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Technisches Gebiet
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Die Erfindung betrifft ein Beleuchtungsmodul für ein Mikroskop. Ferner betrifft die Erfindung ein Mikroskop mit einem Beleuchtungsmodul sowie ein Verfahren zur Bildrekonstruktion unter Verwendung eines Mikroskops.
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Hintergrund
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Aus dem Stand der Technik sind Mikroskopsysteme bekannt, die es ermöglichen, zwischen zwei Beleuchtungsmodi umzuschalten. In einem ersten Modus wird die Probe beispielsweise mit einer lichtblattartigen Lichtverteilung beleuchtet (im Folgenden auch einfach als Lichtblatt bezeichnet), sodass selektiv eine Ebene innerhalb der Probe mit dem Beleuchtungslicht beaufschlagt wird. Die beleuchtete Probenebene wird dann auf einen Detektor abgebildet, um eine zweidimensionale (2D) Schichtbildaufnahme zu generieren. Eine solche Schichtbildaufnahme kann sukzessive für verschiedene Probenebenen durchgeführt werden, um einen Stapel von Schichtbildern zu gewinnen. In einem zweiten Modus wird die Probe mit einer volumenartigen Lichtverteilung beaufschlagt, um einen ausgedehnten dreidimensionalen (3D) Volumenbereich der Probe zu beleuchten und abzubilden. Indem zwischen diesen beiden Beleuchtungsmodi gewechselt wird, kann zum Beispiel in der Fluoreszenzmikroskopie der zur Fluoreszenz angeregte Probenbereich variiert werden.
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Bisher erfolgt das Umschalten zwischen einer 2D-Bildgebung und einer 3D-Bildgebung üblicherweise durch die Ansteuerung zweier getrennter Lichtquellen, deren Licht über einen dichroitischen Strahlteiler zu einem gemeinsamen Anregungspfad vereinigt wird. Dies hat den Nachteil, dass die beiden Aufnahmemodi mit unterschiedlichen Beleuchtungswellenlängen arbeiten müssen.
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Ein besonders leistungsfähiges Mikroskopieverfahren zur 3D-Bildgebung stellt die Lichtfeld-Mikroskopie dar, die es ermöglicht, schnell ablaufende biologische Prozesse über einen längeren Zeitraum in einem Volumen aufzuzeichnen. Dabei wird die 3D-Information aus dem beobachteten Volumen auf einen 2D-Kamerasensor abgebildet, um anschließend eine rechnerische Bildrekonstruktion vorzunehmen. Die Möglichkeit, ganze Probenvolumina mit einer Geschwindigkeit entsprechend der Bildrate der Kamera ohne die Verwendung von beweglichen Teilen wie Galvanometerscanner durchzuführen, macht diese Technologie zu einem der schnellsten Mikroskopieverfahren.
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Nachteilig ist jedoch, dass die Rekonstruktion des 3D-Volumens aufgrund der Komplexität der in der Lichtfeld-Mikroskopie zu betrachtenden Punktspreizfunktion (PSF) äußerst rechenintensiv ist. So kommt in der Lichtfeld-Mikroskopie üblicherweise eine dem Detektor vorgeordnete Anordnung von Mikrolinsen zur Anwendung, sodass sich eine Vielzahl von einzelnen Punktspreizfunktionen ergibt, die in Summe eine komplexe Gesamt-PSF ergeben, die der Bildrekonstruktion zugrunde zu legen ist.
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In der Veröffentlichung WAGNER, Nils [u.a.]: Deep learning-enhanced light-field imaging with continuous validation. In: Nature Methods, Vol. 18, 2021, No. 5, S. 557-563. ISSN 1548-7105 (E); 1548-7091 (P) wurde gezeigt, dass sich die Geschwindigkeit der Bildrekonstruktion um mehrere Größenordnungen verbessern lässt, wenn anstelle von klassischen Rekonstruktionsalgorithmen wie etwa dem Richardson-Lucy-Algorithmus speziell trainierte neuronale Netzwerke verwendet werden. Jedoch macht es dieser Ansatz erforderlich, dass das neuronale Netzwerk für verschiedene Arten von Proben jeweils neu trainiert werden muss, wofür sogenannte Ground-Truth-Daten zur Verfügung gestellt werden. Dies sind Daten, die es erlauben, die Qualität des angewandten Rekonstruktionsmodells zu überprüfen.
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In der vorgenannten Veröffentlichung von Wagner et al. kommt ein System zum Einsatz, das im Grunde aus zwei Mikroskopen besteht. Bei dem Hauptmikroskop handelt es sich um ein Lichtfeldmikroskop, das auf einem Design basiert, wie es beispielsweise in der Veröffentlichung von BROXTON, Michael [u.a.]: Wave optics theory and 3-D deconvolution for the light field microscope. In: Optics Express. 2013, Bd. 21, H. 21, S. 25418-25439. ISSN 1094-4087 (E). beschrieben ist. Dieses Lichtfeldmikroskop umfasst einen Laser mit einer speziellen Optik, die es ermöglicht, das gesamte Probenvolumen, das von der Lichtfeldkamera abgebildet wird, zu beleuchten. Neben dem Hauptmikroskop kommt ein zweites Mikroskop zum Einsatz, bei dem eine Probenebene selektiv mit einem dynamisch erzeugten Lichtblatt beleuchtet und auf eine Kamera abgebildet wird. Unter Verwendung eines Paars von Galvanometerspiegeln wird dann die Probe mit einem von einem zweiten Laser erzeugten Lichtblatt längs der optischen Achse des Detektionsobjektivs abgetastet, um sequenziell einen 3D-Bildstapel zu erzeugen, der als Grundlage für das Training des neuronalen Lichtfeld-Netzwerks dient.
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Aus den Dokumenten
DE 10 2019 214 929 A1 und
HEDDE, P. N. ; GRATTON, E.: Selective Plane Illumination Microscopy with a Light Sheet of Uniform Thickness Formed by an Electrically Tunable Lens. In: Microscopy Research and Technique, 81, 2018, 924 - 928. - ISSN 1097-0029, sind Lichtblattmikroskope bekannt, bei denen sich das Lichtblatt mit Hilfe einer elektrisch durchstimmbaren Linse verschieben lässt.
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Das Dokument MADRID-WOLFF, J. [et. al.]: Light-sheet enhanced resolution of light field microscopy for rapid imaging of large volumes. In: Proc. SPIE Three-Dimensional and Multidimensional Microscopy: Image Acquisition and Processing XXV, 10499, 23.02.2018, 1 - 9. - ISSN 0277-786X offenbart die Kombination eines Lichtblattmikroskops mit einem Lichtfeldmikroskops.
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Kurzdarstellung
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein für ein Mikroskop bestimmtes Beleuchtungsmodul anzugeben, das es ermöglicht, bei gleicher Beleuchtungswellenlänge schnell und flexibel den beleuchteten Probenbereich zu ändern.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch das Beleuchtungsmodul gemäß Anspruch 1. Vorteilhafte Weiterbildungen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen sowie der folgenden Beschreibung.
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Ein Beleuchtungsmodul für ein Mikroskop umfasst eine Lichtquelle, die ausgebildet ist, Beleuchtungslicht in einen Beleuchtungsstrahlengang zu emittieren. Das Beleuchtungsmodul umfasst ein Objektiv, das in dem Beleuchtungsstrahlengang angeordnet und ausgebildet ist, das Beleuchtungslicht in eine Probe zu richten. Das Beleuchtungsmodul enthält weiterhin eine Lichtblatterzeugungskomponente, die dem Objektiv in dem Beleuchtungsstrahlengang vorgeordnet und ausgebildet ist, das Beleuchtungslicht zumindest im Zusammenwirken mit dem Objektiv zur selektiven Lichtblattbeleuchtung einer Ebene der Probe zu einer lichtblattartigen Lichtverteilung zu formen. Das Beleuchtungsmodul weist ferner ein optisches Schaltelement auf, das zwischen einer ersten optischen Einstellung und mindestens einer zweiten optischen Einstellung umschaltbar ist. Das optische Schaltelement ermöglicht in der ersten optischen Einstellung die selektive Lichtblattbeleuchtung der Probenebene. In der zweiten optischen Einstellung formt das optische Schaltelement das Beleuchtungslicht zumindest im Zusammenwirken mit dem fokussierenden optischen System zu einer volumenartigen Lichtverteilung, die einen Volumenbereich der Probe beleuchtet.
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Es sei darauf hingewiesen, dass das optische Schaltelement ausgebildet und geeignet so ansteuerbar ist, dass eine lichtblattartige Lichtverteilung in einer Ebene der Probe auch dadurch erzeugt werden kann, dass die Lichtblatterzeugungskomponente das Beleuchtungslicht im Zusammenwirken mit dem fokussierenden optischen System und dem optischen Schaltelement zu einer lichtblattartigen Lichtverteilung zur Probenbeleuchtung formt. Das fokussierende optische System kann beispielsweise ein der Probe zugewandtes Objektiv sein. Es ist jedoch hierauf nicht beschränkt.
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Das Beleuchtungsmodul ermöglicht es, auf flexible Art und Weise zwischen einer 2D-Bildgebung auf Basis einer Lichtblattbeleuchtung und einer 3D-Bildgebung auf Basis einer Volumenbeleuchtung umzuschalten. In einer bevorzugten Anwendung beruht die 3D-Bildgebung auf einer lichtfeldmikroskopischen Abbildung. Eine solche Lichtfeldabbildung lässt sich dann in besonders einfacher Weise mit Hilfe des Beleuchtungsmoduls in Korrelation zu einer lichtblattmikroskopischen Abbildung setzen. Dabei ist es von besonderem Vorteil, dass das Beleuchtungsmodul über das in ihm enthaltene optische Schaltelement im Stande ist, die unterschiedlichen Lichtverteilungen mit ein- und derselben Wellenlänge zu generieren. Damit kann auch auf einen dichroitischen Strahlteiler verzichtet werden, wie er in herkömmlichen Systemen häufig zum Einsatz kommt.
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Das optische Schaltelement ermöglicht in der ersten optischen Einstellung die selektive Lichtblattbeleuchtung der Probenebene, indem es das Beleuchtungslicht, das von der Lichtblatterzeugungskomponente im Zusammenwirken mit dem fokussierenden optischen System zu der lichtblattartigen Lichtverteilung geformt wird, unbeeinflusst lässt. Eine solche Ausführungsform lässt sich beispielsweise realisieren, indem das optische Schaltelement mittels eines Aktors in den Beleuchtungsstrahlengang einbringbar und aus diesem entfernbar ist. Die erste optische Einstellung korrespondiert dann mit einem Betriebszustand, in dem das optische Schaltelement aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt ist. Hingegen ist das optische Schaltelement in der zweiten optischen Einstellung in den Beleuchtungsstrahlengang eingebracht und trägt so in Folge seiner optischen Wirkung bei, die volumenartige Lichtverteilung zu generieren.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist das optische Schaltelement ein Element mit variabler optischer Wirkung, das in beiden optischen Einstellungen in dem Beleuchtungsstrahlengang angeordnet ist. In diesem Fall ist es in vorteilhafter Weise möglich, die Beleuchtung allein über die variable optische Wirkung des Schaltelementes zu steuern.
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Das optische Schaltelement ist vorzugsweise eine optische Linse mit variabler Brennweite. Eine solche Linse kann beispielsweise als Flüssiglinse ausgeführt sein. Alternativ kann als Schaltelement auch ein deformierbarer Spiegel oder ein räumlicher Lichtmodulator verwendet werden.
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Das optische Schaltelement ist beispielsweise ausgebildet, in der zweiten optischen Einstellung das Beleuchtungslicht in die hintere Brennebene des fokussierenden optischen Systems oder in deren Nähe zu fokussieren. In dieser Ausführungsform wird das Beleuchtungslicht zum Zwecke der Volumenbeleuchtung in die Eintrittspupille des fokussierenden optischen Systems fokussiert. Dadurch wird die ansonsten lichtblattgenerierende Wirkung des fokussierenden optischen Systems weitestgehend außer Kraft gesetzt.
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In einer alternativen Ausführungsform kann das optische Schaltelement auch ausgebildet sein, den Abstand zwischen der Lichtquelle und der Eintrittspupille des fokussierenden optischen Systems zu variieren.
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In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann das optische Schaltelement eine Anordnung akusto-optischer Deflektoren (AOD) aufweisen, die durch das Anlegen unterschiedlicher Radiofrequenzen bzw. dem Ein- und Ausschalten dieser Radiofrequenzen die gleiche Wirkung wie eine Linse mit variabler Brennweite aufweisen. Je nach Ausführung kann hierbei die Brennweite in den beiden lateralen Raumrichtungen unterschiedlich sein. Beispielhaft wird auf die Veröffentlichung von KIRKBY, Paul A. ; NADELLA, K.M. Naga Srinivas ; SILVER, R. Angus: A compact acousto-optic lens for 2D and 3D femtosecond based 2-photon microscopy. In: Optics Express (OpEx), Bd. 18, 2010, H. 13, S. 13720-13744. - ISSN 1094-4087 (E) verwiesen.
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Die Lichtblatterzeugungskomponente umfasst vorzugsweise ein astigmatisches optisches System, das in dem Beleuchtungsstrahlengang zwischen dem optischen Schaltelement und dem fokussierenden optischen System angeordnet ist. Ein solches astigmatisches System kann beispielsweise in Form einer Zylinderlinse realisiert sein.
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Das optische Schaltelement kann ausgebildet sein, in der zweiten optischen Einstellung das Beleuchtungslicht in das astigmatische optische System oder in dessen Nähe zu fokussieren. Durch diese Fokussierung wird der Strahlquerschnitt des Beleuchtungslichtes am Ort des astigmatischen optischen Systems verringert, um von der Lichtblattbeleuchtung auf die Volumenbeleuchtung umzuschalten.
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Vorzugsweise umfasst die Lichtblatterzeugungskomponente eine Strahlablenkeinheit, die ausgebildet ist, die lichtblattartige Lichtverteilung durch Scannen des Beleuchtungslichts zu erzeugen. Diese Ausführungsform arbeitet nach dem Prinzip eines Laser-Scanning-Mikroskops, bei dem das Beleuchtungslicht in einer Abtastbewegung über die Probe geführt wird. Diese Abtastbewegung ist allerdings im vorliegenden Fall so schnell, dass die Zeit, die der Lichtstrahl zur Abtastung des gesamten Probenbereichs benötigt, kürzer als die Aufnahmezeit einer Kamera ist, auf die der Probenbereich abgebildet wird. Als Strahlablenkeinheit kommt beispielsweise ein schnell beweglicher Abtastspiegel zum Einsatz.
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Das Beleuchtungsmodul kann ferner eine Relaisoptik umfassen, die in dem Beleuchtungsstrahlengang zwischen der Strahlablenkeinheit und dem fokussierenden optischen System angeordnet und ausgebildet ist, die Strahlablenkeinheit auf die hintere Brennebene des fokussierenden optischen Systems abzubilden. Eine solche Relaisoptik beinhaltet beispielsweise eine Scanlinse und eine Tubuslinse, die in Lichtausbreitungsrichtung vor dem fokussierenden optischen System angeordnet ist.
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Die Strahlablenkeinheit kann in dem Beleuchtungsstrahlengang dem optischen Schaltelement nachgeordnet sein. Dadurch ist gewährleistet, dass das Beleuchtungslicht am Ort des optischen Schaltelementes keine Abtastbewegung ausführt. Mögliche Aberrationen innerhalb des Schaltelementes beeinträchtigen deshalb die Qualität der Beleuchtung nur wenig.
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Alternativ ist die Strahlablenkeinheit in dem Beleuchtungsstrahlengang dem optischen Schaltelement vorgeordnet. Dies hat den Vorteil, dass am Ort der Strahlablenkeinheit keine durch das Schaltelement verursachte Fokussierung des Beleuchtungslichtes auftritt.
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Vorzugsweise ist die Lichtquelle steuerbar, die Intensität des Beleuchtungslichts in Abhängigkeit der optischen Einstellung des optischen Schaltelementes zu variieren. Dies ermöglicht es, die Lichtbelastung der Probe in Abhängigkeit des Beleuchtungsmodus zu steuern. Insbesondere kann die Intensität des Beleuchtungslichtes im Modus der Volumenbildgebung höher eingestellt werden als im Modus der Lichtblattbildgebung.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist das optische Schaltelement in Abhängigkeit der Wellenlänge des Beleuchtungslichts steuerbar.
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Die Lichtquelle kann mehrere Laser umfassen, deren Laserlicht in dem Beleuchtungsstrahlengang zu dem Beleuchtungslicht zusammengeführt ist.
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Vorzugsweise haben die lichtblattartige Lichtverteilung und die volumenartige Lichtverteilung die gleiche Wellenlänge.
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Die Umschaltung durch ein optisches Schaltelement zwischen der ersten optischen Einstellung, in der die lichtblattartige Lichtverteilung erzeugt wird, und der zweiten optischen Einstellung, in der die volumenartige Lichtverteilung erzeugt wird, erfolgt vorzugsweise innerhalb von 100 ms, besonders vorzugsweise innerhalb von 25 ms und ganz besonders vorzugsweise innerhalb von 10 ms. Ebenso erfolgt die Umschaltung durch das optisches Schaltelement zwischen der zweiten optischen Einstellung, in der die volumenartige Lichtverteilung erzeugt wird, und der ersten optischen Einstellung, in der die lichtblattartige Lichtverteilung erzeugt wird, vorzugsweise innerhalb von 100 ms, besonders vorzugsweise innerhalb von 25 ms und ganz besonders vorzugsweise innerhalb von 10 ms.
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Gemäß einem weiteren Aspekt ist ein Mikroskop mit einem Beleuchtungsmodul oben beschriebener Art vorgesehen. Dabei kann das Mikroskop eine lichtblattmikroskopische Funktionseinheit aufweisen, die für die Beleuchtung und die Detektion zwei separate Objektive vorsieht, deren optische Achsen um einen bestimmten Winkel, vorzugsweise 90°, gegeneinander verkippt sind. Alternativ kann die lichtblattmikroskopische Funktionseinheit auch nach dem Prinzip der Schiefebenenmikroskopie arbeiten, bei dem ein- und dasselbe Objektiv für die Beleuchtung und die Detektion genutzt wird.
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Vorzugsweise umfasst das Mikroskop eine Detektionsvorrichtung mit einem ersten Detektionsmodul, das der ersten optischen Einstellung des optischen Schaltelementes zugeordnet ist, und einem zweiten Detektionsmodul, das der zweiten optischen Einstellung des optischen Schaltelementes zugeordnet ist. In dieser Ausführungsform dient das erste Detektionsmodul der Lichtblattbildgebung, während das zweite Detektionsmodul für die Volumenbildgebung genutzt wird.
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In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Detektionsvorrichtung ein separat von dem fokussierenden optischen System des Beleuchtungsmoduls vorgesehenes Objektiv.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das zweite Detektionsmodul eine Lichtfeldkamera. Einer solchen Lichtfeldkamera ist beispielsweise eine Mikrolinsen-Anordnung vorgeordnet, die es ermöglicht, die gewünschte 3D-Bildinformation zu generieren. Hierfür sind prinzipiell sowohl Lichtfeldkameras, bei denen die Mikrolinsen-Anordnung in einer Bild- oder Zwischenbildebene angeordnet ist, als auch Lichtfeldkameras geeignet, bei denen sich die Mikrolinsen-Anordnung in einer zu einer Pupillenebene konjugierten Ebene („Fourier-Lichtfeld“) befindet.
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Gemäß einem weiteren Aspekt ist ein Verfahren zur Bildrekonstruktion unter Verwendung eines Mikroskops oben beschriebener Art vorgesehen. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Aufnehmen eines Stapels von Bildern verschiedener Ebenen einer Probe mittels des ersten Detektionsmoduls in der ersten optischen Einstellung des optischen Schaltelementes; Aufnehmen eines Volumenbildes der Probe mittels des zweiten Detektionsmoduls in der zweiten optischen Einstellung des optischen Schaltelementes; Trainieren eines neuronalen Netzwerks auf Grundlage des Stapels aufgenommener Bilder und des Volumenbildes; Aufnehmen eines weiteren Volumenbildes der Probe oder einer anderen Probe mittels des zweiten Detektionsmoduls in der zweiten optischen Einstellung des optischen Schaltelementes; und Auswerten des weiteren Volumenbildes mittels des trainierten neuronalen Netzwerks.
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Bei diesem Verfahren erfolgt das Trainieren des neuronalen Netzwerkes anhand von Bildern, die von der anschließend zu analysierenden Probe oder einer anderen Probe aufgenommen werden. Diese andere Probe ist vorzugsweise eine Referenzprobe, die der eigentlich zu untersuchenden Probe ähnlich ist. Dabei ist das auszuwertende Volumenbild nicht auf ein Einzelbild beschränkt. Vielmehr kann auch eine ganze Serie von Volumenbildern auf diese Weise ausgewertet werden. Auch zum Trainieren des neuronalen Netzwerkes können mehrere Bildstapel und/oder mehrere Volumenbilder verwendet werden.
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Das Verfahren ermöglicht es, die Bildrekonstruktion zu vereinfachen, indem bei der Auswertung der lichtfeldmikroskopischen Aufnahme Bildinformation genutzt wird, die über einen lichtblattmikroskopisch aufgenommenen Bildstapel gewonnen wird.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
- 1 ein Beleuchtungsmodul gemäß einem Ausführungsbeispiel in zwei orthogonalen Schnittansichten, wobei sich ein optisches Schaltelement in einer ersten optischen Einstellung befindet, in der eine lichtblattartige Lichtverteilung erzeugt wird;
- 2 das Beleuchtungsmodul aus 1 in zwei orthogonalen Schnittansichten, wobei sich das optische Schaltelement in einer zweiten optischen Einstellung, befindet, in der eine volumenartige Lichtverteilung erzeugt wird;
- 3 zwei unterschiedliche Betriebsmodi eines Beleuchtungsmoduls nach einem weiteren Ausführungsbeispiel, wobei sich das optische Schaltelement in 3(A) in der ersten optischen Einstellung, in der die lichtblattartige Lichtverteilung erzeugt wird, und in 3(B) in der zweiten optischen Einstellung befindet, in der die volumenartige Lichtverteilung erzeugt wird;
- 4 zwei unterschiedliche Betriebsmodi eines Beleuchtungsmoduls nach einem weiteren Ausführungsbeispiel, wobei sich das optische Schaltelement in 4(A) in der ersten optischen Einstellung, in der die lichtblattartige Lichtverteilung erzeugt wird, und in 4(B) in der zweiten optischen Einstellung befindet, in der die volumenartige Lichtverteilung erzeugt wird;
- 5 ein Mikroskop in einer Schnittansicht, welches das Beleuchtungsmodul aus den 1 und 2 enthält, wobei sich das optische Schaltelement in der ersten optischen Einstellung zur Erzeugung der lichtblattartigen Lichtverteilung befindet;
- 6 das Mikroskop aus 5 in einer Schnittdarstellung, wobei sich das optische Schaltelement in der zweiten optischen Einstellung zur Erzeugung der volumenartigen Lichtverteilung befindet; und
- 7 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines beispielhaften Verfahrens zur Bildrekonstruktion unter Verwendung des Mikroskops aus den 5 und 6.
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1 zeigt in schematischer Darstellung ein für ein Mikroskop bestimmtes Beleuchtungsmodul 100 in zwei orthogonalen Schnittansichten. Bezugnehmend auf ein rechtwinkliges Koordinatensystem x-y-z ist das Beleuchtungsmodul 100 in dem oberen Teilbild (A) der 1 in einem x-z-Schnitt und in dem unteren Teilbild (B) der 1 in einem y-z-Schnitt dargestellt.
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Das Beleuchtungsmodul 100 umfasst eine Lichtquelle 102, die ausgebildet ist, Beleuchtungslicht 104 in einen Beleuchtungsstrahlengang 106 zu emittieren, der auf eine zu beleuchtende Probe 108 führt. Die Lichtquelle 102 umfasst beispielsweise einen oder mehrere Laser 110, deren Laserlicht in eine Lichtleitfaser 112 eingekoppelt wird. Das Lichtaustrittsende der Lichtleitfaser 112 stellt eine Punktquelle dar, die das Beleuchtungslicht 104 dem Beleuchtungsstrahlengang 106 zuführt. Der Einfachheit halber ist die Ankopplung des Lasers 110 an die Lichtleitfaser 112 nur in dem oberen Teilbild (A) der 1 gezeigt und in den anderen Figuren weggelassen.
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Das Beleuchtungsmodul 100 weist ferner ein in dem Beleuchtungsstrahlengang 106 angeordnetes fokussierendes optisches System, z.B. ein Objektiv 114 auf, welches das Beleuchtungslicht 104 auf die Probe 108 richtet. In dem Beleuchtungsstrahlengang 106 befindet sich eine Lichtblatterzeugungskomponente 116, die dem Objektiv 114 in Lichtausbreitungsrichtung vorgeordnet ist. Die Lichtblatterzeugungskomponente 116 dient dazu, im Zusammenwirken mit dem Objektiv 114 das Beleuchtungslicht 104 zu einer lichtblattartigen Lichtverteilung zu formen, um die Probe 108 selektiv in einer Probenebene zu beleuchten. In dem gezeigten Ausführungsbeispiel wird so in der Probe 108 ein Lichtblatt 118 erzeugt, dessen Ausdehnung in x-Richtung um ein Vielfaches größer als in y-Richtung ist, wie im rechten Teil der 1 gezeigt ist. In dem Beispiel nach 1 liegt die Lichtblattebene somit in der x-z-Ebene.
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Die Lichtblatterzeugungskomponente 116 umfasst beispielsweise ein astigmatisches optisches System wie etwa eine Zylinderlinse 120, deren Lichteintrittsfläche lediglich in der x-Richtung gekrümmt ist, während sie in der y-Richtung plan ist. Damit weitet die Zylinderlinse 120 den Strahlquerschnitt des durch sie tretenden Beleuchtungslichtes 104 in x-Richtung auf, wie in Teilbild (A) der 1 gezeigt ist. Dagegen bleibt der Strahlquerschnitt des Beleuchtungslichtes 104 beim Durchtritt durch die Zylinderlinse 120 in y-Richtung im Wesentlichen unbeeinflusst, wie das Teilbild (B) der 1 zeigt.
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Das Beleuchtungsmodul 100 weist in dem Beleuchtungsstrahlengang 106 ferner ein optisches Schaltelement 122 auf. Wie nachfolgend im Detail erläutert, hat das optische Schaltelement 122 die Funktion, zwischen einer 2D- und einer 3D-Beleuchtung der Probe 108 umzuschalten. In dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel ist dem optischen Schaltelement 122 ein Kollimator 124 vorgeordnet, der das Beleuchtungslicht 104, das die Lichtleitfaser 112 als divergentes Strahlenbündel aussendet, kollimiert und auf das optische Schaltelement 122 richtet.
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Das optische Schaltelement 122 ist zwischen zwei optischen Einstellungen umschaltbar. In einer ersten optischen Einstellung, die in 1 gezeigt ist, ermöglicht das optische Schaltelement 122 die selektive Lichtblattbeleuchtung einer Probenebene. In dem Ausführungsbeispiel nach 1 wird dies dadurch erreicht, dass das optische Schaltelement 122 das Beleuchtungslicht 104, das von der Zylinderlinse 120 im Zusammenwirken mit dem Objektiv 114 zu dem Lichtblatt 118 geformt wird, weitgehend unbeeinflusst lässt. Dies bedeutet, dass das optische Schaltelement 122 in der ersten optischen Einstellung keine brechende Wirkung auf das Beleuchtungslicht 104 ausübt.
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In einer zweiten optischen Einstellung, die in 2 gezeigt ist, sorgt hingegen das optische Schaltelement 122 dafür, dass das Beleuchtungslicht 104 nicht mehr zu einer lichtblattartigen Lichtverteilung, sondern zu einer volumenartigen Lichtverteilung 128 geformt wird. Dies ist im rechten Teil der 2 gezeigt, wonach die Lichtverteilung 128 in y-Richtung eine deutlich größere Ausdehnung als das in 1 gezeigte Lichtblatt hat. Wie in 2 veranschaulicht, hat das optische Schaltelement 122 in seiner zweiten optischen Einstellung eine fokussierende Wirkung auf das Beleuchtungslicht 104, das als kollimiertes Strahlbündel auf das optische Schaltelement 122 fällt.
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In dem Beispiel nach 2 ist das optische Schaltelement 122 ausgebildet, das Beleuchtungslicht 104 in der zweiten optischen Einstellung in die hintere Brennebene des Objektivs 114 oder in deren Nähe zu fokussieren. Dies bedeutet, dass das optische Schaltelement 122 das Beleuchtungslicht 104 in diesem Beispiel im Wesentlichen in die Eintrittspupille des Objektivs 114 fokussiert. Es kommt dabei auch zu einer signifikanten Fokussierung des Beleuchtungslichts 104 im Bereich der Zylinderlinse 120. Dadurch findet eine Umschaltung der in 1 gezeigten 2D-Lichtblattbeleuchtung hin zu der in 2 gezeigten 3D-Volumenbeleuchtung statt. Diese Umschaltung wird über eine Steuereinheit 126 veranlasst, die das optische Schaltelement 122 entsprechend steuert. Zur Vereinfachung der Darstellung ist die Steuereinheit 126 wiederum lediglich in dem Teilbild (A) der 1 gezeigt und in den anderen Figuren weggelassen.
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In dem Ausführungsbeispiel gemäß den 1 und 2 ist das optische Schaltelement 122 eine optische Linse, z. B. eine Flüssiglinse, deren Brennweite über die Steuereinheit 126 variierbar ist. Eine solche Ausführung ist jedoch nur beispielhaft zu verstehen. So kann das optische Schaltelement 122 z.B. auch als deformierbarer Spiegel oder räumlicher Lichtmodulator (SLM) ausgeführt sein, dessen Wirkung auf das Beleuchtungslicht 104 über die Steuereinheit 126 variierbar ist.
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Abgesehen von der konkreten Ausgestaltung des optischen Schaltelementes 122 kann das Beleuchtungslicht 104 zum Zwecke der Umschaltung zwischen der Lichtblattbeleuchtung und der Volumenbeleuchtung auch in grundsätzlich anderer Weise vorgenommen werden als in dem in den 1 und 2 gezeigten Ausführungsbeispiel. Beispielsweise kann das optische Schaltelement 122 auch so ausgebildet sein, dass es bei einer Umschaltung zwischen den beiden Schaltzuständen den Abstand zwischen der Lichtquelle 102 und der Eintrittspupille des Objektivs 114 in geeigneter Weise verändert.
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In 3 ist ein Beleuchtungsmodul 200 gezeigt, das ein weiteres Ausführungsbeispiel darstellt. Diejenigen Komponenten des Beleuchtungsmoduls 200, die den Komponenten des in den 1 und 2 gezeigten Ausführungsbeispiels entsprechen, sind mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet.
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Im Unterschied zum vorherigen Ausführungsbeispiel arbeitet das Beleuchtungsmodul 200 gemäß 3 mit einer dynamischen Lichtblatterzeugung, bei der das Lichtblatt durch Scannen des Beleuchtungslichtes 104 generiert wird. Dementsprechend enthält das Beleuchtungsmodul 200 anstelle des astigmatischen optischen Systems 116 eine Strahlablenkeinheit 230, die beispielsweise einen schnell beweglichen Abtastspiegel aufweist, der das Beleuchtungslicht 104 in einer Abtastbewegung über den zu beleuchtenden Probenbereich bewegt. Dabei ist die Zeit, in der das Beleuchtungslicht 104 über den zu beleuchtenden Probenbereich bewegt wird, deutlich kürzer als die typische Aufnahmezeit einer Kamera, auf die der Probenbereich abgebildet wird.
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In dem Ausführungsbeispiel nach 3 enthält das Beleuchtungsmodul 200 eine Relaisoptik 232, die zwischen der Strahlablenkeinheit 230 und dem Objektiv 114 angeordnet ist. Die Relaisoptik 232 ist beispielsweise aus einer Scanlinse 234 und einer Tubuslinse 236 gebildet. Die Relaisoptik 232 dient dazu, die Strahlablenkeinheit 230 auf die hintere Brennebene des Objektivs 114 abzubilden.
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In dem in 3 gezeigten Ausführungsbeispiel befindet sich das optische Schaltelement 122 zwischen der Strahlablenkeinheit 230 und der Relaisoptik 232. In der ersten optischen Einstellung des Schaltelementes 122, die in 3 in dem oberen Teilbild (A) gezeigt ist, lässt das Schaltelement 122 das hindurchtretende Beleuchtungslicht 104 unbeeinflusst. Damit bleibt auch das Lichtblatt 118, das von der Strahlablenkeinheit 230 im Zusammenwirken mit dem Objektiv 114 generiert wird, von dem optischen Schaltelement 122 unbeeinflusst.
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Wird das Schaltelement 122 hingegen in die zweite optische Einstellung geschaltet, die in dem unteren Teilbild (B) der 3 gezeigt ist, so fokussiert das Schaltelement 122 das Beleuchtungslicht 104 in die hintere Brennebene des Objektivs 114. Wiederum kann das optische Schaltelement 122 beispielsweise als optische Linse mit variabler Brennweite ausgeführt sein, sodass zum Zwecke der vorstehend genannten Fokussierung die Brennweite entsprechend eingestellt wird. Durch die Fokussierung des Beleuchtungslichts 104 in die hintere Brennebene des Objektivs 114 entsteht ein nahezu kollimierter Strahl, der in der Probe 108 die gewünschte volumenartige Lichtverteilung erzeugt. In der zweiten optischen Einstellung ist die Strahlablenkeinheit 230 deaktiviert. Die Strahlablenkeinheit 230 ist dann so eingestellt, dass das an ihr reflektierte Beleuchtungslicht 104 in dem Beleuchtungsstrahlengang 106 mittig längs der optischen Achse propagiert.
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In dem Ausführungsbeispiel gemäß 3 ist das optische Schaltelement 122 der Strahlablenkeinheit 230 in dem Beleuchtungsstrahlengang nachgeordnet. Dadurch wird vermieden, dass das optische Schaltelement 122 in der zweiten optischen Einstellung einen Fokus des Beleuchtungslichtes 104 generiert, der sich in der Nähe der Strahlablenkeinheit 230 befindet. Jedoch fällt in dieser Konfiguration der durch die Strahlablenkeinheit 230 bewegte Lichtstrahl auf das Schaltelement 122. In Folge dieser Abtastbewegung können Aberrationen, die in dem optischen Schaltelement 122 auftreten, die Präzision der Probenbeleuchtung beeinträchtigen.
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Um eine solche Beeinträchtigung zu vermeiden, kann das Beleuchtungsmodul 200 gemäß 4 abgewandelt werden. Bei dieser Abwandlung ist das optische Schaltelement 122 in Lichtausbreitungsrichtung vor der Strahlablenkeinheit 230 angeordnet. Damit führt das Beleuchtungslicht 104 am Ort des Schaltelementes 122 keine Abtastbewegung aus. Aberrationen, die möglicherweise in dem Schaltelement 122 auftreten, haben deshalb einen geringeren Einfluss auf die Beleuchtungsqualität.
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Wie oben erwähnt, können die Einstellungen des optischen Schaltelementes 122 über die Steuereinheit 126 in der gewünschten Weise gesteuert werden. Dabei ist es insbesondere möglich, das optische Schaltelement 122 in Abhängigkeit der Wellenlänge des Beleuchtungslichts 104 einzustellen. Ist das Schaltelement 122 beispielsweise als Linse mit variabler Brennweite ausgeführt, so lassen sich dadurch die zur Probenbeleuchtung erforderlichen Lichtverteilungen in der jeweils gewünschten Form präzise einstellen, auch wenn die Wellenlänge des Beleuchtungslichts variiert wird. Ohne eine solche wellenlängenabhängige Steuerung des Schaltelementes 122 könnten ansonsten bei Änderung der Wellenlänge unerwünschte Aberrationen auftreten.
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Die Steuereinheit 126 kann auch dazu genutzt werden, die Intensität des von der Lichtquelle 102 ausgesendeten Beleuchtungslichtes 104 in Abhängigkeit der Einstellparameter des optischen Schaltelementes 122 zu variieren. So wird in einer 3D-Bildgebung, in der die Probe 108 mit der volumenartigen Lichtverteilung beleuchtet wird, die Intensität des Beleuchtungslichtes 104 in der Regel höher sein müssen als im Falle einer 2D-Bildgebung, bei der die Probe 108 selektiv in einer Ebene mit dem Lichtblatt beleuchtet wird.
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Es ist insbesondere darauf hinzuweisen, dass es die in 1 bis 4 gezeigten Konfigurationen ermöglichen, die gewünschten Lichtverteilungen für die 2D- und 3D-Bildgebung bei der gleichen Wellenlänge zu generieren. Darin unterscheiden sich diese Konfigurationen von herkömmlichen Lösungen, die zum Zwecke der Umschaltung zwischen zwei Beleuchtungsmodi in der Regel mit zwei getrennten Lichtquellen arbeiten, deren Licht unterschiedlicher Wellenlänge über einen dichroitischen Strahlteiler zu einem gemeinsamen Beleuchtungspfad vereinigt wird. Bei der hier vorgeschlagenen Lösung kann hingegen mit ein- und derselben Lichtquelle und insbesondere ohne dichroitischen Strahlteiler gearbeitet werden, um die verschiedenen Beleuchtungsmodi bereitzustellen.
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In den 5 und 6 ist ein Mikroskop 550 gezeigt, das ein Beleuchtungsmodul oben beschriebener Art enthält. Dabei wird im Folgenden angenommen, dass das Beleuchtungsmodul 100 der in den 1 und 2 gezeigten Konfiguration entspricht. Es versteht sich allerdings von selbst, dass auch die in den 3 und 4 gezeigten Konfigurationen sowie Abwandlungen davon in dem Mikroskop 550 zum Einsatz kommen können.
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Das Mikroskop 550 ermöglicht eine 2D-Bildgebung auf Basis einer Lichtblattbeleuchtung sowie eine 3D-Bildgebung auf Basis einer Volumenbeleuchtung. Die 3D-Bildgebung erfolgt dabei nach dem Prinzip der Lichtfeld-Mikroskopie, bei der die 3D-Information aus dem beleuchteten Probenvolumen auf einen 2D-Kamerasensor abgebildet und anschließend eine rechnerische Bildrekonstruktion durchgeführt wird.
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Das Mikroskop 550 weist neben dem Beleuchtungsmodul 100 eine Detektionsvorrichtung 552 auf, die dazu dient, die in dem jeweiligen Modus beleuchtete Probe 108 in 2D bzw. 3D abzubilden. Wie weiter oben erläutert, erfolgt dabei die 2D/3D-Umschaltung über das in dem Beleuchtungsmodul 100 enthaltene optische Schaltelement 122. 5 veranschaulicht die 2D-Bildgebung in der ersten optischen Einstellung des Schaltelementes 122. Demgegenüber zeigt 6 die 3D-Bildgebung in der zweiten optischen Einstellung des Schaltelementes 122.
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Die Detektionsvorrichtung 552 weist in dem gezeigten Ausführungsbeispiel ein separat von dem Objektiv 114 des Beleuchtungsmoduls 100 vorgesehenes Objektiv 554 auf, das Detektionslicht aus der beleuchteten Probe 108 sammelt. In der gezeigten Ausführungsform sind die beiden Objektive 114 und 554 mit ihren optischen Achsen senkrecht zueinander angeordnet. In Ausbreitungsrichtung des Detektionslichtes ist dem Objektiv 554 ein Strahlteiler 556 nachgeordnet. Dieser ist beispielsweise als Neutralteiler ausgeführt und lässt einen Teil des Detektionslichtes durch, während er den anderen Teil reflektiert.
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Im Strahlengang des transmittierten Detektionslichtes folgt auf den Strahlteiler 556 eine Tubuslinse 558 sowie eine Kamera 560. Die Tubuslinse 558 und die Kamera 560 bilden ein erstes Detektionsmodul 562, das funktionsmäßig der ersten optischen Einstellung des optischen Schaltelementes 122 zugeordnet ist.
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Im Strahlengang des an dem Strahlteiler 556 reflektierten Detektionslichtes sind nacheinander eine Tubuslinse 564, eine Mikrolinsen-Anordnung 566 und eine Kamera 568 angeordnet. Die Tubuslinse 564, die Mikrolinsen-Anordnung 566 und die Kamera 568 bilden ein zweites Detektionsmodul 570, das der zweiten optischen Einstellung des optischen Schaltelementes 122 zugeordnet ist.
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Alternativ kann der Strahlteiler 556 auch durch einen Spiegel, der motorisiert in den Strahlengang eingebracht und wieder entfernt werden kann, ersetzt werden. Je nach Schaltstellung wird das Detektionslicht dabei entweder komplett reflektiert oder transmittiert.
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Um mit dem Mikroskop 550 wahlweise eine 2D-Lichtblattbildgebung unter Verwendung des ersten Detektionsmoduls 562 oder eine 3D-Lichtfeldbildgebung unter Verwendung des zweiten Detektionsmoduls 570 durchzuführen, wird das optische Schaltelement 122 zwischen den beiden in den 5 und 6 gezeigten Betriebsmodi umgeschaltet.
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Ein beispielhaftes Verfahren, das zur Bildrekonstruktion auf Basis einer kombinierten Lichtblatt-/Lichtfeldbildgebung basiert, ist in dem Flussdiagramm nach 7 gezeigt.
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In Schritt S1 wird zunächst ein Stapel von Bildern verschiedener Ebenen der Probe 108 oder einer der Probe 108 ähnlichen Probe aufgenommen. Für jedes dieser Bilder befindet sich das optische Schaltelement 122 in der ersten optischen Einstellung, in der das Beleuchtungsmodul 100 die Probe mit dem Lichtblatt 118 beleuchtet. Die Aufnahme des jeweiligen Bildes erfolgt über das erste Detektionsmodul 562. Um sukzessive verschiedene Probenebenen anzufahren, ist es beispielsweise möglich, die Probe 108 in z-Richtung zu verschieben. Zusätzlich zu dem mit dem ersten Detektionsmodul 562 in der ersten optischen Einstellung des Schaltelements 122 aufgenommenen Bildstapel wird nun noch in der zweiten optischen Einstellung des Schaltelements 122 mit dem zweiten Detektionsmodul 570 ein Volumenbild dieser Probe aufgenommen.
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Auf Basis des in Schritt S1 aufgenommenen Bildstapels und des Volumenbildes (und gegebenenfalls weiter aufgenommener Bildstapel und Volumenbilder) wird dann in Schritt S2 ein neuronales Netzwerk trainiert.
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In Schritt S3 wird durch das Beleuchtungsmodul 100 eine volumenartige Lichtverteilung in der Probe 108 erzeugt. Das optische Schaltelement 122 des Beleuchtungsmoduls 100 befindet sich dabei in der zweiten optischen Einstellung, in der das Beleuchtungslicht 104 in die hintere Brennebene des Objektivs 114 fokussiert wird. Auf diese Weise wird unter Verwendung des zweiten Detektionsmoduls 570 ein Volumenbild der Probe 108 nach der Lichtfeldtechnik generiert.
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In Schritt S4 wird schließlich ein Volumenbild oder eine Serie von Volumenbildern auf Basis des neuronalen Netzwerks ausgewertet, das zuvor in Schritt S2 trainiert worden ist.
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Der Begriff „und/oder“ umfasst alle Kombinationen von einem oder mehreren der zugehörigen aufgeführten Elemente und kann mit „/“ abgekürzt werden.
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Obwohl einige Aspekte im Rahmen einer Vorrichtung beschrieben wurden, ist es klar, dass diese Aspekte auch eine Beschreibung des entsprechenden Verfahrens darstellen, wobei ein Block oder eine Vorrichtung einem Verfahrensschritt oder einer Funktion eines Verfahrensschritts entspricht. Analog dazu stellen Aspekte, die im Rahmen eines Verfahrensschritts beschrieben werden, auch eine Beschreibung eines entsprechenden Blocks oder Elements oder einer Eigenschaft einer entsprechenden Vorrichtung dar.
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Bezugszeichenliste
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- 100
- Beleuchtungsmodul
- 102
- Lichtquelle
- 104
- Beleuchtungslicht
- 106
- Beleuchtungsstrahlengang
- 108
- Probe
- 110
- Laser
- 112
- Lichtleitfaser
- 114
- Objektiv
- 116
- Lichtblatterzeugungskomponente
- 118
- Lichtblatt
- 120
- Zylinderlinse
- 122
- Schaltelement
- 124
- Kollimator
- 126
- Steuereinheit
- 128
- volumenartige Lichtverteilung
- 230
- Strahlablenkeinheit
- 232
- Relaisoptik
- 234
- Scanlinse
- 236
- Tubuslinse
- 550
- Mikroskop
- 552
- Detektionsvorrichtung
- 554
- Objektiv
- 556
- Strahlteiler
- 558
- Tubuslinse
- 560
- Kamera
- 562
- erstes Detektionsmodul
- 564
- Tubuslinse
- 566
- Mikrolinsen-Anordnung
- 568
- Kamera
- 570
- zweites Detektionsmodul
