DE102010042043B4

DE102010042043B4 - Verfahren und Einrichtung zur nichtinvasiven Bestimmung der epidermalen Barriere der menschlichen Haut

Info

Publication number: DE102010042043B4
Application number: DE102010042043A
Authority: DE
Inventors: Patentinhaber gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-10-06
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2013-03-14
Anticipated expiration: 2030-10-07
Also published as: DE102010042043A1

Abstract

Verfahren zur nichtinvasiven Bestimmung der epidermalen Barriere der Haut mit den Schritten
a) Realisierung eines Hautabrisses, welcher die epidermale Barriere der Haut umfasst, mittels eines Substrates und eines Reaktionsklebstoffes, der die epidermale Barriere penetriert und rasch aushärtet, wobei die Aushärtedauer von 30 s bis 5 min beträgt,
b) Bildaufnahme eines Ultradünnschnittes des Hautabrisses mittels Transmissionselektronenmikroskopie,
c) Erkennung mindestens eines Interzellularraumes mit Lipidlamellen als Objekt im Bild,
d) Ermittlung der Flächen der Interzellularräume und der Längen der Lipidlamellen,
e) Bilden eines Quotienten aus der Fläche der Interzellularräume und der Länge der Lipidlamellen,
wobei die Schritte b) bis e) mittels eines Datenverarbeitungssystems ausgeführt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Einrichtung zur Bestimmung der epidermalen Barriere der menschlichen Haut nach nichtinvasiver Probennahme.
Die menschliche Haut besteht im Wesentlichen aus der Unterhaut (Subcutis), der Lederhaut (Dermis) und der Oberhaut (Epidermis). Letztere bildet die eigentliche Schutzhülle vor den Umwelteinflüssen.
Die Oberhaut wiederum kann in die Basalschicht (Stratum basale), das Stratum spinosum, die Körnerzellenschicht (Stratum granulosum) und die Hornschicht (Stratum corneum) unterteilt werden.
Die Hornschicht besteht aus ungefähr 12 bis 16 Schichten von sogenannten Korneozyten. Das sind zellkernlose, abgeflachte und verhornte Zellen, die sich überlappen. Enzyme in den Korneozyten ermöglichen dabei aber immer noch gewisse Stoffwechselaktivitäten.
Zwischen den Korneozyten befinden sich Lipidschichten. Diese Lipide ordnen sich innerhalb der Hornschicht zu einer aus überwiegend parallel angeordneten Lamellenschichten bestehenden Schicht an, die im Folgenden auch mit den Begriffen „Lipidschicht” oder „Lipidlamellen” bezeichnet wird. Dieser Aufbau wird im Allgemeinen als epidermale Barriere, bezeichnet. Gelegentlich findet sich auch „Epidermale Permeabilitätsbarriere” als Bezeichnung.
Eine intakte epidermale Barriere ist die Basis für eine gesunde Haut, sie hält die Feuchtigkeit in der Haut und vermindert so einen übermäßigen Wasserverlust. Außerdem verhindert diese Schutzschicht das Eindringen von Bakterien, Viren und Schadstoffen, so dass diese eine Schutzfunktion besitzt.
Zahlreiche dermatologische Erkrankungen sind durch eine gestörte Barrierefunktion der Hornschicht gekennzeichnet. Zur Bewertung des Krankheitsbildes wie auch zur Evaluation des Einflusses bestimmter Medikamente auf die Regeneration der epidermalen Barriere wird üblicherweise die Wasserdurchlässigkeit der Haut untersucht, indem die Menge des transepidermalen Wasserverlustes (TEWL) bestimmt wird. Der TEWL bezeichnet diejenige Wassermenge, die von der Haut pro Stunde und cm² an die Außenwelt abgegeben wird.
Bei der Corneometrie wird die Hautfeuchte des Stratum corneum durch die Messung der elektrischen Kapazität der Haut bestimmt. Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, dass Wasser und andere Stoffe unterschiedliche Dielektrizitätskonstanten besitzen. Das Corneometer bestimmt dadurch den Grad der Feuchtigkeit der Hautoberfläche, z. B. vor und nach Behandlungen der Haut mit kosmetischen oder pharmazeutischen Erzeugnissen. Mittels der Corneometrie kann somit die Veränderung der Feuchtigkeit der Hautoberfläche bestimmt werden.
Diese Untersuchungen sind aber stark von den herrschenden Umweltbedingungen abhängig und liefern daher nur schlecht reproduzierbare Ergebnisse.
Bildgebende Verfahren erfordern in der Regel die invasive Entnahme von Gewebebiopsien, was mit einer gewissen Belastung des Patienten einhergeht, insbesondere wenn mehr als einmal Proben genommen werden müssen, um den zeitlichen Verlauf der Erkrankung zu dokumentieren. Vor allem bei der Durchführung von Studien zur Wirksamkeit von pharmazeutischen Wirkstoffen oder bei der Anwendung von Kosmetika stellt dies ein erhebliches Problem dar.
Aus dem Stand der Technik (siehe z. B. Löffler et al. Stratum corneum adhesive tape stripping: influence of anatomical site, application pressure, duration and removal, British Journal of Dermatology 2004; 151: 746–752) ist ein Verfahren bekannt, bei dem durch wiederholtes Aufbringen eines Klebebandes auf die Haut eines Probanden die oberen Schichten der Hornhaut entfernt und anschließend lichtmikroskopisch untersucht werden. Dabei kontaktiert jedoch die mit Klebstoff beschichtete Seite des Klebebands jeweils nur die oberste Zellschicht der Hornhaut, so dass mit jedem „Stripping”, d. h. dem Aufbringen und anschließenden Wiederentfernen des Klebebands, eine Gewebeschicht von nur ein bis zwei Zellschichten Dicke entfernt werden kann.
Desweiteren ist ein Verfahren bekannt, das als Follikularbiopsie oder Follikularabriss bezeichnet wird und bei dem mittels eines Polymerklebstoffs, der auf die Haut aufgebracht wird, der Inhalt von Talgdrüsenfollikeln aus der Haut extrahiert wird. Das so gewonnene Material kann hinsichtlich verschiedener Eigenschaften, wie beispielsweise Zahl und Größe von Mikrokomedonen und Follikelfilamenten, Besiedlung des Talgdrüsenfollikels mit Mikroorganismen (z. B. Propionibacterium acnes und Pityrosporum ovale) oder Milben (z. B. Demodex follicorum), Haarbündel (Trichostasis spinulosa) oder die Zusammensetzung der in den Mikrokomedonen enthaltenen Lipide, untersucht werden.
In dem US-Patent US 4 752 472 B1 wird ein Verfahren für die kosmetische Behandlung der menschlichen Haut beschrieben, bei welchem Substanzen oder Stoffen von der Hautoberfläche sowie aus den Talgdrüsenfollikeln entfernt werden. Das Verfahren umfasst das Auftragen einer Schicht aus einem flüssigen, polymerisierenden Klebstoff auf die Haut, das Aufbringen eines biegsamen Trägermaterials auf den aufgetragenen Klebstoff und die anschließende Entfernung des auspolymerisierten Klebstoffs von der Haut durch das Abziehen des Trägermaterials.
Imokawa, et al. Journal of Investigative Dermatology, Vol. 96, April 1991, S. 523–526 offenbaren ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Lipid- und Ceramidgehaltes in der Stratum corneum (Hornschicht). Dabei wird die Hornschicht durch ein einmaliges Stripping gewonnen, wobei zwei Tropfen eines Cyanacrylats auf einen Glasobjektträger aufgetragen und anschließend für eine Minute auf der Haut inkubiert werden. Die von der Haut abgerissene Schicht umfasste mindestens 5 Schichten des Stratum Cornum. Anschließend wird die so gewonnene Probe in einem Lösungsmittelgemisch gelöst, Lipide und Ceramide extrahiert und mittels Dünnschichtchromatographie analysiert.
Marks, Ronald., 2001, Skin Care Forum, Vol. 26, September 2001, S. 1–6 URL: http://www.scf-online.com/english/26_e/26_e_pr/lookintoskin26_e_pr.htm offenbart ein Verfahren zur mikroskopischen Beurteilung des Stratum corneum. Dabei wird ein Tropfen eines Cyanoacrylats auf einen Objektträger gegeben und anschließend für 20 Sekunden auf der Hautoberfläche inkubiert. Danach wird der Objektträger entfernt, wodurch eine Hautprobe mit 2 bis 3 Zellschichten gewonnen werden kann. Aufgrund der relativ kurzen Inkubationszeit kann ein tieferes Eindringen des Cyanoacrylats nicht erfolgen, weshalb nur relativ geringe Zellschichtdicken (2–3) erreicht werden. Mittels Lichtmikroskop und Rasterelektronenmikroskopie werden die abgelösten Zellschichten untersucht. Untersucht wird dabei die Oberflächenmorphologie der Haut aber auch die ,in situ'-Mikrobiologie der Haut.
Gorzellany et al., Journal of experimental dermatology, Vol 15, 2006, S. 387–391 offenbaren ein Verfahren zur Untersuchung von Stratum corneum (Hornschicht) mittels Atomic Force Micrsocopy (AFM). Dabei wird die zu untersuchende Probe mittels Tape-Stripping gewonnen und die Oberflächentopologie der Corneozyten bestimmt.
ENGELHARDT, Harald et al.: Hochauflösende Mikroskopie von Zellen und Oberflächen: Kryo-Elektronentomographie und Raster-Infrarotmikroskopie im optischen Nahfeld. In: Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Tätigkeitsbericht 2005, S. 47–48 offenbaren ein Verfahren zur hochauflösenden Mikroskopie von Zellen und Oberflächen unter Verwendung der Kryo-Elektronenmikroskopie und Raster-Infrarotmikroskopie.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren eignen sich nur schlecht zur Bestimmung oder Untersuchung der epidermalen Barriere der menschlichen Haut.
Aufgabe der Erfindung ist daher, die einfache nichtinvasive Bestimmung und Untersuchung der epidermalen Barriere der menschlichen Haut zu ermöglichen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen nach Anspruch 1 und durch eine Einrichtung mit den Merkmalen nach Anspruch 9 gelöst. Weitere Ausgestaltungen enthalten die Unteransprüche 2 bis 8 sowie 10 und 11.
Verwendet wird ein Substrat und ein Reaktionsklebstoff für die einfache nichtinvasive Bestimmung der epidermalen Barriere der menschlichen Haut einschließlich der Lipidschichten mittels eines Elektronenmikroskops oder eines Rasterkraftmikroskops. Das Substrat und der Reaktionsklebstoff sind dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktionsklebstoff zunächst auf das Substrat aufgetragen wird. Anschließend wird das Substrat mit dem Reaktionsklebstoff auf die Haut aufgetragen. Dabei penetriert der Reaktionsklebstoff die epidermale Barriere und härtet rasch aus. Nach dem Aushärten des Reaktionsklebstoffs wird das Substrat von der Haut abgezogen, wodurch zusammen mit dem ausgehärteten Reaktionsklebstoff Hautschichten entfernt werden. Das auf die Hautoberfläche aufgetragene und mit einem Cyanacrylat-Klebstoff als Reaktionsklebstoff versehene und nach Aushärten des Reaktionsklebstoffs von der Hautoberfläche abgezogene Substrat mit dem Reaktionsklebstoff und der dadurch entfernten Hautschichten wird erfindungsgemäß als Probe zur Bestimmung der epidermalen Barriere mittels eines Elektronenmikroskops oder eines Rasterkraftmikroskops verwendet.
In 1 sind die beschriebenen Schritte schematisch dargestellt.
Überraschend wurde gefunden, dass auf Basis von aus dem Stand der Technik bekannten, technisch sehr einfachen Verfahren zur Realisierung eines Hautabrisses eine Probe der Hornschicht der menschlichen Haut erhalten werden kann, in welcher die Feinstrukturen der Lipidschichten der epidermalen Barriere ausreichend gut erhalten sind, so dass sie sich nach einer raschen Probenaufarbeitung mittels Elektronenmikroskopie, sowohl Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) als auch Rasterelektronenmikroskopie (Scanning electron microscopy, SEM), oder mittels Rasterkraftmikroskopie analysiert werden können.
Ein Hautabriss im Sinne der Erfindung ist eine nichtinvasiv erhaltene Probe der Hornschicht der Haut eines Menschen, welche durch Aufbringen eines Reaktionsklebstoffs auf die Hautoberfläche und das Abziehen des Reaktionsklebstoffs von der Haut nach dem Aushärten des Reaktionsklebstoffs gewonnen wird. Der einfacheren Handhabbarkeit halber wird der Reaktionsklebstoff zu diesem Zweck zunächst auf ein Substrat aufgetragen und anschließend der auf dem Substrat befindliche Reaktionsklebstoff mit der Haut kontaktiert. Das Substrat erleichtert das Aufbringen und Abziehen des Klebstoffs und stabilisiert die Probe während der Aufbereitung und Untersuchung. Der Reaktionsklebstoff dringt bereichsweise in die obersten Zellschichten der Hornschicht der Haut ein und härtet anschließend aus. Durch das Abziehen des Reaktionsklebstoffs werden die vom ausgehärteten Reaktionsklebstoff umgebenen Zellschichten abgelöst. Die so erhaltene Probe wird als Hautabriss bezeichnet.
Die Erfinder haben überraschend festgestellt, dass die Feinstrukturen des Stratum corneum (Hornschicht) durch den ausgehärteten Reaktionsklebstoff so stabilisiert werden, dass sie auch nach Abziehen des Substrats von der Haut erhalten bleiben. Insbesondere die epidermale Barriere, d. h. die Korneozyten und die Lipidlamellen zwischen ihnen, bleiben in ihrer ursprünglichen Form erhalten und sind daher für die Analyse mittels eines Elektronenmikroskops oder eines Rasterkraftmikroskops geeignet.
Bestandteil der Erfindung ist auch die Verwendung eines Verfahrens zur Realisierung eines Hautabrisses mit den Schritten

a) Versehen des Substrats mit einem Reaktionsklebstoff, der die epidermale Barriere penetriert und rasch aushärtet,
b) anschließendes Kontaktieren des mit dem Reaktionsklebstoff versehenen Substrats mit der Hautoberfläche und
c) Abziehen des Substrats von der Hautoberfläche nach dem Aushärten des Reaktionsklebstoffs,

Der Begriff „nichtinvasiv” im Sinne der Erfindung bedeutet, dass mit der Probennahme keine Verletzung eines aus lebenden Zellen bestehenden Gewebes einhergeht.
Erfindungsgemäß wird der Reaktionsklebstoff vor dem Inkontaktbringen auf die Haut auf einem Substrat aufgebracht und der Reaktionsklebstoff anschließend zusammen mit dem Substrat mit der Hautoberfläche kontaktiert. Das Substrat stabilisiert die Probe sowohl während der Probennahme als auch während der späteren mikroskopischen Analyse.
Bevorzugt wird ein Verfahren mit den oben beschriebenen Schritten für die einfache nichtinvasive Bestimmung der Struktur der epidermalen Barriere einschließlich der Lipidschichten verwendet. Besonders bevorzugt lassen sich die derart erhaltenen Proben für die Analyse der epidermalen Barriere mittels Elektronenmikroskopie oder Rasterkraftmikroskopie verwenden.
Im Stand der Technik wurden für elektronen- oder rasterkraftmikroskopische Untersuchungen bisher üblicherweise Hautbiopsien verwendet, welche nur über invasive Verfahren gewonnen werden konnten. Für den Fachmann war nicht zu erwarten, dass die Qualität von durch Hautabrissen gewonnen Proben für die elektronen- oder rasterkraftmikroskopische Analyse ausreichend sein würde.
Die Probe zeichnet sich dadurch aus, dass diese nur aus Bestandteilen des Stratum corneum einschließlich der Lipidschicht besteht, so dass die Probe nichtinvasiv ohne Verletzungen der Haut gewinnbar ist. Die Bestandteile der abgetragenen Oberschicht werden ständig ergänzt, so dass keine bleibenden Veränderungen der Haut zu verzeichnen sind. Insbesondere auch Probennahmen von kindlicher Haut sind damit leicht realisierbar.
Überraschenderweise bleiben die Feinstrukturen der Hornhaut dabei erhalten. So lassen sich vorteilhaft die in der Hornhaut enthaltenen Lipidschichten, welche üblicherweise Strukturen in der Größenordnung von 6 nm bis ca. 100 nm bilden, hervorragend abbilden.
Damit ist das auf die Hautoberfläche aufgetragene und mit einem Cyanacrylat-Klebstoff als Reaktionsklebstoff versehene und nach Aushärten des Reaktionsklebstoffs von der Hautoberfläche abgezogene Substrat mit dem Reaktionsklebstoff und den dadurch entfernten Hautschichten vorteilhafterweise als Probe zur Bestimmung der epidermalen Barriere mittels des Mikroskops verwendbar.
Die aus den Hautabrissen gewonnenen Proben eignen sich in einer Ausgestaltung der Erfindung zur Anfertigung von Ultradünnschnitten für die Transmissionselektronenmikroskopie. Die Analyse der epidermalen Barriere erfolgt erfindungsgemäß über die Begutachtung des Aufbaus der multilamellaren Lipidschichten zwischen den Korneozyten. Dazu werden Ultradünnschnitte der Hautabriss-Probe erstellt, welche mittels eines Transmissionselektronenmikroskops abgebildet werden. In den Ultradünnschnitten sind die Korneozyten, die Intrazellularräume, die Lipidlamellen und andere zellulären und subzelluläre Strukturen gut erkennbar, so dass sich die aus den Hautabrissen gewonnenen Ultradünnschnitte auch für die semiquantitative Auswertung eignen.
Bestandteil der Erfindung ist daher ein Verfahren zur nichtinvasiven Bestimmung der epidermalen Barriere der Haut mit den Schritten

a) Realisierung eines Hautabrisses, welcher die epidermalen Barriere der Haut umfasst, mittels eines Substrates und eines Reaktionsklebstoffes, der die epidermale Barriere penetriert und rasch aushärtet,
b) Bildaufnahme des Hautabrisses als Schnittfläche über ein Mikroskop mit einer Digitalkamera,
c) Erkennung mindestens eines Interzellularraumes mit Lipidlamellen als Objekt im Bild,
d) Ermittlung der Flächen der Interzellularräume und der Längen der Lipidlamellen,
e) Bilden eines Quotienten aus der Fläche der Interzellularräume und der Länge der Lipidlamellen,

Auf diese Art lassen sich zum Beispiel Daten über den Zustand der Lipidlamellen in der Probe gewinnen.
Die aus den Hautabrissen gewonnenen Proben sind in einer Ausgestaltung der Erfindung zur Abbildung der Abrissoberflächen durch Rasterelektronenmikroskopie einsetzbar. In den Abbildungen der Abrissoberflächen lässt sich die Fläche der Korneozyten leicht bestimmen und dadurch auch Aussagen über die relative Feuchtigkeit der Haut treffen.
Bestandteil der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur nichtinvasiven Bestimmung der epidermalen Barriere der Haut mit den Schritten

a) Realisierung eines Hautabrisses, welcher die epidermalen Barriere der Haut umfasst, mittels eines Substrates und eines Reaktionsklebstoffes, der die epidermale Barriere penetriert und rasch aushärtet
b) Bildaufnahme des Hautabrisses als Abrissoberfläche über ein Mikroskop mit einer Digitalkamera
c) Erkennung mehrerer Korneozyten als Objekt im Bild
d) Bestimmung von Flächen der Korneozyten

Vorzugsweise besteht das Substrat aus einem Kunststoff. Dieser sollte unzerbrechlich sein und eine gute Zellhaftung aufweisen, was vorzugsweise durch eine hydrophile Beschichtung des Kunststoffs in bekannter Weise erreicht wird. Weiterhin sollte dieser gegen übliche Lösungsmittel bei einer elektronenmikroskopischen Untersuchung resistent, nicht toxisch und strahlensteril sein. Das Substrat ist gleichzeitig die Basis für die aufgenommenen und abgebildeten Hautschichten. Vorzugsweise besteht das Substrat aus Polyolefin. Durch das Substrat ist damit eine eindeutige Orientierung der Schichten der Probe einschließlich der Lipidschicht gegeben.
Erfindungsgemäß werden an die Beschaffenheit des Reaktionsklebstoffs verschiedene Anforderungen gestellt. Der zur Herstellung des Hautabrisses verwendete Reaktionsklebstoff ist zum einen so ausgewählt, dass die Feinstrukturen des Stratum corneum (Hornschicht) stabilisiert werden und so auch nach Abziehen des Substrats von der Haut erhalten bleiben. Einige Reaktionsklebstoffe verändern beim Eindringen in die Hornschicht die Struktur der Korneozyten und/oder der Lipidlamellen und sind daher nicht für den erfindungsgemäßen Einsatz geeignet.
Der erfindungsgemäße Reaktionsklebstoff härtet außerdem rasch aus. Die Dauer des Aushärtens ist so gewählt, dass das Aufbringen auf das Substrat, die Kontaktierung mit der Haut und die anschließende Penetration in das Stratum corneum gewährleistet ist. Vorzugsweise beträgt die Aushärtedauer von 15 s bis 10 min, bevorzugt von 30 s bis 5 min, besonders bevorzugt von 1 bis 4 min, ganz besonders bevorzugt 2 bis 3 min.
Der Reaktionsklebstoff penetriert in ausreichendem Maße in das Stratum corneum. Vorzugsweise dringt der Reaktionsklebstoff nach dem Kontaktieren mit gesunder Haut 3 bis 6, bevorzugt 4 bis 5, Zellschichten tief in das Stratum corneum ein. Dadurch wird sichergestellt, dass auch bei mehrmaliger, vorzugsweise drei bis viermaliger, Probennahme von der selben Hautfläche das Gewebe nicht verletzt wird.
Der Reaktionsklebstoff besitzt eine Viskosität (Kegel und Platte) bei 25°C von 70 bis 100 cP. Damit wird sichergestellt, dass der Klebstoff in die Haut eindringen kann und mehrere Schichten binden kann. Dadurch wird wiederum sichergestellt, dass. die Lipidschicht ein Bestandteil der Probe ist.
Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Reaktionsklebstoff handelt es sich vorzugsweise um einen Einkomponenten-Reaktionsklebstoff, bevorzugt um einen Cyanacrylat-Klebstoff. Das ist ein dünnflüssiger Ester der Cyanoacrylsäure, welcher durch eine Polymerisationsreaktion zum eigentlichen Klebstoffpolymer reagiert. Die Polymerisation läuft vorteilhafterweise sehr schnell ab. Bei medizinischen Anwendungen werden spezielle Ester eingesetzt. Vorteilhaft lassen sich durch das rasche Eindringen des Cyanacrylat-Klebstoffs in die oberen Schichten der Hornhaut nach dem Aushärten des Klebstoffs bis zu 5 übereinanderliegende Zellschichten der Hornhaut abheben. Dabei wird durch das rasche Eindringen des Cyanacrylat-Klebstoffs sichergestellt, dass dieser die oberen Schichten der Hornhaut gleichmäßig durchdringt. Dadurch können vorteilhaft die verschiedenen übereinander angeordneten Lipidschichten gleichmäßig dargestellt werden. Zudem verleiht der Cyanacrylat-Klebstoff der Probe vorteilhaft eine hohe Stabilität im Elektronenstrahl, was die Analyse der Probe im Elektronenmikroskop ermöglicht.
Vorzugsweise ist der Klebstoff ausgewählt aus Methyl-2-Cyanacrylat, Ethyl-2-cyanacrylat, Propyl-2-Cyanacrylat, Isopropyl-2-Cyanacrylat, Butyl-2-Cyanacrylat, Methoxyethyl-2-Cyanacrylat, Ethoxyethyl-2-Cyanacrylat, Allyl-2-Cyanacrylat und deren Mischungen. Bevorzugt wird als Cyanacrylat-Klebstoff Methyl-2-Cyanacrylat und/oder Ethyl-2-cyanacrylat, ganz besonders Ethyl-2-Cyanacrylat eingesetzt. Dieser Klebstoff hat sich vorteilhaft als besonders geeignet erwiesen, da er die Struktur der epidermalen Barriere nicht wesentlich verändert und gleichzeitig während der Probennahme, der Probenaufbereitung und der mikroskopischen Untersuchung hervorragend stabilisiert.
Vorzugsweise ist das Elektronenmikroskop ausgewählt aus Transmissions-Elektronenmikroskop (TEM), Rasterelektronenmikroskop (REM; häufig auch als SEM – vom englischen Begriff Scanning Electron Microscope – bezeichnet), Raster-Transmissionselektronenmikroskop (STEM), Energiegefilterte Transmissionselektronenmikroskopie (EFTEM), Sekundärelektronenmikroskop und Environmental-SEM (ESEM). Besonders bevorzugt ist das Mikroskop ein Elektronenmikroskop, ein Rasterelektronenmikroskop oder ein Elektronentomograph.
Erfindungsgemäß ist die elektronenmikroskopische Analyse auch mit anderen Analysemethoden kombinierbar. Vorzugsweise werden die Proben beispielsweise zur Untersuchung mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie in Kombination mit einer anschließenden elektronentomographischen Analyse verwendet.
In einer weiteren Ausgestaltung wird die Probe für die Immunogold-Elektronenmikroskopie eingesetzt. Dazu erfolgt eine Immunmarkierung mit einem Gold-konjugierten Antikörper. Proben, welche so markiert wurden, werden vorzugsweise zur Analyse mittels Elektronenmikroskopie verwendet. Durch diese Analyse kann die Lokalisation von immunmarkierten Biomolekülen in der epidermalen Barriere bestimmt werden. Vorzugsweise wird die Probe nach einer Immunmarkierung zur Lokalisation und/oder Identifikation von Biomolekülen zur Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie verwendet.
Als besonders geeignet für die Analyse der Lipidstrukturen der epidermalen Barriere hat sich die Transmissionselektronenmikroskopie erwiesen. Für die Analyse der Probe mittels Transmissionselektronenmikroskopie wird die Probe in bekannter Weise aufbereitet. Gebräuchliche Verfahren sind beispielsweise bei Elias, P. M. and Friend, S. (1975) (”The permeabiltity barrier in mammalian epidermis.” J Cell Biol 65: 180–191.) oder bei Pfeiffer, S., Vielhaber G. et al. (2000) (”High-Pressure freezing provides new information an human epidermis: simultaneous Protein antigen and lamellar lipid structure preservation. Study an human epidermis by cryoimmobilization.” J Invest Dermatol 114(5): 1030–1038.) beschrieben.
Üblicherweise erfolgt eine Kontrastierung in einer wässrigen Rutheniumtetroxid (Ruthenium(VIII)-oxid)-Lösung. Nachdem die Probe dehydratisiert wurde, erfolgt die Einbettung, üblicherweise in ein Epoxyharz.
Anschließend werden mittels eines Ultramikrotoms, bevorzugt mittels eines Ultrakryomikrotoms, Ultradünnschnitte der Probe hergestellt, welche anschließend der Transmissionselektronenmikroskopie unterzogen werden. Die auspolymerisierten Proben werden dazu in den Probenhalter des Ultramikrotoms eingespannt, überflüssiges Einbettungsmittel entfernt und mit Hilfe eines Diamantmessers Ultradünnschnitte angefertigt. Dies geschieht so, dass die Probe quer angeschnitten wird. Die Dicke der Ultradünnschnitte beträgt vorzugsweise 40 bis 250 nm, bevorzugt 50 bis 150 nm, besonders bevorzugt 60 bis 100 nm.
Durch die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) der erfindungsgemäß hergestellten Ultradünnschnitte lässt sich der Aufbau des Stratum corneum vorteilhaft hochaufgelöst abbilden. Dadurch werden sowohl die Korneozyten als auch die einzelnen Lipidlamellen der multilamellaren Lipidschichten erkennbar.
In pathologisch veränderter Haut ist die Anzahl der im Interzellularraum zwischen den Korneozyten vorhandenen Lipidlamellen häufig stark reduziert. Durch eine Bildanalyse der mittels TEM erhaltenen Daten kann eine semiquantitative Auswertung der Lipidlamellen erfolgen. Die mittels TEM erhaltenen Daten werden mathematisch ausgewertet, indem die Fläche des Interzellularraums und die Länge der Lipidlamellen in demselben Bildsegment bestimmt wird. Dies wird anhand der 5 näher erläutert. Dabei wird das verwendete Mikroskop zunächst kalibriert, indem durch einen geeichten Vergrößerungsmaßstab ermittelt wird, welche Abmessung ein Pixel in einem mit diesem Mikroskop aufgenommenen Bild besitzt.
Anschließend wird ein Bild eines Ausschnitts des Ultradünnschnitts aufgenommen, welches eine definierte Kantenlänge aufweist. Dieses Bildsegment hat vorzugsweise eine Länge und Breite von 500 nm bis 2 μm, bevorzugt 800 nm bis 1,5 μm.
Anschließend wird der in dem Bildausschnitt sichtbare Interzellularraum (IZR) erfasst (siehe 5). Der Interzellularraum umfasst den Raum zwischen den einzelnen Korneozyten. Nicht zum Interzellularraum gehören auch Strukturen, die Zellkontakte zwischen den Korneozyten herstellen, wie beispielsweise Corneodesmosomen oder dergleichen. Dies erfolgt entweder mittels automatischer Erkennung der Objekte in den aufgenommen Bildern oder mittels eines Sensorbildschirms oder eines Grafiktabletts (Digitalisiertablett), über welches die Kanten des Interzellularraums auf dem mit einem Datenverarbeitungssystem verbundenen Bildschirm umfahren werden. Durch die Umfahrung der Kanten der auf einem mit einem Datenverarbeitungssystem verbundenen Bildschirm dargestellten Objekte werden digitale und das Objekt repräsentierende Daten gewonnen. Das Datenverarbeitungssystem errechnet aus diesen Daten anschließend die Fläche des Interzellularraums in dem Bildausschnitt.
Anschließend werden die Längen der Lipidlamellen in dem untersuchten Interzellularraum bestimmt, d. h. die Längen aller im Bildausschnitt vorhandenen Lipidlamellen werden erfasst und die Summe daraus gebildet. Eine Lipidlamelle entspricht dabei einem lamellaren Lipid-Bilayer.
Die Erfassung der Längen der Lipidlamellen erfolgt ebenfalls mittels automatischer Erkennung der Objekte in den aufgenommenen Bildern oder mittels eines Sensorbildschirms oder eines Grafiktabletts (Digitalisiertablett), indem die in dem Bildsegment sichtbaren Lipidlamellen nachgefahren werden. Durch das Nachfahren der Kanten der auf einem mit einem Datenverarbeitungssystem verbundenen Bildschirm dargestellten Objekte werden digitale und das Objekt repräsentierende Daten gewonnen. Das digitale Datenverarbeitungssystem errechnet aus diesen Daten anschließend die Summe der Längen der Lipidlamellen.
Um die Daten aus unterschiedlichen Proben besser vergleichen zu können, wird aus den gewonnenen Daten das Verhältnis der Lipidlamellenlängen zu Fläche des Interzellularraums bezogen auf eine Fläche im Interzellularraum von 1000 nm² berechnet. Dies stellt bezogen auf die gesunden Patienten den Grundwert dar, der dann mit den Werten der kranken bzw. der behandelten Patienten verglichen werden kann. Somit ist ein Maßstab gegeben, mit dem die Wirkung direkt erfasst werden kann.
Um aussagekräftige Daten zu erhalten, werden vorzugsweise Messungen an mindestens 10, bevorzugt 20, besonders bevorzugt 50, Bildsegmenten vorgenommen. Vorzugsweise wird dafür nicht nur ein Ultradünnschnitt eines Hautabrisses verwendet, sondern die Bildsegmente werden aus verschiedenen Schnittebenen derselben Probe erhalten.
Vorzugsweise wird dabei sichergestellt, dass für die Auswertung einer Probe eine Interzellularraumfläche von mindestens 25.000 nm², bevorzugt 30.000 nm², besonders bevorzugt 40.000 nm², ganz besonders bevorzugt 50.000 nm² erfasst werden, um belastbare Ergebnisse zu erhalten. Die Zahl der ausgewerteten Fläche hängt dabei von der untersuchten Haut ab. Handelt es sich um gesunde Haut, ist eine ausgewertete Fläche von 25.000 nm² in der Regel ausreichend. Bei stark atopischer Haut beispielsweise, bei der die Lipidschichten stark reduziert sind, sollte ein Mindestwert von 40.000 nm² nicht unterschritten werden.
Für die Ermittlung der Fläche des Interzellularraums und die Längen der Lipidlamellen ist der erste Abriss von einer definierten Stelle der Haut nicht verwendbar, da in diesem Abriss hauptsächlich abschilfernde Korneozyten zu finden sind und kaum interzelluläre Lipidlamellen vorhanden sind. Daher wird vorzugsweise der zweite und der dritte Abriss von einer Stelle der Haut verwendet. Besonders bevorzugt ist insbesondere der dritte Abriss.
Als besonders geeignet für die Analyse der Oberflächenmorphologie der Hautabrisse, insbesondere der Korneozyten, hat sich die Rasterelektronenmikroskopie erwiesen. In einer weiteren Ausgestaltung werden daher die durch das oben beschriebene Verfahren erhaltenen Proben für die Erstellung eines Tiefenprofils der Korneozyten der menschlichen Haut verwendet. Über die Ermittlung des Korneozyten kann darüber hinaus der relative Feuchtigkeitsgehalt der Haut ermittelt werden.
Für die Rasterelektronenmikroskopie werden die Proben in bekannter Weise vorbereitet.
Der Hautabriss auf dem Substrat wird auf einen geeigneten Objektträger, vorzugsweise auf einen Aluminiumträger aufgebracht. Die Probe kann direkt mit einem Rasterelektronenmikroskop analysiert werden. Alternativ wird vor dem Mikroskopieren eine leitfähige Schicht auf die Probe aufgebracht. Dies erfolgt entweder durch „Besputtern” oder durch „Bedampfung”, beispielsweise mit Gold, Chrom, Platin-Kohle, Palladium oder Kohle.
Danach können die Proben direkt im Rasterelektronenmikroskop analysiert werden.
Für die Erstellung eines Tiefenprofils der Korneozyten wird von derselben Stelle der Haut zwei- bis viermal, bevorzugt dreimal, eine Probe nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten (siehe 1 und 2). Mehr als vier- oder fünfmalige Probennahme von einer Stelle würde die Haut soweit abtragen, dass lebende Zellen abgetragen werden und nicht mehr von einem nichtinvasiven Verfahren gesprochen werden kann (siehe 2).
Die derart erhaltenen Proben werden auf einen geeigneten Objektträger aufgebracht und anschließend werden mit dem Rasterelektronenmikroskop Aufnahmen der Probe erstellt. Die unterschiedlichen Proben von den verschiedenen „Tiefen” der Hornschicht werden nacheinander untersucht und somit anschließend ein Tiefenprofil erstellt.
3 zeigt das Tiefenprofil von gesunder Haut, wobei 3A die oberste Schicht, 3B die mittlere Schicht und 3C die unterste Schicht des abgetragenen Bereichs der Hornschicht zeigt.
Wie in 3 deutlich zu erkennen, sind die Falten in der obersten Schicht klar und präzise. Die Zellränder der Korneozyten erscheinen abgelöst. In der mittleren Schicht sind die Falten glatter und besitzen keine scharfen Kanten (3B). Nur vereinzelte Korneozyten zeigen abgelöste Zellränder. Die Korneozyten der untersten Schicht (3C) sind gekennzeichnet durch abgerundete Falten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die horizontale Erstreckung der Korneozyten, ihre Überlappungsbereiche und die Ablösung der Zellränder nach unten hin abnehmen, während die Dicke und das Volumen der Korneozyten, der interzelluläre Raum und die gewellte Form der Zelloberflächen von oben nach unten zunehmen.
Die erfindungsgemäße Verwendung von Hautabrissen für die Analyse mittels Elektronenmikroskopie eignet sich besonders gut für die Beurteilung des Feuchtigkeitsgehaltes der Haut.
Das Auftreten von Faltung und/oder Fältchen auf der Haut ist bedingt durch eine mangelnde Feuchtigkeit. Mit der Feuchtigkeit der Haut geht eine Volumenzunahme der Korneozyten einher. Dadurch wird die Haut gestrafft und wirkt frisch und gesund. Mit zunehmendem Alter verliert die Haut die Fähigkeit, Feuchtigkeit über längere Zeit zu speichern, und Falten entstehen. Antifaltencremes zielen auf eben diesen Effekt ab und versuchen, Falten zu reduzieren bzw. zu beseitigen, indem sie der Haut Feuchtigkeit zuführen, welche von den Korneozyten aufgenommen wird.
Die erfindungsgemäße Verwendung von Hautabrissen zur elektronenmikroskopischen Analyse eignet sich hervorragend zur direkten Überprüfung einer „hautbefeuchtenden Wirkung” sowie in welcher Tiefe welche Befeuchtung erreicht werden kann. Durch die oben beschriebene Erstellung eines Tiefenprofils kann die Volumenzu- bzw.- abnahme der Korneozyten qualitativ bzw. (semi-)quantitativ nachgewiesen werden.
Für die semiquantitative Bestimmung des Volumens der Korneozyten wird in einer rasterelektronenmikroskopischen Aufnahme eines Hautabrisses der Umriss mehrerer Korneozyten vorzugsweise mittels Kantendetektion erfasst und so die Fläche der Korneozyten bestimmt.
Die Höhe der Korneozyten innerhalb einer Ebene des Stratum corneum unterscheidet sich nur unwesentlich voneinander, so dass die Fläche der mittels Rasterelektronenmikroskopie abgebildeten Korneozyten einen zuverlässigen Rückschluss auf deren Zellvolumen und somit auf den Grad der Hautfeuchte erlaubt.
Für die Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts der Haut ist der erste Abriss von einer definierten Stelle der Haut nur wenig aussagekräftig, da im äußeren Bereich der Hornschicht ein Feuchtegradient existiert und die dort hauptsächlich vorhandenen abschilfernden Korneozyten kaum bzw. kein Wasser aufnehmen. Für die Bestimmung des Korneozytenvolumens und die Beurteilung der Hautfeuchte wird vorzugsweise der zweite und der dritte Abriss von einer Stelle der Haut verwendet. Bevorzugt ist insbesondere der dritte Abriss.
Um aussagekräftige Daten zu erhalten, werden vorzugsweise wenigstens 10, bevorzugt wenigstens 20, besonders bevorzugt wenigstens 50 Korneozyten gemessen. Aus den Flächen der Korneozyten wird das arithmetische Mittel gebildet.
Da die Form und Größe von Korneozyten sowohl von dem Patienten als auch von der Körperstelle, von dem bzw. der die Probe genommen wurde, abhängig ist, können mittels der Bestimmung des Korneozytenvolumens nur relative Aussagen über die Hautfeuchte gemacht werden, d. h. es kann die Zu- oder Abnahme der Feuchtigkeit der Haut über einen bestimmten Zeitraum, beispielsweise während der Behandlung mit einem Dermatologikum, bestimmt werden.
Die Bestimmung der epidermalen Barriere anhand eines Ultradünnschnitts oder die Bestimmung der Hautfeuchtigkeit anhand der Abrissoberfläche eines Hautabrisses, wie oben beschrieben, lässt sich auch einfach vollautomatisiert durchführen. Bestandteil der Erfindung ist daher auch eine Einrichtung zur nichtinvasiven Bestimmung der epidermalen Barriere der Haut umfassend eine mit einem Mikroskop verbundene Digitalkamera zur Aufnahme des Bildes eines Abrisses der epidermalen Barriere der Haut und ein mit der Digitalkamera verbundenes Datenverarbeitungssystem mit Einrichtungen

a) zur Erkennung mehrerer Korneozyten oder mindestens eines Interzellularraumes mit Lipidlamellen als Objekt im Bild
b) zur Bestimmung von Längen der Lipidlamellen und Flächenmaßen der Korneozyten oder der Interzellularräume

Vorzugsweise ist das Mikroskop ein Rasterkraftmikroskop, ein Elektronenmikroskop, insbesondere ein Rasterelektronenmikroskop, oder ein Elektronentomograph.
Vorzugsweise umfasst die Einrichtung zur Erkennung mindestens eines Interzellularraumes mit Lipidlamellen als Objekt im Bild einen mit dem Datenverarbeitungssystem verbundenen Sensorbildschirm, der die Gewinnung digitaler und Interzellularraum und Lipidlamellen repräsentierender Daten der Objekte erlaubt.
Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Einrichtung weist das Datenverarbeitungssystem eine Einrichtung zur automatischen Bilderkennung zur Lokalisation von Biomolekülen auf.
Die Digitalkamera ist mit dem Datenverarbeitungssystem so verbunden, dass das Abbild im Datenverarbeitungssystem farbecht, farbkodiert oder in Graustufen gewandelt wird.
Die Verwendung einer Digitalkamera führt vorteilhafterweise gleichzeitig zu digitalen Daten des Abbildes, so dass diese im Datenverarbeitungssystem leicht speicherbar sind und weiteren Anwendungen und Verarbeitungen zur Verfügung stehen. Über die Verteilung der Farben oder der Grauwerte der Abbilder kann leicht auf die Objekte des Abbildes geschlossen werden. Gleichzeitig können daraus auch Schlussfolgerungen gezogen werden, die beispielsweise personen-, wirkungs- oder stoffbezogen auswertbar sind.
Das Datenverarbeitungssystem ist vorzugsweise ein dem Abbild Daten zuordnendes Datenverarbeitungssystem. Derartige Daten sind dabei beispielsweise zeit-, personen- oder wirkstoffbezogen.
Die Daten sind bevorzugt ein Datum und personenbezogene Daten enthaltene Daten, so dass bei zeitlich nacheinander gewonnenen Daten Biografien der Hautschichten von Personen vorhanden sind. Damit können Krankheitsverläufe und deren Bekämpfung einfach dargestellt werden. Gleichzeitig kann die Wirksamkeit der ergriffenen Maßnahmen festgestellt werden, so dass leicht Änderungen in den Behandlungen vornehmbar sind.
Anhand nachfolgender Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert, ohne diese einzuschränken.
Dabei zeigen
1 eine schematische Darstellung der Herstellung eines Hautabrisses und die Aufbringung der Probe auf einen Probenträger für die Transmissionselektronenmikroskopie,
2, eine schematische Darstellung der Gewinnung von Proben für ein Tiefenprofil,
3 das Tiefenprofil der Korneozyten in gesunder Haut,
4 die untere Schicht des Tiefenprofils (links) bzw. einen Schnitt durch die lamellare Lipidschicht (rechts) eines Patienten mit atopischer Dermatitis nach der Behandlung mit einem Kortisonpräparat und
5 ein Bildsegment einer Aufnahme der epidermalen Barriere, in welcher die Fläche des Interzellularraums (IZR) mit den darin befindlichen Lipidlamellen (IZLL) gekennzeichnet ist.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im Folgenden näher beschrieben.
Ausführungsbeispiel 1:
Eine Einrichtung zur nichtinvasiven Bestimmung der epidermalen Barriere der menschlichen Haut besteht im Wesentlichen aus einer Probe mit von der Haut entfernten Hautschichten, einem Mikroskop und einer fotografischen Einrichtung für das Abbild der Hautschichten.
Die Probe ist dazu eine durch Auftragen eines Substrats mit einem Reaktionsklebstoff und nach Aushärten des Reaktionsklebstoffs von der Hautoberfläche abgezogene Probe mit dadurch entfernten Hautschichten in und auf der Reaktionsklebstoffschicht. Das Substrat besteht aus einem Polyolefinkunststoff.
Auf diesem befindet sich der Reaktionsklebstoff, der dann auf die Hautoberfläche aufgebracht wird. Der Reaktionsklebstoff in Form eines Cyanacrylat-Klebstoffs mit einer Viskosität (Kegel und Platte) bei 25°C von 70 bis 100 cP, dringt in die Haut ein und härtet dabei aus. Vorteilhafterweise handelt es sich um einen sogenannten Sekunden-Klebstoff. Dieser dringt durch das schnelle Aushärten nur begrenzt in die Haut ein, so dass sichergestellt ist, dass nur Hautschichten der Oberhaut betroffen sind.
Nach der Aushärtung wird das Substrat von der Haut abgezogen, wobei nur Hautschichten der Oberhaut entfernt werden. Dadurch entstehen keine weitreichenden Verletzungen. Die Oberhaut wird ständig ergänzt, so dass auch langwierige Beschädigungen der Haut vermieden werden.
Die so gewonnene Probe und das Mikroskop sind so angeordnet, dass mittels der fotografischen Einrichtung ein vergrößertes Abbild der Probe gewonnen wird, wobei die Hautschichten mit der epidermalen Barriere einschließlich der Lipidschichten mittels der fotografischen Einrichtung aufgenommen werden.
Die bekannte Aufbereitung schließt ein eventuelles Einfärben, das Einbetten in einen Kunststoff und ein anschließendes Schneiden ein. Das führt zu Dünnschnitten. Das Substrat dient dabei einer eindeutigen Orientierung der Schichten der Probe einschließlich der Lipidschichten.
Das Mikroskop selbst ist ein bekanntes Elektronenmikroskop, Immunfluoreszenzmikroskop, konfokales Lasermikroskop, Rasterkraftmikroskop, Rasterelektronenmikroskop oder Elektronentomograph. Je nach verwendetem Mikroskop ist das Abbild

– ein Ergebnis der Durchstrahlung der Probe oder
– ein rückgestrahltes Abbild der Probe.

Die jeweiligen Strahlen gelangen in einer Ausführungsform auf eine fotografische Platte, so dass ein direktes Abbild vorhanden ist. In einer weiteren Ausführungsform ist die fotografische Einrichtung eine Digitalkamera, die mit einem Datenverarbeitungssystem so verbunden ist, dass das Abbild im Datenverarbeitungssystem farbecht, farbkodiert oder in Graustufen gewandelt und die Verteilung der Farben oder der Grauwerte wenigstens mit den Hautschichten einschließlich der epidermalen Barriere korreliert wird. Nach der Wandlung werden die Abbilder vorteilhafterweise gespeichert. Das Abbild wird mit einem bekannten Gerät ausgegeben. Dazu ist ein Bildschirm und/oder ein Drucker mit dem Datenverarbeitungssystem verbunden.
In einer Ausführungsform des Datenverarbeitungssystems ist das Datenverarbeitungssystem ein dem Abbild Daten zuordnendes Datenverarbeitungssystem. Die Daten werden über ein Dateneingabegerät gespeichert und dem jeweiligen Abbild zugeordnet. Derartige Daten sind personenbezogene Daten, so dass bei zeitlich nacheinander gewonnenen Daten Biografien der Entwicklung der Hautschichten von Personen vorhanden sind.
Damit wird das auf die Hautoberfläche aufgetragene und mit einem Cyanacrylat-Klebstoff als Reaktionsklebstoff versehene und nach Aushärten des Reaktionsklebstoffs von der Hautoberfläche abgezogene Substrat mit dem Reaktionsklebstoff und der dadurch entfernten Hautschichten als Probe zur Bestimmung der Lipidschichten mittels des Mikroskops verwendet.
Ausführungsbeispiel 2:
Für die TEM-Analyse wurden an den unterschiedlichen Arealen jeweils drei Hautabrisse an der gleichen Stelle genommen. Die Hautabrisse wurden für die TEM aufbereitet wie in Pfeiffer, S., G. Vielhaber, et al. (2000). ”High-Pressure freezing provides new information an human epidermis: simultaneous Protein antigen and lamellar lipid structure preservation. Study an human epidermis by cryoimmobilization.” J Invest Dermatol. 114(5): 1030–1038. beschrieben.
Es wurden Ultradünnschnitte mit einer Schichtdicke von 60 nm erstellt.
Es erfolgte eine semiquantitative Bestimmung der Hautlipidlamellen im Interzellularraum des Stratum corneums mit einer automatisierten Verfahren zur Bildanalyse.
Zunächst wurde das verwendete Transmissionselektronen-Mikroskop kalibriert und mittels eines geeichten Vergrößerungsmaßstabs ermittelt, welche Abmessung ein Pixel in einem mit diesem Mikroskop aufgenommenen Bild besitzt.
Anschließend wurden 20 Bildausschnitte verschiedener Ultradünnschnitte des dritten Hautabrisses mit einer Länge von ca. 1 μm und einer Breite von Länge und Breite von ca. 0,4 μm aufgenommen. Der Umriss des in einem Bildausschnitt sichtbaren Interzellularraumes (IZR) wurde mittels eines Grafiktabletts umfahren und in ein Datenverarbeitungssystem eingelesen, das die Gesamtfläche des Interzellularraums in dem entsprechenden Bildsegment errechnet.
Anschließend wurden auf dieselbe Weise die Längen der Lipidlamellen in dem untersuchten Interzellularraum bestimmt und die Summe der Länge aller im Bildsegment enthaltenen Lipidlamellen gebildet.
Aus den erhaltenen Daten wurde der Quotient aus Fläche des Interzellularraums und Lipidlamellenlängen für jedes untersuchte Bildsegment gebildet und anschließend der arithmetische Mittelwert der Quotienten gebildet. Insgesamt wurde eine Interzellularraumfläche von ca. 45.000 nm² untersucht.
Um die Daten aus unterschiedlichen Proben besser vergleichen zu können, wurde aus den gewonnenen Daten das Verhältnis der Membranlängen bezogen auf eine Fläche im Interzellularraum von 1000 nm² berechnet. Mit diesem Wert ist ein Maßstab gegeben, mit dem die Wirkung direkt erfasst werden kann.
Ausführungsbeispiel 3: Erstellung eines Tiefenprofils und Korneozytenbestimmung
Für die Rasterelektronenmikroskopie wurden jeweils drei Hautabrisse von einer Stelle der Haut entnommen und in bekannter Weise für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet. Die Proben werden dabei mittels eines elektrisch leitenden Klebebandes (Leit-Tab, Fa. Piano Wetzlar) auf den Aluminium-Träger geklebt und mit Gold besputtert. Anschließend wurden die auf die Al-Träger aufgebrachten und mit Au-besputterten Proben in ein SEM eingeschleust und bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV untersucht. Die Bilder wurden digital aufgenommen.
Für die semiquantitative Bestimmung des Volumens der Korneozyten wurde in 20 verschiedenen Aufnahmen des jeweils dritten Hautabrisses von einer Hautstelle der Umriss mehrerer Korneozyten mittels Kantendetektion erfasst und anschließend der arithmetische Mittelwert der Flächen der Korneozyten bestimmt.
Ausführungsbeispiel 4:
Im Rahmen einer Studie wurde die Haut von Patienten mit atopischer Dermatitis (n = 7) untersucht. Dabei wurden die epidermale Barriere mittels TEM und die Oberflächenstruktur der Korneozyten mittels SEM vor und nach einer einwöchigen Behandlung mit einem Kortisonpräparat untersucht.
An jeweils sieben Probanden (gesunden Kontrollpersonen und Patienten mit atopischer Dermatitis (AD) wurden an vier unterschiedlichen Arealen (Stirn, Unterarm, Knie und Fuß) Corneometrie und SCORAD bestimmt und anschließend Proben für die REM- und TEM-Analyse entnommen.
SCORAD ist ein klinisches Bewertungsschema zur möglichst objektiven Ermittlung der Schwere (Ausmaß, Intensität) einer atopischen Dermatitis, welches von der European Task Force an Atopic Dermatitis 1993 entwickelt wurde.
Für die TEM- und die REM-Analyse wurden an den unterschiedlichen Arealen jeweils drei Hautabrisse an der gleichen Stelle genommen. Die Hautabrisse wurden für die TEM aufbereitet wie in Pfeiffer, S., Vielhaber G. et al. (2000). ”High-Pressure freezing provides new information an human epidermis: simultaneous Protein antigen and lamellar lipid structure preservation. Study an human epidermis by cryoimmobilization.” J Invest Dermatol. 114(5): 1030–1038. beschrieben. Die weitere Probenbehandlung erfolgte wie in Ausführungsbeispiel 2 beschrieben.
Die Hautproben der ersten und zweiten Abrisse sind makroskopisch untereinander vergleichbar. Die gewonnenen Proben (der zweiten Abrisse) der vierzehn Probanden (7 gesunde Probanden, 7 Probanden mit AD) sind alle auswertbar.
Erwartungsgemäß zeigten sich keine statistisch signifikanten Unterschiede in dem Aufbau der Lipidmuster innerhalb der Hautbarriere. Dies gilt für die vier verschiedenen Areale ebenso wie für die hier gezeigten fünf Probanden. Bei den gesunden Kontrollpersonen korrelieren die Messwerte der Corneometrie mit denen der TEM Analyse.
Auch bei den Probanden mit AD korrelieren SCORAD, Corneometrie, TEM Analyse statistisch signifikant miteinander. Auffällig ist hierbei, dass die Standardabweichung der Corneometrie-Messwerte deutlich größer ist als bei den gesunden Kontrollpersonen. Der Vergleich zwischen Kontrollpersonen und Atopikern zeigt auch in der TEM-Analyse eindeutige Unterschiede. Die Lipidlamellenlängen sind bei Probanden mit AD um den Faktor 4 bis 5 geringer als bei den gesunden Kontrollpersonen.
Die Analyse der Korneozytenoberfläche mittels Rasterelektronenmikroskope (SEM) ergab, dass die einwöchige Behandlung zu einer regelmäßigeren Organisation der Korneozyten führte. Das Tiefenprofil ähnelte im Anschluss an die Behandlung mehr dem von gesunder Haut.
Die ultrastrukturelle Analyse der epidermalen Barriere durch Transmissionselektronenmikroskopie zeigte zunehmend regelmäßige Lipidschichten, aber keine vollständige Normalisierung der epidermalen Barriere.
Die Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäße Verwendung von Hautabrissen eine geeignete Methode zur Untersuchung der epidermalen Barriere darstellt. Die Korrelation zu den anderen gewählten Untersuchungsparametern zur Bestimmung und Charakterisierung der Barriereschädigung (SCORAD und Corneometrie) ist gegeben.

Claims

Verfahren zur nichtinvasiven Bestimmung der epidermalen Barriere der Haut mit den Schritten a) Realisierung eines Hautabrisses, welcher die epidermale Barriere der Haut umfasst, mittels eines Substrates und eines Reaktionsklebstoffes, der die epidermale Barriere penetriert und rasch aushärtet, wobei die Aushärtedauer von 30 s bis 5 min beträgt, b) Bildaufnahme eines Ultradünnschnittes des Hautabrisses mittels Transmissionselektronenmikroskopie, c) Erkennung mindestens eines Interzellularraumes mit Lipidlamellen als Objekt im Bild, d) Ermittlung der Flächen der Interzellularräume und der Längen der Lipidlamellen, e) Bilden eines Quotienten aus der Fläche der Interzellularräume und der Länge der Lipidlamellen, wobei die Schritte b) bis e) mittels eines Datenverarbeitungssystems ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich folgende Schritte durchgeführt werden f) Bildaufnahme des Hautabrisses als Abrissoberfläche mittels Rasterelektronenmikroskopie g) Erkennung mehrerer Korneozyten als Objekt im Bild h) Bestimmung von Flächen der Korneozyten wobei die Schritte f) bis h) mittels eines Datenverarbeitungssystems ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktionsklebstoff ein Cyanacrylat-Klebstoff ist und eine Viskosität (Kegel und Platte) bei 25°C von 70 bis 100 cP besitzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass von der gleichen Hautfläche mehrere Hautabrisse erfolgen und der zweite oder dritte Hautabriss für die Bildaufnahme verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Verfahren zur automatischen Erkennung der Objekte in den aufgenommen Bildern verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Umriß mehrerer Korneozyten mittels Kantendetektion erfasst wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass durch Umfahrung der Kanten der auf einem mit dem Datenverarbeitungssystem verbundenen Bildschirm dargestellten Objekte digitale und das Objekt repräsentierende Daten gewonnen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Immunmarkierung des Hautabrisses mit einem Gold-konjugierten Antikörper erfolgt.
Einrichtung zur Realisierung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfassend ein Transmissionselektronenmikroskop und ein Rasterelektronenmikroskop zur Aufnahme des Bildes eines Abrisses der epidermalen Barriere der Haut mit Einrichtungen a) zur Erkennung mehrerer Korneozyten oder mindestens eines Interzellularraumes mit Lipidlamellen als Objekt im Bild b) zur Bestimmung von Längen der Lipidlamellen und Flächenmaßen der Korneozyten oder der Interzellularräume wobei die Einrichtungen a) und b) nacheinander geschalten sind.
Einrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung zur Erkennung mindestens eines Interzellularraumes mit Lipidlamellen als Objekt im Bild einen mit dem Datenverarbeitungssystem verbundenen Sensorbildschirm umfasst, der die Gewinnung digitaler und Interzellularraum und Lipidlamellen repräsentierender Daten der Objekte erlaubt.
Einrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Datenverarbeitungssystem eine Einrichtung zur automatischen Bilderkennung zur Lokalisation und/oder Identifikation von Biomolekülen aufweist.