DE102010051404B4

DE102010051404B4 - Verwendung von substituierten Salicylaniliden zur Behandlung von Fischen

Info

Publication number: DE102010051404B4
Application number: DE102010051404.7A
Authority: DE
Inventors: Marc de Cocq; Andreas Uhlfelder
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-16
Filing date: 2010-11-16
Publication date: 2017-08-31
Anticipated expiration: 2030-11-17
Also published as: DE102010051404A1

Abstract

Verwendung von Rafoxanid zur Behandlung von Parasitosen bei Fischen, verursacht durch monogene Trematoden und Flagellaten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von substituierten Salicylaniliden zur Behandlung von Parasitosen bei Fischen.
Parasitosen sind bei Fischen, insbesondere bei solchen, die in Aquarien, sonstigen Becken oder in Aquakultur gehalten werden, weit verbreitet.
Zur Prophylaxe bzw. Therapie von Parasitosen bei Fischen werden gegenwärtig unter anderem Wirkstoffe aus der Gruppe der Organophosphate (Wirkmechanismus: irreversible Hemmung der Cholinesterase), der Isocholinderivate (Erhöhung der Ca2+-Permeabilität) und der Imidazolderivate (cholinerge Wirkung und zusätzliche Hemmung der Acetylcholinesterase) eingesetzt.
Grundsätzlich besteht bei anhaltender und/oder wiederholter Anwendung von Antiparasitika mit gleichem oder sehr ähnlichem Wirkmechanismus die Gefahr, dass eine Selektion resistenter Parasiten erfolgt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein weiteres Mittel zur Bekämpfung von Parasitosen bei Fischen bereitzustellen.
Gelöst wird die Aufgabe durch die Verwendung von substituierten Salicylaniliden zur Behandlung von Parasitosen bei Fischen, wobei die substituierten Salicylanilde die chemische Formel
aufweisen oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon oder Solvate hiervon sind, wobei A ein Wasserstoff oder eine gradkettige oder verzweigte Alkanoylgruppe mit C₂ bis C₄ Kohlenstoffatomen, wie Acetyl-, Proprionyl- oder Buturyl-; Q Sauerstoff oder Schwefel; Y₃ ein Wasserstoff, ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, eine Cyanogruppe, eine Nitrogruppe, oder eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit C₁ bis C₄ Kohlenstoffatomen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butyl-; Y₄ ein Wasserstoff oder eine Trifluoromethylgruppe; Y₅ ein Wasserstoff, ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, oder eine Nitrogruppe; Y₆ ein Wasserstoff, ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe mit C₁ bis C₄ Kohlenstoffatomen, wie Methoxy-, Ethoxy-, Propanoxy- oder Butoxy-, oder eine Alkanoyloxygruppe mit C₂ bis C₄ Kohlenstoffatomen, wie Acetoxy-, Proprionyloxy- oder Buturyloxy-; X₂ ein Wasserstoff, eine Hydroxygruppe, ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, eine Nitro- oder eine Trifluoromethylgruppe oder eine Alkoxygruppe mit C₁ bis C₄ Kohlenstoffatomen, wie Methoxy-, Ethoxy- Propanoxy- oder Butoxy-; X₃ ein Wasserstoff, ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, oder eine Trifluoromethylgruppe, eine Nitro- oder Aminogruppe oder eine Alkoxygruppe mit C₁ bis C₄ Kohlenstoffatomen, wie Methoxy-, Ethoxy-, Propanoxy- oder Butoxy-; X₅ und X₆ ein Wasserstoff oder ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor; Z₂ ein Wasserstoff, ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor oder eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit C₁ bis C₄ Kohlenwasserstoffatomen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butyl-; Z₃ ein Wasserstoff, ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, eine Trifluoromethylgruppe, eine Cyanogruppe oder eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit C₁ bis C₄ Kohlenstoffatomen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butyl-; Z₄ ein Wasserstoff, ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, eine Cyano- oder Nitrogruppe, eine Trifluoromethylgruppe oder eine gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit C₁ bis C₄ Kohlenstoffatomen, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Butyl-, oder Alkoxygruppe mit C₁ bis C₄ Kohlenstoffatomen, wie Methoxy-, Ethoxy-, Propanoxy- oder Butoxy-; Z₅ ein Wasserstoff, ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, oder eine Trifluoromethylgruppe; und Z6 ein Wasserstoff oder ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor ist.
Vorzugsweise sind die verwendeten substituierten Salicylanilide dadurch gekennzeichnet, dass A ein Wasserstoffatom, Q ein Sauerstoffatom, Y₃ und Y₅ ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, vorzugsweise Iod, X₂, X₃ und X₆ ein Wasserstoff, X₅ ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, vorzugsweise Chlor, Z₂, Z₃, Z₅ und Z₆ ein Wasserstoff und Z₄ ein Halogen, wie Brom, Chlor, Iod oder Fluor, vorzugsweise Chlor, ist.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass substituierte Salicylanilide, insbesondere Rafoxanid, welches bei Säugetieren als Anthelmintika verwendet wird (Trials in sheep and cattle: Snijders, Horak, Louw, J. S. Afr. Vet. Med. Assoc. 43, 397 (1972); 44, 251 (1973); 46, 265 (1975); Horak, Snijders, Vet. Rec. 94, 12 (1974), DE60100666T2 ), auch bei Fischen erfolgreich zur Behandlung von Parasitosen verwendet werden kann, obwohl bisherige Versuche nicht erfolgreich waren (Buchmann, Szekely, Bjerregaard, Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 10 (1), 14, 1990).
Salicylanilide wirken als Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung, indem sie dem Aufbau des intramitochondrialen Protonengradienten entgegenwirken (sog. Protonen-Ionophore).
Rafoxanid ist der generische Name von 3'-chloro-4'-(4-chlorophenoxy)-3,5-di-iodosalicylanilid (IUPAC Bezeichnung: N-[3-chloro-4-(4-chlorophenoxy)phenyl]-2-hydroxy-3,5-diiodobenzamide).
Rafoxanid hat die folgende Strukturformel:
Rafoxanid und seine Synthese sind bekannt. Herstellungsverfahren sind zum Beispiel beschrieben in den Patenten NL 6816242 ; BE 724668 (beide 1969 für Merck & Co.) und DE 18 10 819 .
Die substituierten Salicylanilide können gegebenenfalls auch als Salz eingesetzt werden. Für die erfindungsgemäße Verwendung kommen nur pharmazeutisch annehmbare Salze in Frage, die insbesondere entsprechend günstige toxische Eigenschaften haben, beispielsweise Metallsalze mit Natrium, Kalium, Calcium, Kupfer, Eisen oder auch Aminsalze, z. B. mit Pyridin, Piperazin, Methylamin, Ethanolamin oder Solvate der vorgenannten Salze.
Andere pharmazeutisch annehmbare Formen der substituierten Salicylanilide, insbesondere von Rafoxanid, wie z. B. Hydrate und andere Solvate etc. können selbstverständlich ebenfalls eingesetzt werden.
Vorzugsweise wird das substituierte Salicylanilid zur Behandlung von Parasitosen bei Fischen in einer Zusammensetzung umfassend Polyvinylpyrrolidon und ein alkalisierendes Metallhydroxid, vorzugsweise NaOH, und/oder ein Metallsalz, vorzugsweise Natriumsalz, von Cholsäure, Desoxycholsäure, Stearinsäure und/oder Isostearinsäure, gelöst und dann verwendet. Diese Zusammensetzung erlaubt eine besonders gute Solubilisierung des Wirkstoffes in wässriger Umgebung.
Herangezogene Druckschriften

1. Bettina SCHELKLE [et al.]: Treatment of gyrodactylid infections in fish. In: Diseases Aquatic Organisms Vol. 83, 2009, 65–75.
Rafoxanid wurde hier nicht als effektiv zur Behandlung gegen Monogena betrachtet (lt. Toyo).
2. J. L. TOJO, M. T. SANTAMARINA: Oral pharmacological treatments for parasitic diseases of rainbow trout Oncorhynchus mykiss. I: Hexamita salmonis. In: Diseases Aquatic Organisms Vol. 33, 1998, 51–56.
Hier wurde Rafoxanid als nicht wirksam gegen Monogenea eingestuft.
3. J. TOJO, [et al.]: Anthelmintic activity of benzimidazoles against Gyrodactylus sp. infecting rainbow trout Oncorhynchus mykiss. In: Diseases Aquatic Organisms Vol. 12, 1992, 185–189.
Hier wurde die Wirkung von Benzimidazolen untersucht und mit Salicylaniliden verglichen.
4. K. BUCHMANN, Cs. SZEKELY, J. BJERREGAARD: Treatment of Pseudodactylogyrus infestations of Anguilla anguilla: I. Trials with niclosamide, toltrazuril, phenolsulfonaphthalein and rafoxanide. In: Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. Vol. 10(1), 1990, 14–17.
Bei dieser Untersuchung wurden infizierte Aale u. a. mit dem in Aceton gelösten Wirkstoff Rafoxanid behandelt. Eine zufriedenstellende Behandlung der Fische gegen Monogenea mit Rafoxanid wurde hier nicht erreicht.
5. G. SCHMAHL, H. TARASCHEWSKI: Treatment of fish parasites. 2. Effects of praziquantel, niclosamide, levamisole-HCl, and metrifonate on monogenea (Gyrodactylus aculeati, Diplozoon paradoxum). In: Parasitology Research, Vol. 73(4), 1987, 341–351. Hier wurde die Wirkung von verschiedenen Anthelminthika gegen Monogenea untersucht.
6. G. SCHMAHL, H. MEHLHORN Treatment of fish parasites. 4. Effects of triazinone (toltrazuril) on Monogenea. In: Parasitology Research, Vol. 75(1), 1988, 132–143.
Hier wurde die Wirkung von Toltrazuril gegen Monogenea untersucht.
7. F. S. MIKHAILITSYN [et al.]: Search for new antiparasitic agents. 7. The study of anthelmintic activity-structure relationships in new halogencontaining benzamides. In: Meditsinskaya Parazitologiya i Parazitarnye Bolezni No. (5), 1991, 53–55. ISSN 0025-8326. (abstract). CAPLUS [online]. Accession No. 1992: 439807. In: STN Karlsruhe.
Hier wurden Salicylanilide auf ihre antiparasitäre Wirkung überprüft.
8. Manaus-Aquarium: Bilocil^®-Wirkstofflösung zur Behandlung von Zierfischen im Süßwasseraquarium – Stand: September 2012 – Firmenschrift.
Bilocil^® für Zierfische beinhaltet u. a. den Wirkstoff Rafoxanid zur Behandlung auch gegen monogene Trematoden.
9. Manaus-Aquarium: Bilocil^® sensitive-Wirkstofflösung zur Behandlung von empfindlichen Zierfischen im Süßwasseraquarium – Stand: September 2012 – Firmenschrift. Bilocil^® sensitive für Zierfische beinhaltet u. a. den Wirkstoff Rafoxanid zur Behandlung auch gegen monogene Trematoden.

Der Wirkstoff kann entweder als solcher oder in geeigneten Zusammensetzungen angewendet werden. Die Verabreichung erfolgt durch Behandlung des Wassers (Badebehandlung) oder durch Verabreichung an die Fische (enteral, parenteral oder dermal).
Injektionslösungen werden intravenös, intramuskulär und subcutan verabreicht.
Lösungen zum Gebrauch auf der Haut werden dem Wasser zugefügt oder dem Fisch aufgeträufelt, aufgestrichen, eingerieben, aufgespritzt, aufgesprüht oder durch Tauchen (Dippen, Baden oder Waschen) aufgebracht.
Vorteilhafterweise beträgt die Konzentration an substituiertem Salicylanilid bei Badebehandlung zwischen 0,005 und 1 mg/l Wasser, vorzugsweise zwischen 0,01 und 0,3 mg/l Wasser, weiter vorzugsweise zwischen 0,02 und 0,2 mg/l Wasser.
Es kann vorteilhaft sein, bei der Herstellung Konservierungsmittel, Verdickungsmittel, Farbstoffe, Haftmittel und/oder Dispergiermittel zuzufügen.
Bevorzugt handelt es sich bei den zu behandelnden Fischen um Zierfische, insbesondere um Süßwasserfische, weiter vorzugsweise um Diskusfische.
Die erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide werden zur Bekämpfung von pathogenen Parasiten eingesetzt, die bei der Haltung und Zucht bei Fischen vorkommen. Durch die Bekämpfung der pathogenen Parasiten sollen Krankheiten und Todesfälle vermindert werden, sodass durch den Einsatz des Wirkstoffs eine tiergerechte, gesundheitserhaltende und einfachere Tierhaltung möglich ist.
Die mit den erfindungsgemäßen substituierten Salicylaniliden zu behandelnden Parasitosen sind vorzugsweise durch parasitäre Metazoa, insbesondere durch Helminthen, verursacht.
Unter Helminthen werden parasitisch lebende Metazoa aus den Tierstämmen Plathelminthes (Plattwürmer), Nematoda (Rundwürmer) und Acanthocephala (Kratzer) verstanden.
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide zur Behandlung von Parasitosen bei Fischen verwendet werden, die durch die nachfolgend aufgeführten Parasiten verursacht werden: Helminthen aus dem Stamm der Plathelminthen (Plattwürmer), insbesondere aus dem Unterstamm der Trematoda (Saugwürmer) und/oder aus dem Unterstamm der Turbellaria (Strudelwürmer) und/oder aus dem Unterstamm der Cercomeromorpha, in diesem Fall vorzugsweise aus der Klasse der Monogenea (Hakensaugwürmer) und/oder aus der Klasse der Cestodea (Bandwürmer).
Als Beispiele für Parasiten aus dem Unterstamm der Turbellaria seien solche der Ordnung Rhabdocoela, insbesondere solche der Unterordnung Temnocephalida, insbesondere die Familie der Temnocephalidae, und darin besonders die Gattungen Temnocephala, Diceratocephala, Craspadella, Notodactylus, Actinodactylla und Decadidymus genannt.
Als Beispiele für Parasiten aus dem Unterstamm der Cercomeromorpha seien aus der Klasse Cestodea solche der Ordnung Caryophyllida, insbesondere die Familie der Lytocestidae, vorzugsweise die Gattung Khawia und die Familie Caryophillaeidae mit der Gattung Caryophyllaeus, genannt. Weitere Beispiele für Parasiten aus der Klasse Cestodea sind Parasiten aus der Ordnung Spathebothriida, hier insbesondere die Familie Acrobothriidae darin insbesondere die Gattung Cyathocephalus, außerdem solche aus der Ordnung Pseudophyllida, hier insbesondere die Familie Bothriocephalidae, darin insbesondere die Gattung Bothriocephalus, die Familie Diphyllobothriidae, darin insbesondere die Gattungen Diphyllobothrium, Ligula und Schistocephalus, die Familie Triaenophoridae – wiederum insbesondere die Gattungen Eubothrium und Triaenophorus – sowie ebenfalls aus der Klasse der Cestodea beispielhaft die Ordnung Proteocephalida, insbesondere die Familie Proteocephalidae und darin insbesondere die Gattung Proteocephalus.
Insbesondere erfolgt die Verwendung der erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide zur Behandlung von Parasitosen bei Fischen, die durch Parasiten der Klasse Monogenea verursacht sind, vorzugsweise durch solche, die zur Ordnung der Gyrodactylida, weiter vorzugsweise zur Familie der Gyrodactylidae, insbesondere zu Gattung Gyrodactylus und/oder zur Ordnung der Dactylogyrida, vorzugsweise zur Familie der Dactylogyridae, insbesondere zu den Gattungen Dactylogyrus und/oder Pseudodactylogyrus, gehören. Die Verwendung der erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide ist aber auch gegen andere Haut- und Kiemenwürmer, die an Fischen parasitieren, vorgesehen.
Weiter vorzugsweise erfolgt die Verwendung der erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide zur Behandlung von Parasitosen, die durch Helminthen verursacht sind, die zum Stamm der Nematoda (Rundwürmer), insbesondere zur Klasse der Neoplea, vorzugsweise zur Ordnung Trichinellida, und darin zur Familie der Capillariidae, insbesondere zur Gattung Capillaria und/oder zur Familie der Trichinellidae, darin insbesondere zur Gattung Trichinella, gehören. Ebenso vorteilhaft ist die Verwendung der erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide zur Behandlung von Parasitosen, die durch Parasiten die zur Klasse der Chromadorea, vorzugsweise zur Unterordnung Rhabditia, weiter vorzugsweise zur Ordnung der Spirurida, darin zu der Familie der Anguillicolidae, hier insbesondere zur Gattung Anguillicola, zur Familie der Philometridae, hier insbesondere zur Gattung Philometra, sowie zur Unterordnung Spirurina, zur Unterordnung Camallanoidea – hier insbesondere zur Familie Camallanidae, und darin zur Gattung Camallus – zur Überfamilie Spiruroidea, zur Überfamilie Habronematoidea, und darin insbesondere zur Familie Cystidicolidae, hier insbesondere zu den Gattungen Cysticola und Spinitectus sowie zur Unterordnung der Ascaridina, gehören. Auch zur Behandlung von Parasitosen ausgelöst durch Parasiten aus der Unterordnung der Ascaridina, vorzugsweise aus der Überfamilie der Ascaridoidea, insbesondere durch Parasiten der Familie der Anisakidae, darin insbesondere durch Parasiten der Gattungen Anisakis und Pseudoterranova und durch Parasiten der Familie der Raphidascarididae, darin insbesondere durch solche der Gattung Raphidascaris sowie durch solche der Überfamilie Seuratoidea, darin insbesondere durch solche der Familie Cucullanidae und darin durch solche der Gattung Cucullans, können die erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide vorteilhaft eingesetzt werden.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verwendung der erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide zur Behandlung von Parasitosen, die durch Protozoa, vorzugsweise durch solche vom Reich der Archezoa, weiter vorzugsweise durch solche vom Stamm der Metamonada, weiter vorzugsweise durch solche von der Klasse der Trepomonadea, insbesondere durch solche von der Klasse Diplomonadida oder vorzugsweise durch solche vom Reich der Mastigota, vorzugsweise durch solche vom Stamm der Euglenozoa, weiter vorzugsweise durch solche von der Klasse der Kinetoplastea, insbesondere durch Parasiten von der Ordnung Bodonida, weiter vorzugsweise von der Familie Bodonidae, insbesondere von der Gattung Cryptobia und/oder insbesondere durch Parasiten von der Ordnung Trypanosomatida, weiter vorzugsweise von der Familie Trypanosomatidae, insbesondere von der Gattung Trypanosoma oder vorzugsweise durch solche vom Reich der Chromista, verursacht sind. Insbesondere erfolgt die obengenannte Verwendung zur Behandlung von Parasitosen, die durch Diplomonadida verursacht sind, die zur Familie der Hexamitidae gehören und weiter vorzugsweise zur Gattung Hexamita, Spironucleus und/oder Octomitus, gehören. Auch bevorzugt ist unter den parasitären Protozoen (Protozoa) insbesondere die Bekämpfung von Einzeller mit Geiseln (Flagellaten) zu denen die bereits obengenannten Trypanosoma, Cryptobia und Hexamita (Octomitus) gehören.
Besonders bevorzugt werden erfindungsgemäß Fische im Süß- und Seewasser behandelt.
Die Behandlung der Fische kann sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch erfolgen.
Die erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide, insbesondere Rafoxanid, können in Kombination mit anderen Wirkstoffen angewendet werden.
Die Anwendung in Kombination bedeutet entweder, dass die erfindungsgemäßen substituierten Salicylanilide, insbesondere Rafoxanid, zuzüglich ein oder mehrere andere Wirkstoffe in einer gemeinsamen Zusammensetzung formuliert und entsprechend gemeinsam appliziert werden. Die Wirkstoffkombinationen können aber auch getrennt oder zeitlich abgestuft angewendet werden In diesem Fall sind die Wirkstoffe getrennt formuliert.
Beispiele:
1. Verwendung von Rafoxanid bei mit Plathelminthen (Haut- und Kiemenwürmern) infizierten Diskusfischen (Symphysodon spp.)
Eine Anzahl von 88 Fischen waren mit viviparen Gyrodactylusarten und eiproduzierenden Dactylogyrusarten infiziert. Die zu behandelnden Fische stammten aus einer Gruppe von 120 Jungfischen, die in einem 300 Liter Aquarium gehalten wurden. Der durchschnittliche Kiemenwurmbefall der unbehandelten Diskus betrug ca. 35 Kiemenwürmer pro Fisch. Die Fische wurden vor und während der Behandlung bei 29°C gehalten. Zur Anwendung kam eine 0,25%ige Rafoxanidlösung (siehe Beispiel 2, unten), wobei variabel von 0,4 ml bis 2,0 ml in Becken mit 22 Liter Aquariumwasser dosiert wurde. Die Wasserwerte waren in allen Becken gleich (pH 7,2, Nitrat 50 mg/L, Nitrit 0 mg/L, GH: 12, KH: 8). Pro Test wurden 4 junge Diskusfische (Symphysodon spp.) mit einer Größe von ca. 3 cm und 2 Yamatonuma-Garnelen (Caridina multidentata) in die Behandlungbecken eingesetzt. Das Absterben der Parasiten wurde über eine Periode von 5 Tagen beurteilt. (siehe Tabelle 1). Die Behandlung über 2 Tage mit 0,4 ml der Rafoxanidlösung verursachte eine erhebliche Reduktion der Anzahl an Würmern. Die Behandlung am Tag 1 mit 1,2 ml der Rafoxanidlösung verursachte bei einem der drei Experimente eine totale Elimination. Totale Ausrottung wurde erreicht, wenn am Tag1 und am Tag2 2,0 ml der Rafoxanidlösung zugefügt wurden. Eine identische Ausrottung der Würmer wurde erreicht, wenn am Tag 1, 3 und 5 eine Dosierung von 1,2 ml angewendet wurde.

Nach der Applikation von Rafoxanid bei Diskusfischen im Behandlungswasser war bei den Untersuchungen auch eine signifikante Reduktion von den oben genannten Flagellaten im gesamten Gastrointestinaltrakt erkennbar. Eine mikroskopische Untersuchung der Fische erfolgte 24 Stunden nach der letzten Behandlung (wenn nicht in der Tabelle 1 anders angegeben). Tabelle 1

Start der Behandlung (Datum)	Wirkstofflösung	1. Behandlungstag	2. Behandlungstag	3. Behandlungstag	4. Behandlungstag	5. Behandlungstag	Ergebnis
13.09.2009	Rafoxanid 0,25%	0,4 ml					sehr geringer Befall, 3 Würmer vorgefunden, alle Fische und Garnelen sind vital
14 09 2009	Rafoxanid 0,25%	0,4 ml	0,4 ml				wenige Würmer vorgefunden, 7 Würmer, alle Fische und Garnelen sind vital
15 09.2009	Rafoxanid 0,25%	0,8 ml					keine Würmer nachweisbar, alle Fische und Garnelen sind vital
14 09 2009	Rafoxanid 0,25%	0,8 ml	0,8 ml				keine Würmer nachweisbar, alle Fische und Garnelen sind vital
14 09 2009	Rafoxanid 0,25%	1,2 ml					keine Würmer nachweisbar, alle Fische und Garnelen sind vital
14.09.2009	Rafoxanid 0,25%	1,2 ml	Fische 24 h nach der Behandlung des Aquariums eingesetzt				wenige Würmer vorgefunden, 4 Würmer, alle Fische und Garnelen sind vital
17.09 2009	Rafoxanid 0,25%	1,2 ml	1,2 ml				am 20 09. 1 Wurm vorgefunden, alle Fische und Garnelen sind vital
17.09.2009	Rafoxanid 0,25%	2 ml					keine Würmer nachweisbar, alle Fische und Garnelen sind vital
17.09 2009	Rafoxanid 0,25%	2,0 ml	2,0 ml				am 20.09 keine Würmer nachweisbar, alle Fische und Garnelen sind vital
02.10.2009	Rafoxanid 0,25%	0,4 ml	0,4 ml	0,4 ml	0,4 ml	0,4 ml	am 8.10 mehr wie 10 Würmer vorgefunden, alle Fische und Garnelen sind vital
02 10 2009	Rafoxanid 0,25%	0,4 ml		0,4 ml		0,4 ml	am 8.10. mehr mehr 10 Wurmer vorgefunden, alle Fische und Garnelen sind vital
02.10.2009	Rafoxanid 0,25%	0,8 ml		0,8 ml		0,8 ml	am 8.10. keine Würmer nachweisbar, alle Fische und Garnelen sind vital
02.10.2009	Rafoxanid 0,25%	0,8 ml	0,8 ml			0,8 ml	am 8.10. 1 Wurm vorgefunden, alle Fische und Garnelen sind vital
02.10.2009	Rafoxanid 0,25%	1,2 ml	1,2 ml	1,2 ml			am 8.10. keine Würmer nachweisbar, alle Fische und Garnelen sind vital
02.10 2009	Rafoxanid 0,25%	1,2 ml		1,2 ml		1,2 ml	am 8.10 keine Würmer nachweisbar, alle Fische und Garnelen sind vital

2. Experimente mit Rafoxanid bei mit Kiemenwürmern (Monogenea) infizierten europäischen Aalen (Anguilla anguilla)
Bei früheren Untersuchungen wurde eine sehr schlechte bzw. eine Unverträglichkeit von Rafoxanid für Aale (Anguilla anguilla) angegeben (Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 10 (I), 14, 1990, TREATMENT OF PSEUDODACTYLOGYRUS INFESTATIONS OF ANGUILLA ANGUILLA, TRIALS WITH NICLOSAMIDE, TOLTRAZURIL, PHENOLSULFONPHTHALEIN and RAFOXANIDE, By K. Buchmann, Cs. Szekely & J. Bjerregaard). Eine Anzahl von 20 Fischen war mit eiproduzierenden Dactylogyrusarten infiziert. Der durchschnittliche Kiemenwurmbefall der unbehandelten Aale betrug ca. 70 Kiemenwürmer pro Fisch. Die Fische wurden vor und während der Behandlung bei 20°C gehalten. Zur Anwendung kam eine 0,25%ige Rafoxanidlösung (siehe Beispiel 2, unten), wobei variabel von 0,7 ml bis 1,5 ml in Becken mit 50 Liter Aquariumwasser dosiert wurde. Die Wasserwerte waren in allen Becken gleich (pH 7,6, Nitrat 25 mg/L, Nitrit 0 mg/L, GH: 10, KH: 6). Pro Test wurden 3 junge Aale (Größe ca. 30 cm) in die Becken eingesetzt. Das Absterben der Parasiten wurde über eine Periode von 5 Tagen beurteilt (siehe Tabelle 2). Die Behandlung über 3 Tage mit 0,7 ml der Rafoxanidlösung verursachte lediglich eine Reduktion der Anzahl an Würmern. Eine Ausrottung der Würmer wurde erreicht, wenn am Tag 1, 3 und 5 eine Dosierung von 1,0 ml im Behandlungswasser angewendet wurde. Auch eine höhere, therapeutisch nicht notwendige Dosierung, mit einer Applikation von 1,5 ml am Tag 1, 3 und 5, wurde von den Aalen sehr gut vertragen und führte erwartungsgemäß auch zur totalen Ausrottung der Kiemenwürmer.
Testreihe zur Wirkung von Rafoxanid bei einem Befall der Kiemen von europäischen Aalen (Anguilla anguilla) durch Monogenea.

Die Testreihen wurden in 40 Liter fassenden Aquarien durchgeführt. Pro Test wurden 3 junge Aale mit einer Größe von ca. 30 cm in die Becken eingesetzt. Die zu behandelnden Fische stammten aus einer Gruppe von 20 Fischen, die in mehreren größeren Aquarien gehalten wurden. Der durchschnittliche Kiemenwurmbefall der unbehandelten Aale betrug ca. 70 bis 100 Kiemenwürmer pro Fisch. Die Fische wurden vor und während der Behandlung bei 20°C Raumtemperatur gehalten. Eine mikroskopische Untersuchung der Fische erfolgte 24 Stunden nach der letzten Behandlung (wenn nicht anders angegeben in der Tabelle 2). Tabelle 2

Start der Behandlung (Datum)	Wirkstofflösung	1. Behandlungstag	2. Behandlungstag	3. Behandlungstag	4. Behandlungstag	5. Behandlungstag	Ergebnis
14 09.2010	Rafoxanid 0,25%	0,7 ml		0,7 ml		0,7 ml	Wurmbefall, mehr wie 20 Würmer vorgefunden, alle Fische sind vital
14 09 2010	Rafoxanid 0,25%	1 ml		1 ml		1 ml	am 20.09. und am 24.09 keine Würmer nachweisbar, alle Fische sind vital
14.09.2010	Rafoxanid 0,25%	1,5 ml		1,5 ml		1,5 ml	am 20 09. und am keine Würmer nachweisbar, alle Fische sind vital

Die Zusammenstellung von Rafoxanid Lösungen wird beschrieben von Lo et al. ( US Patent 4128632 )
Rafoxanid ist äußerst wasserunlöslich. Die Löslichkeit in Wasser bei 25°C beträgt ungefähr 0,005%.
Durch die Zugabe von 1% Tensid wird eine Löslichkeit von 0,14% in Wasser erreicht. Es ist gelungen eine 7,5%ige wässerige Zusammensetzung von Rafoxanid zu erreichen mit folgenden Lösungsmitteln: Polyvinylpyrrolidon und ein Ätzmittel wie Natriumhydroxid oder das Natriumsalz von Cholsäure, Desoxycholsäure, Stearinsäure oder Isostearinsäure enthält. Eine Rafoxanid Lösung kann auch hergestellt werden mittels einer Komplexbildung von Rafoxanid mit Polyvinylpyrrolidon und der Verwendung eines speziellen Lösungsmittels wie Glycerolformal oder Aceton, dass gegebenenfalls durch Verdampfen entfernt werden kann. Beide Verfahren geschehen unter Erhitzung bei einer Temperatur von 60°C. Eine 7,5%ige und eine 0.25%ige Lösung von Rafoxanid wird mit folgendem Verfahren erreicht:
Beispiel 1
Zubereitung von 1000 ml einer 7,5%igen Rafoxanid-Polyvinylpyrrolidon komplexbildenden Stammlösung:

Rafoxanid 75 g

Polyvinylpyrrolidon 225 g

Natriumhydroxid 4,7 g

Benzylalkohol 1 g

Auffüllung mit Aquadest bis 1000 ml
Natriumhydroxid wird in 200 ml destilliertem Wasser gelöst und es werden 400 ml Aceton zugegeben. Unter Rühren werden 225 g Polyvinylpyrrolidon (Mol. Gewicht 3000) und danach 75 g Rafoxanid zugefügt. Diese Lösung wird gut gerührt bis alle Bestandteile gelöst sind (ca. 30 Minuten). Falls notwendig, kann destilliertes Wasser (bis 500 ml) zugefügt werden. Diese Lösung wird unter Vakuum bis 60°C erhitzt um das Aceton bei diesem Vorgang zu eliminieren. Nach der Entfernung des Acetons wird Benzylalkohol zugefügt und die Mischung bis 1000 ml aufgefüllt.
Beispiel 2
Zubereitung von 1000 ml einer 0.25%iqen Rafoxanid-Polyvinylpyrrolidon komplexbildenden Stammlösung

Rafoxanid 2,5 g

Polyvinypyrrolidon 200 g

Natriumhydroxid 6,4 g

Glycerolformal 200 g

Benzylalkohol 10 g

Auffüllung mit Aquadest bis 1000 ml
6,4 Gram Natriumhydroxid werden in 600 ml Wasser gelöst und unter Rühren 200 g Polyvinylpyrrolidon (Mol. Gewicht 3000) zugegeben. Als Nächstes werden 200 g Glycerolformal unter Rühren zugefügt und danach 2,5 Gramm Rafoxanid zugegeben. Diese Lösung wird bis 60°C erhitzt und unter Rühren 60 Minuten kräftig gemischt bis alle Bestandteile gelöst sind. Jetzt werden 10 ml Benzylalkohol zugefügt und die Lösung auf Zimmertemperatur heruntergekühlt. Die Lösung wird mit destilliertem Wasser bis auf 1000 ml aufgefüllt.
Die angewendete Rafoxanid-Lösung hat folgende günstige Eigenschaften:

1. Hiermit wurde eine stabile 0,25%ige–10%ige Stammlösung von Rafoxanid hergestellt, welche auch bei einer längeren Lagerung stabil bleibt. Es fallen keine der verwendeten Substanzen in der Lösung aus (Bildung eines Niederschlags).
2. Die Lösung ist bei der angewendeten Dosierung nicht toxisch für die Wirtstiere aus der beschriebenen Zielgruppe.
3. Die Rafoxanid-Lösung wird von Wirtstieren gut resorbiert, wodurch für die Parasiten toxische Konzentrationen entstehen.

Claims

Verwendung von Rafoxanid zur Behandlung von Parasitosen bei Fischen, verursacht durch monogene Trematoden und Flagellaten.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Rafoxanid in einer Zusammensetzung umfassend mit Polyvinylpyrrolidon und einem alkalisierenden Metallhydroxid, vorzugsweise NaOH, und/oder einem Metallsalz, vorzugsweise Natriumsalz, von Cholsäure, Desoxycholsäure, Stearinsäure und/oder Isostearinsäure, gelöst ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet ist, dass die Konzentration von Rafoxanid bei der Badebehandlung zwischen 0,005 und 1 mg/L Wasser, vorzugsweise zwischen 0.01 und 0,3 mg/L Wasser, weiter vorzugsweise zwischen 0,02 und 0,2 mg/L Wasser beträgt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fische Zierfische, vorzugsweise Süßwasserfische, weiter vorzugsweise Diskusfische sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Parasitosen durch parasitäre Metazoa, weiter vorzugsweise durch Helminthen verursacht sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Helminthen zum Stamm der Plathelmintha (Plattwürmer gehören) gehören.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Helminthen zum Unterstamm der Trematoda (Saugwürmer), und/oder zum Unterstamm der Turbellaria (Strudelwürmer), und/oder zum Unterstamm der Cercomeromorpha, vorzugsweise zur Klasse der Monogenea (Hakensaugwürmer) und/oder der Cestoda (Bandwürmer) gehören.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Monogenea vorzugsweise zur Ordnung Gyrodactylida, weiter vorzugsweise zur Familie der Gyrodactylidae, insbesondere zur Gattung Gyrodactylus und/oder zu Ordnung der Dactylogyrida, vorzugsweise zur Familie der Dactylogyridae, insbesondere zu den Gattungen Dactylogyrus und/oder Pseudodactylogyrus gehören.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Parasitosen durch Protozoa, vorzugsweise durch solche vom Reich der Archezoa, vorzugsweise vom Stamm der Metamonada, weiter vorzugsweise von der Klasse der Trepomonadea, insbesondere von der Klasse Diplomonadida oder vorzugsweise durch solche vom Reich der Mastigota, vorzugsweise vom Stamm der Euglenozoa, weiter vorzugsweise von der Klasse der Kinetoplastea, insbesondere von der Ordnung Bodonida, weiter vorzugsweise von der Familie Bodonidae, insbesondere von der Gattung Cryptobia und/oder insbesondere von der Ordnung Trypanosomatida, weiter vorzugsweise von der Familie Trypanosomatidae, insbesondere von der Gattung Trypanosoma oder vorzugsweise durch solche vom Reich der Chromista, verursacht sind.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Diplomonadida vorzugsweise zur Familie der Hexamitidae gehören und weiter vorzugsweise zur Gattung Hexamita, Spironucleus und/oder Octomitus gehören.