-Dehydrogenase über die Zwischenverbindung NADH regeneriert wird.
  • Vorteilhafterweise handelt es sich bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von Vertretern der allgemeinen Formel (I) und/oder Formel (II) unter Einsatz von Ganzzellkatalysatoren, die alle drei Gene A, B und C enthalten, um ein s. g. quasi Cofaktor-unabhängiges System, da die notwendigen Cofaktoren (NADH und FADH2) als Energieträger in situ regeneriert werden.
  • Die entsprechenden Gen- und Aminosäuresequenzen für die drei genannten Enzyme (Styrol-Monooxygenase, Epoxid-Isomerase und Aldehyd-Dehydrogenase) in einem Ganzzellkatalysator sind dem Fachmann bestens bekannt oder können bekannten Datenbanken (z. B. NCBI; RCSB PDB; UniProt; PDB Europa) entnommen werden.
  • Die Gene A, B und C, die für die drei genannten Enzyme kodieren, sind funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt, wobei die Promotoren identisch oder untereinander unterschiedlich sein können.
  • Erfindungsgemäß erfolgt die Aktivierung des Ganzzellkatalysators signalabhängig durch das Kontaktieren mit einem Aktivator und/oder einem Induktor, wobei die Induktion der Expression der Gene A, B und/oder C signalabhängig induziert und der Ganzzellkatalysator in seine aktive Form überführt wird. Vorzugsweise aktivieren die Aktivatoren bzw. Induktoren den regulierbaren Promotor (im Sinne der Anmeldung auch Operator genannt), in dem sie direkt mit einem regulierbaren Promotor interagieren bzw. in dem sie an ein Repressorprotein binden, das sich daraufhin vom Promotor löst. Durch das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Aktivator und/oder Induktor werden die o. g. Enzyme (Styrol-Monooxygenase, Epoxid-Isomerase und Aldehyd-Dehydrogenase) in dem Ganzzellkatalysator synthetisiert und stehen somit für die biokatalytische Umsetzung eines Substrates der Formel (III) und/oder (IV) zur Verfügung.
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung unterscheiden sich die regulierbaren Promotoren voneinander, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind. Vorteilhaft kann somit die Anwesenheit unterschiedlicher Aktivatoren und/oder Induktoren in dem Ganzzellkatalysator zur Expression ausgewählter Gene führen, wodurch der Stress für eine rekombinante Zelle minimiert wird.
  • Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen für Promotoren (bspw. T7-Promotor bei pET16-Expressionsystemen), die für ein erfindungsgemäßes Verfahren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bestens bekannt oder können bekannten Datenbanken (z. B. EPD; TRED; MPromDB) entnommen werden.
  • Bevorzugt erfolgt das Kontaktieren der Ganzzellkatalysatoren mit einem Aktivator und/oder Induktor in einer Konzentration des Aktivators und/oder Induktors bezogen auf das Gesamtvolumen der wässrigen Komponente zwischen 1 und 1000 µM, besonders bevorzugt zwischen 10 und 800 µM, ganz besonders bevorzugt zwischen 25 und 500 µM, wobei der Aktivator und/oder Induktor kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden kann.
  • Durch das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV) findet innerhalb eines Ganzzellkatalysators mit mindestens einem Enzym von Styrol-Monooxygenase, Epoxid-Isomerase und/oder Aldehyd-Dehydrogenase eine biokatalytische Umsetzung zu einem korrespondierenden Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II) statt. D. h., dass erfindungsgemäße Substrate der Formel (III) zu Reaktionsprodukten der Formel (I) bzw. Substrate der Formel (IV) zu Reaktionsprodukten der Formel (II) biokatalytisch umgesetzt werden.
  • Bevorzugt erfolgt das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV) durch das Einleiten des Substrates über die Gasphase und/oder durch direkte Zugabe zur flüssigen Komponente in Form als Flüssigkeit und/oder Feststoff. Bei direkter Zugabe zum Ganzzellbiokatalysator kann zudem eine organische Phase als Substratreservoir Anwendung finden, wodurch die Prozesslaufzeit optimiert werden kann.
  • Im Falle, dass das Substrat ein Vertreter der allgemeinen Formel (III) bzw. (IV) ist, wobei R2 nicht H ist (d. h. R2 ist ein verzweigter oder linearer C1 bis C3-Alkylrest), weisen die korrespondierenden Reaktionsprodukte der Formel (I) bzw. (II) am C-Atom mit dem Rest R2 ein Chiralitätszentrum (*) auf.
  • Alle Enantiomere und racemischen Gemische von Reaktionsprodukten der Formel (I) und (II) können durch ein erfindungsgemäßes Verfahren gebildet werden und sind dabei grundsätzlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren als mitumfasst anzusehen.
  • Dabei wurde überraschend gefunden, dass bei der biokatalytischen Umsetzung eines Substrates der allgemeinen Formel (III) bzw. (IV), wobei R2 nicht H ist, sich einzelne Enantiomere, bevorzugt in einer definierten Konfiguration, ganz besonders bevorzugt S- oder R-Konfiguration mit einem hohen Enantiomerenüberschuss bilden. Bevorzugt beträgt der Enantiomerenüberschuss mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%.
  • Alternativ bevorzugt können die Reaktionsprodukte der allgemeinen Formel (I) und/oder (II) als racemisches Gemisch mit einem Enantiomerenüberschuss zwischen 0 und 50%, bevorzugt zwischen 0 und 40% vorliegen, ganz besonders bevorzugt zwischen 0 und 30%.
  • Der Enantiomerenüberschuss (ee in %) ist definiert als ee(%) = |(R – S)| / R + S·100 wobei R und S die molare Konzentration des R- bzw. S-konfigurierten Enantiomers bedeutet und stets ein positiver Wert erhalten wird.
  • Erfindungsgemäß werden bei dem Kontaktieren von aktivierten Ganzzellkatalysatoren, die die drei Gene A, B und C enthalten, Substrate der Formel (III) eingesetzt:
    • – wobei R1 H oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest, besonders bevorzugt H oder Methyl ist,
    • – R2 H oder ein verzweigter oder linearer C1 bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Propyl) ist,
    • – R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx, besonders bevorzugt H, Halogen oder Rx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C1 bis C10-Alkylrest, besonders bevorzugt ein C1 bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy oder Isobutyl ist,
    wobei deren korrespondierende Säuren oder Ketone (d. h. wenn R1 nicht H ist) gemäß Formel (I) gebildet werden.
  • Besonders bevorzugt sind Substrate der Formel (III), wobei lediglich zwei der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 einen von H verschiedenen Substituenten (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx), ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent ist.
  • Erfindungsgemäß werden bei dem Kontaktieren von aktivierten Ganzzellkatalysatoren, die die zwei Gene A und B enthalten, Substrate der Formel (III) eingesetzt:
    • – wobei R1 H oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest, besonders bevorzugt H oder Methyl ist,
    • – R2 H oder ein verzweigter oder linearer C1 bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl oder n-Propyl) ist,
    • – R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx, besonders bevorzugt H, Halogen oder Rx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C1 bis C10-Alkylrest, besonders bevorzugt ein C1 bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy und/oder Isobutyl ist,
    wobei deren korrespondierende Aldehyde oder Ketone (d. h. R1 ist nicht OH) gemäß Formel (I) gebildet werden.
  • Besonders bevorzugt sind Substrate der Formel (III), wobei lediglich zwei der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 einen von H verschiedenen Substituenten (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx), ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent ist.
  • Erfindungsgemäß werden bei dem Kontaktieren von aktivierten Ganzzellkatalysatoren, die die Gene A, B und/oder C enthalten, vorzugsweise authentische Bakterienzellen, bizyklische Substrate der Formel (IV) eingesetzt, wobei:
    • – der Substituent R2 ein verzweigter oder linearer C1 bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl oder n-Propyl) ist,
    • – die Substituenten R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx, besonders bevorzugt H, Halogen oder Rx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C1 bis C10-Alkylrest, besonders bevorzugt ein C1 bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy und/oder Isobutyl ist.
    • – X ein CH2, O, NH, NRx, S oder SO2, besonders bevorzugt CH2, O, NH oder NRx, ganz besonders bevorzugt CH2 oder NH ist,
    • – n die Zahl 0, 1 oder 2, besonders bevorzugt die Zahl 0 oder 1 ist,
    wobei deren korrespondierende bizyklische Ketone gemäß Formel (II) gebildet werden.
  • Besonders bevorzugt sind Substrate der Formel (IV), wobei lediglich zwei der Reste R3, R4, R5 und R6 einen von H verschiedenen Substituenten (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx), ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5 und R6 ein von H verschiedener Substituent ist.
  • Das Substrat gemäß Formel (III) und/oder (IV) wird vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 0,1 und 10 mM, besonders bevorzugt zwischen 0,2 und 5 mM, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,2 und 2,5 mM in einer biokatalytischen Umsetzung eingesetzt und kann kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden.
  • Bevorzugt beträgt der Gehalt eines Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) nach der biokatalytischen Umsetzung eines Substrates der Formel (III) bzw. (IV) mindestens 30 mol-%, besonders bevorzugt mindestens 40 mol-%, ganz besonders bevorzugt mindestens 50 mol-% des Gehalts an ursprünglich zugesetztem Substrat.
  • Gegebenenfalls ist es wünschenswert, dass das Substrat und das korrespondierende Reaktionsprodukt in einem definierten Verhältnis abweichend zu dem vorgenannten Verhältnis zueinander vorliegen. In diesem Fall kann die Reaktion jederzeit unterbrochen werden.
  • Bevorzugt wird das Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II) von dem Ganzzellkatalysator in die wässrige Komponente sekretiert, wodurch die Isolierung mindestens eines Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) von der Biomasse und der wässrigen Komponente begünstigt wird.
  • Bevorzugt erfolgt die Isolierung des Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) von der Biomasse und der wässrigen Komponente schrittweise, wobei in einem ersten Schritt durch Zentrifugation oder Filtration die Biomasse von der wässrigen Komponente, enthaltend ein Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II), abgetrennt wird.
  • Vorangegangene und nachfolgende Quellennachweise sind nur insoweit aufgeführt, als dass sie für das Verständnis der Erfindung für den Fachmann notwendig sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Typ der Ganzzellkatalysatoren ausgewählt aus rekombinanten (d. h. genetisch veränderten) und/oder authentischen Bakterienzellen.
  • Die Methoden zur Kultivierung rekombinanter und/oder authentischer Bakterienzellen sind dem Fachmann bekannt, wobei die Bakterienzellen kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fedbatch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Anzucht oder der biokatalytischen Umsetzung eines Substrates mit der allgemeinen Formel (III) bzw. Formel (IV) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
  • Die zu verwendende wässrige Komponente muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Bakterienstämme genügen. Beschreibungen von wässrigen Komponenten (z. B. Kulturmedien) verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) beschrieben.
  • Die aus den genannten Schriften als bekannt vorausgesetzten Einsatzstoffe (z. B. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Metallsalze) können zu der wässrigen Komponente in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugeführt werden. Zur pH-Wert-Kontrolle der wässrigen Komponente werden basische Verbindungen wie z. B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie z. B. Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise und/oder Pufferverbindungen wie z. B. Hydrogenphosphatsalze, TRIS eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können der wässrigen Komponente geeignete, selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika (z. B. Chloramphenicol, Ampicillin, Kanamycin) hinzugefügt werden. Bevorzugt werden Bakterienzellen mit teilweise inaktivierten Stoffwechselwegen (bspw. auxotrophe Mutanten) verwendet, wobei auf einem (Expressions-)Vektor, enthaltend mindestens ein Gen A, B und/oder C, u. a. Gene zur Komplettierung unvollständiger Stoffwechselwege enthalten sind. Um aerobe Bedingungen aufrecht zu erhalten werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die wässrige Komponente eingetragen.
  • Die bakterielle Biomasse in Form von Bakterien kann demnach durch eine dem Fachmann bekannte Weise der Kultivierung (Anzucht) erhalten werden, beispielsweise durch Kultivierung in LB-Medium, vorzugsweise jedoch durch Kultivierung in einem Medium, das die Erzeugung hoher Zelldichten, insbesondere größer als 1 × 109 Zellen pro mL, zulässt. Die Anzucht erfolgt vorzugsweise in laborüblichen Schüttelkolben, zur Erzeugung größerer Mengen an bakterieller Biomasse ist aber auch die Anzucht unter kontrollierten Bedingungen im Fermenter möglich.
  • Bevorzugt erfolgt die Kultivierung der authentischen und/oder rekombinanten Bakterienzellen unter physiologischen Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 0 und 60°C, bevorzugt zwischen 10 und 50°C, besonders bevorzugt zwischen 20 und 40°C, wobei der pH-Wert der wässrigen Komponente bevorzugt zwischen 5,8 und 8,5, besonders bevorzugt zwischen 6,8 und 8,0 liegt.
  • Erfindungsgemäß werden für ein erfindungsgemäßes Verfahren authentische Bakterienzellen von Wildtypstämmen verwendet, wobei die Wildtypstämme aus Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis und Corynebacterium, besonders bevorzugt aus Rhodococcus opacus 1CP, Rhodococcus species ST-5, Pseudomonas fluorescens ST, Corynebacterium species AC-5, Pseudomonas putida CA-3 und Pseudomonas putida S12 ausgewählt sind.
  • Bevorzugt enthalten authentische Bakterienzellen alle drei Gene A, B und C, die für die Enzyme Styrol-Monooxygenase, Epoxid-Isomerase und Aldehyd-Dehydrogenase kodieren, wobei alle drei Gene A, B und C funktionell unter die Kontrolle eines identischen Promotors bzw. Operators gestellt sind.
  • Vorteilhaft entsprechen die verwendeten authentischen Bakterienzellen, die für ein erfindungsgemäßes Verfahren zur biokatalytischen Synthese von Phenylessigsäure und/oder deren Derivate eingesetzt werden können, laut Listen der ZKBS (Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit) der Risikoklasse 1 und sind demzufolge als nicht pathogen für Mensch und Tier gekennzeichnet. Da es sich um natürlich vorkommende Isolate handelt, setzt ihre Handhabung keine Gentechnikzulassung voraus.
  • Erfindungsgemäß sind die rekombinanten Bakterienzellen, die zur biokatalytischen Synthese von Vertretern der Formel (I) und/oder (II) aus Substraten der Formel (III) und/oder (IV) befähigt sind, Negativmutanten authentischer Bakterienzellen.
  • Erfindungsgemäß sind die rekombinanten Bakterienzellen Negativmutanten (d. h. Knock-Out-Mutanten oder Deletionsmutanten) der o. g. Wildtypstämme (d. h. authentische Bakterienzellen, die natürlicherweise die drei Gene A, B und C aufweisen), wobei ein Gen A, B und/oder C, bevorzugt das Gen C teilweise oder komplett deletiert und/oder gegen ein modifiziertes Gen ausgetauscht ist. Im Sinne der Erfindung wird der Begriff Negativmutante synonym für die Begriffe Deletionsmutante und Knockout-Mutante verwendet.
  • Im Falle, dass unsubstituierte Phenylessigsäuren gewonnen werden soll, sind die rekombinanten Bakterienzellen bevorzugt Negativmutanten (d. h. Knock-Out-Mutanten oder Deletionsmutanten), bei denen ein Gen, das für der Phenylacetyl-CoA-Ligase kodiert, teilweise oder komplett deletiert ist.
  • Alternativ erfolgt die Generierung rekombinanter Bakterienzellen durch die Einbringung von Nukleotidsequenzen der Gene A, B und/oder C durch Genom-Insertion oder Einbringung von Expressionsvektoren in Bakterienzellen, wobei s. g. Insertionsmutanten gebildet werden. Vorzugsweise sind Insertionsmutanten natürlicherweise nicht zur biokatalytischen Synthese von Vertretern der Formel (I) und/oder (II) befähigt, da sie ursprünglich keine Nukleotidsequenz der Gene A, B und/oder C enthalten. Potentielle Wirtsorganismen für Insertionsmutanten sind bevorzugt ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Corynebacterium und Bacillus.
  • Durch die gezielte Insertion ausgewählter Nukleotidsequenzen der Gene A, B und/oder C in eine Bakterienzelle können vorteilhaft die Umsatzraten, die Ausbeute und die Enantiomerenüberschüsse bei der erfindungsgemäßen biokatalytischen Umsetzung von Substraten der Formel (III) und/oder (IV) gesteigert werden. Die Nukleotidsequenzen der Gene A, B und C umfassen dabei authentische und/oder artifizielle Leserahmen. Bevorzugt ist ein artifizieller Leserahmen über eine Gensynthese an das "Codon Usage" des Wirtsorganismus angepasst.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind die zu insertierenden Nukleotidsequenzen so konzipiert, dass sie zwischen den Genen A, B und/oder C Nukleotidsequenzen aufweisen, die für authentische oder artifizielle Aminosäurelinker kodieren, so dass durch die Expression rekombinante Enzyme in Form von Heterodimeren oder Heterotrimeren gebildet werden, wobei die Enzyme (Styrol-Monooxygenase, Epoxid-Isomerase und/oder Aldehyd-Dehydrogenase) über Linkersequenzen miteinander kovalent verbunden sind.
  • Prinzipiell können geeignete Gene A, B und/oder C durch an sich bekannte Methoden, wie beispielsweise die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit Hilfe von kurzen, synthetischen Nukleotidsequenzen (Primern) amplifiziert und anschließend isoliert werden. Die Herstellung der verwendeten Primer erfolgt im Allgemeinen anhand bekannter Gensequenzen aufgrund bestehender Homologien zu den Genen A, B und/oder C.
  • Idealerweise weist der Vektor für die Klonierung eines amplifizierten Gens A, B und/oder C eine geringe Molekülmasse auf und besitzt selektierbare Gene, um in einer Zelle zu einem leicht erkennbaren Phänotyp zu führen, so dass eine einfache Selektion von vektorhaltigen und vektorfreien Wirtszellen möglich ist. Um eine hohe Ausbeute an DNA und entsprechenden Genprodukten zu erhalten, sollte der Vektor einen starken Promotor und/oder Regulatorsequenzen aufweisen. Für eine Replikation des Vektors ist zudem ein Replikationsursprung wichtig. Beispielsweise sind u. a. pET-Vektorsysteme basierend auf einer Antibiotikaselektion geeignet.
  • Bei der Verwendung von authentischen Bakterienzellen als Ganzzellkatalysator ist der Induktor und/oder Aktivator bevorzugt ausgewählt aus Styrol, Styroloxid und/oder Phenylacetaldehyd, ganz besonders bevorzugt Styrol und/oder Styroloxid.
  • Bevorzugt ist die Epoxid-Isomerase eine Styroloxid-Isomerase mit der EC-Nr.: 5.3.99.7 und die Aldehyd-Dehydrogenase eine Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase mit der EC-Nr.: 1.2.1.39.
  • Bevorzugt erfolgt die Isolierung des Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) durch Extraktion der wässrigen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe der Phthalsäureester, besonders bevorzugt Bis(2-ethylhexyl)phthalat, 1,2-Cyclohexandicarbonsäurediisononylester und Mesamoll®, und/oder der aliphatischen verzweigten und/oder linearen Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit 5 bis 16 Kohlenstoffatomen, wie z. B. n-Pentan, Cyclopentan, n-Hexan, Cyclohexan, n-Heptan, n-Octan, Cyclooctan, n-Decan, n-Dodecan oder n-Hexadecan. Bevorzugt dienen die genannten organischen Lösungsmittel in einem einphasigen, wässrigen System zur Extraktion nach dem Umsatz eines Substrates der Formel (III) bzw. (IV). Alternativ dienen die genannten organischen Lösungsmittel in einem zweiphasigen System in Form einer zweiten Phase neben der wässrigen Komponente als Reservoir für ein Substrat der Formel (III) bzw. (IV) und/oder zur Abtrennung von Reaktionsprodukt der Formel (I) und (II), bevorzugt von substituierten oder unsubstituierten Ketonen und/oder bizyklischen Derivaten, ganz besonders bevorzugt von bizyklischen Derivaten der Formel (II).
  • Für die Extraktion des Produktes nach dem Umsatz eignen sich darüber hinaus halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit einem oder zwei Kohlenstoffatomen, wie z. B. Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan oder Tetrachlorethan, aliphatische acyclische und cyclische Ether, vorzugsweise mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Diethylether, Methyl-tert-butylether, Ethyl-tert-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Tetrahydrofuran oder Ester wie z. B. Ethylacetat oder n-Butylacetat oder Ketone wie z. B. Methylisobutylketon oder Dioxan oder Gemische davon.
  • Die Isolierung des Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) durch Extraktion der wässrigen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel erfolgt vorzugsweise nach der Abtrennung des Ganzzellkatalysators in Form von Biomasse von der wässrigen Komponente, wobei die Abtrennung des Ganzzellkatalysators in Form von Biomasse von der wässrigen Komponente bevorzugt durch Zentrifugation oder Filtration erfolgt.
  • Bevorzugt erfolgt die Extraktion von Reaktionsprodukten der Formel (I), wobei R1 = OH ist, und der Formel (II) mit einem organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert zwischen 0 und 8, besonders bevorzugt zwischen 1 und 7, ganz besonders bevorzugt zwischen 2 und 6, wobei vorteilhaft hohe Extraktionsverhältnisse erzielbar sind. Definitionsgemäß ist das Extraktionsverhältnis ein Maß für die Effizienz der Extraktion und gibt an, wie viel Produkt (in g) das organische Lösungsmittel im Verhältnis zum Gesamtgehalt an Produkt aufgenommen hat. Je größer dieser Wert wird, desto besser extrahiert ein organisches Lösungsmittel das Produkt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Extraktionsverhältnis größer 4:1, besonders bevorzugt größer 6:1 und am meisten bevorzugt größer 8:1.
  • Gegebenenfalls erfolgt zur Aufreinigung des Reaktionsproduktes der Formel (I) und/oder (II) im Anschluss an die Extraktion eine Destillation, wobei bevorzugt das organische Lösungsmittel abgetrennt wird. Bevorzugt erfolgt die Abtrennung des organischen Lösungsmittels durch Verdampfung bei einem Druck zwischen 0,1 und 1000 mbar, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 750 mbar, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 400 mbar.
  • Alternativ zur Extraktion von Produkten der Formel (I), wobei R1 = OH ist, aus der wässrigen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel kann die Extraktion der wässrigen Komponente auch mit pH-Wert abhängigen Methoden der Festphasenextraktion durchgeführt werden. Beispielsweise können nach der Einstellung eines alkalischen pH-Werts in der flüssigen Komponente Anionenaustauscher oder bei sauren pH-Bereichen hydrophobe Adsorberharze als Adsorber verwendet werden.
  • Bevorzugt erfolgt die biokatalytische Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder substituierten oder unsubstituierten Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate der Formel (I) und/oder (II) in einem einphasigen, wässrigen System oder in einem zweiphasigen System.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung findet das biokatalytische Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäure und/oder ihren Derivaten der Formel (I) und/oder (II) in einem zweiphasigen System statt. Dabei werden organische Lösungsmittel, wie bereits oben genannt oder ionische Flüssigkeiten, die beide substanziell nicht mit Wasser mischbar sind, als zweite organische Phase verwendet, wobei sich bevorzugt das Substrat in der organischen Phase akkumuliert. Beispiele bekannter zweiphasiger Systeme sind in den Schriften von Panke et al. (Biotechnol. Bioeng. 2000, 69, 91–100) und Wubbolts et al. (Enzyme Microb. Technol. 1994, 16, 887–894) beschrieben.
  • Unter substanziell nicht mit Wasser mischbare organische Phasen werden organische Phasen verstanden, die weniger als 1 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 0,5 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Gesamtgewicht der organische Phasen enthalten.
  • Bevorzugt werden als Substrate für die biokatalytische Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen gemäß der Formel (I) Vertreter der Formel (III) eingesetzt, wobei:
    • – der Substituent R1 H oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest ist,
    • – der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest ist,
    • – die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH oder Rx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C1 bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy oder Isobutyl ist,
    wobei ausschließlich maximal zwei der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx) sind, ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent ist.
  • Beispielsweise ist ein Substrat der allgemeinen Formel (III) ganz besonders bevorzugt:
    • – 2-Fluorstyrol, 3-Fluorstyrol oder 4-Fluorstyrol, 2-Fluor-α-alkylstyrol, 3-Fluor-α-alkylstyrol, 4-Fluor-α-alkylstyrol
    • – 2-Chlorstyrol, 3-Chlorstyrol oder 4-Chlorstyrol, 2-Chlor-α-alkylstyrol, 3-Chlor-α-alkylstyrol, 4-Chlor-α-alkylstyrol
    • – 2-Bromstyrol, 3-Bromstyrol oder 4-Bromstyrol, 2-Brom-α-alkylstyrol, 3-Brom-α-alkylstyrol, 4-Brom-α-alkylstyrol
    • – 2-Iodstyrol, 3-Iodstyrol oder 4-Iodstyrol, 2-Iod-α-alkylstyrol, 3-Iod-α-alkylstyrol, 4-Iod-α-alkylstyrol
    • – 2-Isobutyl-α-alkylstyrol, 3-Isobutyl-α-alkylstyrol, 4-Isobutyl-α-alkylstyrol
    • – 2-Methylstyrol, 3-Methylstyrol oder 4-Methylstyrol, 2-Methyl-α-alkylstyrol, 3-Methyl-α-alkylstyrol, 4-Methyl-α-alkylstyrol
    wobei die Bezeichnung „Alkyl-“ für einen verzweigten oder linearen C1 bis C3-Alkylrest steht.
  • Bevorzugt werden als bizyklische Substrate für die biokatalytische Synthese von substituierten oder unsubstituierten bizyklischen Derivaten gemäß der allgemeinen Formel (II) Vertreter der Formel (IV) eingesetzt, wobei:
    • – der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder linearer C1 bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl oder n-Propyl) ist,
    • – die Substituenten R3, R4, R5 und R6 und unabhängig voneinander H, Halogen, OH oder Rx sind, wobei Rx gegebenenfalls ein substituierter und/oder verzweigter C1 bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy oder Isobutyl ist,
    • – X ein CH2, O, NH oder NRx, ganz besonders bevorzugt CH2 oder NH ist,
    • – n die Zahl 0, 1 oder 2, besonders bevorzugt die Zahl 0 oder 1 ist.
    wobei ausschließlich maximal zwei der Reste R3, R4, R5 und R6 ein von H verschiedener Substituent (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx) sind, ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5 und R6 ein von H verschiedener Substituent ist.
  • Beispielsweise ist ein Substrat der allgemeinen Formel (IV) ganz besonders bevorzugt:
    • – ein Indol (das zu Indigo als finales Produkt weiterreagiert, vgl. O'Connor et al. [Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 4287–4291])
    • – ein Inden
    • – ein 3,4-Dihydronaphthalen
  • Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich insbesondere vorteilhaft auch die folgenden Vertreter von Reaktionsprodukten der allgemeinen Formeln (I) und (II) biokatalytisch synthetisieren:
    • – 4-Chlor-, 4-Fluor- und 4-Methylphenylessigsäure
    • – α-Methylphenylessigsäure und 4-Chlor-α-methylphenylessigsäure
    • – (RS)-2-(4-Isobutylphenyl)propionsäure
  • Es sei angemerkt, dass die erfindungsgemäßen Ausgestaltungen in jeder Anordnung miteinander kombinierbar sind.
  • Die Erfindung umfasst auch rekombinante Bakterienzellen zur biokatalytischen Synthese substituierter oder unsubstituierter Phenylessigsäure und/oder deren zyklischer Derivate gemäß der Formel (III) und/oder Formel (IV) enthaltend:
    • i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist,
    • ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und
    • iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist.
  • Erfindungsgemäß sind die rekombinante Bakterienzellen Negativmutanten authentischer Bakterienzellen.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung enthalten die Gene A, B und/oder C der Negativmutanten artifizielle Leserahmen.
  • Bevorzugt unterscheiden sich die regulierbaren Promotoren der Negativmutanten voneinander, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind. Vorteilhaft kann somit die Anwesenheit unterschiedlicher Aktivatoren und/oder Induktoren im Ganzzellkatalysator zur Expression ausgewählter Gene A, B und/oder C führen, wodurch der Stress in Folge der Genexpression für eine rekombinante Zelle minimiert wird. Geeignet sind u. a. handelsübliche Systeme basierend auf dem lac-Operon, auf T7-Promotoren, auf trp- und phoA- sowie araB-Regulatoren, wobei die Induktion je nach System mit IPTG, Tryptophan, durch Phosphatmangel oder mit Arabinose realisiert werden kann.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II) enthaltend:
    • a) mindestens einen Typ an Ganzzellkatalysatoren, bevorzugt eine Typ rekombinanter Bakterienzellen in einer wässrigen Komponente und/oder
    • b) mindestens einen Typ kryokonservierter Ganzzellkatalysatoren, bevorzugt einen Typ rekombinanter Bakterienzellen.
  • Gegenstand der Erfindung sind auch authentische Bakterienzellen zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II), wobei die authentischen Bakterienzellen ausgewählt sind aus Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis und Corynebacterium, besonders bevorzugt aus Rhodococcus opacus 1CP, Rhodococcus species ST-5, Pseudomonas fluorescens ST, Corynebacterium species AC-5, Pseudomonas putida CA-3 und Pseudomonas putida S12.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Negativmutanten für ein erfindungsgemäßes Verfahren oder ein erfindungsgemäßes Kit.
  • Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
  • 1: Metabolisierung des Styrols durch Seitenkettenoxidation durch die Enzyme Styrol-Monooxygenase (SMO), Styroloxid-Isomerase (SOI) und Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase (PAADH), wobei die gebildete Phenylessigsäure über anschließende Zwischenschritte dem Tricarbonsäurezyklus (TCC) zugeführt wird (basierend auf Velasco et al. [J. Bacteriol. 1998, 180, 1063–1071]).
  • 2: Umsatz substituierter Styrole unter Verwendung von Pseudomonas fluorescens ST als authentischen Ganzzellkatalysator, wobei die Produktkonzentrationen [mM] nach 12 h ausgehend von 1,25 mM Substrat dargestellt sind.
  • 3: Umsatz substituierter Styrole unter Verwendung von Sphingopyxis sp. Kp5.2 als authentischen Ganzzellkatalysator, wobei die Produktkonzentrationen [mM] nach 12 h ausgehend von 1,25 mM Substrat dargestellt sind.
  • 4: Umsatz von 4-Chlorstyrol unter Verwendung von Pseudomonas fluorescens ST als authentischen Ganzzellkatalysator, wobei die Stoffmengen [µmol] von Substrat und Produkt über einen Zeitraum von 186 Tagen dargestellt sind.
  • Beispiel 1 Synthese substituierter Phenylessigsäuren mit Pseudomonas fluorescens ST
  • Ein 1L-Kolben mit 200 mL Minimalmedium und einmalig 0,05% Hefe sowie 5 mM Glukose (als Kohlenstoffquelle) wurde mit einer Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Pseudomonas fluorescens ST) inokuliert und nachfolgend die Biomasse mit Glukose auf eine OD600 (Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm) von ca. 1,5 herangezogen. Anschließend wurde die Biomasse für mind. 3 Tage mit täglich 17–26 pmol Styrol (als Induktor) induziert, zuvor wurde jeweils der Kolben entsprechend belüftet. Die Zugabe des Styrols erfolgte über die Gasphase unter Verwendung eines Verdampferaufsatzes. Nachfolgend wurden die Zellen mittels Zentrifugation bei 4°C und 5000 × g (30 min) geerntet. Das Pellet wurde im Folgenden 2× mit 50 mL einer 25 mM Phosphatpufferlösung (pH = 7) gewaschen und anschließend in einem geeigneten Volumen an Phosphatpuffer (25 mM; pH = 7) aufgenommen. Über einen Verdampferaufsatz konnten nachfolgend die verschiedenen Substrate über die Gasphase zugegeben werden. Der Umsatz erfolgte bevorzugt bei 30°C und 120 rpm.
  • Im Vorversuch konnten mit einer Zellsuspension (OD600 = 1; Zelltrockenmasse ca. 0,6 mg/mL) bei einmaliger Zugabe von jeweils 1,25 mM Substrat nach unvollständiger Umsetzung des Substrates innerhalb von 12 h die in Tabelle 1 und 2 angegebenen Produktkonzentrationen im Kulturmedium nachgewiesen werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei diesem Beispiel um eine Testtransformation zur Untersuchung des Substratspektrums handelt, welches durch einen Typ von Ganzzellkatalysatoren umgesetzt werden kann. Die angegebenen Ausbeuten sind dabei nicht die finalen Ausbeuten, wie sie nach Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden. (siehe Ausführungsbeispiel 3). Tabelle 1: 12-stündige Ausbeuten beim Umsatz von Styrolen mit Zellen von Pseudomonas fluorescens ST
    Substrat Produkt Produkt-Konzentration [µM] unvollständige Ausbeute [%] nach 12 h
    Styrol Phenylessigsäure 0 0
    3-Chlorstyrol 3-Chlorphenylessigsäure 140 11,2
    4-Chlorstyrol 4-Chlorphenylessigsäure 320 25,6
    4-Fluorstyrol 4-Fluorphenylessigsäure 475 38,0
    α-Methylstyrol α-Methylphenylessigsäure 290 23,2
    4-Chlor-α-methylstyrol 4-Chlor-α-methylphenylessigsäure 105 8,4
  • Beispiel 2 – Synthese substituierter Phenylessigsäuren mit dem Isolat Sphingopyxis sp. Kp5.2
  • Ein 1L-Kolben mit 200 mL Minimalmedium und einmalig 0,05% Hefe sowie 5 mM Glukose (als Kohlenstoffquelle) wurde mit einer Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Sphingopyxis sp. Kp5.2) inokuliert und nachfolgend die Biomasse mit Glukose auf eine OD600 von ca. 0,8 herangezogen. Anschließend wurde die Biomasse für mind. 3 Tage mit täglich 17–26 pmol Styrol (als Induktor) induziert, zuvor wurde jeweils der Kolben entsprechend belüftet. Die Zugabe des Styrols erfolgte über die Gasphase unter Verwendung eines Verdampferaufsatzes. Nachfolgend wurden die Zellen mittels Zentrifugation bei 4°C und 5000 × g (30 min) geerntet. Das Pellet wurde im Folgenden 2× mit 50 mL einer 25 mM Phosphatpufferlösung (pH = 7) gewaschen und anschließend in einem geeigneten Volumen an Phosphatpuffer (25 mM; pH = 7) aufgenommen. Über einen Verdampferaufsatz konnten nachfolgend die verschiedenen Substrate über die Gasphase zugegeben werden. Der Umsatz erfolgte bevorzugt bei 30°C und 120 rpm.
  • Im Vorversuch konnten mit einer Zellsuspension (OD600 = 1; Zelltrockenmasse ca. 1,0 mg/mL) bei einmaliger Zugabe von jeweils 1,25 mM Substrat nach unvollständiger Umsetzung des Substrates innerhalb von 12 h die in Tabelle 2 und 3 angegebenen Produktkonzentrationen im Kulturmedium nachgewiesen werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei diesem Beispiel um eine Testtransformation zur Untersuchung des Substratspektrums, welches durch einen Typ von Ganzzellkatalysatoren umgesetzt werden kann. Die angegebenen Ausbeuten sind dabei nicht die finalen Ausbeuten, wie sie nach Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden. (siehe Ausführungsbeispiel 3). Tabelle 2: 12-stündige Ausbeuten beim Umsatz von Styrolen mit Zellen von Sphingopyxis sp. Kp5.2
    Substrat Produkt Produkt-Konzentration [µM] unvollständige Ausbeute [%] nach 12 h
    Styrol Phenylessigsäure 43 3,4
    3-Chlorstyrol 3-Chlorphenylessigsäure 100 8,0
    4-Chlorstyrol 4-Chlorphenylessigsäure 102 8,2
    4-Fluorstyrol 4-Fluorphenylessigsäure 97 7,8
    α-Methylstyrol α-Methylphenylessigsäure 156 12,5
    4-Chlor-α-methylstyrol 4-Chlor-α-methylphenylessigsäure 19 1,5
  • Beispiel 3 – Langzeitversuch zur Synthese von 4-Chlor-Phenylessigsäure mit Pseudomonas fluorescens ST
  • Ein 1L-Kolben mit 200 mL Minimalmedium, einmalig 0,05% Hefe sowie 5 mM Glukose wurden mit Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Pseudomonas fluorescens ST) inokuliert und Biomasse durch Zugabe von Glukose auf eine OD600 von 1 angezogen. Nachfolgend wurde der Kolbeninhalt steril mittels Zentrifugation geerntet (4°C, 5000 × g, 30 min), das Pellet mit sterilem Wasser oder 25 mM Phosphatpuffer (pH = 7) gewaschen und nachfolgend in einem geeigneten Volumen Minimalmedium resuspendiert. Nachfolgend wurde die wässrige Komponente mit den Ganzellkatalysatoren für 6 Tage in Anwesenheit von Styrol (als Induktor) inkubiert. Die Induktion mit Styrol erfolgte in diesem Beispiel erst nach der Ernte und dem Waschschritt, kann aber auch bereits im Vorfeld erfolgen. Styrol wurde dabei über die Gasphase mittels Verdampferaufsatz zugefüttert (ca. 17–26 µmol aller 1–3 Tage, vor jeder erneuten Fütterung wurde der Kolben belüftet). Nachfolgend wurde über einen Zeitraum von einigen Monaten neben ca. 17 µmol Styrol (als Energiequelle und Induktor) das Substrat 4-Chlorstyrol in Portionsgrößen von 20–40 µmol über die Gasphase zugegeben. Das Reaktionsprodukt 4-Chlorphenylessigsäure konnte in der wässrigen Komponente nachgewiesen werden.
  • Im Vorversuch konnte mit einer eingesetzten Zellsuspension (OD600 = 0,8; Zelltrockenmasse ca. 0,4–0,5 mg/mL) nach 20 Tagen eine Stoffmenge von 260 µmol Reaktionsprodukt nach Zugabe von 308 µmol Substrat erreicht werden, was einer Ausbeute von ca. 85% entspricht. Nach 60 Tagen entsprach die Stoffmenge der gebildeten Phenylessigsäure ca. 670 µmol nach Zugabe von 750 µmol Substrat (Ausbeute > 85%). Binnen 120 Tagen konnten 1260 µmol Reaktionsprodukt aus 1390 µmol Substrat umgesetzt werden, was einer Ausbeute von bis zu 90% entspricht. Die erreichte Konzentration betrug dabei 8,4 mM. Der Verlauf der Transformation ist in 4 dargestellt. Die sich langsam einstellende Divergenz zwischen gefüttertem Substrat und gebildetem Produkt ist auf eine Inaktivierung des Ganzzellkatalysators zurückzuführen, allerdings über den gesamten Beobachtungszeitraum nur schwach ausgeprägt.
  • Beispiel 4 – Stereoselektiver Umsatz von 4-Chlor-α-methylstyrol mit Pseudomonas fluorescens ST
  • Kultivierung und Gewinnung eines Typs an Ganzzellkatalysatoren erfolgte wie in Ausführungsbeispiel 3 angegeben. Nach Induktion der Biomasse mit Styrol über die Gasphase wurde nachfolgend über einen Zeitraum von einigen Tagen neben ca. 17 µmol Styrol (als Energiequelle und Induktor) das Substrat 4-Chlor-α-methylstyrol in Portionsgrößen von 20–40 µmol über die Gasphase zugegeben. Das Reaktionsprodukt 4-Chlor-α-methylphenylessigsäure konnte im Kulturmedium nachgewiesen werden.
  • Im Vorversuch konnten mit der verwendeten Zellsuspension (OD600 0,8; Zelltrockenmasse ca. 0,4–0,5 mg/mL) nach 14 Tagen ca. 80 µmol Reaktionsprodukt nach Zugabe von 220 µmol Substrat nachgewiesen werden, was einer Ausbeute von ca. 36% entspricht. Die erreichte Konzentration betrug dabei 0,4 mM. Die Reaktion erwies sich mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von 75–80% als ausgesprochen enantioselektiv. Letzteres war auf Grundlage der Literatur über die beteiligten Enzyme des hier angewandten Ganzzellkatalysators nicht vorhersehbar.

Claims (13)

  1. Verfahren zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II),
    Figure DE102013211075B9_0005
    durch die biokatalytische Umsetzung eines Substrats mit der Formel (III) und/oder Formel (IV)
    Figure DE102013211075B9_0006
    wobei: – der Substituent R1 H, OH oder ein verzweigter oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest ist, – der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest ist, wobei * ein Chiralitätszentrum ist, – die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter C1 bis C10-Alkylrest ist, – X CH2, O, NH, NRx, S oder SO2 ist, – n die Zahl 0, 1 oder 2 ist, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung von mindestens einem Ganzzellkatalysator, ausgewählt aus den authentischen Bakterienzellen Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis und Corynebacterium und/oder Negativmutanten davon enthaltend: i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, in einer wässrigen Komponente, b) Aktivierung des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor und/oder einem Aktivator, der zur Expression der Gene definiert in (a) führt, c) Kontaktieren des aktivierten Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV), wobei das Substrat mit mindestens einem Enzym definiert in (a) zu einem Reaktionsprodukt der Formel (I) und/oder (II) umgesetzt wird, wobei das Reaktionsprodukt der Formel (I) und/oder (II) in dem Ganzzellkatalysator nicht weiter verstoffwechselt wird und sich in der wässrigen Komponente anreichert, d) Isolierung mindestens eines gebildeten Reaktionsproduktes der Formel (I) und/oder (II).
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Induktor Styrol, Styroloxid und/oder Phenylacetaldehyd ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Epoxid-Isomerase eine Styroloxid-Isomerase und die Aldehyd-Dehydrogenase eine Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung des Produktes durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel oder mittels Festphasenextraktion erfolgt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die biokatalytische Synthese von Vertretern der Formel (I) und/oder Formel (II) in einem einphasigen wässrigen System oder in einem zweiphasigen System erfolgt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat Vertreter der Formel (III) eingesetzt werden, wobei: – der Substituent R1 H oder ein verzweigter oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest ist, – der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder ein linearer C1 bis C3-Alkylrest ist, – die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH oder Rx sind, wobei Rx ein C1 bis C5-Alkylrest ist wobei ausschließlich maximal zwei der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent sind.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als bizyklisches Substrat Vertreter der Formel (IV) eingesetzt werden, wobei: – der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder linearer C1 bis C3-Alkylrest ist, – die Substituenten R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander H, Halogen, OH oder Rx sind, wobei Rx ein C1 bis C5-Alkylrest ist, – X ein CH2, O, NH oder NRx ist, – n die Zahl 0, 1 oder 2 ist. wobei ausschließlich maximal zwei der Reste R3, R4, R5 und R6 ein von H verschiedener Substituent sind.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Enantiomerenüberschuss des Reaktionsproduktes mindestens 70% beträgt.
  9. Negativmutanten authentischer Bakterienzellen zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II) enthaltend: i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, wobei die authentischen Bakterienzellen ausgewählt sind aus Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis und Corynebacterium.
  10. Negativmutante gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sich die regulierbaren Promotoren voneinander unterscheiden, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind.
  11. Kit zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II) enthaltend: a) mindestens einen Typ rekombinanter Negativmutanten authentischer Bakterienzellen gemäß Anspruch 9 oder 10 in einer wässrigen Komponente und/oder b) mindestens einen Typ kryokonservierter, Negativmutanten authentischer Bakterienzellen gemäß Anspruch 9 oder 10.
  12. Verwendung authentischer Bakterienzellen zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II), dadurch gekennzeichnet, dass die authentischen Bakterienzellen ausgewählt sind aus Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis und Corynebacterium.
  13. Verwendung von Negativmutanten nach Anspruch 9 oder 10 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einem Kit nach Anspruch 11.
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1. ARIANE, BORN: Etablierung und Optimierung der Error-Prone-PCR und eines Aktivitätsscreenings für Styrol-Monooxygenasen. 2011. Diplomarbeit an der Technischen Universität, Bergakademie Freiberg. *
1. ARIANE, BORN: Etablierung und Optimierung der Error-Prone-PCR und eines Aktivitätsscreenings für Styrol-Monooxygenasen. 2011. Diplomarbeit an der Technischen Universität, Bergakademie Freiberg.
2. VELASCO, A.; [u. a.]: Genetic and functional analysis of the styrene catabolic cluster of Pseudomonas sp. Strain Y2. 1998. In: Journal of Bacteriology, Vol. 180, S. 1063-1071. *
2. VELASCO, A.; [u. a.]: Genetic and functional analysis of the styrene catabolic cluster of Pseudomonas sp. Strain Y2. 1998. In: Journal of Bacteriology, Vol. 180, S. 1063-1071.

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