DE102009022414B4

DE102009022414B4 - Antibakterielle Verwendung eines Extrakts aus Morus australis Poir. und der Verbindung Kuwanon H

Info

Publication number: DE102009022414B4
Application number: DE102009022414.9A
Authority: DE
Inventors: Yuan-Ling Ku; Shih-Tsun Liang; Yu-Hsuan Lin; Liang-Hua Chen; Ying-Yu Kuo; Feng-Nien Ko
Original assignee: Medical and Pharmaceutical Industry Technology and Development Center
Current assignee: Medical and Pharmaceutical Industry Technology and Development Center
Priority date: 2008-12-29
Filing date: 2009-05-25
Publication date: 2014-02-13
Anticipated expiration: 2029-05-26
Also published as: TW201023870A; FR2940614B1; GB2466527A; JP2010155819A; FR2940614A1; TWI378798B; DE102009022414A1; GB0908520D0; GB2466527B; JP5022403B2

Abstract

Verwendung einer Verbindung mit der Formel (I), oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, zur Behandlung einer bakteriellen Infektion:

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Verwendung der von dem aus der Wurzelrinde von Morus australis Poir. hergestellten Extrakt abgetrennten Verbindung Kuwanon H zum Behandeln einer bakteriellen Infektion.
Hintergrund der Erfindung
JP H10-7555 A offenbart fünf von einem Extrakt der Baumrinde eines Maulbeerbaums wie Morus bombycis Koidz, Morus alba L. und Morus Lhou Koidz abgetrennte Verbindungen, bei denen es sich um Mulberrofuran C, D und G, Kuwanol A und Sanggenon G handelt, und die antibakterielle Verwendung der fünf Verbindungen z. B. gegen Staphylococcus aureus und Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA).
JP S56-123979 A offenbart zwei Verbindungen, Kuwanon G und H, und ihre Verwendung zum Senken des Blutdrucks eines Hochdruckpatienten, welche von einem Extrakt abgetrennt werden, der aus der Wurzelrinde eines Maulmeerbaumes wie Morus bombycis Koidz, Morus alba L. und Morus Lhou Koidz hergestellt wird.
Die hypotensive Wirkung von Kuwanon H ist aus K. Daigo, Y. Inamori und T. Takemoto, ”Studies an the Constituents of the Water Extrakt of the Root of Mulberry Tree (Morus bombycis Koidz)”, Chem. Pharm. Bull. 34(5), 1986, S. 2243–2246, bekannt. Nach Shi-De Luo et al., „Anti HIV flavonoids from Morus alba”, Acta Botanica Yunnanica 17(1), 1995, S. 89–95, besitzt Kuwanon H darüber hinaus antivirale Wirksamkeit gegenüber HIV.
Die antibakterielle Aktivität des wässrigen Extrakts von Morus australis gegenüber Steptococcus mutans wird in C.-P. Chen et al.; „Screening of Taiwanese crude drugs for antibacterial activity against Streptococcus mutans”, J. Ethnopharm. 27, 1989, S. 285–295, beschrieben. In R. Venkatesh Kumar et al.; ”Mulberry: Life Enhancer”, J. Med. Plants Res. 2(10), 2008, S. 271–278, wird allgemein die entzündungshemmende Wirkung der Extrakte getrockneter Blätter oder Wurzeln der Maulbeere beschrieben. In T. Nomura; „IX. Biological Activities of Phenolic Constituents of Mulberry Tree and Related Plants. Progress in the Chemistry of Organic Natural Products”, Bd. 53, Springer-Verlag Wien 1988, S. 188–189, sind antimikrobielle Aktivitäten bestimmter Flavonoide aus der Wurzel einer nicht näher spezifizierten Morus-Art gegenüber Staphylococcus aureus und Streptococcus faecalis beschrieben. In T. Nomura et al., ”Components of Root Bark of Morus australis”, Planta med., 1983, 49, 90–94, sowie T. Fukai et al.; ”Antimicrobial activity of 2-arylbenzofurans from Morus species against methicillin-resistant Staphylococcus aureus”, Fitoterapia 76, 2005, S. 708–711, wurde Mulberroferan D im Extrakt von Morus australis sowie dessen antibakterielle Aktivität nachgewiesen.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine antibakterielle Verwendung von Kuwanon H, einer Verbindung mit der folgenden Formel (I):
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon bereitzustellen.
Die vorstehend erwähnte antibakterielle Verwendung der vorliegenden Erfindung schließt eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Behandeln einer bakteriellen Infektion, die als wirksame Komponente Kuwanon H oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon umfasst, ein.
Das „Behandeln einer bakteriellen Infektion” bedeutet in der vorliegenden Erfindung im weitesten Sinn das Behandeln einer jeden Störung, die durch eine bakterielle Infektion verursacht ist, oder bedeutet streng genommen das Hemmen des Wachstums von Bakterien.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
„Sang-Bai-Pi” ist eine traditionelle chinesische Heilpflanze, eine getrocknete Wurzelrinde von Morus alba L., zur Bekämpfung einer Entzündung, Hustenlinderung und Diurese. Die Pflanze Morus alba L. ist in Taiwan selten; Morus australis Poir. ist jedoch häufig anzutreffen. Dies motiviert die Erfinder der vorliegenden Erfindung, Extrakte aus Morus australis Poir. herzustellen und Verbindungen aus dem Extrakt zu isolieren, welche ein industriell brauchbares Potenzial aufweisen.
Im Folgenden wird ein Verfahren zum Behandeln eines Subjekts mit einer bakteriellen Infektion beschrieben, welches das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung mit der Formel (I):
oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon an das Subjekt umfasst.
Im Folgenden wird ein Verfahren zum Behandeln eines Subjekts mit einer bakteriellen Infektion beschrieben, welches das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines aus der Wurzelrinde von Morus australis Poir. hergestellten Extrakts an das Subjekt umfasst, wobei der Extrakt durch ein Verfahren hergestellt wird, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Extrahieren der Wurzelrinde von Morus australis Poir. mit einem polaren Lösungsmittel;
b) Konzentrieren der resultierenden Extraktlösung von Schritt a);
c) Aufgeben des resultierenden Konzentrats von Schritt b) auf eine Umkehrphasenchromatografiesäule und Eluieren der Säule der Reihe nach mit einem ersten Elutionsmittel und einem zweiten Elutionsmittel, wobei das erste Elutionsmittel eine Polarität von einer ungefähr 50 gew.-%igen wässrigen Ethanollösung aufweist und das zweite Elutionsmittel eine Polarität von einer ungefähr 95 gew.-%igen wässrigen Ethanollösung aufweist; und
d) Sammeln eines zweiten Eluats von der Elution der Säule mit dem zweiten Elutionsmittel und Entfernen des zweiten Elutionsmittels aus dem zweiten Eluat durch Verdampfung.

Vorzugsweise sind die Bakterien grampositive Bakterien.
Vorzugsweise sind die Bakterien Staphylococcus aureus (Smith) oder Streptococcus pneumoniae. Mehr bevorzugt sind die Bakterien Staphylococcus aureus (Smith). Am meisten bevorzugt sind die Bakterien Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA). Mehr bevorzugt sind die Bakterien Streptococcus pneumoniae. Am meisten bevorzugt sind die Bakterien Erythromycin- und Ampicillin-resistente Streptococcus pneumoniae.
Vorzugsweise umfasst der Extrakt die Verbindung der Formel (I) und eine Verbindung, Sanggenon G, mit der folgenden Formel (II):
Vorzugsweise umfasst der Extrakt 1–5% der Verbindung (I) und 1–5% der Verbindung (II), bezogen auf das Gewicht des Extraktes. Mehr bevorzugt umfasst der Extrakt ungefähr 3,7% der Verbindung (I) und 2,3% der Verbindung (II), bezogen auf das Gewicht des Extrakts.
Vorzugsweise ist das erste Elutionsmittel eine 50 gew.-%ige wässrige Ethanollösung und ist das zweite Elutionsmittel eine 95 gew.-%ige wässrige Ethanollösung.
Vorzugsweise ist das polare Lösungsmittel in Schritt a) Wasser oder eine 95 gew.-%ige wässrige Ethanollösung, wobei die 95 gew.-%ige wässrige Ethanollösung mehr bevorzugt ist.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele besser verständlich.
Prozentsätze und andere Mengen, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, beziehen sich auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist. Prozentsätze werden aus allen verwendeten Bereichen so ausgewählt, dass sie insgesamt 100% ergeben.
Beispiel 1: Herstellung eines Extrakts, EX-1
In Scheiben geschnittene getrocknete Wurzelrinden von Morus australis Poir. (Moraceae) wurden pulverisiert und mit einem Sieb gesiebt. 100 g des resultierenden Pulvers wurden mit 1000 ml einer 95 gew.-%igen wässrigen Ethanollösung (10:1 (Vol./Gew.)) in einem Rundkolben vermischt und die resultierende Mischung wurde unter Refluxieren eine Stunde lang gekocht und mit einem Sieb mit der Maschenzahl 350 und #2-Filterpapier filtriert, um ein Filtrat und einen Rückstand zu erhalten. Der Rückstand wurde der Extraktion unter Refluxieren und der Filtration unter den gleichen Bedingungen wie oben unterworfen. Die resultierenden zwei Filtrate wurden vereinigt und eine kleine Portion davon wurde durch Verdampfung getrocknet, um das Trockenpulvergewicht des vereinigten Filtrats zu berechnen, welches 10,21 g beträgt, d. h. 10,21 Gew.-% Ausbeute an Rohextrakt. Das vereinigte Filtrat wurde auf 1/10 seines ursprünglichen Gewichts eingeengt und zu dem resultierenden Konzentrat wurde ein gleiches Gewicht an Wasser zugegeben. Die resultierende Mischung wurde auf eine Umkehrphasenchromatografiesäule aufgegeben, die mit Polystyrol-Adsorptionsharz (Diaion^® HP20, Mitsubishi, Japan) in einer Menge vom 30-fachen des Trockengewichts des Konzentrats des vereinigten Filtrats gepackt war, welche dann mit 2 Bettvolumina (Bettvolumen = 600 ml) einer 50 gew.-%igen wässrigen Ethanollösung (1200 ml) und dann 2 Bettvolumina einer 95 gew.-%igen wässrigen Ethanollösung (1200 ml) der Reihe nach eluiert wurde. Das Eluat von der 95 gew.-%igen wässrigen Ethanollösung wurde gesammelt und im Vakuum zur Trockne eingeengt. 2,73 g Trockenextrakt mit dem Codenamen EX-1 wurden so mit einer Ausbeute von 26,7%, bezogen auf das Trockengewicht des Konzentrats des vereinigten Filtrats, und 2,73%, bezogen auf das Gewicht der getrockneten Wurzelrinden, erhalten.
Beispiel 2: Abtrennung des Extrakts EX-1
Zu einer homogenen Lösung von 2 g EX-1 in 10 ml Methanol wurden 10 ml reines Wasser zugegeben und die resultierende Mischung wurde dann kräftig geschüttelt, um das Ausfällen darin zu erleichtern, gefolgt von einer Zentrifugation bei 10000 U/min während 15 Minuten. Der sich aus der Zentrifugation ergebende Feststoff wurde den Auflösungs-, Fällungs- und Zentrifugationsschritten unterzogen. Insgesamt wurden sechs Zyklen durchgeführt.
Die von den sechs Zentrifugationen erhaltenen sechs Flüssigkeiten wurden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingeengt (Gewicht 1,3 g). Das resultierende trockene Pulver wurde auf eine Silicagelsäule (3,2 cm × 48,5 cm) aufgegeben, die mit Silica Gel 60 in einer Menge vom 30-fachen des Gewichts des trockenen Pulvers gepackt war, welche dann mit 15 Bettvolumina (Bettvolumen = 250) einer gemischten mobilen Phase aus Toluol:Ethylacetat = 7:3 (3750 ml) eluiert wurde. Das Eluat wurde der Reihe nach in einer vorgegebenen Anzahl von Flaschen gesammelt. Die Flüssigkeit in jeder Flasche wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt und eine kleine Menge an Methanol wurde wieder hinzugegeben, um das resultierende trockene Pulver aufzulösen, welches anschließend auf eine Dextrangelsäule (1,5 cm × 40 cm) aufgegeben wurde, die mit Sephadex LH-20-Harz in einer Menge vom 100-fachen des Gewichts des trockenen Pulvers gepackt war. Die Säule wurde mit einem Bettvolumen Methanol (30 ml) eluiert und es wurden Fraktionen von Verbindungen P2-1, P2-2, P3-1 und P3-2 erhalten. Jede Fraktion wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt und anschließend einer Reinigung mit präparativer HPLC unterworfen. Es wurden die Verbindungen P2-1, P2-2, P3-1 und P3-2 erhalten. Die Ausbeute der Verbindung P3-1 beträgt 2,3% (46 mg), bezogen auf das Gewicht von EX-1, und die Ausbeute an Verbindung P3-2 beträgt 3,65% (73 mg), bezogen auf das Gewicht von EX-1.
Der Rückstand nach den sechs Zentrifugationen wurde in Methanol gelöst und die resultierende Lösung wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das resultierende trockene Pulver wurde auf eine Silicagelsäule (3,2 cm × 48,5 cm) aufgegeben, die mit Silica Gel 60 in einer Menge von 30-fachen des Gewichts des trockenen Pulvers gepackt war, welche anschließend mit zwei Bettvolumina (Bettvolumen = 250) einer gemischten mobilen Phase aus Toluol:Ethylacetat = 9:1 (500 ml) eluiert wurde. Das Eluat wurde der Reihe nach in einer vorgegebenen Anzahl von Flaschen gesammelt. Die Flüssigkeit in jeder Flasche wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt und eine kleine Menge an Methanol wurde wieder hinzugegeben, um das resultierende trockene Pulver aufzulösen, welches dann auf eine Dextrangelsäule (1,5 cm × 40 cm) aufgegeben wurde, die mit Sephadex LH-20-Harz in einer Menge vom 100-fachen des Gewichts des trockenen Pulvers gepackt war. Die Säule wurde mit einem Bettvolumen Methanol (30 ml) eluiert und die Verbindungen P3-3 und P3-4 wurden erhalten. Strukturanalyse der Verbindungen P2-1, P2-2, P3-1, P3-2, P3-3 und P3-4

P2-1: ESI-MS: m/z 603,3 ([M + Na]⁺) und m/z 579,2 ([M – H]^–). Die NMR-Analyse wurde ebenfalls durchgeführt. Die ESI-MS und NMR-Daten zeigen, dass die Formel von P2-1 C₃₄H₂₈O₉ ist. Die NMR-Daten wurden mit der Untersuchung von Fukai, T.; Hano, Y.; Hirakura, K.; Nomura, T.; Uzawa, J.; Fukushima, K., Structure of mulberrofuran J, a 2-arylbenzofuran derivative from the cultivated mulberry tree (Morus Ihou Koidz.) (Struktur von Mulberrofuran J, einem 2-Arylbenzofuranderivat von dem kultivierten Maulbeerbaum (Morus Ihou Koidz.)), Heterocycles 1984, 22, 1007–1011 verglichen und es wird bestätigt, dass die Verbindung P2-1 das in dieser Untersuchung beschriebene Mulberrofuran C ist. Mulberrofuran C ist auch in der japanischen Patentschrift JP S57-144223 A offenbart.
P2-2: ESI-MS: m/z 715,3 ([M + Na]⁺) und m/z 691,3 ([M – H]^–). Die NMR-Analyse wurde ebenfalls durchgeführt. Die ESI-MS- und NMR-Daten zeigen, dass die Formel von P2-2 C₄₀H₃₆O₁₁ ist. Die NMR-Daten wurden mit der Untersuchung von Nomura, T.; Fukai, T.; Narita, T., Hypotensive constituent, kuwanon H, a new flavone derivative from the root bark of the cultivated mulberry tree (Morus alba L.) (Blutdrucksenkender Bestandteil, Kuwanon H, ein neues Flavonderivat aus der Wurzelrinde des kultivierten Maulbeerbaums (Morus alba L.)), Heterocycles 1980, 14, 1943–1951 verglichen und es wird bestätigt, dass die Verbindung P2-2 das in diesem Artikel beschriebene Albanin F (Kuwanon G) ist. Albanin F (Kuwanon G) ist auch in der koreanischen Patentschrift KR 10 2002 087225 A offenbart.
P3-1: ESI-MS: m/z 695,4 ([M + H]⁺) und m/z 693,7 ([M – H]^–). Die NMR-Analyse wurde ebenfalls durchgeführt. Die ESI-MS- und NMR-Daten zeigen, dass die Formel von P3-1 C₄₀H₃₈O₁₁ ist. Die NMR-Daten wurden mit der Untersuchung von Fukai, T.; Hano, Y.; Fujimoto, T.; Nomura, T., Structure of sanggenon G, a new Diels-Alder adduct from the Chinese crude drug „Sang-Bai-Pi” (Morus root barks) (Struktur von Sanggenon G, einem neuen Diels-Alder-Addukt aus der chinesischen Rohdroge „Sang-Bai-Pi” (Morus-Wurzelrinden)), Heterocycles 1983, 20, 611–615 verglichen und es wird bestätigt, dass die Verbindung P3-1 Sanggenon G ist. Sanggenon G ist auch in der japanischen Patentschrift JP H10-7555 A offenbart.
P3-2: ESI-MS: m/z 761 ([M + H]⁺), 783 ([M + Na]⁺) und 759 ([M – H]^–). Das Molekulargewicht von P3-2 wurde zu 760 berechnet. Die NMR-Analyse wurde ebenfalls durchgeführt. Die ESI-MS- und NMR-Daten zeigen, dass die Formel von P3-2 C₄₅H₄₄O₁₁ ist. Die NMR-Daten wurden mit den Untersuchungen von Nomura, T.; Fukai, T.; Narita, T.; Terada, S.; Uzawa, J.; litaka, Y.; Takasugi, M.; Ishikawa, S. I.; Nagao, S.; Masamune, T., Confirmation of the structures of kuwanons G and H (albanins F and G) by partial synthesis (Bestätigung der Strukturen der Kuwanone G und H (Albanine F und G) durch Teilsynthese), Tetrahedron Letters 1981, 22, 2195–2198; Oshima, Y.; Konno, C.; Hikino, H., Structure of moracenin A, a hypotensive principle of Morus root barks (Struktur von Moracenin A, einem blutdrucksenkenden Wirkstoff von Morus-Wurzelrinden), Heterocycles 1980, 14, 1287–1290; und Oshima, Y.; Konno, C.; Hikino, H.; Matsushita, K., Structure of moracenin B, a hypotensive principle of Morus root barks (Struktur von Moracenin B, einem blutdrucksenkenden Wirkstoff von Morus-Wurzelrinden), Tetrahedron Letters 1980, 21, 3381–3384 verglichen und es wird bestätigt, dass die Verbindung P3-2 Kuwanon H (auch als Albanin A oder Moracenin A bezeichnet) ist. Die japanische Patentschrift JP S56-123979 A offenbart, dass Kuwanon H den Blutdruck eines Hochdruckpatienten wirksam senkt.
P3-3: ESI-MS: m/z 421 ([M + H]⁺). Die NMR-Analyse wurde ebenfalls durchgeführt. Die ESI-MS- und NMR-Daten zeigen, dass die Formel von P3-3 C₂₅H₂₄O₆ ist. Die NMR-Daten wurden mit der Untersuchung von Nomura, T.; Fukai, T.; Yamada, S.; Katayanagi, M., Phenolic constituents of the cultivated mulberry tree (Morus alba L.) (Phenolbestandteile des kultivierten Maulbeerbaumes (Morus alba L.)), Chem. Pharm. Bull. 1976, 24, 2898–2900 verglichen und es wird bestätigt, dass die Verbindung P3-3 Morusin ist. Morusin ist auch in der US-Patentschrift US 2008/0286213 A1 offenbart.
P3-4: ESI-MS: m/z 447,0 ([M + H]⁺). Die NMR-Analyse wurde ebenfalls durchgeführt. Die ESI-MS- und NMR-Daten zeigen, dass die Formel von P3-4 C₂₉H₃₄O₄ ist. Die NMR-Daten wurden mit der Untersuchung von Nomura, T.; Fukai, T.; Shimada, T.; Chen, I.-S. Mulberrofuran D, a new 2-arylbenzofuran from the root barks of the mulberry tree (Morus australis Poir.) (Mulberrofuran D, ein neues 2-Arylbenzofuran aus den Wurzelrinden des Maulbeerbaums (Morus australis Poir.)), Heterocycles, 1982, 19, 1855–1860, verglichen und es wird bestätigt, dass die Verbindung P3-4 Mulberrofuran D ist. Mulberrofuran D ist auch in der japanischen Patentschrift JP H10-7555 A beschrieben.

Antimikrobieller Test
Staphylococcus aureus (Smith) und Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (ATCC 33591), In-vitro-Bakterien
Die minimale Hemmkonzentration (MHK) einer Probe auf Staphylococcus aureus (Smith) und Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (ATCC 33591) wurde durch das Brüheverdünnungsverfahren bestimmt [Edwards J. R. et al. In vitro antibacterial activity of SM-7338, a carbapenem antibiotic with stability to dehydropeptidase I (In-vitro antibakterielle Aktivität von SM-7338, einem Carbapenem-Antibiotikum mit Stabilität gegenüber Dehydropeptidase I), Antimicrobial Agents Chemotherapy, 33: Seiten 215–222, 1989]. Die Testsubstanz wurde gelöst (allgemein 100% DMSO) und eine Verdünnungsreihe in Lösungsmittel bis zu den gewünschten Stammkonzentrationen hergestellt. Für jede getestete Konzentration wurde ein 0,01 ml Aliquot (1% DMSO Endkonzentration) auf eine Platte mit 48 Vertiefungen gegeben, wonach 0,99 ml Mueller-Hinton-Brühe (DIFCO, USA.) mit 1–5 × 10⁵ kbE/ml von Staphylococcus aureus (Smith) oder Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (ATCC 33591) hinzugefügt wurde. So betrug die maximale Endkonzentration von DMSO 1% und die Ausgangskonzentration der Testsubstanz betrug 100 μg/ml oder 30 μM. Die Platten wurden 20 Stunden bei 37°C inkubiert und anschließend einer Sichtprüfung unterzogen und positiv (+) für eine Hemmung des Wachstums oder der Trübung oder negativ (–) für keine Auswirkung auf das Wachstum oder die Trübung bewertet. Eine Vehikel-Kontrollprobe und Referenzwirkstoffe wurden als Leerwert bzw. positive Kontrollproben verwendet. Jede Konzentration wurde in doppelter Ausführung bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Streptococcus pneumoniae (ATCC 6301) und Streptococcus pneumoniae (Erythromycin- und Ampicillin-resistentes klinisches Isolat), In-vitro-Bakterien

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) einer Probe auf Streptococcus pneumoniae und Streptococcus pneumoniae (Erythromycin- und Ampicillin-resistentes klinisches Isolat) wurde durch das Brüheverdünnungsverfahren [Edwards J. R. et al. In vitro antibacterial activity of SM-7338, a carbapenem antibiotic with stability to dehydropeptidase I (In vitro antibakterielle Aktivität von SM-7338, einem Carbapenem-Antibiotikum mit Stabilität gegenüber Dehydropeptidase I), Antimicrobial Agents Chemotherapy, 33: Seiten 215–222, 1989] bestimmt. Die Testsubstanz wurde gelöst (allgemein 100% DMSO) und eine Verdünnungsreihe in Lösungsmittel bis zu den gewünschten Stammkonzentrationen hergestellt. Für jede getestete Konzentration wurde ein 0,01 ml Aliquot (1% DMSO-Endkonzentration) zu einer Platte mit 48 Vertiefungen zugegeben, wonach 0,99 ml Trypsin-Soja-Brühe (DIFCO, USA), enthaltend 7 fötales Rinderserum, mit 1–5 × 10⁵ kbE/ml von Streptococcus pneumoniae (ATCC 6301) oder Streptococcus pneumoniae (Erythromycin- und Ampicillin-resistentes klinisches Isolat) zugegeben wurde. So betrug die maximale Endkonzentration von DMSO 1% und die Ausgangskonzentration der Testsubstanz betrug 100 μg/ml oder 30 μM. Die Platten wurden 20 Stunden bei 37°C inkubiert und dann einer Sichtprüfung unterzogen und positiv (+) für eine Hemmung des Wachstums oder der Trübung oder negativ (–) für keine Auswirkung auf das Wachstum oder die Trübung bewertet. Eine Vehikel-Kontrollprobe und Referenzwirkstoffe wurden als Leerwert bzw. positive Kontrollproben verwendet. Jede Konzentration wurde in doppelter Ausführung bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Minimale Hemmkonzentration (MHK) von Extrakt EX-1 und Einzelverbindungen in dem antimikrobiellen Test

Probe	MHK (μg/ml)
Probe	SA (Smith)	MRSA	SP	SP (EM & AM Res.)
EX-1	0,3	1	30	30
P2-1	3	> 100	100	30
P2-2	3	> 100	30	30
P3-1	1	3	30	10
P3-2	0,3	0,3	10	10
P3-3	10	100	100	30
P3-4	3	100	30	10
Gentamicin	0,1	1	100	100
Ampicillin	0,1	30	0,01	3

SA (Smith): Staphylococcus aureus (Smith);
MRSA: Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus;
SP: Streptococcus pneumoniae;
SP (EM & AM Res.): Erythromycin- und Ampicillin-resistenter Streptococcus pneumoniae, klinische Isolate.

Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass die Verbindung P3-2 sehr wirksam das Wachstum von SA (Smith) und MRSA mit einer MHK von jeweils 0,3 μg/ml verhindert. Im Gegensatz dazu ist die MHK von Gentamicin auf MRSA 10mal so hoch wie die auf SA (Smith).
Die Verbindung P3-1 zeigt eine Wirksamkeit im Hinblick auf das Hemmen des Wachstums von SA (Smith) und MRSA mit einer MHK von 1 bzw. 3 μg/ml. Die Verbindung P3-1 ist relativ weniger wirksam im Hinblick auf das Hemmen des Wachstums von SP und SP (EM & AM Res.) mit einer MHK von 30 bzw. 10 μg/ml.
Überraschenderweise zeigt der Extrakt EX-1 eine sehr starke Hemmung des Wachstums von SA und MRSA mit einer MHK von 0,3 bzw. 1 μg/ml, in Anbetracht der Gehalte an P3-2 und P3-1, die 3,65 Gew.-% bzw. 2,3 Gew.-% darin betragen. Es ist offensichtlich, dass Bestandteile, die in dem Extrakt EX-1 enthalten sind, eine synergistische Wirkung auf das Hemmen des Wachstums von SA und MRSA erzeugen, so dass der Extrakt EX-1 sehr niedrige MHK-Werte auf SA und MRSA aufweist.
Wenngleich die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Einzelheiten von bestimmten Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist es nicht beabsichtigt, dass solche Einzelheiten als Beschränkungen des Umfangs der Erfindung angesehen werden sollten, mit der Ausnahme dass und in dem Maße wie sie in den beigefügten Ansprüchen enthalten sind. Viele Abwandlungen und Variationen sind im Lichte der vorstehenden Offenbarung möglich.

Claims

Verwendung einer Verbindung mit der Formel (I), oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, zur Behandlung einer bakteriellen Infektion:
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Bakterien grampositive Bakterien sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Bakterien Staphylococcus aureus (Smith) oder Streptococcus pneumoniae sind.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Bakterien Methicillin-resistente Staphylococcus aureus oder Erythromycin- und Ampicillin-resistente Streptococcus pneumoniae sind.