DE102010025764A1

DE102010025764A1 - Phospholipase-Träger-Komplex

Info

Publication number: DE102010025764A1
Application number: DE102010025764A
Authority: DE
Inventors: Dr. Suck Kirstin; Dr. Sohling Ulrich; Dr. Ruf Friedrich
Original assignee: Sued Chemie AG
Current assignee: Clariant Produkte Deutschland GmbH
Priority date: 2010-07-01
Filing date: 2010-07-01
Publication date: 2012-01-05
Also published as: EP2588584A1; WO2012001153A1; CA2810850A1; US20130183734A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Phospholipase-Phospholipase-Träger-Komplexes zur Entschleimung von Rohölen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Entschleimung von Rohölen und einen Phospholipase-Träger-Komplex.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Phospholipase-Träger-Komplexes zur Entschleimung von Rohölen. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Entschleimung von Rohölen und einen Phospholipase-Träger-Komplex.
Rohöle enthalten – abhängig von der Art des Öls – unerwünschte Begleitstoffe, die entfernt werden müssen. Dafür werden die Rohöle raffiniert. Durch die Raffination wird die Qualität und Haltbarkeit der Öle erhöht. Dazu müssen verschiedene Stoffe, unter anderem freie Fettsäuren, Metallionen, Geschmacksstoffe und auch Phospholipide aus dem Rohöl entfernt werden. So ist z. B. Biodiesel ein Produkt, welches durch Umesterung von Pflanzenöl mit Methanol gewonnen wird. Die Gehalte an gewissen Komponenten, wie Phosphor oder Metallionen ist im Biodieselendprodukt gemäß der Spezifikation der EU und der US-Norm limitiert (siehe EU-Norm zur Spezifikation von Biodiesel EN 14214. Hier liegt z. B. der obere Grenzwert für Phosphor bei 4 ppm.). Da in Zukunft immer mehr Chemie mit Pflanzenölen betrieben wird ist die Raffination dieser besonders wichtig. Störender Phosphor kann z. B. bei Hydrierungsreaktionen Katalysatoren vergiften.
Rohöle enthalten sogenannte wasserlösliche und wasserunlösliche Phospholipide. Wasserlösliche Phospholipide können durch Hydratation aus den Ölen extrahiert werden. Die wasserunlöslichen Phospholipide verbleiben im Öl und können ihrerseits z. B. mit Enzymen, wie Phospholipasen, entfernt werden.
Phospholipasen sind Enzyme, die zur Gruppe der Hydrolasen gehören, die die Esterbindung von Phospholipiden hydrolysieren. Phospholipasen werden nach ihrer Regioselektivität bei Phospholipiden in 5 Gruppen eingeteilt:
Phospholipasen A₁ (PLA₁), die die Fettsäure in der sn1-Position unter Bildung des 2-Lysophospholipids abspalten.
Phospholipasen A₂ (PLA₂), die die Fettsäure in der sn2-Position unter Bildung des 1-Lysophospholipids abspalten.
Phospholipasen C (PLC), die einen Phosphorsäuremonoester abspalten.
Phospholipasen D (PLD), welche die Kopfgruppe abspalten oder austauschen.
Phospholipasen B (PLB), die die Fettsäure sowohl in der sn1-Position als auch in der sn2-Position unter Bildung eines 1,2-Lysophospholipids abspalten.
Diese Reaktionen finden immer an der Grenzfläche aggregierter Substrate statt.
Es gibt zahlreiche Beschreibungen zur Verwendung von Phospholipasen, vor allem Phospholipase A, zur Entschleimung von Rohölen. Ein Bespiel ist der Enzymax^® Prozess von Lurgi EP 0513709 B1 , bei dem die wasserunlöslichen Phospholipide aus einem vorentschleimten Speiseöl durch Einsatz von Phospholipasen (A2, A1, B) entfernt werden.
In der DE 4339556 C1 wird als weitere Variante dieses Verfahrens die Wiederverwendung des Enzyms beschrieben, indem es aus einer gebrauchten, schlammhaltigen wässrigen Phase durch Zusatz von Tensiden oder Lösungsvermittler abgelöst und als weitgehend schlammfreie Lösung, die mindestens 10% des eingesetzten Enzyms enthält, wieder eingesetzt wird.
Da die Herstellungskosten von Enzymen hoch sind, ist es erforderlich, dass diese wiederholt eingesetzt werden können. Sie müssen sich daher kostengünstig aus der Reaktionsmischung abtrennen lassen. Eine Möglichkeit ist, die Enzyme in geeigneter Weise mit einem Träger zu verbinden. Dazu stehen im Wesentlichen zwei Verfahren zur Verfügung, eine Immobilisierung und eine Verkapselung.
Bei einer Immobilisierung werden die Enzyme auf einem Träger gebunden. Die Bindung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Eine physikalische Bindung kann durch Adsorption des Enzyms auf der Oberfläche des Trägers erreicht werden. Die Bindung erfolgt über hydrophobe Wechselwirkungen oder durch ionische Kräfte, wobei geladene Gruppen des Enzyms mit entgegengesetzt geladenen Gruppen auf der Oberfläche des Trägers in Wechselwirkung treten. Vorteil dieser Methode ist ihre einfache Ausführbarkeit sowie der relativ geringe Einfluss auf die Aktivität des Enzyms. Nachteilig ist jedoch, dass die Enzyme relativ leicht wieder von der Oberfläche des Trägers verdrängt werden können. Eine irreversible Bindung des Enzyms kann erreicht werden, indem eine kovalente Bindung zwischen Enzym und Träger ausgebildet wird. Hier muss jedoch in Kauf genommen werden, dass unter Umständen die Aktivität des Enzyms verringert wird, da das Enzym beispielsweise so auf der Oberfläche fixiert sein kann, dass das aktive Zentrum nicht mehr zugänglich ist. Schließlich kann die Stabilität des Enzym/Träger-Komplexes noch erhöht werden, indem die Enzyme durch zumindest bifunktionelle Moleküle vernetzt werden. Es entstehen dabei größere Aggregate, die eine geringere Löslichkeit aufweisen. Die Kontrolle der Immobilisierung ist bei diesem Verfahren jedoch sehr schwierig. Ferner muss meist eine deutliche Deaktivierung des Enzyms in Kauf genommen werden, da dessen Konformation stark verändert wird oder das aktive Zentrum nicht mehr frei zugänglich ist.
Beim zweiten Verfahren wird das Enzym in einer kugel- oder schlauchförmigen Matrix eingeschlossen. Die Matrix muss für die Edukte und Produkte der katalysierten Reaktion durchlässig sein, nicht jedoch für die Enzyme. Für diese Technik werden natürliche Polymere, wie z. B. Alginate, Gelatine oder Agar, oder auch synthetische Polymere, wie Polyacrylamid oder Polyvinylalkohol verwendet. Bei dieser Methode wird das Enzym bei Reaktionen in organischen Medien vor der Inaktivierung durch das Lösungsmittel geschützt. Als Nachteil muss jedoch in Kauf genommen werden, dass die Matrix als Diffusionsbarriere für die Edukte und Produkte der enzymkatalysierten Reaktion wirken kann.
Die Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen sind dem Fachmann geläufig und sind detailliert in folgender Literaturstelle beschrieben: L. Cao (2005): Carrier-bound Immobilized Enzymes; Wiley-VCH Verlag Weinheim, Deutschland.
Die Immobilisierung von Phospholipase A1 in Natrium-Alginat Partikeln bzw. Natrium-Alginat-Chitosan Partikeln ist in der CN 100535094 C und in der CN 101485366 A beschrieben.
In der WO 2005086900 A2 , S. 142–144, werden Verfahren zur Immobilisierung von Phospholipasen auf Trägern wie z. B. Sepharose, Gelatine, Glutaraldehyde, Albumin-Glutaraldehyde, Chitosan-Xanthan, Alginate und Agarose aufgezählt.
Über die Immobilisierung von Lecitase in Gelantine-Hydrogel mit anschließender Quervernetzung durch Glutaraldehyd berichten Sheelu et al., J Am Oil Chem Soc (2008) 85: 739–748. Das immobilisierte Enzym wird zur Ölentschleimung in einem sogenannten „Spinning basket” Bioreaktor zur Entschleimung von Reiskeimöl eingesetzt. Im Hydrogel bleibt das Enzym im Reaktor über 6 Zyklen aktiv im Gegensatz zur vergleichenden adsorptiven Immobilsierung auf Eupergit, Celite und XAD-7. Auf diesen Trägern war das Enzym nach dem 2. Zyklus nicht mehr aktiv.
Weiterhin ist die Immobilisierung über kovalente und adsorptive Verfahren von Phospholipasen in folgenden Literaturstellen beschrieben: Fernandez-Lorente et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2007) 47: 99–104; Bornscheuer et al., Enzymes in Lipid Modification (2005), Chapter 12; 217–291; Garcia et al., Grasas y aceites (2008) 59: 368–374; Nam and Walsh, Journal of food Biochemistry (2005): 29: 1–12; Kim et al., Enzyme and Microbial Technology (2001) 29: 587–592; Chen et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (1998) 5: 483–490. Die Enzyme in immobilisierter Form wurden charakterisiert hinsichtlich pH-Stabilität, Temperaturstabilität, Kinetik der Enzymreaktion etc.. In einem Beispiel wurde die Phospholipase 1 kovalent immobilisiert um anschließend chirale Moleküle herzustellen.
Insgesamt wurde bisher kein Verfahren beschrieben, bei dem ein Phospholipase-Enzym in mehreren Recyclingschritten bei der Entschleimung von Rohölen eingesetzt werden kann, um dadurch das Verfahren der Enzym-katalysierten Ölentschleimung kosteneffektiver zu gestalten.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde eine Möglichkeit zu finden, wie Phospholipase in technischen Prozessen wie der Entschleimung von Rohölen eingesetzt werden kann, und bei der Anwendung eine hohe Aktivität und eine lange Halbwertszeit aufweist und somit wiederholt eingesetzt werden kann.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass sich Phospholipasen A1, A2 und/oder B beziehungsweise deren Mischungen besonders gut auf Trägern immobilisieren lassen und diese erfindungsgemäßen Phospholipase-Träger-Komplexe überraschend effektiv in der Entschleimung von Rohölen eingesetzt werden können.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wurde nun durch eine Verwendung eines Phospholipase-Träger-Komplexes mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst. In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung somit die Verwendung eines Phospholipase-Träger-Komplexes umfassend mindestens eine Phospholipase A1, A2 und/oder B und mindestens einen Träger zur Entschleimung von Rohölen.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform wird der Träger ausgewählt aus anorganischen Trägern wie Silikaten und organischen Polymeren und Copolymeren.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird das Silikat ausgewählt aus der Gruppe der natürlichen und künstlichen Silikate und Schichtsilikate und deren Mischungen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Silikat um ein künstliches Silikat auf Basis von Siliziumdioxid, wobei Kieselsäure und Fällungskieselsäure besonders bevorzugt sind.
Kieselsäuren lassen sich thermisch oder nasschemisch herstellen, wie z. B. beschrieben in K. H. Büchel et al. (1999): Industrielle Anorganische Chemie; Wiley-VCH Verlag Weinheim, Deutschland. Thermisch ist die Flammhydrolyse das dominierende Verfahren, bei der Tetrachlorsilan in einer Knallgasflamme zersetzt wird. Die gebildete pyrogene Kieselsäure ist röntgenamorph und nicht porös. Nasschemisch hat bei der Herstellung von Kieselsäuren das Fällungsverfahren die größte Bedeutung. Zur Bildung von Kieselsäure wird beim Fällungsverfahren Wasser in großen Rührkesseln vorgelegt und anschließend Wasserglas und Säure, in der Regel Schwefelsäure, simultan zugegeben. Dabei bilden sich kolloidale Primärteilchen, die mit fortschreitender Reaktion agglomerieren und schließlich zu Aggregegaten verwachsen. Im Gegensatz zu den pyrogenen Kieselsäuren, sind Fällungskieselsäuren meistens mesoporös.
Ebenfalls bevorzugt handelt es sich bei dem Silikat um ein Schichtsilikat, das in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein saueraktiviertes Schichtsilikat ist, bei dem die Teilchen durch ein Bindemittel miteinander verbunden sind. Bevorzugte Verfahren zur sauren Aktivierung von Schichtsilikaten sind beispielsweise in der DE 4405878 A1 und DE 4405876 A1 beschrieben. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das sauer aktivierte Schichtsilikat erhalten, indem ein bevorzugt aus einer natürlichen Quelle gewonnenes oder auch ein synthetisches Schichtsilikat mit einer Säure belegt wird. Derartige sauer aktivierte Schichtsilikate sind auch als oberflächenmodifizierte Bleicherden bekannt, z. B. aus F. Bergaya et al. (2006): Handbook of Clay Science; Elsevier Verlag Heidelberg, Deutschland. Bevorzugte Schichtsilikate gemäß der vorliegenden Erfindung sind Zweischichtsilikate, z. B. Serpentine-Kaoline sowie Dreischichtsilikate, wie Talk-Pyrophilite, Smektite, zu denen u. a. Montmorillonit, Beidelit, Nontronit, Saponit, Hektorit oder Stevensit gehören, Vermikulite und Glimmerden sowie deren Mischungen.
Das Silikat kann zudem mindestens ein Metalloxid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxiden von Aluminium, Calcium, Magnesium, Zink, Titan, Zirkonium und deren Mischungen enthalten.
Besonders bevorzugte Trägermaterialien sind die Produkte Sipernat^® der Firma Evonik, insbesondere Sipernat^® 22, und CAB-O-SIL^®, insbesondere CAB-O-SIL^® M-5 der Firma Cabot und K-Träger der Firma Süd-Chemie AG.
Ebenfalls bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Träger umfassend mindestens ein organisches Polymer und/oder Copolymer.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte organische Polymere und Copolymere sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylat, Polymethacrylat, Polymethylmethacrylat, Polyethylen, Polyethylenperepthalat, Polytetrafluorethylen, Polypropylen, Polyvinylstyrol, Polystyrol, Styrol-Divinylbenzolcopolymere, Polyamid und deren Mischungen, wobei Divenylbenzol-vernetzte Polymere, Polymethacrylat, Polyacrylat und Polyvinylstyrol besonders bevorzugt sind. Als Träger können die Produkte Duolite^® oder Amberlite^® der Firma Rohm and Haas eingesetzt werden. Ebenfalls besonders bevorzugt sind die Produkte Lewatit^®, insbesondere Lewatit VP OC 1600, der Firma Lanxess ein makroporöses, Divenylbenzol-vernetztes Polymer auf der Basis von Methacrylat.
Grundsätzlich bevorzugt sind gemäß der vorliegenden Erfindung Träger in Form eines Pulvers oder Granulats.
Werden Träger in Form eines Pulvers gewählt, so wird die Partikelgröße des Pulvers bevorzugt so eingestellt, dass sich der Träger ohne Schwierigkeit mit einem geeigneten Verfahren, wie beispielsweise Filtration oder Zentrifugation, innerhalb einer geeigneten Zeitspanne vom Reaktionsansatz abtrennen lässt.
Bevorzugt wird ein Pulver verwendet mit einer mittleren Teilchengröße, gemessen nach Malvern in Luft, von 0,1 bis 250 μm, bevorzugter von 1–150 μm, besonders bevorzugt mit einer Teilchengröße von 5–100 μm, ganz besonders bevorzugt mit einer Teilchengröße von 8–80 μm. Weiterhin kann der Träger als Granulat verwendet werden, welches eine mittlere Teilchengröße, gemessen nach Malvern in Luft von mehr als 0,1 mm aufweist. Bevorzugt weist das Granulat eine Korngröße im Bereich von 0,15 bis 5 mm, insbesondere bevorzugt 0,2 bis 2 mm auf. Die Korngröße lässt sich beispielsweise durch Absieben aus einem Granulat mit breiter Teilchengrößenverteilung einstellen, ein Verfahren, das dem Fachmann gut bekannt ist.
Die Größe der Granulate auf organischer Basis können bei der Polymerisationsreaktion eingestellt werden. Nicht eingeschränkte Beispiele für Polymerisationsverfahren sind Emulsionspolymerisation, Suspensionspolymerisation, Fällungspolymerisation, Lösungspolymerisation und Sprühpolymerisation. Die gewünschte Teilchengrößenverteilung kann anschließend z. B. durch Absieben eingestellt werden.
Das Granulat auf anorganischer Basis kann nach üblichen Verfahren hergestellt werden, indem beispielsweise das fein gemahlene Trägermaterial mit einem Granuliermittel, beispielsweise Wasser, beaufschlagt und dann in einer üblichen Granuliervorrichtung in einer mechanisch erzeugten Wirbelschicht granuliert wird. Es können jedoch auch andere Verfahren eingesetzt werden, um das Granulat herzustellen. So kann das pulverförmige Trägermaterial beispielsweise durch Kompaktierung zu einem Granulat geformt werden.
Möglich ist auch eine Extrusion einer plastischen Masse. Das Extrudat wird anschließend zerkleinert, beispielsweise indem der extrudierte Strang in kurze zylinderförmige Stücke geschnitten wird, und dann die erhaltenen Formkörper getrocknet werden. Neben massiven Zylindern können auf diese Weise z. B. auch Hohlzylinder hergestellt werden.
Nach der Formgebung kann das anorganische Granulat noch wärmebehandelt werden und beispielsweise durch Erhitzen gesintert werden. Dadurch kann die Stabilität des Granulats erhöht werden. Für die Wärmebehandlung wird das Granulat bevorzugt auf eine Temperatur von mehr als 300°C, gemäß einer weiteren Ausführungsform auf eine Temperatur von mehr als 400°C, und gemäß noch einer weiteren Ausführungsform auf eine Temperatur von mehr als 500°C erhitzt. Gemäß einer Ausführungsform wird die Temperatur geringer als 1200°C, gemäß einer weiteren Temperatur geringer als 1000°C gewählt.
Um stabile anorganische Granulate zu erhalten, wird die Wärmebehandlung bevorzugt für eine Dauer von zumindest 30 Minuten, gemäß einer weiteren Ausführungsform für eine Dauer von zumindest 60 Minuten gewählt. Gemäß einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform wird die Behandlungsdauer geringer als 5 Stunden gewählt.
In einer weiteren Ausführungsform wirkt es sich günstig auf die Enzymaktivität aus, wenn bei der Herstellung der Granulate auf Basis von Fällungskieselsäuren der Anteil an Kieselsäure hoch gewählt wird. Neben der Kieselsäure können noch weitere Schichtsilikate in der Granuliermischung enthalten sein. Diese Schichtsilikate können als Bindemittel dienen und bewirken eine höhere Festigkeit des Granulats. Als derartige Schichtsilikate werden bevorzugt Bentonite verwendet. Es können dabei sowohl Schichtsilikate in der Alkaliform, insbesondere Natriumform, als auch mit Erdalkaliionen als austauschbaren Kationen, insbesondere Calciumionen, verwendet werden. Beispielhafte Schichtsilikate sind Bentonite, Montmorillonite, Natronite, Saponite, Hektorite, Attapulgite, Sepiolithe oder deren Mischungen. Der Anteil dieser Schichtsilikate wird vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 50 Gew.-% gewählt. Außerdem können beispielsweise noch Granulierhilfsmittel oder Porenbildner in der pulverförmigen Granuliermischung enthalten sein. Beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, können als Bindemittel verwendet werden: Agar-Agar, Alginate, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten. Das Bindemittel kann auch anorganischer Natur sein. Üblicherweise werden Wassergläser, Bentonite oder Kieselsol als anorganische Bindemittel eingesetzt. Die Prozentangaben zur pulverförmigen Granuliermischung beziehen sich auf eine trockene rieselfähige Granuliermischung, d. h. ohne einen Zusatz von Flüssigkeit.
Grundsätzlich bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Träger, die eine hohe spezifische Oberfläche gemäß BET aufweisen, wobei eine Oberfläche von mehr als 10 m²/g bevorzugt ist, weiter bevorzugt eine Oberfläche von mehr als 20 m²/g, besonders bevorzugt von mehr als 30 m²/g, insbesondere von mehr als 40 m²/g und am meisten bevorzugt von mehr als 60 m²/g. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die spezifische Oberfläche im Bereich von 10 bis 650 m²/g, besonders bevorzugt 30 bis 520 m²/g, insbesondere bevorzugt 50 bis 500 m²/g.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Träger ein hohes Porenvolumen auf. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Träger ein Porenvolumen von mehr als 0,1 ml/g auf, besonders bevorzugt ein Porenvolumen von mehr als 0,2 ml/g, ganz besonders bevorzugt ein Porenvolumen von mehr als 0,3 ml/g auf. Das Porenvolumen wird als kumulatives Porenvolumen nach BJH (I. P. Barret, L. G. Joiner, P. P. Haienda, J. Am. Chem. Soc. 73, 1991, 373) für Poren mit einem Durchmesser von 1,7 bis 300 nm bestimmt. Gemäß einer Ausführungsform weisen die Träger ein Porenvolumen von weniger als 1,5 ml/g auf. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens beträgt das Porenvolumen des anorganischen Trägermaterials weniger als 1,4 ml/g und gemäß einer weiteren Ausführungsform weniger als 1,3 ml/g. Besonders bevorzugt ist dabei ein Porenvolumen von 0,1 bis 1,5 ml/g, insbesondere von 0,4 bis 1,0 ml/g.
Grundsätzlich bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Träger, die einen Mindestporendurchmesser von 2 nm aufweisen. Der Porendurchmesser wird nach der BJH-Methode bestimmt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform liegt der Porendurchmesser bei mehr als 2 nm, besonders bevorzugt bei mehr als 5 nm auf, ganz besonders bevorzugt bei mehr als 8 nm. Besonders bevorzugt ist dabei ein Porendurchmesser von 2 nm bis 100 nm, insbesondere von 3 bis 60 nm, weiter bevorzugt von 7 bis 35 nm und am meisten bevorzugt von 20 bis 32 nm.
Ebenso bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Träger die einen pH-Wert gemessen in einer 10%igen Suspension in Wasser von 2,0–9,0, bevorzugt von 3,0–8,0, besonders bevorzugt von 3,0–7,5 aufweisen. Träger mit einem pH-Wert von 2,0–9,0 wirken sich günstig auf die Enzymaktivität aus.
Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Entschleimung von Rohöl, umfassend die Schritte

a) Mischen eines Phospholipase-Träger-Komplexes wie vorstehend definiert mit einer Puffer-Lösung im Verhältnis von 0,01%–80% (Gewicht Phospholipase-Träger-Komplex zu Volumen Puffer-Lösung);
b) In-Kontakt-Bringen der Puffer-Lösung enthaltend den Phospholipase-Träger-Komplexes mit einem Rohöl;
c) Abtrennen des Rohöls von der Puffer-Lösung enthaltend den Phospholipase-Träger-Komplex;

Das Verfahren zur Entschleimung von Rohöl umfasst in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform den Schritt

d) wiederholtes In-Kontakt-Bringen der Puffer-Lösung enthaltend den Phospholipase-Träger-Komplex mit einem Rohöl.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Entschleimung von Rohöl sind dieselben Puffer-Lösungen bevorzugt, wie sie vorstehend bereits definiert worden sind. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung des Phospholipase-Träger-Komplexes gegebenen Definitionen gelten somit auch vorliegend für das erfindungsgemäße Verfahren zur Entschleimung von Rohöl.
Ebenfalls möglich ist eine Vorentschleimung mit Säure bei einer Temperatur von 25 bis 95°C, bevorzugt 35 bis 85°C.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Entschleimung von Rohöl, wird der Anteil der Pufferlösung enthaltend den Phospholipase-Träger-Komplexe bezogen auf das Rohöl auf 0,01 bis 30 Gew.-%, bevorzugt 0,05 bis 20 Gew.-%, weiter bevorzugt auf 0,1 bis 15 Gew.-% und besonders bevorzugt auf 0,5 bis 12 Gew.-%, insbesondere bevorzugt auf 1 bis 10 Gew.-% und am meisten bevorzugt von 1 bis 5 Gew.-% eingestellt.
Weiter bevorzugt wird der Anteil an Enzym bezogen auf das Rohöl auf 0,01 bis 20 Units pro Gramm Öl (U/g) eingestellt, bevorzugter 0,1 bis 15 U/g, besonders bevorzugt 0,2 bis 13 U/g. (Units: Internationale Einheit für Enzymaktivität; 1 Unit entspricht dem Substratumsatz von 1 μmol/min)
Das Mischen des Phospholipase-Träger-Komplexes mit der Puffer Lösung kann auf jede dem Fachmann bekannte Weise erfolgen. Möglich ist zudem ein Mischen indem die Pufferlösung auf den Phospholipase-Träger-Komplex aufgesprüht wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das In-Kontakt-Bringen gemäß den Schritten b) und/oder d) für einen Zeitraum von 1 Minute bis 24 Stunden, bevorzugter 5 Minuten bis 20 Stunden, weiter bevorzugt von 10 Minuten bis 18 Stunde und besonders bevorzugt von 15 Minuten bis 10 Stunden und ebenfalls bevorzugt für einen Zeitraum von 20 Minuten bis 5 Stunden, insbesondere bevorzugt von 25 Minuten bis 4 Stunden und am meisten bevorzugt für einen Zeitraum von 30 Minuten bis 3 Stunden durchgeführt.
In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform wird das In-Kontakt-Bringen gemäß den Schritten b) und/oder d) bei einer Temperatur von 20 bis 85°C, bevorzugt 30 bis 80°C, weiter bevorzugt von 32 bis 75°C und am meisten bevorzugt von 35 bis 65°C durchgeführt.
Das In-Kontakt-Bringen gemäß Schritt b) und/oder d) kann durch Mischmethoden jeglicher Art, die dem Fachmann als geeignet bekannt sind, wie Schütteln, Rühren oder Ultraschall erfolgen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Entschleimung von Rohöl, kann jedes Öl oder Fett der Herkunft aus Pflanzen, Tieren, Algen und Fischen eingesetzt werden. Nicht limitierte Bespiele bevorzugter Öle und Fette sind: Sojaöl, Rapsöl, Palmöl, Sonnenblumenöl, Canolaöl, Reiskeimöl, Erdnussöl, Kokosnussöl, Kürbiskernöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Jojobaöl, Jatrophaöl, Walnussöl, Traubenkernöl, Sesamöl, Mandelöl, Leinöl oder Baumwollsaatöl. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können auch Mischungen der Öle oder Fette sowie Mischungen von Ölen und Fetten jeglicher Art eingesetzt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Rohöl ein vorentschleimtes Rohöl. Vorentschleimtes Rohöl erhält man z. B. durch Mischen des Öls mit Wasser, bei einer Temperatur zwischen 30°C bis 90°C für 30 bis 60 Minuten, wobei eine Temperatur von 35 bis 85°C bevorzugt und eine Temperatur von 40 bis 80°C besonders bevorzugt ist. Des Weiteren erhält man vorbehandeltes Öl durch Behandlung mit Säure, insbesondere Zitronensäure, bei einer Temperatur zwischen 30°C bis 90°C für 15 bis 60 Minuten, wobei eine Temperatur von 35 bis 85°C bevorzugt und eine Temperatur von 40 bis 80°C besonders bevorzugt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird anschließend die säurehaltige, wässrige Phase z. B. durch Zentrifugation abgetrennt. Es kann aber auch nach der Säurebehandlung ein Neutralisationsschritt mit einer entsprechenden Base erfolgen, um einen pH-Wert von 3,5 bis 8,0, bevorzugt von 4 bis 7 zu erreichen.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten festen Phospholipase-Träger-Komplexe eignen sich auch für eine kontinuierliche Anwendung, z. B. für eine Anwendung im Durchflussreaktor, durch welche dann kontinuierlich eine Lösung des Substrates geleitet wird, sowie für einen Einsatz in batchweise geführten Verfahren.
Das Abtrennen der Puffer-Lösung enthaltend den Phospholipase-Träger-Komplex kann durch jedes Verfahren, das dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist erfolgen, bevorzugt ist eine Abtrennung durch Zentrifugation, Filtration oder Absetzen.
Die Puffer-Lösung, enthaltend den festen Phospholipase-Träger-Komplex, kann in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erneut mit unbehandeltem Rohöl versetzt werden. Dabei wird in einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform die (Anfangs)Konzentration der Pufferlösung wiederhergestellt indem die abgetrennte Fraktion an Puffer-Lösung und Phospholipase-Träger-Komplex mit frischer Pufferlösung aufgefüllt wird.
Es ist hierbei ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Phospholipase-Träger-Komplexes, dass dieser mehrfach, mindestens jedoch dreifach, bevorzugter vier- bis 30fach, insbesondere 5 bis 25fach, ebenfalls bevorzugt 6 bis 20fach und am meisten bevorzugt 7 bis 18fach wiederverwendet werden kann.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, den Phosphorwert in dem entschleimten Öl auf unter 20 ppm senken, besonders bevorzugt auf unter 10 ppm, ganz besonders bevorzugt auf unter 4 ppm Phosphor.
Weiterhin ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich den Calcium und Magnesiumgehalt auf unter 20 ppm zu senken, besonders bevorzugt auf unter 15 ppm, ganz besonders bevorzugt auf unter 10 ppm, ebenfalls bevorzugt auf unter 8 ppm und am meisten bevorzugt auf unter 4 ppm.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Phospholipase-Träger-Komplexes, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen mindestens einer Phospholipase A1, A2 und/oder B oder deren Mischungen in einer Puffer-Lösung mit einem pH-Wert von 3,0 bis 8,0;
b) Bereitstellen mindestens eines Trägers wie vorstehend definiert;
c) In-Kontakt-Bringen der mindestens einen Phospholipase A1, A2 und/oder B oder deren Mischungen mit dem mindestens einen Träger;
d) Abtrennen des entstandenen Phospholipase-Träger-Komplexes von dem Reaktionsmedium.

Die Phospholipase wird bevorzugt in Form einer wässrigen Puffer-Lösung bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Konzentration der Puffer-Lösung in einem Bereich von 5 bis 1000 mmol/l eingestellt, bevorzugt in einem Bereich von 10 bis 500 mmol/l, weiter bevorzugt 15 bis 250 mmol/l und am meisten bevorzugt 30 bis 150 mmol/l. Bevorzugte Puffer sind Acetatpuffer und Citratpuffer, wobei grundsätzlich jeder Puffer eingesetzt werden kann, der dem Fachmann als geeignet bekannt ist.
Der pH-Wert der Puffer-Lösung wird in Abhängigkeit von dem zu immobilisierenden Enzym ausgewählt und liegt vorzugsweise im Bereich von 3,0 bis 9,0, weiter bevorzugt im Bereich von 3,0 bis 8,0 und am meisten bevorzugt im Bereich von 3,0 bis 7,0. Der ideale Bereich für den pH-Wert hängt vom spezifischen Enzym ab. Für Phospholipasen A1 und Phospholipasen A2 wird der pH-Wert des Puffers bevorzugt im Bereich von 3,0 bis 7,0 gewählt.
Die Konzentration des Puffers wird in einer bevorzugten Ausführungsform im Bereich 10 bis 300 mmol/l, bevorzugter 20 bis 200 mmol/l und am meisten bevorzugt 50 bis 150 mmol/l eingestellt.
Die Konzentration der mindestens einen Phospholipase in der Puffer-Lösung liegt gemäß einer bevorzugten Ausführungsform im Bereich von 0,01 bis 500 U/ml, bevorzugter im Bereich von 0,05 bis 100 U/ml, weiter bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 50 U/ml und am meisten bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 30 U/ml.
Bevorzugt wird die mindestens eine Phospholipase durch nicht-kovalente Bindungen auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert. Es ist jedoch auch möglich, die mindestens eine Phospholipase über kovalente Bindungen auf der Oberfläche des Trägers zu fixieren. Dazu werden der Träger und die Phospholipase mit einem Kopplungsagens umgesetzt, welches mindestens zwei reaktive Gruppen aufweist, sodass eine der Gruppen mit beispielsweise Hydroxygruppen auf der Oberfläche des Trägers und die andere Gruppe mit einer geeigneten Gruppe am Enzym reagieren kann, wie einer Hydroxy-, einer Amino- oder einer Thiolgruppe. Beispiele für Kopplungsagenzien sind Silanisierungsreagenzien, Polycarbonate, Polyaldehyde, Polyepoxide, Polyazylazide, Polyisocyanate und Polyazlactone. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird das Kopplungsagens bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Silanen, Polyaldehyden und Polyepoxiden ausgewählt. Zur besseren Kopplung der eingesetzten Phospholipase an die Trägeroberfläche kann zusätzlich an das Kopplungsagens ein sogenannter Spacer angebunden werden. Nicht limitierte Beispiele für Spacer-Moleküle sind Glutaraldehyd, Polyethylenglycoldiamin, Polyethylenimin, Dextran oder Polyether.
Es ist auch möglich, die mindestens eine Phospholipase durch entsprechende zumindest bifunktionelle Moleküle zu vernetzen, um dadurch das Molekülgewicht des Enzyms zu erhöhen und damit seine Löslichkeit im Reaktionsmedium zu verschlechtern. Diese Maßnahme kann ergriffen werden, wenn das Enzym auf dem Träger physikalisch adsorbiert wird. Für die Vernetzung können übliche bifunktionelle Moleküle verwendet werden, die dem Fachmann für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt sind.
Bevorzugt ist die mindestens eine Phospholipase über eine nicht-kovalente Bindung an den Träger gebunden. Durch die nicht-kovalente Bindung des Enzyms auf dem Träger wird die Struktur des Enzyms weniger gestört, sodass sich die Immobilisierung nicht übermäßig auf die Aktivität des Enzyms auswirkt.
Die Menge des Enzyms, welche auf dem Träger immobilisiert ist, liegt bevorzugt bei 0,01 bis 10 U pro mg (Träger), insbesondere bevorzugt bei 0,05 bis 5 U pro mg, weiter bevorzugt bei 0,1 bis 3 U pro mg.
Um eine vorzeitige Deaktivierung des Enzyms zu verhindern, wird das In-Kontakt-Bringen bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 37°C, insbesondere bevorzugt im Bereich von 10 bis 35°C, weiter bevorzugt von 15 bis 30°C und am meisten bevorzugt von 18 bis 25°C durchgeführt.
Enzym und Träger können in an sich beliebiger Weise in Kontakt gebracht werden. So kann der Träger in einer Lösung des Enzyms suspendiert werden. Es ist aber auch möglich, die Lösung des Enzyms auf den Träger aufzusprühen, während dieser beispielsweise bewegt wird.
Die Dauer, welche für die Immobilisierung des Enzyms benötigt wird, hängt vom verwendeten Träger und vom verwendeten Enzym ab. Bevorzugt wird das In-Kontakt-Bringen für einen Zeitraum im Bereich von 1 Minute bis 48 Stunden, bevorzugter 5 Minuten bis 24 Stunden, weiter bevorzugt von 10 Minuten bis 12 Stunden ebenso bevorzugt von 12 Minuten bis 3 Stunden und am meisten bevorzugt von 15 Minuten bis 1 Stunde durchgeführt.
Abschließend wird das Reaktionsmedium noch von dem festen Phospholipase-Träger-Komplex abgetrennt. Dies kann mit üblichen Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren desweiteren den Schritt des:

e) Waschens des abgetrennten Phospholipase-Träger-Komplexes;

Optional kann ungebundenes Enzym durch Waschen entfernt werden. Zum Waschen kann beispielsweise der gleiche Puffer verwendet werden, wie er auch bei der Umsetzung von Enzym und anorganischem Träger verwendet worden ist, es kann jedoch auch ein unterschiedlicher Puffer gewählt werden. Ist nur relativ wenig Lösungsmittel, insbesondere Wasser, in dem festen Phospholipase-Träger-Komplex enthalten, beispielsweise weil das Enzym auf den Träger aufgesprüht worden ist, kann das Lösungsmittel auch verdampft werden. Dazu kann beispielsweise auch unter vermindertem Druck das Lösungsmittel abdestilliert werden. Auch hier wird die Temperatur möglichst niedrig gewählt, d. h. bevorzugt in einem Bereich von 0 bis 37°C insbesondere bevorzugt im Bereich von 10 bis 35°C, weiter bevorzugt von 15 bis 30°C und am meisten bevorzugt von 18 bis 25°C, um eine vorzeitige Deaktivierung des Enzyms zu vermeiden.
Um eine Denaturierung des Enzyms während der Immobilisierung zu vermeiden bzw. um einen geeigneten pH-Wert für eine möglichst effiziente Adsorption des Enzyms auf den Trägern bereitzustellen, werden die Träger vor dem In-Kontakt-Bringen in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf einen geeigneten pH-Wert äquilibriert. Dazu werden die Träger bevorzugt in einem geeigneten Puffer aufgeschlämmt. Der pH-Wert des Puffers wird bevorzugt in einem Bereich von 3,0 bis 9,0, bevorzugt in einem Bereich von 3,0 bis 8,5 und weiter bevorzugt in einem Bereich von 3,5 bis 8,0 gewählt. Der Puffer wird bevorzugt gleich zu dem Puffer gewählt, in welchem das Enzym gelöst bzw. aufgenommen ist. Die Dauer für die Aquilibrierung des Trägers wird vorzugsweise im Bereich von 1 Minute bis 48 Stunden, bevorzugter 5 Minuten bis 24 Stunden, weiter bevorzugt von 8 Minuten bis 12 Stunden und am meisten bevorzugt von 10 Minuten bis 5 Stunden gewählt. Vor der Immobilisierung kann der zum Äquilibrieren verwendete Puffer ggfs. durch frischen Puffer ersetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Phospholipase-Träger-Komplex, umfassend mindestens eine Phospholipase A1, A2 und/oder B und mindestens einen Träger, wobei der Träger ausgewählt ist aus Silikaten und organischen Polymeren und Copolymeren.
Grundsätzlich gelten auch im Hinblick auf den erfindungsgemäßen Phospholipase-Träger-Komplex die vorstehend gegebenen Definitionen. Der Träger kann somit sämtliche Eigenschaften und Zusammensetzungen aufweisen, wie sie vorstehend näher definiert wurden, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Träger jedoch ausgewählt aus Kieselsäure, Fällungskieselsäure, säureaktiviertes Schichtsilikat, Divinylbenzol-vernetztes Methacrylat, Polyacrylat und Polymethacrylat.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform besitzt der Träger auf Basis von säureaktiviertem Schichtsilikat eine Kationenaustauchkapazität von weniger als 40 meq/100 g, bevorzugt weniger als 30 meq/100 g, weiter bevorzugt von weniger als 20 meq/100 g.
In einer ebenfalls besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Verhältnis der mindestens einen Phospholipase zum Träger 0,05–5 U/mg (Träger).
Die Erfindung wird im Weiteren an Hand von Figuren und Beispielen näher erläutert. Es wird hierbei betont, dass die Beispiele und Figuren lediglich veranschaulichenden Charakter besitzen und besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Weder Beispiele noch Figuren beschränken den Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Es zeigen
1 die Partikelgrößenverteilung des Produkts Lanxess VPOC 1600 (Träger 4) gemessen mit einem Mastersizer 2000 Vers. 5.40 (serial number MAL 1015917) der Firma Malvern Instruments Ltd, UK, in Luft
2 die Partikelgrößenverteilung des Produkts EXM 1907 (Träger 5) gemessen mit einem Mastersizer 2000 Vers. 5.40 (serial number MAL 1015917) der Firma Malvern Instruments Ltd, UK, in Luft
3 die Partikelgrößenverteilung des Produkts Cab-O-Sil (Träger 1) gemessen mit einem Mastersizer 2000 Vers. 5.40 (serial number MAL 1015917) der Firma Malvern Instruments Ltd, UK, in Luft
4 die Partikelgrößenverteilung des Produkts Sipernat 22 (Pulver) (Träger 2) gemessen mit einem Mastersizer 2000 Vers. 5.40 (serial number MAL 1015917) der Firma Malvern Instruments Ltd, UK, in Luft.
Methoden
Es wurden folgende Analysenmethoden verwendet:
BET-Oberfläche/Porenvolumen nach BJH und BET:
Die Oberfläche und das Porenvolumen wurden mit einem vollautomatischen Stickstoffporosimeter der Firma Micromeritics Typ ASAP 2010 bestimmt.
Die Probe wird im Hochvakuum auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff abgekühlt. Anschließend wird kontinuierlich Stickstoff in die Probenkammern dosiert. Durch die Erfassung der adsorbierten Gasmenge als Funktion des Druckes wird bei konstanter Temperatur eine Adsorptionsisotherme ermittelt. In einem Druckausgleich wird das Analysengas schrittweise entfernt und eine Desorptionsisotherme aufgenommen.
Zur Ermittlung der spezifischen Oberfläche und der Porosität nach der BET-Theorie werden die Daten gemäß DIN 66131 ausgewertet.
Das Porenvolumen wird ferner aus den Messdaten unter Anwendung der BJH-Methode ermittelt (I. P. Barret, L. G. Joiner, P. P. Haienda, J. Am. Chem. Soc. 73, 1991, 373). Bei diesem Verfahren werden auch Effekte der Kapillarkondensation berücksichtigt. Porenvolumina bestimmter Volumengrößenbereiche werden durch Aufsummieren inkrementeller Porenvolumina bestimmt, die aus der Auswertung der Adsorptionsisotherme nach BJH erhalten werden. Das Gesamtporenvolumen nach BJH-Methode bezieht sich auf Poren mit einem Durchmesser mit 1,7 bis 300 nm.
Teilchengrößenbestimmung mittels dynamischer Lichtstreuung (Malvern)
Die Bestimmung der mittleren Teilchengröße wird mit einem Gerät ”2000-Mastersizer” der Firma Malvern Instruments Ltd., UK, entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Messungen werden mit der vorgesehenen Probenkammer (”dry powder feeder”) in Luft durchgeführt und die auf das Probenvolumen bezogenen Werte ermittelt.
Wassergehalt
Der Wassergehalt der Produkte bei 105°C wird unter Verwendung der Methode DIN/ISO-787/2 ermittelt.
Bestimmung des Schüttgewichts
Ein bei der 1000 ml Markierung abgeschnittener Messzylinder wird gewogen. Dann wird die zu untersuchende Probe mittels eines Pulvertrichters so n einem Zug in den Messzylinder eingefüllt, dass sich oberhalb des Abschlusses des Messzylinders ein Schüttkegel ausbildet. Der Schüttkegel wird mit Hilfe eines Lineals, das über die Öffnung des Messzylinders geführt wird, abgestreift und der gefüllte Messzylinder erneut gewogen. Die Differenz entspricht dem Schüttgewicht.
Bestimmung der Proteinkonzentration nach der BCA-Methode
Bei der BCA-Methode dient Bicinchoninsäure (BCA) als Detektionssystem. Dabei kommt es zunächst zur Komplexbildung von Protein mit Cu²⁺-Ionen in alkalischer Lösung. Die Cu²⁺-Ionen des Komplexes werden zu Cu²⁺-Ionen reduziert, welche durch Komplexbildung mit BCA durch Absorptionsmessung bei 562 nm detektiert werden können.
Durchführung
Die Bestimmung wurde mit Arbeitsreagenzien durchgeführt, die von der Firma Pierce, Illinois, US, gebrauchsfertig bezogen wurden.
25 μl der Enzym/Protein-Lösung werden in eine Kavität einer 96-Loch-Platte pipettiert. 200 μl Arbeitsreagenz wird dazu pipettiert und die Mischung homogenisiert. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Extinktion bei 550 nm im Plattenphotometer gemessen. Standardkurve für Proteinbestimmungen:

Standard 1 0,025 mg/ml

Standard 2 0,125 mg/ml

Standard 3 0,25 mg/ml

Standard 4 0,5 mg/ml

Standard 5 1,0 mg/ml

Standard 6 2,0 mg/ml

Blindwert nur Puffer
Verwendete Träger
In den folgenden Beispielen wurden kommerziell erhältliche Trägermaterialien auf Basis von SiO₂, Schichtsilikaten und organischen Polymeren verwendet. Tabelle 1: Verwendete Trägermaterialien

Träger 1 CAB-O-Sil^® M-5 (CABOT)

Träger 2 Sipernat 22 (Evonik)

Träger 3 KA-Granulat (Süd-Chemie)

Träger 4 Lewatit^® VP OC 1600 (Lanxess)

Die Eigenschaften der Trägermaterialien sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2: Physikalische Eigenschaften der Trägermaterialien

	Träger 1	Träger 2	Träger 3	Träger 4
Schüttgewicht (g/l) (nach Herstellerangaben)	43	220	522	650–800
Mittlere Teilchengröße (d₅₀) [μm] (nach Malvern)	13,25	12,07	608	550
BET Oberfläche (m²/g)	200,29	167,10	149,2	80
Kumulatives Porenvolumen (BJH) für Porendurchmesser 1.7–300 nm (cm³/g)	0,48	1,15	0,4	0,45
Durchschnittlicher Porendurchmesser (BJH) (nm)	11,8	32,5	10,5	25,3

Beispiele
Beispiel 1: Herstellung von Trägern auf der Basis von Fällungskieselsäure
Es wurden Granulate auf Basis von Fällungskieselsäure hergestellt. Dazu wurde Fällungskieselsäure (Sipernat^® 22, Evonik Degussa, Hanau, DE) mit Wasser granuliert. In einem Eirich Intensivmischer R = 2E (Firma Eirich, Hartheim, DE) wurde der Träger vorgelegt und über einen Trichter Wasser zudosiert. Dabei wurde die niedrigste Einstellung für die Umdrehungsgeschwindigkeit des Tellers sowie die maximale Umdrehungsgeschwindigkeit für den Wirbler gewählt. Die nassen Granulate wurden zunächst bei 70°C getrocknet und nach dem Trocknen wurden die Granulate noch jeweils für eine Stunde bei 600°C gesintert. Die für die Herstellung der Granulate verwendete Formulierung ist in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3: Formulierungen zur Herstellung von Granulaten auf der Basis von Fällungskieselsäure

Träger 5

Einwaage Sipernat^® 22 [g] 300

Wasser [g] 506

Die Eigenschaften des erhaltenen Granulats sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4: physikalische Eigenschaften des Granulats

	Träger 5
Schüttgewicht [g/l]	343
pH (10 Gew.-% in Wasser)	6,1
Wassergehalt (Gew.-%)	2,0
BET-Oberfläche (m²/g)	157
Kumulatives Porenvolumen nach BJH für Poren von 1,7–300 nm (cm³/g)	1,12
Durchschnittsporendurchmesser nach BJH (nm)	28,6

Beispiel 2: Trägerung von Phospholipase A1 und anschließende Ölentsohleimung
Für die Adsorption auf den Trägern wurde eine Phospholiase A1 (Lecitase^TM Ultra) aus Thermomyces lanuginosa (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, DE) verwendet.
Bestimmung der Enzym-Bindekapazität im statischen System
Vorbereitung der Träger
Jeweils 100 mg der Träger werden mit 2,2 ml 50 mMol Acetat-Puffer (pH 4,5) equilibriert. Der im Puffer suspendierte Träger wird 10 Minuten bei 20 Upm in einem Überkopfmischer geschüttelt. Die Suspension wird anschließend bei 3219 g und 25°C für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Vorbereitung der Enzyme
Es wird eine Stammlösung der Phospholipase A1 mit einer Konzentration von 50 U/ml in 50 mMol Acetat-Puffer (pH 4,5) hergestellt.
Untersuchung der Enzymadsorption
Zu jeweils 100 mg der equilibrierten Träger werden 2,2 ml der Enzymstammlösung gegeben und die Suspension für 90 min bei Raumtemperatur und 20 Upm im Überkopfschüttler inkubiert. Danach wird der Feststoff bei 3219 g (25°C) für 10 min abzentrifugiert und der Proteingehalt im Überstand nach der BCA-Methode bestimmt. Anschließend wird der Feststoff erneut dreimal in 2,2 ml des entsprechenden Puffers suspendiert, für 10 min bei Raumtemperatur und 20 Upm im Überkopfschüttler vermischt und bei 3219 g erneut abzentrifugiert. Der Proteingehalt des Waschwassers wird ebenfalls bestimmt. Die auf dem Träger adsorbierte Enzymmenge wird aus der Differenz zwischen eingesetzter Enzymmenge und der Summe der im Überstand bzw. im Waschwasser gemessenen Enzymmenge berechnet. Nachdem der Überstand restlos entfernt ist, wird der mit dem Enzym beladene Träger mit 0,9 ml 50 mMol Acetat-Puffer (pH 4,5) und 0,1 ml CaCl₂ (50 mM) aufgefüllt und die Suspension für die Rohölentschleimung eingesetzt.
Blindwert der Enzymadsorption
Für den Blindwert wird anstelle der Enzymlösung reiner Acetatpuffer verwendet. Der Blindwert wird analog der oben genannten Prozedur behandelt.
Die Menge an gebundener Phospholipase A1 an die verschiedenen Trägermaterialien ist in Tabelle 5 dargestellt. Es wurde jeweils die gesamte eingesetzte Menge an Enzym auf den Trägern gebunden. Tabelle 5: Gebundene Menge an Phospholipase A1 an verschiedenen Trägern

Träger 1 Träger 2 Träger 3 Träger 4

gebunden [U] 110 110 110 110

gebunden [U/g] 1100 1100 1100 1100

gebunden [%] 100 100 100 100
Entschleimung mit Rohöl
i) Messwert geträgerte Phospholipase A1
Zu dem geträgerten Enzym werden 9 ml Sojaöl gegeben. Die Suspension wird anschließend für 16 h bei 37°C und 40 Upm im Überkopfschüttler inkubiert. Anschließend werden die Proben bei 3219 g (25°C) für 10 min zentrifugiert und der Überstand restlos vom Träger entfernt. Der Ölüberstand wird für die Phosphoranalytik verwendet. Die Bestimmung von Phosphor erfolgte durch ICP gemäß DEV E-22. Das geträgerte Enzym wird erneut mit Puffer/Öl versetzt und der oben beschriebene Vorgang wiederholt. Dieser Vorgang wird mindestens dreimal wiederholt.
ii) Blindwert geträgerte Phospholipase A1
Als Blindwert dient der Träger ohne immobilisiertes Enzym. Die Entschleimung mit Rohöl verläuft analog wie unter i.
iii) Messwert ungeträgerte Phospholipase A1
Es wurde dieselbe Konzentration an ungeträgerter Phospholipase A1 eingesetzt wie bei dem Versuch unter i. Zu 0,9 ml (110 U) PLA1 in 50 mM Acetatpuffer (pH 4,5) werden 0,1 ml CaCl₂-Lösung (50 mM) und 9 ml Sojaöl gegeben. Die Suspension wird anschließend für 16 h bei 37°C und 40 Upm im Überkopfschüttler inkubiert. Anschließend werden die Proben bei 3219 g (25°C) für 10 min zentrifugiert. Der Ölüberstand wird für die Phosphoranalytik verwendet.
iv) Blindwert ungeträgerte Phospholipase A1
Bei dem Blindwert ungeträgerte Phospholipase wird der Versuch mit Puffer, ohne Enzymlösung, wie unter iii analog durchgeführt.
Die Ergebnisse zur Entschleimung von Sojaöl mit immobilisierter Phospholipase A1 sind in der Tabelle 6 dargestellt. Dabei wurde in jedem Schritt das Öl über 16 h bei 37°C mit dem Enzym inkubiert.
Beispiel 3: Trägerung von Phospholipase A2 und anschließende Ölentschleimung
Für die Adsorption auf den Trägern wurde eine Phospholipase A2 aus Schweinepankreas verwendet (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, DE).
Für die Phospholipase A2 wurde zur Immobilisierung und für alle weiteren Schritte ein 50 mMol Acetatpuffer (pH 4) verwendet. Ansonsten wurde der Versuch analog dem Versuch in Beispiel 2 durchgeführt.
Die Menge an gebundener Phospholipase A2 an die verschiedenen Trägermaterialien ist in Tabelle 8 dargestellt. Es wurde jeweils die gesamte eingesetzte Menge an Enzym auf den Trägern gebunden. Tabelle 8: gebundene Menge an Phospholipase A2 an verschiedenen Trägern

Träger 1 Träger 2 Träger 3 Träger 4 Träger 5

gebunden [U] 110 110 110 110 110

gebunden [U/g] 1100 1100 1100 1100 1100

gebunden [%] 100 100 100 100 100
Ergebnisse der Entschleimung
Die Ergebnisse zur Entschleimung von Sojaöl und Rapsöl mit immobilisierter Phospholipase A2 sind in den Tabellen 9 und 10 dargestellt. Dabei wurde in jedem Schritt das Öl über 16 h bei 37°C mit dem Enzym inkubiert.
Beispiel 4 Verringerung der Konzentration an Träger 2/Phospholipase A2-Immobilisat
Für die Adsorption auf den Trägern wurde eine Phospholiase A2 aus Schweinepankreas verwendet (Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, DE).
Vorbereitung von Träger 2
Jeweils 50 mg und 25 mg Träger 2 werden mit 2,2 ml 50 mMol Acetat-Puffer (pH 4) equilibriert. Der im Puffer suspendierte Träger wird 10 Minuten bei 20 Upm in einem Überkopfmischer geschüttelt. Die Suspension wird anschließend bei 3219 g und 25°C für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Vorbereitung der Enzyme
Für die Beispiele wird eine Stammlösung der Phospholipase A2 mit einer Konzentration von 50 U/ml in 50 mMol Acetat-Puffer (pH 4) hergestellt.
Untersuchung der Enzymadsorption
Zu jeweils 50 mg equilibriertem Träger 2 werden 1,1 ml Enzymstammlösung gegeben, zu jeweils 25 mg equilibriertem Träger 2 werden 0,55 ml Enzymstammlösung gegeben und die Suspension für 90 min bei 25°C und 20 Upm im Überkopfschüttler inkubiert. Danach wird der Feststoff bei 3219 g (25°C) für 10 min abzentrifugiert und der Proteingehalt im Überstand nach der BCA-Methode bestimmt. Anschließend wird der Feststoff erneut dreimal in 2,2 ml des entsprechenden Puffers suspendiert, für 10 min bei Raumtemperatur und 20 Upm im Überkopfschüttler vermischt und bei 3219 g erneut abzentrifugiert. Der Proteingehalt des Waschwassers wird ebenfalls bestimmt. Die auf dem Träger adsorbierte Enzymmenge wurde aus der Differenz zwischen eingesetzter Enzymmenge und der Summe der im Überstand bzw. im Waschwasser gemessenen Enzymmenge berechnet. Alle Versuche werden als Dreifachbestimmung durchgeführt. Nachdem der Überstand restlos entfernt ist, wird der mit dem Enzym beladene Träger mit 0,9 ml 50 mMol Acetat-Puffer (pH 4) und 0,1 ml CaCl₂ (50 mM) aufgefüllt und die Suspension für die Rohölentschleimung eingesetzt.
Blindwert der Enzymadsorption
Für den Blindwert wird anstelle der Enzymlösung reiner Acetatpuffer verwendet. Der Blindwert wird analog der oben genannten Prozedur behandelt.
Die Menge an gebundener Phospholipase A2 an die verschiedenen Trägermaterialien ist in Tabelle 11 dargestellt. Die gesamt eingesetzte Menge an Phospholiapse A2 hat auf den Trägern gebunden. Tabelle 11: gebundene Menge an Phospholipase A2 an verschiedene Mengen von Träger 2 bei pH 4

Träger 2 (50 mg) Träger 2 (25 mg)

gebunden [U] 55 27,5

gebunden [U/g] 1100 1100

gebunden [%] 100 100
Entschleimung mit Sojaöl
Die Entschleimung mit Sojaöl verläuft analog der Beschreibung in Beispiel 2.
Die Ergebnisse zur Entschleimung von Sojaöl mit immobilisierter Phospholipase A2 sind in der Tabelle 12 dargestellt. Dabei wurde in jedem Schritt das Öl über 16 h bei 37°C mit dem Enzym inkubiert.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 0513709 B1 [0006]
DE 4339556 C1 [0007]
CN 100535094 C [0012]
CN 101485366 A [0012]
WO 2005086900 A2 [0013]
DE 4405878 A1 [0024]
DE 4405876 A1 [0024]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

EN 14214 [0002]
L. Cao (2005): Carrier-bound Immobilized Enzymes; Wiley-VCH Verlag Weinheim, Deutschland [0011]
Sheelu et al., J Am Oil Chem Soc (2008) 85: 739–748 [0014]
Fernandez-Lorente et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2007) 47: 99–104 [0015]
Bornscheuer et al., Enzymes in Lipid Modification (2005), Chapter 12; 217–291 [0015]
Garcia et al., Grasas y aceites (2008) 59: 368–374 [0015]
Nam and Walsh, Journal of food Biochemistry (2005): 29: 1–12 [0015]
Kim et al., Enzyme and Microbial Technology (2001) 29: 587–592 [0015]
Chen et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic (1998) 5: 483–490 [0015]
K. H. Büchel et al. (1999): Industrielle Anorganische Chemie; Wiley-VCH Verlag Weinheim, Deutschland [0023]
F. Bergaya et al. (2006): Handbook of Clay Science; Elsevier Verlag Heidelberg, Deutschland [0024]
I. P. Barret, L. G. Joiner, P. P. Haienda, J. Am. Chem. Soc. 73, 1991, 373 [0039]
DIN 66131 [0089]
I. P. Barret, L. G. Joiner, P. P. Haienda, J. Am. Chem. Soc. 73, 1991, 373 [0090]
DIN/ISO-787/2 [0092]

Claims

Verwendung eines Phospholipase-Träger-Komplexes umfassend mindestens eine Phospholipase A1, A2 und/oder B beziehungsweise deren Mischungen und mindestens einen Träger zur Entschleimung von Rohölen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Träger ein Porenvolumen gemäß BJH von mehr als 0,1 ml/g für Poren mit einem Durchmesser von 1,7 bis 300 nm aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Träger einen Porendurchmesser gemäß BJH von mehr als 2 nm aufweist.
Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger ausgewählt wird aus Silikaten und organischen Polymeren und Copolymeren.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das Silikat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus natürlichen und künstlichen Silikaten und Schichtsilikaten und deren Mischungen.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei es sich bei dem Silikat um ein Silikat auf Basis von Siliziumdioxid wie Kieselsäure und/oder Fällungskieselsäure handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei das organische Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylat, Polymethacrylat, Polyethylen, Polyethylenperepthalat, Polytetrafluorethylen Polypropylen, Polyvinylstyrol, Polystyrol, Styrol-Divinylbenzolcopolymere, Polymethylmethacrylat, Polyamid und deren Mischungen.
Verfahren zur Entschleimung von Rohöl, umfassend die Schritte a) Mischen eines Phospholipase-Träger-Komplexes umfassend mindestens eine Phospholipase A1, A2 und/oder B und mindestens einen Träger mit einer Puffer-Lösung im Verhältnis von 0,01%–80% (Gewicht Phospholipase-Träger-Komplex zu Volumen Puffer-Lösung); b) In-Kontakt-Bringen der Puffer-Lösung enthaltend den Phospholipase-Träger-Komplex mit einem Rohöl; c) Abtrennen des Rohöls von der Puffer-Lösung enthaltend den Phospholipase-Träger-Komplex;
Verfahren gemäß Anspruch 8, weiter umfassend den Schritt d) wiederholtes In-Kontakt-Bringen der Puffer-Lösung enthaltend den Phospholipase-Träger-Komplex mit einem Rohöl.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 oder 9, wobei der Anteil der Pufferlösung enthaltend den Phospholipase-Träger-Komplex auf 0,01 bis 15 Gew.-% bezogen auf das Rohöl eingestellt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der Anteil an Enzym bezogen auf das Rohöl auf 0,01 bis 15 Unit pro Gramm Öl eingestellt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Rohöl aus der Gruppe bestehend aus Sojaöl, Rapsöl, Palmöl, Sonnenblumenöl, Canolaöl, Reiskeimöl, Erdnussöl, Kokosnussöl, Kürbiskernöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Jojobaöl, Jatrophaöl, Walnussöl, Traubenkernöl, Mandelöl, Leinöl oder Baumwollsaatöl und deren Mischungen ausgewählt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Phospholipase-Träger-Komplexes, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen mindestens einer Phospholipase A1, A2 und/oder B in einer Puffer-Lösung mit einem pH-Wert von 3,0 bis 8,0; b) Bereitstellens mindestens eines Trägers ausgewählt aus mindestens einem Silikat und mindestens einem organischen Polymer; c) In-Kontakt-Bringens der mindestens einen Phospholipase A1, A2 und/oder B mit dem mindestens einen Träger; d) Abtrennens des entstandenen Phospholipase-Träger-Komplexes von dem Reaktionsmedium;
Phospholipase-Träger-Komplex, umfassend mindestens eine Phospholipase A1, A2 und/oder B und mindestens einen Träger, wobei der Träger ausgewählt ist aus Silikaten und organischen Polymeren und Copolymeren.
Phospholipase-Träger-Komplex gemäß Anspruch 14, wobei der Träger ausgewählt ist aus Kieselsäure, Fällungskieselsäure, Polyacrylat, Polymethacrylat und Divinylbenzol-vernetztem Methacrylat.
Phospholipase-Träger-Komplex gemäß Anspruch 15, wobei das Verhältnis der mindestens einen Phospholipase zum Träger 0,05–5 U/mg (Träger) beträgt.