DNA
ist ein Nukleinsäure-Makromolekül, aufgebaut
aus aufeinanderfolgenden Basen Adenin (A) und Thymin (T), sowie
Guanin (G) und Cytosin (C), wobei A und T und C und G jeweils im
Verhältnis
1:1 darin vorkommen. Die Basenpaare A, T und G, C ergänzen einander
komplementär.
Die Abfolge der einzelnen Basen innerhalb eines DNA-Moleküls stellt
einen genetischen Code dar. Der in der DNA von Lebewesen befindliche genetische
Code ist die Grundlage der Proteinbiosynthese. Im ersten Schritt
zur Proteinbiosynthese wird die Basenfolge eines DNA-Stranges in
die komplementäre
Basenfolge eines Boten-RNA-Stranges, auch mRNA genannt, umgeschrieben.
Eine bestimmte Basenabfolge wird auch als Sequenz bezeichnet. Jedes
Gen hat eine andere Sequenz, die Teilsequenzen aufweisen kann, die
in vielen Genen vorkommen, aber auch Teilsequenzen, die einzigartig
oder charakteristisch für
das jeweilige Gen sind. Die Gene sind darum anhand Ihrer charakteristischen
Teilsequenzen voneinander unterscheidbar.
RNA
bedeutet Ribonukleinsäure.
Dabei handelt es sich um ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit der
Base Uracil (U) anstelle von Thymin (T). Je drei Basen der Boten-RNA
bilden ein Codewort, das in eine bestimmte Aminosäure übersetzt
wird. Eine bestimmte Abfolge von aneinandergeketteten Aminosäuren ergibt ein
Protein, also einen Eiweißstoff.
Durch entsprechende Vorgänge
in den Zellen von Lebewesen werden auf diese Weise die für die biochemischen
Abläufe
im Körper
notwendigen Proteine bereitgestellt. RNA weist ebenso wie DNA Sequenzen
auf, die charakteristisch für
das jeweilige Gen sind.
Die
Gesamtheit von Genen eines Lebewesens bezeichnet man als dessen
Genom, die Gesamtheit von Eiweißstoffen
eines Lebewesens als dessen Proteom. Während das Genom einiger Lebewesen
bereits entschlüsselt
ist, und die Entschlüsselung
weiterer Genome zur Routine wird, stellt die Untersuchung der jeweiligen
Proteome eine große
Herausforderung dar. Ein Grund dafür ist, dass die Zusammensetzung
des Proteoms eines Lebewesens variieren kann. Wie ein Proteom zusammengesetzt
ist, hängt
unter anderem davon ab, ob und wie viel einer bestimmten mRNA erzeugt
wird.
Die
Erzeugung von mRNA innerhalb einer Zelle oder eines Lebewesens bezeichnet
man auch als Genexpression, das heißt als einen Vorgang, bei dem
Gene exprimiert werden. Dabei können
verschiedene Gene in Abhängigkeit
von einer Vielzahl von Parametern gar nicht, in nicht nachweisbarer
Menge, oder aber in unterschiedlich hoher Konzentration exprimiert
werden.
Einen Überblick über den
Expressionsgrad bestimmter Gene bezeichnet man als Expressionsmuster dieser
Gene oder als Genexpressionsmuster. Aus der Analyse derartiger Muster
unter Berücksichtigung
der jeweils vorherrschenden Parameter erhofft man sich, Erkenntnisse über das
Proteom eines Organismus zu gewinnen. Zu diesem Zweck müssen eine
Vielzahl von Genexpressionmustern ermittelt und analysiert werden. Hierzu
bedient man sich moderner analytischer Methoden, vorzugsweise solcher
Methoden, mit denen eine Vielzahl von Einzelanalysen gleichzeitig
durchgeführt
werden können.
Eine
zunehmend wichtige Methode ist die Untersuchung von Nukleinsäuren mit
Mikroarrays. Auf Mikroarrays sind Sondenmoleküle in geordneten Rastern von
Messpunkten auf einer Oberfläche
angeordnet. Die Sondenmoleküle
bestehen aus Nukleinsäuren,
zum Beispiel synthetischen DNA-Abschnitten, die mittels Amplifikation
ausgehend von natürlichen
Nukleinsäuren
hergestellt wurden, oder aber aus synthetisch hergestellten Oligonukleotiden,
die nicht mittels PCR erzeugt wurden. Sie weisen bestimmte Sondensequenzen
auf, die zu Zielsequenzen komplementär sind. Die Zielsequenzen entsprechen
charakteristischen Teilsequenzen von Genen, anhand derer man die
Gene voneinander unterscheidet. Durch Hybridisierung von Zielsequenzen
mit dazu komplementären
Sondensequenzen erhält
man nachweisbare Hybridmoleküle.
Sind solche Moleküle
in einem Messpunkt nachweisbar, so ist dies ein Hinweis auf das
Vorhandensein des Moleküls,
zu dessen Zielsequenz Sondensequenzen innerhalb eines Messpunktes
komplementär
sind.
Durch
die Vielzahl unterschiedlicher Messpunkte auf einem Mikroarray kann
eine entsprechende Vielzahl unterschiedlicher Gene beziehungsweise
deren Exprimierung von einer identischen Probe zeitgleich untersucht
werden. Durch die Parallelisierung von Analyseschritten auf einem
Mikroarray kann der Probendurchsatz erhöht werden, und unterschiedliche
Proben werden unter gleichen Bedingungen nachgewiesen.
Um
die Expression von mRNA, bzw. von RNA in Zellen bzw. biologischem
Ausgangsmaterial mittels eines Mikroarrays zu ermitteln, wird bei
geringen Ausgangsmengen an RNA diese üblicherweise zunächst in cDNA
umgewandelt, welche aufgereinigt wird.
Nach
Aufreinigung und Aufkonzentrierung wird aus der cDNA eine cRNA generiert.
Diese kann biotinyliert sein, um einen Farbstoff mittels Streptavidin-Biotin-Kopplung
an die cRNA binden zu können.
Ein weiteres Verfahren, mit dem die Bindung von Farbstoffen beziehungsweise
Markierungsagenzien an cRNA ermöglicht
wird, ist das Vorsehen von Aminoallylgruppen, die bei der Herstellung
von cRNA darin eingebaut werden. Schließlich kann alternativ die cRNA-Synthese
auch unter Einsatz modifizierter Nukleotide erfolgen, welche Reste
tragen, die durch Fluoreszenzmessung nachgewiesen werden können. Das
mit Biotin- oder Aminoallylgruppen, bzw. mit mo difizierten Nukleotiden
versehene Syntheseprodukt wird gereinigt und auf eine bestimmte
Konzentration eingestellt.
Die
resultierenden cRNA-Lösungen
werden einer Fragmentierung unterworfen, um cRNA-Abschnitte zu erhalten,
die eine für
die Durchführung
von Mikroarray-Hybridisierungs-Experimenten
geeignete Länge
aufweisen.
Derartige
Verfahren sind Stand der Technik, wobei es keine Probleme darstellt,
die cDNA- oder die cRNA-Synthese zu automatisieren.
Problematisch
für eine
Automatisierung stellt sich allerdings die Reinigung der Syntheseprodukte cDNA
und cRNA dar.
Diese
erfolgt nach dem Stand der Technik mit sogenannten Spin-columns.
Dabei werden Probengefäße, deren
Boden eine Membran aufweist, mit dem jeweiligen Reaktionsproduktgemisch
befüllt
und zentrifugiert. Während
das gewünschte
Produkt an der Membran adsorbiert wird, bleiben unerwünschte Nebenprodukte
und Reaktionslösung
in Lösung
und werden verworfen. Nach entsprechendem Waschen des an die Membran
adsorbierten Reaktionsproduktes wird das Reaktionsprodukt anschließend aus
der Membran eluiert, wobei eine bestimmte Lösungsmittelmenge verwendet
wird, um eine bestimmte Endkonzentration zu erhalten. Diese Schritte
sind bisher nicht automatisiert, bzw. eine Automatisierung derartiger
Schritte stellt sich als sehr aufwendig dar, weil die Proben in
eine Vorrichtung zum Zentrifugieren eingebracht werden müssen. Dieser Schritt
erfolgt daher bisher manuell. Das ist für die Hochdurchsatzanalytik
von RNA ein wesentlicher Engpass. Für die Untersuchung von Expressionsmustern,
die zur Aufklärung
der Vorgänge
in Zellen wesentlich ist, ist das Verfahren nach dem Stand der Technik
im Hochdursatzverfahren darum denkbar ungeeignet. Eine Automatisierung,
stellt sich wegen der Zentrifugation jedenfalls als umständlich und
sehr wahrscheinlich störanfällig dar.
Ein
weiteres Verfahren zur Reinigung des oben angeführten Syntheseproduktes cDNA
stellt die Extraktion mit Phenol/Chloroform mit nachfolgendem Ausfällen der
Produkte dar. Dabei werden die Verunreinigungen denaturiert und
sammeln sich in der organischen Phase oder in der Grenzschicht zwischen
den beiden Phasen an. Die DNA verbleibt in der wässrigen Lösung und wird anschließend mit
Ethanol und Ammoniumacetat ausgefällt. Diese Vorgehensweise ist
schwer automatisierbar, da hierbei Zentrifugationsschritte notwendig
sind und außerdem
zwei Phasen getrennt werden müssen.
Das ausgefällte
und gewaschene Produkt wird anschließend in einer definierten Menge
Lösungsmittel
aufgenommen, wodurch man zu Lösungen
gelangt, in denen das Produkt in einer Konzentration in einem bestimmten
Konzentrationsbereich vorhanden ist.
Aus
dem QIAquick 96 PCR Purification Kit Protocol (abgedruckt in QIAquick
Multiwell PCR Purification Handbook 03/2001, 19–21) ist es bekannt, PCR-Produkte
unter Zuhilfenahme einer Vakuum- bzw. Unterdruckvorrichtung aufzureinigen.
Dabei wird das PCR-Produkt mit einem Puffer PM versetzt, durchmischt
und in Vertiefungen einer speziellen Mikrotiterplatte eingebracht,
deren Böden
eine durchlässige
Membran darstellen, an die ein Vakuum angelegt werden kann. Der
Puffer bewirkt, dass das PCR-Produkt an die Membran der jeweiligen
Vertiefung der Mikrotiterplatte adsorbiert wird. Nach Waschen und
Trocknen der Membran im Vakuum wird das Filtrat verworfen und das
Adsorbat mittels eines Puffers EB (10 mM Tris·Cl) in Probengefäße eluiert.
Ein ähnliches
Protokoll (RNeasy 96 Protocol for RNA Cleanup, RNeasy 96 Handbook
01/2002) beschreibt die Reinigung von RNA. Als erster Puffer fungiert
ein Puffer RLT mit Ethanol. Nach Filtration im Vakuum werden die
Filtrate verworfen. Anschließend
kann ein DNase-Verdau stattfinden. Vor Eluierung muss die Membran
vollständig
getrocknet werden, um frei von Ethanol zu sein, wozu ein 10-minütiges Vakuum
angelegt wird. Die Eluierung erfolgt mit RNase-freiem Wasser, wobei
mehrere Elutionsschritte vorzunehmen sind, um die Ausbeute an adsorbierter
RNA zu erhöhen.
Die Flüssigkeitsmenge
hängt dabei
von der zu eluierenden Menge und der Größe der Filtermembran ab.
Die
Vakuumverfahren haben den Nachteil, dass durch die Anwendung von
Unterdruck ein Teil des Produkts verloren gehen kann, indem es durch
die jeweilige Membran hindurchgezogen wird, wenn es nicht vollständig mittels
Adsorption an die Membran gebunden ist. Bei der nachfolgenden Elution
wird ein Teil der Probe auch nicht wieder von der Membran gelöst. Nach
Elution ist man mit unterschiedlich konzentrierten Proben konfrontiert,
die erheblich verdünnt
sein können.
Für die
nachfolgende Fragmentierung muss die Ausgangskonzentration an cRNA
zumindest 0,6 μg/μl betragen.
Um vergleichbare Ergebnisse bei der Analyse auf Mikroarrays zu erhalten,
muss außerdem
eine genau definierte Menge an cRNA eingesetzt werden. Manche Experimente
lassen sich gar nicht oder nur sehr schwer durchführen, weil
die Verdünnung
der eluierten Proben zu groß ist.
Eine Weiterverarbeitung derartiger Proben erscheint dann sinnlos,
beziehungsweise sehr aufwändig,
zumal wenn die erhaltenen Produktlösungen Zwischenprodukte darstellen.
Es
ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren, mit dem ein zu analysierendes
Gemisch ausgehend von mRNA bzw. RNA erhalten werden kann, das leicht
automatisierbar ist, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung eines
entsprechenden Verfahrens zur Verfügung zu stellen.
Die
Aufgabe wird hinsichtlich des Verfahrens gelöst durch ein Verfahren nach
Anspruch 1.
Vorteilhafte
Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich
aus den Unteransprüchen
2–9.
Hinsichtlich
der Vorrichtung wird die Aufgabe gelöst durch eine Vorrichtung nach
Anspruch 10.
Vorteilhafte
Ausgestaltungen einer Erfindungsgemäßen Vorrichtung ergeben sich
aus den jeweiligen Unteransprüchen.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Bereitstellung eines mittels eines Mikroarrays analysierbaren Reaktionsgemisches
ausgehend von mRNA oder RNA weist folgende Schritte auf:
- a) Synthetisieren von cDNA,
- b) Binden der cDNA an einen Membranfilter in Gegenwart eines
Bindepuffers,
- c) Waschen, Trocknen und Eluieren des an den Membranfilter adsorbierten
Produktes in ein Probengefäß,
- d) Aufkonzentrieren des Eluats aus Schritt c),
- e) Synthese von cRNA ausgehend von der cDNA-Lösung aus
Schritt d),
- f) Binden der cRNA an einen Membranfilter in Gegenwart eines
Bindepuffers,
- g) Waschen, Trocknen und Eluieren des an den Membranfilter adsorbierten
Produktes in ein Probengefäß,
- h) Aufkonzentrieren des Eluats aus Schritt g),
- i) Einstellen der cRNA-Konzentration in der Lösung aus
Schritt h) und Fragmentieren der cRNA.
Das
erfindungsgemäße Verfahren
zeichnet sich dadurch aus, dass die Aufreinigung der jeweiligen Produkte
aus cDNA- und cRNA-Synthese nicht wie bisher mittels eines Ausfäll- oder
Spin-Column-Verfahrens aufgereinigt wird, sondern dass das jeweilige
Reaktionsprodukt dadurch isoliert wird, dass das jeweilige Reaktionsgemisch
an einer Membran gebunden, gewaschen, getrocknet und aus der Membran
in ein Probengefäß eluiert
wird.
Gemäß einer
vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens erfolgt das Binden an
einen Membranfilter in Schritt b) und/oder Schritt f) und/oder das
Waschen, Trocknen und Eluieren in Schritt c) und/oder Schritt g) jeweils
unter Zuhilfenahme eines an das Membranfilter angelegten Unterdruckes.
Besonders vorteilhaft ist es, in all diesen Schritten eine solchen
Unterdruck anzulegen.
Das
jeweilige Produkt wird dann im Vakuum mit Hilfe einer Vakuumkammer,
die für
die direkte Automatisierung konstruiert wurde, an einer Membran
filtriert, wobei das Produkt an die Membran adsorbiert. Das Filtrat
wird verworfen, und der Rückstand
wird nach Waschen und Trocknen aus der Membran in entsprechende
Probengefäße beziehungsweise
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eluiert. Auf diese Weise wird
das gesamte Verfahren sehr viel leichter automatisierbar, als wenn
man die einzelnen Reaktionsgemische in Vorrichtungen zum Zentrifugieren überführen müsste.
Im
Gegensatz zum Verfahren mit den aufwendigen Ausfäll- oder Zentrifugierschritten
erfordert das erfindungsgemäße Verfahren
allerdings eine Aufkonzentrierung des im Elutionsmittel gelösten Produktes.
Eine derartige Aufkonzentrierung kann mit Hilfe von Magnetpartikeln
oder von Filterplatten durchgeführt
werden, wie sie dem Fachmann schon seit langem zur Verfügung stehen.
Derartige Vorrichtungen bzw. Mittel sind in einem automatisierten
Verfahren sehr leicht einzusetzen.
Die
Reinigung der biotinylierten cRNA bzw. der cDNA mittels des vorgeschlagenen
Reinigungsschrittes im Vakuum erfordert im Gegensatz zum bisherigen
Verfahren eine Aufkonzentrierung, da mit mehr Lösungsmittel gearbeitet werden
muss und da ein Arbeiten mit Membranen in Verbindung mit Vakuumtechnik
im Vergleich zum Einsatz von spin-columns bzw. Ausfäll-Techniken
zu einem Verlust von Produkt führt,
das durch den Unterdruck durch die Membran gezogen wird, aus dieser
nicht vollständig
eluierbar ist und/oder mit schwer zu kontrollierenden Konzentrationsschwankungen
der einzelnen Proben einhergeht.
Durch
das Vorsehen des jeweiligen Aufkonzentrierungsschrittes ist es aber überraschenderweise
gelungen, die jeweiligen Zwischenprodukte in Konzentrationen zu
erhalten, die zu einem Produkt führen,
das zuverlässig
mittels eines Mikroarrays analysierbar ist. Dies war bisher nicht
möglich.
Aufgrund der in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehenen
Aufkonzentrierungsschritte der jeweiligen Zwischenprodukte steht einer
Automatisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens nichts im Wege.
Insbesondere ist es nicht erforderlich, in ein automatisiertes Verfahren
einen Schritt einzubauen, bei dem die Proben in eine Zentrifugiervorrichtung
eingebracht werden müssen.
Dadurch steht nun erstmals ein Verfahren zur Verfügung, mit
dem ausgehend von RNA bzw. mRNA bis zum Reaktionsgemisch, das auf
einen Mikroarray aufgetragen wird, jeder Schritt leicht und auf ökonomisch
sinnvolle Weise automatisiert zur Verfügung gestellt werden kann.
Mit
einer entsprechenden Vorrichtung, die zur Durchführung des Verfahrens ausgebildet
ist, kann man auf sehr effektive Weise eine biologische Probe für eine nachfolgende
Analyse mittels Mikroarray vorbereiten, in der man am einen Ende
die Vor richtung mit RNA bzw. mRNA füttert, und am anderen Ende
die fragmentierte, markierte cRNA fertig für die Hybridisierung auf Mikroarrays
erhält.
Gemäß einer
Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird Schritt d) ausgeführt,
indem Lösungsmittel
verdunstet wird.
Dies
ist eine besonders einfache Art und Weise, eine Lösung zu
konzentrieren, die besonders leicht in bekannten Vorrichtungen implementierbar
ist, etwa durch entsprechende Programmierung und Verwendung eines
Thermocyclers.
Gemäß einer
weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird/werden
Schritt d) oder/und Schritt h) ausgeführt, indem das Produkt mit
Hilfe von Magnetpartikeln aufkonzentriert wird.
Gemäß einer
weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird/werden
Schritt d) und/oder Schritt h) ausgeführt, indem das Produkt mit
Hilfe von Filterplatten, zum Beispiel der Fa. Millipore (96er SeqDye
Terminator Platte unter Verwendung des SEQ96 CleanupKit, Best. Nr.
LSKS 09601), aufkonzentriert wird.
Sowohl
cRNA als auch cDNA sind auf diese Weise gut aufkonzentrierbar.
Gemäß weiteren
Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahren wird folgender
zusätzlicher Schritt
ausgeführt:
- j) Auftragen des Produkts aus Schritt i) auf
einen Mikroarray und Durchführen
eines Mikroarray-Hybridisierungsexperimentes, gegebenenfalls gefolgt
von Schritt
- k) Auswerten des Mikroarray-Hybridisierungsexperimentes aus
dem vorhergehenden Schritt.
Solche
Verfahren haben den Vorteil, dass sie Hybridisierungsexperiment
und Analyse direkt nacheinander im Anschluss an die Fragmentierung
ermöglichen.
Gemäß einer
bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind sämtliche
Schritte des Verfahrens bis zur fragmentierten, biotinylierten oder
markier ten cRNA automatisiert.
Ein
derartiges Verfahren ermöglicht
die vollständige
Automatisierung der Erstellung eines Reaktionsgemischs, das mittels
eines Mikroarrays analysierbar ist, ausgehend von RNA oder mRNA
aus lysiertem Material, ohne dass Zwischenschritte erforderlich
wären,
bei denen Zentrifugationen stattfinden. Ein solches Verfahren ist
platz- und kostensparend in einem Roboter implementierbar.
Gemäß einer
weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird es ohne
menschliches Zutun maschinell ausgeführt.
Ein
solches Verfahren ist vorteilhaft, da es den Einsatz menschlicher
Arbeitskraft für
ein an sich repetitives Vorgehen vermeidet und so Ressourcen freisetzt.
Eine
erfindungsgemäße Vorrichtung
im Sinne der Aufgabe ist eine Vorrichtung zur vollautomatisierten, maschinellen
Durchführung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
Derartige
Vorrichtungen verwirklichen die Vorteile des Verfahrens.
Verfahren
und Vorrichtung vereinfachen die Vorbereitung von Proben, die auf
einem Mikroarray aufgetragen werden, so erheblich, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung,
mit der das Verfahren durchgeführt wird,
die Forschung wesentlich beschleunigt.
Genaue Beschreibung der
Erfindung:
Aus
zu untersuchenden eukaryotischen Zellen oder Zellkulturen wird die
RNA oder die mRNA isoliert, wobei darauf geachtet wird, dass möglichst
keine RNase in Kontakt mit der isolierten RNA oder mRNA kommt. Derartige
Isolierungen lassen sich beispielsweise Durchführen mit dem High Pure RNA
Isolation Kit der Fa. Roche (Katalog-Nr. 1828.665) oder dem entsprechenden
mRNA Isolation Kit.
Nach Überprüfung der
Qualität
der isolierten RNA oder mRNA setzt man eine reverse Transkriptase ein,
um unter Einsatz eines bestimmten Primers einen ersten cDNA-Strang
aus mRNA oder RNA zu generieren.
Die
Generierung der cDNA kann beispielsweise unter Verwendung eines
Kits „cDNA
Synthesis System" der
Fa. Roche, Kat. Nr. 1 117 831, erfolgen. Dabei wird nach Erzeugung
des ersten cDNA-Stranges die RNA mit RNaseH modifiziert, so dass
sie eine Primerfunktionen für
eine Polymerase aufweist, mit deren Hilfe der zweite Strang erzeugt
wird. Die in einem Enzymcocktail zugefügte Polymerase I weist Exonuklease-Aktivität auf, mittels
derer der Primer in Syntheserichtung verdaut wird, wobei die Nukleotide
durch die Polymeraseaktivität
ersetzt werden. Eine E.Coli-Ligase verknüpft die Lücken zwischen den Polymeraseprodukten
auf dem zweiten Strang, wodurch eine vollständige doppelsträngige cDNA
entsteht. Um Überhänge an den
3'-Enden der doppelsträngigen cDNA
zu vermeiden, wird eine T4-DNA-Polymerase eingesetzt.
Zur
Durchführung
der vorliegenden Erfindung eignen sich neben dem angeführten Roche-Kit
auch andere, dem Fachmann bekannte Verfahren zur Generierung von
cDNA, wie zum Beispiel das „Superscript Choice
System for cDNA-Synthesis" der
Fa. Invitrogen Life Technologies, P/N 18090-019. Alle derartigen
Verfahren basieren auf dem Einsatz reverser Transkriptasen.
Nach
erfolgter cDNA-Synthese ist Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens
beendet.
Die
cDNA wird nach dem Versetzen der Reaktionslösung mit Puffer PM an einen
Membranfilter gebunden. Dazu werden die Proben in eine für eine Filtrierung
geeignete Vorrichtung eingebracht, zum Beispiel eine speziell ausgebildete
Mikrotiterplatte, beispielsweise eine QIAquick 96-well-Mikrotiterplatte
der Fa. QIAgen, Bestell-Nr. 28181, bei der die Böden der Vertiefungen, in die
die Proben eingebracht werden, aus einer durchlässigen Membran ausgebildet
sind. Eine solche Mikrotiterplatte gestattet die gleichzeitige Filtration
mehrerer Proben gleichzeitig. Sie wird im folgenden als Membran-Mikrotiterplatte
bezeichnet. Sie wird in einer speziellen Vorrichtung eingebracht,
die es gestattet, auf der Unterseite der Membran-Mikrotiterplatte
einen Unterdruck anzulegen, der auch als Vakuum bezeichnet wird.
Durch den Unterdruck wird die flüssige
Phase durch die Membran „hindurchgezogen", cDNA wird dabei
durch Adsorption an die Membran gebunden.
Mit
dem Binden an die Membran ist Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens
beendet.
Die
Vertiefungen der Membran-Mikrotiterplatte werden mit Hilfe eines
Waschpuffers mehrfach gewaschen, beispielsweise eines Waschpuffers
PE wie im QIAquick Multiwell PCR Purification Handbook auf Seite 20
unter 3., 4. angegeben. Daraufhin wird die Membran-Mikrotiterplatte
bei angelegtem Vakuum, das heißt
bei Unterdruck, unter Durchleitung von Luft oder einem Schutzgas
wie beispielsweise N2 oder Argon durch die Membranen
getrocknet. Hierdurch wird der Waschpuffer vollständig entfernt.
Danach wird die Membran-Mikrotiterplatte aus der Filtrationsvorrichtung
entnommen, eventuelle Flüssigkeitsrückstände an den
Außenseiten der
Membran-Mikrotiterplatte
werden entfernt, die Filtrate werden verworfen und die Membran-Mikrotiterplatte wird über einem
Probengefäß wieder
in der Unterdruckvorrichtung angebracht. Die Membran-Mikrotiterplatte wird über einer
konventionellen Mikrotiterplatte mit Vertiefungen oder über einer
entsprechenden Ansammlung von Probengefäßen positioniert. Ein Elutionspuffer,
zum Beispiel ein Puffer EB (0,5 mM Tris·Cl, pH 8,5) oder Wasser wird
in die Vertiefungen der Membran-Mikrotiterplatte eingebracht, eine
Weile stehen gelassen, beispielsweise eine Minute, und anschließend mittels
Unterdruck durch die Membranen gezogen. Hierdurch wird das Eluat
in die Probengefäße oder
Vertiefungen einer Mikrotiterplatte überführt, die sich unterhalb der
Membran-Mikrotiterplatte befinden. Der Elutionsvorgang kann zur
Erzielung einer möglichst
quantitativen Elution der cDNA aus der jeweiligen Membran mehrfach
wiederholt werden, wie im QIAquick Multiwell PCR Purification Handbook
auf Seite 21 unter 8. angegeben. Anstelle einer Membran-Mikrotiterplatte
kann auch ein anderes Format gewählt
werden, beispielsweise eine Einzelmembran oder dergleichen. Wichtig
ist nur, dass ein Vakuum daran angelegt werden kann, dass eine Filtration
durch eine Membran ermöglicht,
an der cDNA adsorbierbar ist.
Mit
der Eluierung ist Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens abgeschlossen.
Die
Eluate sind gegenüber
cDNA-Lösungen,
die durch Ausfällen,
Zentrifugieren der cDNA, Dekantieren der überstehenden Lösung, Waschen
und Wiederaufnahme in Lösung
gewonnen werden, verdünnt.
Damit eine zufriedenstellende Weiterverarbeitung der cDNA gewährleistet
werden kann, werden die Eluate darum aufkonzentriert.
Diese
Aufkonzentrierung entspricht einer Einengung der Eluate. Sie kann
erfolgen durch Isolieren der cDNA mittels Magnetpartikeln, an die
die cDNA gebunden wird, die mit einem Magneten im Probengefäß festgehalten
werden – hierbei
kann das Lösungsmittel
auch durch ein anderes ersetzt werden, falls dies gewünscht ist.
Die
Einengung kann auch durch Filtration an Filterplatten und Elution
in kleineren Volumina Lösungsmittel
bewerkstelligt werden. Dazu sind beispielsweise Filter der Fa. Millipore
grundsätzlich
geeignet.
Die
Einengung der Eluate kann auch durch Verdunstung von Lösungsmittel
aus den Eluaten erfolgen, beispielsweise indem man einen für PCR-Reaktionen
vorgesehenen Heizblock entsprechend ansteuert, in dem die Probengefäße oder
Mikrotiterplatte mit Proben untergebracht ist, oder indem man die
Proben auf sonstige Weise erwärmt.
Die Proben werden bis zur Trockne eingeengt und anschließend in
einer definierten Menge Lösungsmittel
wieder aufgenommen.
Schritt
d) des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist damit beendet.
Die
resultierende cDNA-Lösung
dient als Edukt für
die nun folgende cRNA-Synthese. Diese kann nach dem Fachmann bekannten
Verfahren erfolgen, beispielsweise unter Verwendung des BioArrayTM HighYieIdTMRNA
Transcript Labeling Kit der Fa. Enzo, das von Affymetrix vertrieben
wird (Part. Nr. 900182) gemäß der dazugehörenden Anleitung.
Mit diesem Kit werden Proben für
den Einsatz mit Mikroarrays der Fa. Affymetrix vorbereitet.
Der
cDNA werden nach dieser Anleitung ein Reaktionspuffer, biotinylierte
Ribonukleotide, DTT, ein RNase-Inhibitor-Mix, eine T7 RNA-Polymerase
und Wasser hinzugefügt.
Das Reaktionsgemisch wird anschließend bei 37°C fünf bis neun Stunden inkubiert.
Nach Abschluss der RNA-Synthese wird das Produkt direkt weiterverarbeitet.
Es kann aber auch bei –70°C oder –20°C zwischengelagert
werden. Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist abgeschlossen.
Die
Proben werden mit RNase-freiem Wasser und einem Bindepuffer versetzt,
zum Beispiel auf 100 μl
mit RNase-freiem Wasser aufgefüllt
und mit 350 μl
Puffer RLT gemäß der Anleitung „RNeasy
96 Protocol for RNA Cleanup" aus
dem RNeasy Handbook 01/2002, S.36, der Fa. QIAgen, Bestell-Nr. 74181.
Die
Proben werden durchmischt, mit Ethanol versetzt, und erneut durchmischt.
Die
Proben werden in eine Membran-Mikrotiterplatte überführt und mittels Unterdruck
in der dafür
vorgesehenen Vorrichtung wie oben bezüglich der cDNA-Aufreinigung
erläutert
filtriert.
Im
Anschluss daran fügt
man einen weiteren Puffer, zum Beispiel den Puffer RW1 gemäß der Anleitung „RNeasy
96 Protocol for RNA Cleanup" aus
dem RNeasy Handbook 01/2002, S.36, der Fa. QIAgen, Bestell-Nr. 74181,
den Proben hinzu. Nach einer gewissen Verweildauer, beispielsweise
5 Minuten, wird das Reaktionsgemisch durch Anlegen eines Vakuums
filtriert. Die Filtrate werden verworfen, die Adsorbate werden mit
einem mit Waschpuffer mehrfach gewaschen, beispielsweise einem ethanolischen
Puffer RPE gemäß der Anleitung „RNeasy
96 Protocol for RNA Cleanup" aus
dem RNeasy Handbook 01/2002, S.37, der Fa. QIAgen, Bestell-Nr. 74181,
indem der Waschpuffer jeweils aufgetragen und durch Anlegen eines
Vakuums filtriert wird.
Das Äußere der
Membran-Filterplatte wird von daran befindlichen Flüssigkeitsresten
befreit und die Membran-Filterplatte wird getrocknet, indem ein
Vakuum angelegt wird, das Luft oder ein Schutzgas durch die Membranen
zieht. Hierdurch werden Reste von Ethanol aus der Membran entfernt.
Die
Membran-Mikrotiterplatte wird über
einer normalen Mikrotiterplatte oder einer entsprechenden Ansammlung
von Probengefäßen angeordnet,
und die an die jeweilige Membran adsorbierte cRNA wird mittels RNase-freiem
Wasser in die Probengefäße oder
Vertiefungen der Mikrotiterplatte eluiert, indem man das Wasser
den Vertiefungen der Membran-Mikrotiterplatte hinzufügt, es einwirken
lässt und
mittels Vakuum durch die Membran hindurch in die darunter befindlichen
Probengefäße oder
Vertiefungen der Mikrotiterplatte überführt.
Dieser
Vorgang wird einmal wiederholt, um eine quantitative Eluierung an
die Membran adsorbierter cRNA zu gewährleisten.
Die
Schritte f) und g) des erfindungsgemäßen Verfahrens sind damit abgeschlossen.
Die
Eluate werden nun aufkonzentriert. Dies kann erfolgen durch Isolieren
der cRNA mittels magnetischer Partikel, an die die cRNA gebunden
wird, die mit einem Magneten im Probengefäß oder in der jeweiligen Vertiefung
einer Mikrotiterplatte festgehalten werden – hierbei kann das Lösungsmittel
auch durch ein anderes ersetzt werden, falls dies gewünscht ist.
Die
Aufkonzentrierung kann auch durch Filtration an Filterplatten bis
zum Erreichen der gewünschten Lösungsmittelmenge
bewerkstelligt werde, beispielsweise unter Zuhilfenahme von Filterplatten
der Fa. Millipore, wie etwa Millipore Montage Seq 96Cleanup Kit,
Bestell-Nr. LSKS09601.
Schritt
h) des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist damit abgeschlossen.
Die
cRNA liegt nun in einer bestimmten Konzentration in Lösung vor.
Diese Konzentration ist bestimmbar. Um eine Fragmentation möglichst
erfolgreich durchführen
zu können,
wird die Konzentration der cRNA-Lösungen nun eingestellt, indem
die Lösungen
in Abhängigkeit
von der vorgefundenen Konzentration verdünnt werden. Die Konzentration
wird dabei mittels optischer Messungen kontrolliert und auf einen
vorgegebenen Wert eingestellt, der vom verwendeten Fragmentierungsprotokoll
ab hängt.
Die Konzentration sollte so eingestellt werden, dass sie im Fragmentierungsgemisch
nach Zugabe der Reaktanden RNA/Lösungsmittel
in etwa im Größenordnungsbereich
1 μg/μl liegt,
beispielsweise zwischen 0,5 und 2 μg/μl. Die Messung und Einstellung
der Konzentration kann nach dem Protokoll „Quantifying the cRNA (IVT
Product)" der Fa.
Affymetrix erfolgen ((Affymetrix, Expression Analysis Technical
Manual, P/N 700236 rev.3 (Version 2000), Eukarytoic Sample and Array
Processing, Seite 2.1.21).
Sobald
die gewünschte
Konzentration eingestellt ist, wird die Probe mit einem Fragmentierungspuffer versehen,
beispielsweise gemäß dem Protokoll „Fragmenting
the cRNA for Target Preparation" der
Fa. Affymetrix (Affymetrix, Expression Analysis Technical Manual,
P/N 700236 rev.3 (Version 2000), Eukarytoic Sample and Array Processing,
Seiten 2.1.22–23).
Das
Reaktionsgemisch wird gemäß dem verwendeten
Protokoll inkubiert, anschließend
gekühlt,
gegebenenfalls ein Aliquot daraus mittels Gelektrophorese analysiert.
Die fragmentierte cRNA-Lösung
kann bei –20°C aufgehoben
werden, aber auch sofort mit einem Mikroarray in Kontakt gebracht
werden.
Diese
beschriebenen Schritte lassen sich alle von einem Roboter durchführen, der
entsprechend programmiert ist, und auf dem eine heizbare Station
für Mikrotiterplatten
vorgesehen ist, beispielsweise ein Heizblock, wie er für PCR-Raktionen
verwendet wird, und eine Vorrichtung zum Filtrieren unter Vakuum
mittels Membran-Mikrotiterplatten.
Da keine Zentrifuge in den Roboter implementiert werden muss, ist
das Verfahren leicht automatisierbar.
Im
folgenden wird die Erfindung anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels
erläutert.
