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Die Erfindung betrifft eine mikrobiologische Kulturplatte mit einem integrierten Ausstrichsystem zur emersen Kultivierung von Mikroorganismenkulturen, wobei mit ihr ein aseptisches Arbeiten außerhalb steriler Laborbedingungen möglich wird und zu prüfende flüssige Proben – ohne die Kulturplatte öffnen zu müssen – dezentral auf einem Nährboden aufgebracht und dort gleichmäßig ausgestrichen werden.
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In mikrobiologischen Laboren ist die Verwendung von sterilen Petrischalen aus Glas oder Kunststoff zur emersen Kultivierung von Mikroorganismenkulturen auf verfestigten Nährböden üblich und vielfältig im Einsatz. Ein großes Einsatzgebiet ist die Bestimmung von Lebendkeimzahlen als KBE (Kolonie bildende Einheiten), um z. B. die Keimbelastungen in Ab- und Trinkwasser, Lebensmitteln oder in der Medizindiagnostik zu prüfen. Unter Verwendung spezieller Selektivnährböden werden auch explizit Einzelstämme (z. B. pathogene Bakterien) oder Mikroorganismengruppen (z. B. Schimmelpilze) bestimmt.
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Ein solches Verfahren ist relativ einfach. Zur Keimzahlbestimmung wird ein flüssiges Probenaliquot (i. d. R. 100 μl) auf einen sterilen, verfestigten Nährboden in einer Petrischale aufgebracht und mittels sterilem Werkzeug gleichmäßig und vollständig auf der Fläche verteilt. Die Probenflüssigkeit wird vom Nährboden absorbiert und vermehrungsfähige Keime beginnen an der Oberfläche zu wachsen und eine sichtbare Kolonie zu bilden. Diese können nach einer entsprechenden Inkubationszeit ausgezählt werden.
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Ein Problem besteht jedoch darin, dass für einen Probenausstrich zwingend aseptische Bedingungen vorliegen müssen, was aber bei einer bekanntermaßen zweiteiligen zu öffnenden Petrischale, aufgrund einer einhergehenden Kontamination durch Umgebungskeime, außerhalb steriler Laborbedingungen nicht gegeben ist. Somit kann eine keimfreie Arbeitsweise nur im Sterilbereich mikrobiologischer Labore vollzogen werden. Das Verfahren unter Feldbedingungen durchzuführen, z. B. in der Sterilumgebung einer Brennerflamme, erfordert Kompromisse und die qualitätsgerechte Ausführung ist nicht gewährleistet.
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Ein großes Einsatzgebiet für Keimzahlbestimmungen außerhalb von Laboren ist in der Beurteilung von Umweltproben (z. B. Proben von Gewässern), von Trink- und Brauchwasserproben im Privatbereich sowie von gewerblichen Proben (z. B. Proben von Kompostierung oder der Müllverarbeitung) zu sehen.
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Anfragen aus der Bevölkerung zeigen, dass zunehmend ein Interesse zur Eigenkontrolle bzgl. der hygienischen Unbedenklichkeit von Trink- und Nutzwasser existiert. Brauch-, Regen- und Brunnenwasser steht dabei zunächst im Mittelpunkt des Interesses, da diese Quellen vor allem im ländlichen Bereich gern zur Wasser-/Abwasser- und damit Kostenersparnis genutzt werden.
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Nach derzeitigem Stand der Technik müssen die flüssigen Proben nach der Probennahme immer erst in kommerzielle Labore geschickt werden, um dort geprüft zu werden. Das ist teuer, zeitaufwendig und birgt die Gefahr der Veränderung der Probe während der Transportzeiten in sich.
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Eine andere Problemstellung ist die Kontrolle von mikrobiologischen Raumluftbelastungen, z. B. durch aerogene Schimmelpilzsporen. Für die Abscheidung dieser Keime existieren diverse Probennahmegeräte. Man unterscheidet indirekte und direkte Filtrationsverfahren sowie Impaktorverfahren und Impingerverfahren. Sie ermöglichen eine sanierungsbegleitende Beurteilung bei schimmelkontaminierten Bauten. Die eindeutige mikrobiologische Einschätzung des Kontaminationsstatus bildet nicht nur die Voraussetzung zur Auswahl geeigneter Sanierungsmethoden, sondern sie ist gleichzeitig das Kriterium zur Dokumentation des Sanierungserfolges im Nachgang der Maßnahme.
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Werden die Keime direkt auf Nährbodenplatten abgeschieden (Impaktorverfahren), kann anschließend eine unmittelbare Inkubation stattfinden. Werden die Keime aber nach dem Impingerverfahren zunächst in eine Sammelflüssigkeit abgeschieden, was besonders bei sehr hohen Konzentrationen angebracht ist, muss diese Probe im Anschluss zeitnah und definiert auf Kulturplatten ausgestrichen werden.
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Eine wesentliche Erleichterung und Verfahrensverbesserung ist es, wenn gleich vor Ort eine Probenweiterbehandlung, d. h. ein Ausstrich von flüssigen Probenmaterialien auf Kulturplatten möglich wäre.
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Das setzt ein geschlossenes, steriles Einweg-Kultivierungssystem mit entsprechendem Nährboden voraus, in das mit einfachsten Handgriffen durch den Laien die Probenaufgabe und -verteilung erfolgen kann, ohne dass es zu Fremdkontaminationen kommt. Die Inkubation der selbständig inokulierten Platten kann dann der Anwender in aller Regel selbst bei Zimmertemperatur durchführen und die sich bildenden Kolonien auszählen.
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Mit einem solchen in sich abgeschlossenen Petrischalensystem, welches auch preisgünstig als Massenartikel angeboten werden kann, könnten gleichzeitig Privatanwender angesprochen werden, die eine Eigenkontrolle von wässrigen Proben im Haushalt (Trinkwasser, Brauchwasser, Brunnenwasser, Grauwasser, Regenwasser, Aquarien, Teiche etc.) hinsichtlich der Keimbelastung durchführen wollen.
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Zur Erläuterung des bisher bekannten Standes der Technik wird weiter ausgeführt.
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Direkte Kultivierungen auf verfestigten Nährböden sind üblich für eine aussagefähige Keimzahlbestimmung in wässrigen Proben. Unter den für die jeweiligen gesuchten Spezies oder Mikroorganismengruppen optimalen Kultivierungsbedingungen erfolgt die Vermehrung lebender Keime und die Ausprägung von Kolonien, die auf dem Nährboden sichtbar werden und ausgezählt werden können. So ist sichergestellt, dass nur vermehrungsfähige Keime erfasst werden, weshalb das Ergebnis als „Kolonie bildende Einheiten (KBE/ml)” angegeben wird. Diese Ergebnisform ist für die meisten Anwendungsfälle im Bereich Hygiene, Medizin und Biologie relevant.
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Über die Wahl des Nährbodens und der Inkubationsbedingungen kann selektiert werden, welche Keime sich entwickeln. Daher ist es möglich, Einzelstämme oder Mikroorganismengruppen wie z. B. Schimmelpilze selektiv nachzuweisen.
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In bekannter Weise wird für die Bestimmung aerober Keime das Ausplattieren der Probe auf der Oberfläche eines Nährbodens (Oberflächen-Spatelmethode) durchgeführt. Hierzu werden Petrischalen verwendet, bestehend aus Schalenunterteil und übergreifendem Deckel. Für den Ausstrich wird im Sterilbereich, z. B. unter einer Laminarflowbox, mit sterilen Instrumenten eine Probenmenge manuell aufgegeben und mittels Spatel (Drigalskispatel) möglichst gleichmäßig verteilt. Dieses kann nicht außerhalb eines Sterilbereiches qualitätsgerecht ausgeführt werden, da die Platten für Probenaufgabe und Probenausstrich geöffnet werden müssen und dadurch der Nährboden durch Keime aus der Umgebung kontaminiert wird.
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Es sind nun diverse Vorrichtungen und Verfahren für unterschiedliche Abwandlungen und spezielle Einsatzfälle beschrieben, wobei es die Möglichkeit gibt, Keime mit unterschiedlicher Sauerstoffverträglichkeit (anaerob, mikroaerophil) zu vermehren, indem ein Überschichten mit flüssigem Nährboden oder das Einmischen der Probe in anfangs flüssigem Nährboden erfolgt (Gussplattenmethode). Ebenso können verschiedene Stoffwechselaktivitäten über Indikatoren im Nährboden sichtbar gemacht werden.
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Auf konkrete Beispiele des Standes der Technik soll nachfolgend näher eingegangen werden.
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So wird nach
DE 37 05 229 C2 ein Verfahren zur Bestimmung von Mikrobengehalten nach einem Plattengussverfahren sowie dabei zu verwendende Schalen genannt. Hier werden Nährboden und Probe homogen miteinander vermischt, wobei die Schichtdicke durch Geometrie und Größe der Schale/-n und durch das eingebrachte Volumen variiert wird. Die Schalen besitzen eine runde oder rechtwinklige Gestalt mit Böden, die voneinander abweichend z. B. konkav, konvex, linear steigend, gestaltet sind. Damit sollen unterschiedliche Konzentrationsbereiche auswertbar sein. Ein gleichmäßiger Ausstrich einer Probe unter Feldbedingungen zur Erzielung eines emersen Mikroorganismenwachstums ist hierdurch nicht möglich.
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Nach
US 4,358,539 wird ein Einweg-Kultivierungssystem beschrieben, mit dem aseptisch in einfacher Art und Weise eine Überführung einer flüssigen Probe, z. B. aus Flüssigkulturen, auf einen Nährboden durchgeführt wird, indem die Probe über eine interne Kanüle auf eine absorbierende Fasergewebescheibe übertragen wird, welche zentral auf dem festen Nährboden aufliegt. Von diesem zentralen Pad aus wächst die Kultur radial auf den Nährboden. Mit diesem System sind zwar mikrobielle Übertragungen für einfache Kontrollaufgaben möglich, z. B. zur Reinheitskontrolle einer Kultur, jedoch keine quantitative Keimzahlbestimmung. Eine aktive und gleichmäßige Verteilung der Probe auf der Nährbodenoberfläche erfolgt nicht. Die übertragene Flüssigkeitsmenge wird nicht überprüft.
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Mit
US 5,830,746 werden eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Aufwachsen anaerober Mikroorganismen beschrieben. Es wird hier durch eine ringförmige Dichtfläche im Deckel ein abgeschlossener Gasraum im Kultivierungsraum gebildet, wenn die Platte umgedreht gelagert wird. Vorrichtungen zur Probenaufbringung und -verteilung sind nicht vorgesehen. Das System muss deshalb wie bei konventionellen Petrischalen zur Inokulierung geöffnet werden, wodurch eine Anwendung im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung nur unter aseptischen Bedingungen möglich ist.
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In
EP 1 528 100 B1 wird eine verriegelbare Kontaktplatte gezeigt. Es stehen dabei ein Teller mit einer Bodenplatte sowie ein Deckel über einen Verriegelungsmechanismus in Wirkverbindung. Die Elemente müssen bei Probennahme geöffnet werden, so dass ein aseptisches Arbeiten unter Feldbedingungen nicht gegeben ist. Verteilungs- bzw. Ausstrichelemente sind nicht vorhanden.
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Schließlich sei noch auf
DE 690 108 56 T2 hingewiesen, worin eine Wegwerfkulturschale mit Verstärkungsrippen genannt ist. Hier weist die Petrischale innen am Boden nach oben stehende Rippen auf, die lediglich zur Verstärkung des dünnen Glasmaterials dienen. Diese behindern ein gleichmäßiges Ausstreichen einer Probe, wobei diese Kulturschale ebenfalls geöffnet werden muss und damit keine sichere Keimzahlauslesung ermöglicht.
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Zur Keimzahlbestimmung werden auch sogenannte „Dip-Slides” genutzt. Es handelt sich hier um ein Kulturverfahren zur (semi-)quantitativen Keimzahlbestimmung aus wässrigen Medien. Die Dip-Slides können aber auch zur Oberflächenkeimzahlbestimmung verwendet werden.
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Die „Dip-Slides” sind kommerziell hergestellte beidseitig nährbodenbeschichtete, flexible Kunststoffträger, die ursprünglich für die Urindiagnostik entwickelt wurden. Sie finden aber mittlerweile auch breite Anwendung in technischen Bereichen.
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Die Trägerplatte des Eintauchobjektträgers ist auf der Ober- und Unterseite in aller Regel mit zwei unterschiedlichen Nährmedien zur Gesamtkeimzahlbestimmung von Bakterien und Hefen/Schimmelpilzen beschickt. Darüber hinaus gibt es noch Systeme mit dreiflächigen Trägerplatten.
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Von verschiedenen Firmen wurden „Dip-Slides” für Hygienekontrollen entwickelt. Von den Herstellern werden Dip-Slides mit verschiedenen Nährmedien angeboten. Es gibt dementsprechend Agar zur Gesamtkeimzahlbestimmung oder Selektivnährmedien zum Nachweis von z. B. Enterobakterien oder zum Nachweis von Hefen und Pilzen.
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Im Unterschied zur vorgeschlagenen Erfindung nimmt man im Falle von Dip-Slides bewusst eine unsterile Probennahme und eine undefinierte Probenmenge und -verteilung in Kauf, die auf der Nährbodenoberfläche durch das Eintauchen absorbiert wird.
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„Dip-Slides” werden zwar in einem sterilen Röhrchen aufbewahrt und ausgeliefert. Zur Probennahme muss der Nährbodenträger aber kurzzeitig herausgenommen und in eine aseptische Umgebung gebracht werden.
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Die vorgeschlagene Erfindung hat gegenüber den „Dip-Slides” den Vorteil, dass eine genau definierte Probenmenge auf einer definierten Nährbodenoberfläche vollständig und gleichmäßig verteilt werden kann. Dadurch können die ermittelten Koloniezahlen sehr genau auf das Probevolumen bezogen werden. Zudem wird der Nährboden zur Probenapplikation erfindungsgemäß nie einer unsterilen Umgebung ausgesetzt.
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Anhand des vorliegend diskutierten Standes der Technik wird deutlich, dass nach einer Lösung gesucht werden muss, die die Nachteile der bisher bekannten überwindet.
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine gattungsgemäße Petrischale als mikrobiologische Kulturplatte mit einem integrierten Ausstrichsystem derart weiterzuentwickeln, dass ein in ein Unterteil übergreifender Deckel in Führungen am Umfang des Unterteils gleitend, einen bevorzugt aseptischen Innenraum einschließt, der zur Probenaufgabe geschlossen bleibt, im Deckel ein auf einen Nährboden und auf eine steril von außen aufgebrachten Probe absenkbares und kreisförmig bewegbares Ausstrichelement fest angebracht ist, welches nach dem Ausstrich durch eine gegenläufige Drehung zwischen Deckel und Unterteil wieder in seine Ausgangslage über die in gleichmäßiger Höhe auf dem Nährboden ausgestrichenen Probe anhebbar ist. Über ein im Deckel, insbesondere außermittig, angebrachtes Septum soll mittels eines geeigneten Probenaufgabesystems keimfrei eine Probe auf den Nährboden abgesetzt werden können. Die erfindungsgemäße Kulturplatte soll einfach und kostengünstig in der Herstellung ausgeführt und unkompliziert in der Handhabung sein.
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Erfindungsgemäß wird die Aufgabe wie folgt gelöst, wobei hinsichtlich der grundlegenden erfinderischen Gedanken auf die Merkmale des Patentanspruchs 1 verwiesen wird. Die weitere Ausgestaltung der Erfindung wird in den Patentansprüchen 2 bis 10 angegeben.
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Zur erfinderischen Lösung sind weitere Hinweise erforderlich.
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Die mikrobiologische Kulturplatte stellt sich als ein in sich geschlossenes System zur Kultivierung von Mikroorganismen dar. Sie besteht aus einem ein Unterteil übergreifenden Deckel – zunächst ähnlich einer bekannten Petrischale –, wobei jedoch eine spezielle Randausbildung am unteren Deckelrand und am Außenumfang des Unterteils, der eigentlichen Schale, dazu geeignet sind, ein ungewolltes öffnen dieses in sich geschlossenen Systems zu verhindern. Das Unterteil beinhaltet innen auf seinem Boden bereits einen dort fest eingebrachten Nährboden mit definiertem Volumen, der durch den absenkbaren Deckel mit seinem integrierten Ausstrichsystem derart erreichbar ist, indem Führungsstifte oder Führungsstege am Ende des das Unterteil umgreifenden Deckelrandes angebracht, in eine Führungsnut am Außenumfang des Unterteils eingreifen und beim Absenken und Verdrehen des Deckels gegenüber dem Unterteil im Uhrzeigersinn über eine gewindeähnliche Steigung einer schiefen Ebene in einen ringförmig umlaufenden Bereich der Führungsnut im Unterteil führbar sind, so dass dort ein Verdrehen des Deckels gegenüber dem Unterteil um mindestens 360° erfolgen kann. Es erreicht der insbesondere aus elastischem und transparentem Material bestehende Deckel, der während seines Absenkens und Drehens innere mechanische Spannung entwickelt, wieder seine Ausgangslage, wenn er gegen den Uhrzeigersinn, die gewindeähnliche Steigung im umgekehrten Fall überwindet und über die Ausgangslage sichernde Arretierungselemente geführt ist.
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In der Ausgangslage des Deckels besteht gegenüber dem oberen Rand des Unterteils ein derartiger Abstand, der dem entspricht, den das fest an der Innenseite des Deckels angebrachte Ausstrichsystem, bestehend aus mindestens einem in radialer Form bemessenen Steg und einer daran nach unten weisenden elastischen Lippe, überwindet, um an der Nährbodenfläche die durch mindestens einem vorgesehenen Septum eingebrachte Probe zu erreichen und kreisförmig, gleichmäßig zu verteilen. Das Septum befindet sich im Deckel in außenmittiger Lage, wobei generell festzuhalten ist, dass der Deckel und das Unterteil zur Sicherung der erfindungsgemäßen Funktion als rotationssymmetrische Elemente ausgebildet sind. Das Unterteil soll dabei vorteilhafterweise hitzebeständiges, transparentes Glas oder Kunststoff sein, so dass mindestens Temperaturen von 90°C realisiert werden können, was für die Herstellung nötig ist, um den anfangs heißen, flüssigen Nährboden einfüllen zu können.
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Schließlich ist vorgesehen, dass alle Elemente der mikrobiologischen Kulturplatte aus sterilisierbaren, vorzugsweise strahlensterilisierbaren Materialien, bestehen. Für die aerobe Mikroorganismenkultivierung sind Deckel und Unterteil ungedichtet gegeneinander aufliegend, so dass über geringste Materialtoleranzen ein Gasaustausch mit der Umgebung gegeben ist, ohne dass es zu Fremdinfektionen kommen kann.
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Es ist denkbar, dass die Deckelabsenkung auch mittels anderer geometrischer Formgebung eines Teilbereiches am Außenumfang des Unterteils möglich ist und Haltelemente des unteren Deckelrandes in diesem Teilbereich im Hintergriff mit einem Führungselement stehen, von welchem sie sich wieder lösen können, um wieder in die wie vorgenannte Beabstandung zwischen Deckel und Unterteil zu gelangen.
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Es soll dazu auf nachfolgend genannte vorteilhafte Ausführungen hingewiesen werden.
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Somit zeigen:
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1: Schnittdarstellung der mikrobiologischen Kulturplatte mit einer Führungsnut im Unterteil, die eine gewindeähnliche Steigung aufweist,
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2: Draufsicht auf die mikrobiologische Kulturplatte von oben gem. 1,
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3: Seitenansicht gem. der 1 und 2 von Deckel und Unterteil,
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4: Schnittdarstellung der mikrobiologischen Kulturplatte mit einem konischen Bereich und einem Führungssteg in einem Teilbereich des Außenumfangs des Unterteils,
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5: Draufsicht auf die mikrobiologische Kulturplatte von oben gemäß 4,
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6: Seitenansicht der mikrobiologischen Kulturplatte gemäß der 4 und 5 von Deckel und Unterteil.
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Die in den Figuren verwendeten Bezugszeichen sind in einer gesonderten Bezugszeichenliste aufgeführt.
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Nach 1 befinden sich ein Deckel 2 und ein Unterteil 1 einer mikrobiologischen Kulturplatte über eine Führungsnut 5, eingebracht etwa in der Mitte des Außenumfangs am Unterteil 1, und Führungsstifte 6 in formschlüssiger Verbindung, wodurch ein ungewolltes Abheben des Deckels 2 verhindert wird. In der Ausgangslage befindet sich der Deckel 2 mit einem definierten Abstand H + x mit seiner Deckelinnenseite beabstandet vom oberen Rand des Unterteils 1, was auch der Höhe entspricht, die ausreicht, um das am Deckel 2 innen befestigte Ausstrichsystem, bestehend aus einem Steg 7 und einer Lippe 8, auf die Oberfläche eines festen Nährbodens 3 abzusenken.
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Über ein außermittig im Deckel 2 vorhandenes Septum 4 ist dabei eine Probenflüssigkeit in definierter Menge in das in sich geschlossene Kultursystem einbringbar.
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Die Absenkung wird möglich, indem per Drehung des Deckels 2 im Uhrzeigersinn entgegen des Unterteils 1 der aus flexiblem und transparentem Material bestehende Deckel 2, über einen oberen und geneigten Abschnitt 10, 11 der Führungsnut 5 seine Ausgangslage, bei Überwindung des Widerstandes, den Arretierungspunkte 9 ausüben, verlässt, wodurch schließlich bei Erreichen des untersten und umlaufenden Bereiches der Führungsnut 5 ein barrierefreies Drehen des Deckels 2 und damit das Ausstreichen der Probe ermöglicht werden.
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In ähnlicher Form stellt sich der Aufbau der mikrobiologischen Kulturplatte gemäß 4 dar. Im Unterschied zur ersten Ausführung besitzt das Unterteil 1 außen, etwa ab seiner Mitte und zum Boden hin gesehen, eine konische Ausnehmung 14 mit einer darin horizontal und in diesem Bereich mittig angeordneten Führungskante 13, die durch mehrere Unterbrechungen 15 Öffnungen aufweist, durch welche Führungsstege 12 des Deckels 2, durch Druck auf den Deckel 2, gelangen, so dass sie in einen Hintergriff zu einer horizontalen Führungskante 13 im unteren Bereich der konischen Ausnehmung 14 gebracht werden. In dieser Phase der Absenkung um den Abstand H besitzt auch hier der Deckel 2 eine innere Materialspannung, die ihn bei Überdeckung mit den Unterbrechungen 15 wieder in seine Ausgangslage zurückkehren lässt. Unterhalb der Führungskante 13 ergibt sich die umlaufend, durch Deckeldrehung, nutzbare Führungsnut 5.
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Die Vorteile der Erfindung können wie folgt zusammengefasst werden:
- – Durchführung von Arbeiten zur emersen Kultivierung von Mikroorganismenkulturen, auch im Feldversuch, aseptisch möglich,
- – hohe Sicherheit bei der Keimzahlbestimmung,
- – Handhabung auch von Nichtfachleuten gegeben,
- – einfach und kostengünstig herstellbar.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Unterteil
- 2
- Deckel
- 3
- Nährboden
- 4
- Septum
- 5
- Führungsnut
- 6
- Führungsstift
- 7
- Steg
- 8
- Lippe
- 9
- Arretierungspunkt
- 10
- oberer Abschnitt
- 11
- geneigter Abschnitt
- 12
- Führungssteg
- 13
- Führungskante
- 14
- konische Ausnehmung
- 15
- Unterbrechung
- H + x
- Abstand + Fertigungstoleranz
- H
- Abstand
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 3705229 C2 [0019]
- US 4358539 [0020]
- US 5830746 [0021]
- EP 1528100 B1 [0022]
- DE 69010856 T2 [0023]
