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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Trennen von Suspensions- oder Kolloidbestandteilen, insbesondere von Blutbestandteilen.
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Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zum Trennen von Suspensions- oder Kolloidbestandteilen, insbesondere von Blutbestandteilen.
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Aus dem wissenschaftlichen Artikel
"High flow rate microfluidic device for bloodplasmaseparationusing a rangeoftemperatures" von A. I. Rodriguez-Villarreal, M. Arundell, M. Carmona et al., Lab Chip, 2010, 10, 211–219, sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Trennen von Blutbestandteilen bekannt, die auf einem Trennen von Blutbestandteilen aufgrund einer lateralen Separierung der Blutbestandteile nach einer Engstelle in einer Leitungsanordnung beruhen. Die Ausbeute an Plasma dieses Verfahrens beträgt bei diesem vorbekannten Verfahren etwa 4 Prozent.
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Aus dem wissenschaftlichen Artikel
"Passive microfluidic devices for plasmaextractionfromwhole human blond" von E. Sollier, H. Rostaing, P. Pouteau et al., Sensors and Actuators B 141 (2009) 617–624, sind drei Verfahren und drei Vorrichtungen zum Trennen von Blutbestandteilen bekannt. Die Verfahren basieren auf Mikrofiltration und Zentrifugation in mikrofluidischen Vorrichtungen. Das beste der hier offenbarten Verfahren ist das sogenannte ”Corner-Edge”-Design, bei dem Vollblut mit Faktor 20 verdünnt wird. Die Ausbeute beträgt weniger als 11 Prozent.
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Die Anforderungen für die Auftrennung bestehen in der Dauer des Prozesses, der Menge an Ausbeute der Blutbestandteile, der Menge des Totvolumens, automatischem Durchführen mit allenfalls wenig manuellen Handlungen, geringen Herstellungskosten, variabler Probenmenge, Baugröße und Robustheit.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Trennen von Bestandteilen in Suspensionen oder Kolloiden in Restpartikelbestandteile und einen weiterzuverarbeitenden Partikelbestandteil anzugeben, die sich bei einem verhältnismäßig einfachen Aufbau der Leitungsanordnung durch ein effizientes Trennen der Bestandteile einer verhältnismäßig geringen und variablen Probenmengen einer verhältnismäßig kurzen Zeit mit geringem Totvolumen auszeichnet.
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Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren zum Trennen von Suspensions- oder Kolloidbestandteilen mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 gelöst.
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Diese Aufgabe wird bei einer Vorrichtung zum Trennen von Suspensions- oder Kolloidbestandteilen mit den Merkmalen des Patentanspruches 6 gelöst.
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Dadurch, dass erfindungsgemäß das Trennen von Suspensions- oder Kolloidbestandteilen wie insbesondere Blutbestandteilen aus einer agglutinierte Bestandteile aufweisenden Probe durch eine rein axiale Strömung in einer Leitungsanordnung bis zum Einstellen einer axialen Separierung der agglutinierten Bestandteile und dem restlichen Kolloid oder der restlichen Suspension erfolgt, ergibt sich ein verhältnismäßig einfacher Aufbau der Leitungsanordnung, der ein effizientes Trennen bei einer verhältnismäßig geringen Menge der Probe zulässt.
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Die vorgestellte Erfindung verwendet, wie aus
WO 96/31270 bekannt, sogenannte Agglutinine. In der medizinischen Sprache versteht man unter Agglutination (lat.: agglutinare: anheften) das Verkleben oder Verklumpen von zum Beispiel Zellen, beziehungsweise von Antikörpern mit Antigenen. Durch die Zugabe von Substanzen wie zum Beispiel kationische Polymere Hexadimethrinbromid kann die Agglutination zusätzlich verstärkt werden, was zu einem schnelleren Prozessablauf der Auftrennung in der vorgestellten Erfindung führt.
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Als Probe dient beispielsweise Vollblut, Urin, Speichel oder Kulturmedium. Agglutinierte Bestandteile sind beispielsweise Blutzellen, Mikroorganismen oder Viren.
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Anwendungsbeispiele sind die Auftrennung von Vollblut als Suspension mit Gerinnungshemmer in Plasma und Blutzellen, Auftrennung von Vollblut oder Suspension ohne Gerinnungshemmer in Serum und Blutzellen. Die Leitungsanordnung besitzt für Probenmengen im oberen Mikroliterbereich Durchmesser im Millimeterbereich, um eine gewisse axiale Länge der Probe in der Leitung zu gewährleisten. Zu kleine Probenmengen lassen sich nicht effizient trennen.
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Aus diesem Grund werden für die Auftrennung von Probenmengen von beispielsweise Probanden mit wenig Probenvolumen wie Säuglingen Durchmesser der Leitungsanordnung im Mikrometerbereich bevorzugt. Zur Minimierung der Leitungslänge und des daraus folgenden Platzbedarfs werden für Proben im Milliliterbereich Durchmesser im Zentimeterbereich bevorzugt. Für die Trennung von Vollblut-, Urin-, Speichel-, Kulturmediumsbestandteilen wird die Kanalanordnung aus hygienischen Gründen in einem Fluidikchip separiert. Die Anordnung ist weitestgehend geschlossen und gewährleistet für den Nutzer der Vorrichtung ein geringes Kontaminationsrisiko. Für eine besonders kostengünstige Umsetzung wird die Auftrennung in einer Schlauchlösung bevorzugt. Außerdem wird die Schlauchlösung für die Trennung von weniger risikobehaftetem Material bevorzugt.
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Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
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Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen mit Bezug auf die Figuren der Zeichnung.
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Es zeigen:
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1 in einer schematischen Ansicht ein erstes Ausführungsbeispiel der Erfindung mit einer durch eine verzweigungsfreie Leitung gebildeten Leitungsanordnung,
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2 in einer schematischen Darstellung die Leitung bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 1 während verschiedener Schritte beim Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens,
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3 in einer schematischen Darstellung ein weiteres Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer als Fluidikchip ausgebildeten Leitungsanordnung,
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4 in einer Draufsicht den Fluidikchip bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 3 nach Befüllen mit Inertfluidlösung und mit einer agglutinierte Blutzellen beinhaltenden Probe,
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5 in einer Draufsicht den Fluidikchip gemäß dem Ausführungsbeispiel von 4 nach Bewegen der Probe in einer ersten Strömungsrichtung mit einer ersten Strömungsgeschwindigkeit über eine erste Zeitdauer und
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6 in einer Draufsicht den Fluidikchip gemäß 4 nach Bewegen der Probe in einer der ersten Strömungsrichtung entgegengesetzten zweiten Strömungsrichtung mit einer von der ersten Strömungsgeschwindigkeit verschiedenen zweiten Strömungsgeschwindigkeit über eine zweite Zeitdauer.
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1 zeigt in einer schematischen Darstellung ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Trennen von insbesondere Blutbestandteilen. Das Ausführungsbeispiel gemäß 1 verfügt über eine Pumpeinheit 1, die über eine Steuereinheit 2 zum Pumpen in zwei Pumprichtungen mit jeweils einstellbarer Pumpleistung ansteuerbar ist. Weiterhin ist das Ausführungsbeispiel gemäß 1 mit einer Zweiwegventileinheit 3 als Ventileinheit ausgestattet, die über einen Inertfluidanschluss 4 fluiddynamisch mit einem Inertfluidbehältnis 5 verbunden ist. In dem Inertfluidbehältnis 5 ist in der Darstellung gemäß 1 eine Inertfluidlösung 6 bevorratet. Die Vorratslösung 6 dient dem Zweck, der Pumpeinheit 1 ein inertes Fluid bereitzustellen, um hydraulisch und nicht pneumatisch zu agieren.
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Weiterhin ist die Zweiwegventileinheit 3 mit einem Leitungsanschluss 7 ausgestattet, an den bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 1 eine Leitungsanordnung 8 in Gestalt einer sich mit einer Länge in einer axialen Richtung verzweigungsfrei erstreckenden Leitung 9 mit gleichbleibendem Querschnitt von beispielsweise etwa 1,5 Millimeter im Durchmesser bei einem runden Querschnitt angeschlossen ist. Die Leitung 9 ist für eine möglichst große Erstreckung in Verbindung mit geringem Platzbedarf in der axialen Richtung zweckmäßigerweise gewendelt oder spiralförmig ausgebildet.
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Das dem Leitungsanschluss 7 gegenüberliegende Ende der Leitung 9 ist mit einer Vorrats/Auffangbehältnisanordnung 10, hier bestehend aus einem Auffangbehältnis und aus einem Vorratsbehältnis, verbunden, das, wie in 1 dargestellt, zum einen die Funktion eines Vorratsbehältnisses für eine bereits mit einem Reagenz zum Agglutinieren von Blutzellen versetzten Probe 11 und zum anderen die Funktion eines Auffangbehältnisses, wie weiter unten näher erläutert, zum Aufnehmen von Blutbestandteilen erfüllt. Zur Agglutination der Blutzellen wird als Reagenz beispielsweise das Phytohämagglutinin (PHA-E) verwendet, welches zu den so genannten Lektinen gehört.
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2 zeigt in verschiedenen Teilbildern (a), (b), (c) und (d) die Leitung 9 bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 1 nach Durchführen verschiedener Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens. In dem in 2 obersten Teilbild (a) ist die Leitung 9 an ihrem dem Inertfluidanschluss 4 zugewandten Ende mit Inertfluidlösung 6 gefüllt. An ihrem der Vorrats/Auffangbehältnisanordnung 10 zugewandten Ende ist durch Zusammenwirken der Pumpeinheit 1, der Steuereinheit 2 und der Zweiwegventileinheit 3 unter Aufnahme eines Luftpolsters 12 aus dem nunmehr eingesetzten Vorratsbehältnis der Vorrats/Auffangbehältnisanordnung 10 die Probe 11 mit agglutinierten Blutzellen mit einem Volumen von beispielsweise 200 Mikroliter eingebracht worden. Hinter und vor der Probe 11 befindet sich das Luftpolster 12.
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Nach Einpumpen von Inertfluidlösung 6, Rückpumpen der aufgenommenen Inertfluidlösung 6 unter Mitnahme des Luftpolsters 12 und anschließendem Aufnehmen der Probe 11 bis zum Einstellen einer ersten Separierung von Blutbestandteilen gemäß dem oberen mittleren Teilbild (b) von 2 mit einer sehr geringen Vorlaufgeschwindigkeit liegt an das Luftpolster 12 angrenzend ein erster Ansatz von Plasma 13 an dem der Vorrats/Auffangbehältnisanordnung 10 abgewandten Ende der Leitung 9 vor, während ein mit agglutinierten Blutzellen angereichertes Mischvolumen 14 an dem der Vorrats/Auffangbehältnisanordnung 10 zugewandten Ende vorhanden ist. Durch diesen Vorgang wird an dieser Stelle der Agglutinationsvorgang verstärkt.
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Nach einer verhältnismäßig kurzen ersten Pumppause, welche die Agglutination der Bestandteile durch Sedimentation verstärkt, wird ausgehend von der Anordnung gemäß dem Teilbild (b) in einem ersten Pumpintervall zunächst in Richtung des Inertfluidanschlusses 4 mit einer bei diesem Ausführungsbeispiel verhältnismäßig hohen ersten Strömungsgeschwindigkeit über eine erste Zeitdauer in Richtung des Inertfluidanschlusses 4 als erste Strömungsrichtung weitergepumpt, bis das Luftpolster 12 nahe dem Inertfluidanschluss 4 angeordnet ist. Nach Abschluss dieses ersten Pumpvorganges liegt, wie in dem unteren mittleren Teilbild (c) dargestellt, das Plasma 13 nunmehr auf der der Vorrats/Auffangbehältnisanordnung 10 zugewandten Seite der Leitung 9 vor.
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Anschließend wird nach einer weiteren zweiten Pumppause die Anordnung von im Volumen gegenüber dem Teilbild (b) bereits angereicherten Menge an Plasma 13 und dem gegenüber dem mit agglutinierten Blutzellen angereichertem Menge von Mischvolumen 14 in einem zweiten Pumpvorgang über eine zweite Zeitdauer mit einer gegenüber der ersten Strömungsgeschwindigkeit kleineren zweiten Strömungsgeschwindigkeit in Richtung der Vorrats/Auffangbehältnisanordnung 10 als zweiter Strömungsrichtung zurückgepumpt, bis, wie in dem untersten Teilbild (d) dargestellt, das Plasma 13 mit einem nunmehr verhältnismäßig großen Volumen an dem der Vorrats/Auffangbehältnisanordnung 10 zugewandten Ende der Leitung 9 angrenzt. Das Trennen der Blutbestandteile ist nach einer typischen Prozesszeit von etwa 15 Minuten und einer Plasmaausbeute von typischerweise zwischen etwa 30 Prozent und etwa 40 Prozent nunmehr abgeschlossen, und durch Weiterpumpen mit einer Entnahmegeschwindigkeit lässt sich das Plasma 13 in die Vorrats/Auffangbehältnisanordnung 10 mit dem nunmehr eingesetzten Auffangbehältnis zur anschließenden Weiterverarbeitung aus der Leitung 9 austreiben.
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3 zeigt in einer schematischen Darstellung ein weiteres Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung hier zum Trennen von Blutbestandteilen, wobei sich bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 1 und bei dem Ausführungsbeispiel gemäß 2 einander entsprechende Elemente mit den gleichen Bezugszeichen versehen und im Weiteren zum Teil nicht nochmals näher erläutert sind. Das Ausführungsbeispiel gemäß 3 verfügt als Ventileinheit über eine Mehrwegventileinheit 15, an die fluiddynamisch neben dem mit Inertfluidlösung 6 gefüllten Inertfluidbehältnis 5 ein mit reinem Vollblut 16, das gegebenenfalls mit einem Gerinnungshemmer versetzt ist, gefülltes Vorratsbehältnis 17 einer Vorratsbehältnisanordnung und ein eine Agglutinierlösung 18 zum Agglutinieren von Blutzellen aufnehmendes weiteres Vorratsbehältnis 19 der Vorratsbehältnisanordnung jeweils über einen Vorratsanschluss 20, 21 angeschlossen sind.
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Weiterhin ist die Mehrwegventileinheit 15 mit einem ersten Ausgangsanschluss 22, mit einem zweiten Ausgangsanschluss 23 und mit einem dritten Ausgangsanschluss 24 ausgestattet, wobei über den ersten Ausgangsanschluss 22, über eine ebenfalls von der Steuereinheit 2 ansteuerbare Zweiwegventileinheit 25 sowie über einen Auslassanschluss 26 der Zweiwegventileinheit 25 Inertfluidlösung 6 aus dem Inertfluidbehältnis 5 einem Multifunktionsanschluss 27 eines Fluidikchips 28, in dem die Leitungsanordnung 8 ausgebildet ist, einspeisbar ist. Die Zweiwegventileinheit 25 ist überdies über einen weiteren Auslassanschluss 29 mit einem Auffangbehältnis 30 verbunden, mit dem, wie weiter unten näher erläutert, separierte Blutbestandteile aufnehmbar sind.
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Der zweite Ausgangsanschluss 23 ist bei entsprechender Stellung der Mehrwegventileinheit 15 mit dem das Vollblut 16 aufnehmenden Vorratsbehältnis 17 verbunden und an einen ersten Speiseanschluss 31 des Fluidikchips 28 gelegt. Der dritte Ausgangsanschluss 24 der Mehrwegventileinheit 15 schließlich ist bei entsprechender Stellung der Mehrwegventileinheit 15 mit dem die Agglutinierlösung 18 aufnehmenden weiteren Vorratsbehältnis 19 verbunden und an einen zweiten Speiseanschluss 32 des Fluidikchips 28 angeschlossen.
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Der rechteckig ausgebildete Fluidikchip 28, der zweckmäßigerweise als ein Kunststoffspritzgussteil ausgebildet und zur einmaligen Verwendung vorgesehen ist, verfügt über eine Y-artig ausgebildete, mit einer Abdeckung verschlossene Leitungsanordnung 8, die einen Einlaufabschnitt 33, einen Blindabschnitt 34 und einen Auslassabschnitt 35 aufweist, die in einem Verbindungsbereich 36 miteinander verbunden sind. An einem dem Verbindungsbereich 36 abgewandten Ende ist der Einlaufabschnitt 33 mit den Speiseanschlüssen 31, 32 versehen, während der Auslassabschnitt 35 an seinem dem Verbindungsbereich 36 abgewandten Ende den Multifunktionsanschluss 27 aufweist. Der Blindabschnitt 34 ist zur Reduzierung eines Kontaminationsrisikos an seinem dem Verbindungsbereich 36 abgewandten Ende mit einem allein für gasförmiges, nicht jedoch für flüssiges Fluid durchlässigen Blindanschluss 37 versehen. Der Durchmesser der Abschnitte 33, 34, 35 liegt beispielsweise bei etwa 1,3 Millimeter. Die lange Seite des Fluidikchips 28 ist beispielsweise 75 Millimeter und die kurze Seite beispielsweise 25 Millimeter lang, so dass sich für den Einlaufabschnitt 33 und für den Blindabschnitt 34 eine Länge von jeweils etwa 140 Millimeter ergibt.
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4 zeigt den Fluidikchip 28 des Ausführungsbeispieles gemäß 3 nach Einpumpen von Inertfluidlösung 6 in den Auslassabschnitt 35 bis nahe zu dem Verbindungsbereich 26 und aufgrund entsprechendem Betätigen der Zweiwegventileinheit 25 unter fluiddynamischen Abtrennen des Multifunktionsanschlusses 27 nach Einpumpen von zuvor den Speiseanschlüssen 31, 32 vorgelegtem Vollblut 16 und vorgelegter Agglutinierlösung 18 in den Einlaufabschnitt 33 unter Mischen zu einer agglutinierte Blutzellen aufweisenden Probe 11. Nach Einbringen der agglutinierte Blutzellen beinhaltenden Probe 11 ist der Einlaufabschnitt 33 über entsprechendes Betätigen der Mehrwegventileinheit 15 unter Einschluss eines Luftpolsters 12 an das Inertfluidbehältnis 5 angeschlossen. Die Bereiche des Einlaufabschnittes 33 und des Auslassabschnittes 35 um den Verbindungsbereich 36 sowie der Blindabschnitt 34 sind mit Restluft 38 gefüllt.
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5 zeigt den Fluidikchip 28 des Ausführungsbeispieles gemäß 3 nach Bewegen der Probe 11 aus der Anordnung gemäß 4 über eine erste Zeitdauer mit einer ersten Strömungsgeschwindigkeit in einer ersten Strömungsrichtung von dem Einlaufabschnitt 33 in den Blindabschnitt 34. Die Probe 11 wird unter Auftrennen in ein Volumen mit überwiegend Plasma 13 und ein Mischvolumen 14 soweit unter Nachlauf des Luftpolsters 12 und von Inertfluidlösung 6 in den Blindabschnitt 34 gepumpt, bis unter Austreiben von Restluft 38 durch den Blindanschluss 37 das Mischvolumen 14 bis nahe zu dem Blindanschluss 37 gelangt ist. Dabei ist durch ein weiteres Luftpolster 39 bildende Restluft und die bereits in dem Auslassabschnitt 35 vorhandene Inertfluidlösung 6 sichergestellt, dass die Probe 11 ausschließlich in den Blindabschnitt 34 eintritt.
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6 zeigt den Fluidikchip 28, nachdem ausgehend von der Anordnung gemäß 5 mit entsprechender Beschaltung der Mehrwegventileinheit 15 sowie der Pumpeinheit 1 über eine zweite Zeitdauer in einer der ersten Strömungsrichtung entgegengesetzten zweiten Strömungsrichtung mit einer von der ersten Strömungsgeschwindigkeit verschiedenen zweiten Strömungsgeschwindigkeit, die bei diesem Ausführungsbeispiel kleiner als die erste Strömungsgeschwindigkeit ist, unter Verschließen der an die Speiseanschlüsse 31, 32 angeschlossenen Ausgangsanschlüsse 23, 24 und Absaugen der in dem Auslassabschnitt 35 vorhandenen Inertfluidlösung 6 nach einer Prozesszeit von typischerweise etwa 9 Minuten in dem Auslassabschnitt 35 nunmehr das Volumen mit Plasma 13 vorliegt, wobei die in dem Einlaufabschnitt 33 vorhandene Inertfluidlösung 6 zusammen mit dem in dem Verbindungsbereich 36 vorhandenen Luftpolster 12 eine fluiddynamische Sperre darstellt. Nunmehr lässt sich bei entsprechender Ansteuerung der Zweiwegventileinheit 25 über die Steuereinheit 2 das mit einer Ausbeute von etwa 40 Prozent vorliegende Plasma 13 aus dem Auslassabschnitt 35 über den Multifunktionsanschluss 27 in das Auffangbehältnis 30 überführen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- ”High flow rate microfluidic device for bloodplasmaseparationusing a rangeoftemperatures” von A. I. Rodriguez-Villarreal, M. Arundell, M. Carmona et al., Lab Chip, 2010, 10, 211–219 [0003]
- ”Passive microfluidic devices for plasmaextractionfromwhole human blond” von E. Sollier, H. Rostaing, P. Pouteau et al., Sensors and Actuators B 141 (2009) 617–624 [0004]
