DE3705229C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Mikrobengehalten nach einem Plattengußverfahren, wobei man eine Probe und einen Nährboden in eine Schale gießt, den Nährboden gerinnen läßt und die geronnene Platte inkubiert, wonach man die Kolonien in der Schale zählt. Die Erfindung betrifft ferner eine Schale, die zur Bestimmung von Mikrobengehalten nach einem Plattengußverfahren verwendbar ist.

In Milchwirtschafts- und übriger Lebensmittelmikrobiologie, in medizinischer Mikrobiologie sowie in allgemeiner Mikrobiologie werden zur Bestimmung der Zahl von Mikroben in Proben allgemein Plattengußverfahren verwendet. Viele der sog. internationalen Vergleichsmethoden sind diese Methoden.

In Plattengußverfahren wird ein bestimmtes Volumen der zu untersuchenden Probe oder einer Verdünnung derselben in eine Petrischale inokuliert. Über die Probe werden z. B. 10 bis 15 ml eines sterilen gerinnbaren (Agar) Nährbodens mit einer Temperatur von 45 ± 1°C gegossen. Die Probe wird unmittelbar mit dem Nährboden vermischt und das Gerinnen kann bei Raumtemperatur auf einer waagerechten Fläche erfolgen. Die Probe und der Nährboden können auch vor dem Gießen in die Schale vermischt werden. Der geronnene Nährboden liegt in der Schale in Form einer gleichmäßigen Schicht. Die geronnenen Schalen werden auf den Kopf gestellt und in einen Inkubator verstellt (Inkubation). Von dem Verfahren (in erster Linie davon, welche Mikrobengruppe man bestimmen will) sind die Inkubationstemperaturen (z. B. 10°C, 30°C, 37°C, 44°C, 55°C) und die Inkubationsdauer (z. B. 2 Tage, 3 Tage, 6 Tage und 10 Tage) abhängig. Während der Inkubation liegen die Schalen in waagerechter Position.

Nach der Inkubation werden die Kolonien in der Schale gezählt. Wenn die Menge der Inokulation und die verwendeten Verdünnungsverhältnisse bekannt sind, wird aufgrund der zu zählenden Kolonien die Zahl der Mikroben pro Volumen- oder Gewichtseinheit Probe, normalerweise Stück pro ml oder Stück pro g erhalten.

Der Nährboden kann im Hinblick auf seine Nährstoffe möglichst vielseitig sein, damit möglichst viele Mikrobentypen der Probe Wachstumsmöglichkeiten hätten (sog. Gesamtkolonienzahl). Der Nährboden kann im Hinblick auf seine Nährstoffe begrenzt sein oder man hat ihm bekannte wachstumsfördernde Verbindungen zugesetzt. Dann wird von selektiven Nährböden gesprochen, und das Ziel besteht darin, bestimmte Mikrobengruppen zum Vorschein zu bringen.

Das Zählen kann nach Augenmass (durch Verwendung von bekannten Hilfsmitteln) oder durch Verwendung von verschiedenen elektronischen Zählvorrichtungen (automatische Kolonienzähler) erfolgen.

Das Zählen ist durch die große Koloniendichte in der Schale begrenzt. Normalerweise sind zum Zählen nur Schalen tauglich, deren Kolonienzahl eine bestimmte Grenze nicht überschreitet; z. B. in Schalen mit einem Durchmesser von 9 cm wird eine Kolonienzahl von 300 Stück für die obere Grenze gehalten. Um auch Proben zählen zu können, die einen großen Mikrobengehalt aufweisen, müssen Verdünnungstechniken verwendet werden. Bei praktischer Plattengußarbeit sollen im allgemeinen immer Verdünnungen verwendet werden. Die Fertigung von Verdünnungsserien nimmt 70 bis 90% (abhängig vom angenommenen Verdünnungsbedarf) von der Gesamtarbeitszeit des Plattengußschritts in Anspruch.

Dementsprechend ist der Bedarf an Material das Vielfache gegenüber der Anzahl der Verdünnungen.

Die bekannten Plattengußverfahren wiesen den Nachteil auf, daß große Verdünnungsserien gefertigt und mehrere Verdünnungen kultiviert werden sollen. Dabei braucht man natürlich eine große Menge von Schalen und auch der Bedarf an Inkubationsraum ist groß. Die Verfahren sind somit aufwendig und zeitraubend.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem die vorstehend genannten Nachteile vermieden werden und das die Bestimmung von Mikrobengehalten in einfacher und zuverlässiger Weise ermöglicht. Diese Aufgabe wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Mikroben in einen in einer Schale gerinnenden Nährboden gebracht werden, dessen Schichtdicke in kontrollierter Weise variiert.

Der Grundgedanke der Erfindung besteht darin, daß man einen Mikroben enthaltenden Nährboden in einer Sache derart zum Gerinnen bringt, daß sich die Schichtdicke des geronnenen Nährbodens in bestimmter Weise ändert. Der Nährboden kann in einer Schale zum Gerinnen gebracht werden, wobei die Schichtdicke mit Hilfe der Geometrie der Schale eingestellt wird. Wenn sich die Schichtdicke des Nährbodens beim Übergang von einem Bereich zu einem anderen Bereich der Schale ändert, ändert sich auch die Zahl der Kolonien in entsprechender Weise.

Der Grundgedanke kann auch derart angewendet werden, daß eine Proben-Nährboden-Mischung in verschiedenen Mengen in übliche Petrischalen genau dosiert wird. Dabei wird eine Reihe von Schalen erhalten, die eine unterschiedliche Schichtdicke aufweisen. Das Verfahren als solches bietet aber nicht andere Rationalisierungsvorteile als die Möglichkeit, auf die Verdünnungsserien zu verzichten.

Nach dem Grundgedanken der Erfindung sind die sich bildenden Kolonien nach der Inkubation in der Zählstufe in den dünnsten Agarschichten am lichtesten und in den dicksten Schichten am dicktesten und zwischen diesen in Dichten, die von der Geometrie des Nährbodens abhängig sind, zu sehen. Wenn die Probe und der Nährboden (Agar) vor dem Gießen sorgfältig vermischt sind und wenn ihre Mengen bekannt und die Geometrie des Nährbodens und der Schale mathematisch bekannt sind, läßt sich der Mikrobengehalt der Probe leicht zählen. Für das Ergebnis kann jede den angenommenen mikrobiologischen Standarden entsprechende Information verwendet werden: nur die Kolonien, die in den verschiedenen Schichtdickenzonen der Schale deutlich zu sehen sind, werden berücksichtigt. Die Dichtegradient für die Kolonien ist durch den Schichtdickengradienten bestimmt, und dies wird in der Mathematik des Koloniezählens berücksichtigt. Beim Plattengussschritt ist es wichtig, daß die Schalen auf einer genau waagerechten Unterlage liegen.

Vorteile des erfindungsgemäßen Plattengusses

• 1. Es werden keine Verdünnungsserien benötigt, weil die variierende Schichtdicke des Nährbodens die Koloniendichte wenigstens in einem Bereich der Schale derart lichter macht, daß die Proben gezählt werden können. Die Ersparnis an Arbeitszeit gegenüber den gegenwärtigen Verfahren beträgt 70 bis 90%, wenn keine Verdünnungsserien benötigt werden.
• 2. Die Ersparnis an Nährboden ist ebenso vielfach wie der Bedarf an Verdünnungsserien (und der davon abhängige Bedarf an Parallelschalen) bei den gegenwärtigen Verfahren.
• 3. Wenn Einwegschalen verwendet werden, ist die Ersparnis an Material ebenso vielfach wie der durch die Verdünnungsserien bedingte Bedarf bei den gegenwärtigen Verfahren.
• 4. Es wird eine vielfache Ersparnis an Inkubationsraum erzielt, wenn keine durch die Verdünnungsserien bedingten Parallelschalen benötigt werden. Das gleiche gilt unmittelbar proportional für die Ersparnis an Arbeitsraum und an Materialfunktionen.
• 5. Die Kolonien brauchen nicht über die ganze Schale gezählt zu werden, sondern das zählbare Kolonienmaterial wird von den durch die Geometrie des Schalenbodens bedingten Zählzonen oder -streifen erhalten. Auch die Tatsache, daß auf Verdünnung und auf damit verbundene Faktoren verzichtet werden kann, erleichtert und beschleunigt das Zählen.
• 6. Das gesamte Verfahren einschließlich des Koloniezählens läßt sich zum größten Teil durch Ausnutzung und Modifikation der bekannten Technik mechanisieren und automatisieren.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Mikrobengehalte stimmen weitgehend mit Ergebnissen überein, die nach den bekannten Verfahren erhalten sind. Sämtliche bekannten Plattengußverfahren können durch das vorliegende Verfahren ersetzt werden.

Die Erfindung betrifft ferner eine Schale, die bei der Bestimmung von Mikrobengehalten nach einem Plattengußverfahren verwendbar ist, wobei man eine Probe und einen Nährboden in eine Schale gießt, den Nährboden gerinnen läßt und die geronnene Platte inkubiert, wonach man die Kolonien in der Schale zählt. Die Schale ist dadurch gekennzeichnet, daß die so ausgebildet sind, daß in der Schale nach dem Gießen der Probe und des Nährbodens ein Gerinnsel gebildet wird, dessen Schichtdicke in kontrollierter Weise variiert.

Der Grundgedanke der Erfindung, nach dem die Schichtdicke des gerinnenden Nährbodens in der Schale in bekannter und kontrollierter Weise variiert, kann durch die Verwendung von Schalen neuen Typs erzielt werden: die Schale ist so ausgebildet, daß in der Schale nach dem Gießen der Proben-Nährboden-Mischung auf einer waagerechten Unterlage ein Gerinnsel gebildet wird, dessen Schichtdicke kontrolliert variiert. Diese neue Schale kann z. B. rund, wie eine übliche Petrischale, oder z. B. rechteckförmig sein. Die Schichtdicke des Nährbodens wird auf einen gewünschten Wert dadurch eingestellt, daß als Form des Bodens einer runden Schale eine sphärische oder eine mathematische bekannte asphärische Fläche, und diese zwar entweder steigend oder fallend, gewählt wird. Der Boden einer runden Schale kann auch derart steigend oder fallend sein, daß die Schale konzentrisch ringförmige waagerechte Ebenen, in der Mitte eine kreisförmige Ebene aufweist. In einer rechteckförmigen Schale kann der Boden linear, kreisbogenförmig oder sonst mathematisch bekannt steigend sein. Der Boden einer rechteckförmigen Schale kann auch als mit rechteckigen Ebenen steigend ausgebildet werden. Die rechteckige Schale ist vorzugsweise rektangulär. Die Geometrie der Schale kann auch mit Hilfe von am Boden vorgesehenen Einlagen verschiedener Höhe eingestellt werden. Bei den erfindungsgemässen Schalen kann die kleinste Dicke der Nährbodenschicht z. B. 1 mm und die größte Dicke 10 mm betragen.

Mit diesen Schalen werden sämtliche Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielt. Es werden keine Verdünnungsserien benötigt, und die Ersparnis an Material, Nährboden und Inkubationsraum ist vielfach im Vergleich zu den gegenwärtigen Verfahren. Wenn eine rektanguläre Schale verwendet wird, ist der Bedarf an Nährboden auch sonst geringer, im besten Falle nur etwa 50% des Bedarfs an Nährboden in einer Petrischale, und der Bedarf an Inkubationsraum ist mehr als 20% kleiner als bei der Verwendung von runden Schalen, bezogen auf die Fläche.

Erfindungsgemäß soll somit vorzugsweise eine rektanguläre Schale verwendet werden. Dabei wiederum wird als bevorzugt betrachtet, daß die Probe (Inokulation) und der verwendete Nährboden vor dem Gießen in die Schale gründlich vermischt werden.

Fig. 1A, 2A, 3, 4A, 5, 6 und 7 zeigen in vertikalem Schnitt verschiedene Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Schalen mit Nährboden, und Fig. 1B, 2B und 4B zeigen die entsprechenden Schalen von oben gesehen.

Fig. 1A und 1B zeigen eine Schale 1, die von oben gesehen rund ist und einen nach oben konvexen Boden 1a aufweist. Der Nährboden ist mit Bezugszeichen 2 bezeichnet. Aus den Figuren geht hervor, daß wenn die Schichtdicke des Nährbodens auf den äußeren Umfang der Schale hin in einer durch die Geometrie des Schalenbodens bedingten bekannten Weise zunimmt, nimmt die Koloniendichte in entsprechender Weise zu.

Fig. 2A und 2B zeigen eine Schale 11, die von der vorstehend beschriebenen Schale dadurch abweicht, daß sie einen nach unten konvexen Boden 11a aufweist, wobei die Schichtdicke des Nährbodens 2 und analog hierzu die Koloniedichte in der Mitte der Schale am größten sind und auf die Ränder der Schale hin abnehmen.

Fig. 3 zeigt eine Schale 21, deren Boden 21a mit konzentrischen waagerechten Ebenen stufenweise veränderlich ist. In der Schale werden kreisförmige Schichtdickenzonen gebildet, die der Geometrie des Bodens entsprechen.

Fig. 4A und 4B zeigen eine Schale 31, die von oben gesehen rektangulär ist und einen linear veränderlichen Boden 31a aufweist. Wenn die Schichtdicke beim Übergang von der einen kurzen Seite der Schale zu der anderen zunimmt, nimmt die Zahl der Kolonien entsprechend zu.

Fig. 5 zeigt eine Schale 41, deren Boden 41a bogenförmig steigend ist, wobei ein entsprechender Schichtdickengradient und ein entsprechender Dichtegradient für die Kolonien erhalten werden.

Fig, 6 zeigt eine Schale 51, deren Boden 51a mit rechteckigen Ebenen stufenweise steigend ist, wobei in der Schale Schichtdickenzonen entsprechend der Geometrie des Schalenbodens gebildet werden.

Fig. 7 zeigt eine Schale 61, deren Boden mit Einlagen 61a versehen ist. Die Proben-Agar-Mischung wird ins Fach 1 zugegeben, von dem ein Teil ins Fach 2 fließt usw., wobei in der Schale verschiedene Schichtdickenzonen gebildet werden.

Die Erfindung wird anhand folgender Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

1 µl (Schleife oder Mikropipette) einer Milchprobe wird in 12 ml von geschmolzenem, sterilem und auf 45°C abgekühltem Standard Plate Count Agar (z. B. FIL-IDF 100 : 1981) in steriler Teströhre aseptisch inokuliert. Nach der Inokulation wird die Proben-Agar-Mischung z. B. in einem Teströhrenmischer kräftig geschüttelt.

Nach dem Schütteln wird die Proben-Agar-Mischung in eine rektanguläre Schale gegossen, deren Boden mit waagerechten, rechteckigen Ebenen steigend ist. Die Schale weist fünf Ebenen auf, die jeweils eine Fläche von 4 cm² aufweisen. Die Ebenen sind steigend und mit einer Höhendifferenz von 2 mm abgestuft. Die Flüssigkeitsmenge von 12 ml, das Agarvolumen des Beispiels, füllt die beschriebene Schale so ab, daß in der Schale fünf im Hinblick auf die Fläche gleich große, im Hinblick auf die Dicke der Agarschicht aber unterschiedliche Streifen gebildet werden. Die Schichtdicken betragen in dem ersten Streifen 2 mm, im zweiten Streifen 4 mm, im dritten Streifen 6 mm, im vierten Streifen 8 mm und im fünften Streifen 10 mm. Analog hierzu betragen die Agarmengen (und Probenmengen) im ersten Streifen 0,80 ml (0,066 µl), im zweiten Streifen 1,60 ml (0,133 µl), im dritten Streifen 2,40 ml (0,199 µl), im vierten Streifen 3,20 ml (0,266 µl) und im fünften Streifen 4,00 ml (0,333 µl). Die gemeinsame Agarfläche der Streifen beträgt nach dem Gießen 20 cm². Die Agar- und Probenmengen der Streifen werden auch in Tabelle 1 aufgeführt.

Die Schale mit geschlossenem Deckel wird in waagerechter Position 72 ± 2 Stunden bei + 30 ± 1°C inkubiert.

Die Ergebnisse werden streifenweise durch Dividieren der in jedem Streifen zählbaren Kolonienzahl (in der Praxis ≦ωτ 40 Stück pro Streifen) durch die Probenzahl der Streifen gerechnet, wobei die Probenzahl im ersten Streifen des Beispiels 0,066 µl, d. h. 0,000066 ml und die Probenzahl im fünften Streifen 0,333 µl, d. h. 0,000333 ml, beträgt. Somit bedeuten die Kolonienzahl 3 Stück im ersten Streifen 3 Stück/0,000066 ml etwa 45 000 Stück/ml und die Kolonienzahl 17 Stück im fünften Streifen 17 Stück/ 0,000333 ml etwa 50 000 Stück. Das Ergebnis stellt direkt die Mikrobenzahl Stück pro ml der Probe dar. Der Kolonienzahlen der Streifen und die aufgrund dieser gerechneten Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Die Information aller zählbaren Streifen kann durch Rechnen des Mittelwertes der Ergebnisse der Streifen für das Ergebnis verwendet werden.

Tabelle 1

Tabelle 2

Beispiel 2

Die Probe wird in Agar in einem Verdünnungsverhältnis von 10^-4 (10 µl der ursprünglichen Probe in 100 ml Agar) aseptisch inokuliert. Nach der Inokulation wird die Proben-Agar-Mischung kräftig geschüttelt und in Mengen von 2, 5, 10, 20, 40 und 60 ml in übliche Petrischalen gegossen, wobei die ursprüngliche Probe in Mengen von 0,0002 ml, 0,0005 ml, 0,001 ml, 0,002 ml, 0,004 ml bzw. 0,006 ml anwesend ist. Die Schalen werden inkubiert und die Kolonien gezählt.

Die auf den Schalen gezählten Kolonienzahlen werden nach der folgenden Formel in Koloniendichte der ursprünglichen Probe umgerechnet

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3

Die Klammern in der Tabelle bedeuten, daß die betreffenden Koloniendichten in den Schalen nicht gezählt werden können. Wenn Petrischalen mit einem Durchmesser von 90 mm verwendet werden, ist nur in Schalen, die 10 ml oder mehr Agar enthalten, der Schalenboden völlig von Agar bedeckt.

• Literaturverzeichnis:
• Plattenverdünnungsverfahren Standard Plate Count Method:
• 1. FIL-IDF 100 : 1981 Liquid Milk Enumeration of Microorganisms Colony Count Technique at 30°C.
• 2. ISO/DP 6610 ibid.
• 3. APHA American Public Health Association, Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 14th Edition, 1978, S. 77-93.
• Schleifenmethode: Plate Loop Method
• 1. APHA, 14th Edition, S. 315-317
• 2. Thompson, Donnelly & Black, 1960, A Plate Loop Method for Determining Viable Counts of Raw Milk
• 3. J. Milk Food Technol. 26: 156-171

Claims (13)

1. Verfahren zur Bestimmung von Mikrobengehalten nach einem Plattengußverfahren, wobei man eine Probe und einen Nährboden in eine Schale gießt, den Nährboden gerinnen läßt und die geronnene Platte inkubiert, wonach man die Kolonien in der Schale zählt, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nährboden und die Probe zur Bildung einer homogenen Mischung vermischt, in welcher der Mikrobengehalt konstant ist, und die Mischung derart zum Gerinnen bringt, daß die Schichtdicke des Nährbodens in kontrollierter Weise variiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nährboden in einer Schale zum Gerinnen bringt und die Schichtdicke mit Hilfe der Geometrie der Schale einstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nährboden in mehreren Schalen zum Gerinnen bringt und die Schichtdicke mit Hilfe der Größe der Schale und/oder des Volumens des Nährbodens einstellt.

4. Schale, die bei der Bestimmung von Mikrobengehalten nach einem Plattengußverfahren verwendbar ist, wobei man eine homogene Mischung aus einer Probe und einem Nährboden in eine Schale gießt, den Nährboden gerinnen läßt und die geronnene Platte inkubiert, wonach man die Kolonien in der Schale zählt, dadurch gekennzeichnet, daß die Schale eine geometrisch definierte und konstante Form aufweist, wobei sich in der Schale nach dem Gießen der homogenen Mischung aus Probe und Nährboden ein Gerinnsel bildet, dessen Schichtdicke kontrolliert variiert.

5. Schale nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Querschnitt rund ist.

6. Schale nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Querschnitt rektangulär ist.

7. Schale nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen konkaven Boden aufweist.

8. Schale nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen konvexen Boden aufweist.

9. Schale nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen linear steigenden Boden aufweist.

10. Schale nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen kreisbogenförmig steigenden Boden aufweist.

11. Schale nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen steigenden oder fallenden Boden derart aufweist, daß in der Schale konzentrisch ringförmige waagerechte Ebenen und in der Mitte eine kreisförmige Ebene vorgesehen sind.

12. Schale nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen mit rechteckigen Ebenen steigenden Boden aufweist.

13. Schale nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß an ihrem Bodenteil eine Einlage oder mehrere Einlagen verschiedener Höhe angebracht sind.