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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Mikroskopvorrichtung mit einem
Objektiv, einer Lichtquelle zum Beleuchten einer Probe, einer Optik
zum Einkoppeln des Beleuchtungslichts in das Objektiv und einem
Begrenzungselement, um den in das Objektiv einzukoppelnden Beleuchtungslichtstrahl
zu begrenzen.
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In
der Mikroskopie ist es grundsätzlich wünschenswert,
die Fokussierung der Probe bezüglich des Objektivs in einfacher
Weise bewerkstelligen zu können und eine einmal gefundene
Fokusposition der Probe auch dann noch konstant zu halten, wenn sich
die Probe (gewollt oder ungewollt) relativ zum Objektiv bewegt.
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Hierzu
wird bei bekannten Mikroskopvorrichtungen gewöhnlich auf
Messlicht zurückgegriffen, das von einer Grenzfläche
des das Präparat haltenden Probengefäßes
zurückreflektiert wird. Um dabei die eigentliche Probenbeobachtung
nicht zu stören und Bilder nicht zu verfälschen,
setzt man üblicherweise einen Infrarot-Laser als Messlichtquelle
ein, dessen Rückreflexe gemessen werden. In den meisten
Fällen wird als reflektierende Fläche die Grenzfläche
zwischen dem Deckglas und dem das Präparat einbettenden
Medium verwendet.
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Dabei
muss der für die Infrarot-Lasermessung erforderliche Messlichtbeleuchtungs-
und Messlichtmessstrahlengang – zusätzlich zu
den anderen Strahlengängen – in das Mikroskop
ein- bzw. ausgekoppelt werden. Geschieht dies da, wo in einem Mikroskop üblicherweise
Platz ist und Auflicht- bzw. Bildstrahlengang leicht zugänglich
sind, d. h. vom Objektiv aus gesehen hinter dem für beispielsweise
eine Auflichtfluoreszenzmessung benötigten dichroitischen
Strahlteiler, müssen alle Strahlteiler und Sperrfilter
zusätzlich zur für die Fluoreszenzmessung erforderlichen
spektralen Charakteristik auch noch ein spektrales Fenster für
den Infrarot-Laser für die Fokusmessung aufweisen. Da dies
eine ernsthafte Einschränkung bedeutet, sind einige Mikroskophersteller
mittlerweile dazu übergegangen, zusätzlichen Raum
zwischen Objektiv und Strahlteiler zu schaffen, um das Infrarot-Laserfokusmesslicht
dort einzukoppeln.
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In
der
EP 0 273 717 A2 ist
ein Mikroskop beschrieben, bei welchem ein separater He-Ne-Laser als
Lichtquelle für die Fokusmessung verwendet wird.
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In
der
WO 01/88599 A1 ist
eine konfokale Autofokussiereinrichtung für optische Geräte
beschrieben, bei welcher eine von einem Messlichtlaser beleuchtete
Messblende eine Punktlichtquelle bildet, die auf die Probenoberfläche
abgebildet wird, wobei das von der Probenoberfläche reflektierte
Messlicht nach Durchlaufen mehrerer Punktblenden auf einem Detektor
abgebildet wird, und wobei aus dem Detektorsignal auf die Fokusposition
rückgeschlossen wird.
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Es
ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Mikroskopvorrichtung
zu schaffen, bei welcher auf möglichst einfache Weise die
Fokusposition kontrolliert werden kann.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
eine Mikroskopvorrichtung gemäß Anspruch 1.
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Bei
der erfindungsgemäßen Lösung ist vorteilhaft,
dass keine zusätzliche Lichtquelle erforderlich ist, weil
das für den Betrieb des Mikroskops ohnehin vorhandene Beleuchtungslicht
zur Fokusmessung verwendet werden kann. Man bedient sich dabei der
Tatsache, dass ein räumlich begrenzter Beleuchtungsstrahl
nach Reflexion an der Probengrenzfläche eine Referenzfläche
räumlich versetzt passiert und dass dieser Strahlversatz
für einen bestimmten Einstrahlwinkel (α) vom Grad
der Defokussierung (Δ) abhängt, wie dies schematisch
aus 8 ersichtlich ist.
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Die
Erfindung beinhaltet eine geeignete Auskoppel- und Detektoranordnung,
mittels der von der Probengrenzfläche reflektiertes und
die Einkoppeloptik rückwärts durchlaufendes Beleuchtungslicht
aufgefangen und in ein Messsignal überführt werden kann,
das sich in Abhängigkeit von der Fokus-Position verändert.
Da dies erfindungsgemäß keine zusätzliche
Lichtquelle erforderlich macht, ist naturgemäß immer
der passende Strahlteiler im Strahlengang, was den Einsatz spezieller
Filterkombinationen, beispielsweise mit einem spektralen Fenster
für Infrarotlicht zur Fokusmessung, vermeidet. Es wird nicht
nur der Einsatz in allen handelsüblichen Mikroskopen, bei
denen zwischen Objektiv und Strahlteiler Extraraum geschaffen wurde,
ermöglicht, sondern es wird auch eine kompaktere Bauart
des Fokustriebs ermöglicht, der dadurch stabiler ausgelegt
sowie schneller und präziser bewegt werden kann.
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Vorzugsweise
erfolgt die Strahlauskopplung aus dem reflektierten Strahl an einer
Stelle, an der der Beleuchtungsstrahl gar nicht oder nur so beeinflusst
wird, dass das vom Auge oder der Kamera gesehene Gesichtsfeld nicht
obstruiert wird. Im folgenden werden drei verschiedene Realisierungsformen beschrieben,
die diese Anforderungen erfüllen.
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Gemäß einer
ersten Ausführungsform wird ein als gemeinsames Element
ausgebildetes Auskoppel- und Begrenzungselement in einer zur Fokusebene
des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet, wobei die Detektorfläche
in einer zu der Ebene der Objektivpupille konjugierten Ebene liegt.
Das Auskoppelelement kann als Fläche ausgebildet sein, die
von der Probenoberfläche reflektiertes Beleuchtungslicht
reflektiert, wobei eine Begrenzungskante der reflektierenden Fläche
des Auskoppelelements zugleich die Begrenzungskante des Begrenzungselements
bildet, und wobei das Auskoppelelement und das Begrenzungselement
von einem Prisma gebildet werden, wobei die Begrenzungskante vom
dem First des Prismas gebildet wird. Bei der Beleuchtung der Probe
erzeugt der Beleuchtungsstrahlengang, der zweckmäßigerweise
von einer Tubuslinse und dem Objektiv gebildet wird, in der Fokusebene
des Objektivs ein scharfes Bild der Kante des Begrenzungselements.
Je nachdem ob sich die reflektierende Grenzfläche vor,
in oder hinter dieser Schärfenebene des Objektivs befindet,
wandert das (teilweise virtuelle) Bild der Grenzfläche
auf dem Auskoppelelement und führt dadurch auf dem Detektor
zu einem eindeutigen Fokussignal.
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Gemäß einer
alternativen Ausführungsform werden Begrenzungs- und Auskoppelelement
getrennt, wobei ersteres sich weiterhin in einer zur Objektebene
konjugierten Ebene befindet, während das Auskoppelelement
in einer zur Ebene der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet
ist. Die Detektorfläche liegt in diesem Fall in einer zu
der Fokusebene des Objektivs konjugierten Ebene. Da der Winkel des
reflektierten Lichtes das umgekehrte Vorzeichen des Winkels des
eingestrahlten Lichtes aufweist, definiert die Positionierung des
Auskoppelelements in der zur Objektiv-Pupille konjugierten Ebene, welche
Winkel zur Fokus-Positionsbestimmung herangezogen werden. Vorzugsweise
ist das Auskoppelelement als Fläche ausgebildet, die von
der Probenoberfläche reflektiertes Beleuchtungslicht reflektiert.
Das von der Proben-Grenzfläche reflektierte Licht, welches
vom Auskoppelelement reflektiert wird, wird mit Hilfe einer Linse
auf einen Dualdetektor gelenkt. Dieser Detektor befindet sich in
einer zur Objektebene konjugierten Ebene und ist so positioniert, dass
bei einer in der Fokusebene des Objektivs befindlichen reflektierenden
Grenzfläche gleiche Anteile des detektierten Lichts auf
die beiden Detektorhälften fallen und dass sich bei einer
Veränderung der Fokusposition die relativen Anteile kontinuierlich
verändern.
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Um
das Signal des Differenz-Detektors bezüglich der Intensität
des Beleuchtungslichts zu kalibrieren, werden vorzugsweise ein Referenzsignal-Auskoppelelement
und ein Referenzsignal-Detektor vorgesehen, wobei das Referenzsignal-Auskoppelelement
ausgebildet und angeordnet ist, um einen Teil des Beleuchtungslichts
vor dem Eintritt in die Einkoppeloptik auf den Referenzsignal-Detektor auszukoppeln.
Vorzugsweise sind die beiden Auskoppelelemente als gemeinsames Element
ausgebildet, z. B. als Prisma.
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Gemäß einer
weiteren alternativen Ausführungsform ist die Mikroskopvorrichtung
für eine TIRF-Beleuchtung der Probe ausgebildet. Dabei
ist die Optik zum Einkoppeln des Beleuchtungslichts in das Objektiv
so ausgebildet, dass das Beleuchtungslicht in der Ebene der Objektivpupille
einen Fokus besitzt, dessen Position in der Pupillenebene den Beleuchtungswinkel
vorgibt, unter dem die Probe beleuchtet wird. Dieser (in zwei Dimensionen
variable) Fokuspunkt wird durch eine telezentrische Anordnung zweier
Linsen (von der die zweite eine Tubuslinse ist) in die Objektivpupille
abgebildet. Das Auskoppelelement ist ein im Unendlichraum zwischen den
beiden Linsen angeordneter Strahlteiler, der nur einen winzigen
Bruchteil des auftreffenden Lichts reflektiert und diesen auf zwei
verschiedene Detektoren richtet, einen, der den Bruchteil des eingestrahlten
(Beleuchtungs-)Lichts „sieht”, und einen zweiten, der
das von der Probengrenzfläche reflektierte Licht detektiert.
Vor den Detektoren befindet sich jeweils ein als Blende ausgelegtes
Selektionselement, das bei einer in der Objektiv-Pupille zentrierten
Fokusposition den geringsten Teil des auftreffenden Lichts passieren
lässt. Die Lichtmenge, die der Detektor für das
von der Probengrenzfläche reflektierte Licht detektiert, ändert
sich mit der Position des Fokuspunktes in der Objektivpupille und
nimmt dramatisch zu, sobald der TIRF-Winkel (d. h. der Winkel der
Totalreflexion) überschritten ist. Je steiler dieser Übergang ist,
um so besser ist der Fokus in der Objektivpupille ausgebildet, und
bei einem einmal eingestellten vorgegebenen TIRF-Winkel hängt
das Detektorsignal nur noch von der relativen Fokusposition ab.
Im Spezialfall von TIRF erlaubt es diese Meß-Variante,
die wie die vorher aufgeführten auch nur das Anregungslicht
als Meßlicht benötigt, nicht nur die Fokusposition bei
einem gegebenen TIRF-Winkel zu bestimmen, sondern auch den TIRF-Winkel
bei einer vorgegebenen Fokusposition sowie die Güte der
Fokussierung in der Objektivpupille. Um ein Referenzsignal zu haben,
wird ein Bruchteil des Anregungslichts vom gleichen Auskoppelelement
(Strahlteiler) auf einen zweiten Detektor gelenkt, vor dem ein analoges
Begrenzungselement (Blende) angebracht ist. Diese Blende ist so
angeordnet, dass das Signal aufgrund einer vom TIRF-Winkel abhängigen Überstrahlung
der Maske vom TIRF-Winkel, d. h. von der Dezentrierung der Lichtquelle,
abhängt.
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Vorzugsweise
ist eine Steuereinheit vorgesehen, um das Signal der beiden Detektoren
zu vergleichen, um den TIRF-Übergang festzustellen, wobei
die Steuereinheit zweckmäßigerweise so ausgebildet
ist, dass der TIRF-Übergang festgestellt wird, wenn die
Signale der beiden Detektoren in etwa gleich groß sind,
wobei die Intensität der Lichtquelle in Abhängigkeit
von dem Verhältnis der Signale der beiden Detektoren so
gesteuert wird, dass die Intensität der Lichtquelle nach
erfolgtem TIRF-Übergang erhöht wird.
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Im
folgenden werden drei unterschiedliche Ausführungsformen
der Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen näher
erläutert. Dabei zeigen:
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1A bis 1E eine
Seitenansicht des Strahlengangs eines ersten Ausführungsbeispiels
einer erfindungsgemäßen Mikroskopvorrichtung mit (A)
in der Fokusebene, (B) vor der Fokusebene bzw. (C) hinter der Fokusebene
des Objektiv befindlicher Probengrenzfläche, wobei in den 1A, 1B und 1D jeweils
der die obere Hälfte der Objektivpupille passierende Teil
des Eintrittsstrahls und in den 1C und 1E der
den unteren Teil der Objektivpupille passierende Teil des Eintrittsstrahls
gezeigt ist;
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2A bis 2C schematisch
das Signal der ersten Detektorhälfte, der zweiten Detektorhälfte bzw.
das Differenzsignal der beiden Detektorhälften in Abhängigkeit
von der Fokusposition der Probengrenzfläche;
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3 eine
Ergänzung der Ausführungsform gemäß 1A bis 1E;
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4A und 4B eine
Seitenansicht des Strahlengangs einer zweiten Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Mikroskops mit in der
Fokusebene bzw. vor der Fokusebene des Objektivs befindlicher Probengrenzfläche;
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5 eine
Seitenansicht des Strahlengangs einer dritten Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen Mikroskopvorrichtung mit
zentriertem Beleuchtungs-Spot und im Fokus des Objektivs befindlicher Probengrenzfläche;
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6 die
Anordnung von 5 mit dezentriertem Beleuchtungs-Spot;
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7 schematisch
die Signale der beiden Detektoren in Abhängigkeit vom TIRF-Winkel;
und
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8 eine
schematische Darstellung des Parallelversatzes des an einer Probengrenzfläche
reflektierten Strahls in Abhängigkeit von der Defokussierung
des Objektivs.
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In
den 1A bis 1E ist
eine erste Ausführungsform einer Mikroskopvorrichtung gezeigt, die
ein Objektiv 10 mit einer Objektpupille 12, eine Tubuslinse 14,
eine Beleuchtungslichtquelle 16 zum Beleuchten einer Probenfläche 18,
sowie eine schematisch dargestellte Optik 20 zur Beleuchtung
der Feldblendenebene 22 mit Hilfe der Lichtquelle 16 aufweist.
Vom ge samten Auflichtstrahlengang ist in der Schemazeichnung nur
ein Strahlenbündel 24 gezeigt, das sich in der
Feldblendenebene vereint und ein Strahlbegrenzungselement 26 mit
einer Begrenzungskante 28 gerade noch passiert. Das Strahlbegrenzungselement 26 hat
die Funktion, den in das Objektiv 10 einzukoppelnden Beleuchtungsstrahl 24 seitlich
so zu begrenzen, dass das Gesichtsfeld des Mikroskop-Detektors (nicht
gezeigt) in der Objektebene 18 gerade nicht eingeschränkt
wird. Die dem Objektiv 10 zugewandte Fläche 30 des
Begrenzungselements 26 ist reflektierend ausgebildet, um gegebenenfalls
von der Probenfläche 18 reflektiertes Beleuchtungslicht 32 auf
einen Dualdetektor 34 (in 1A nicht
dargestellt) mit zwei Hälften bzw. Sektoren 34a und 34b zu
reflektieren. Dabei ist eine Linse 36 vorgesehen, die zusammen
mit der Tubuslinse 14 das auf der Grenzfläche 30 reflektierte
Licht auf dem Detektor 34 leitet und zwar dergestalt, dass
sich der Detektor 34 in einer zur Fokusebene 38 des
Objektivs 10 konjugierten Ebene befindet. Das Begrenzungselement 26 kann,
wie gezeigt, als Prisma ausgebildet sein.
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Sofern
sich nun, wie in 1A gezeigt, eine reflektierende
Grenzfläche 18 der Probe genau in der Fokusebene 38 des
Objektivs 10 befindet, wird das Beleuchtungsstrahlenbündel 24,
das auf dem Hinweg das Begrenzungselement 26 gerade noch
passiert, so zurückreflektiert, dass es in der Feldblendenebene 22 wieder
an seinem Ausgangspunkt landet, d. h. es wird durch die Kante 28 des
Begrenzungselements 26 nicht beeinträchtigt, sondern
kann ungehindert passieren. Somit wird kein Anteil des in der Fokusebene 38 befindlichen
Probengrenzfläche 18 reflektierten Lichts auf
den Detektor 34 reflektiert. Zur Verdeutlichung der Darstellung
ist in 1A sowie in den 1B und 1D jeweils
nur die den oberen Teil der Objektivpupille 12 passierende
Hälfte des Beleuchtungsstrahlenbündels 24 und
die den unteren Teil der Objektivpupille 12 passierende
Teil des reflektierten Lichtbündels 32 gezeigt.
Gemäß der Definition der Schemazeichnung besitzt
der Winkel α dieser Hälfte des Beleuchtungslichts
ein positives Vorzeichen, der Winkel des reflektierten Lichts entsprechend
ein negatives Vorzeichen.
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Befindet
sich die Fokusebene 38 des Objektivs 10 dagegen
in der Probe, d. h. kommt die Fokusebene 38 des Objektivs 10 jenseits
der reflektierenden Probenfläche 18 zu liegen,
(siehe 1B und 1C), landet
das reflektierte Strahlenbündel 32 dadurch zumindest
teilweise auf dem Begrenzungselement 26, d. h. der reflektierenden
Fläche 30 und wird aus dem Strahl ausgekoppelt
und auf den Detektor 34 gelenkt. Der ausgekoppelte Teil
des reflektierten Strahls 32 ist mit 40 bezeichnet.
Die beiden Hälften 34a und 34b des Detektors 34 sind
so positioniert, dass sie ein scharfes Bild der oberen Hälfte der
Pupille 12 (in der Detektorhälfte 34a)
bzw. der unteren Hälfte der Pupille 12 (in der
Detektorhälfte 34b) erfassen. Wie 1C im Vergleich
zu 1B verdeutlicht, trifft bei der gezeigten Fokuslage
nur Licht mit Einfallswinkel α > 0 auf den Detektor. Dessen Grenzfläche
zwischen den Detektorhälften ist so positioniert und ausgerichtet,
dass Licht, das nach Reflexion die „unteren Pupillenhälfte” passiert
(bei dem der Winkel „α” nach Reflektion
ein negatives Vorzeichen aufweist) auf 34a, reflektiertes
Licht, das die obere Pupillenhälfte passiert auf Detektorhälfte 34b landet.
Wie groß der Anteil des ausgekoppelten Strahls 40 ist,
hängt vom Grad der Defokussierung, d. h. vom Abstand z
der reflektierenden Probenfläche 18 von der Fokusebene 38,
ab.
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Umgekehrt
ist die Situation bei der in den 1B und 1E gezeigten
Defokussierung in die entgegengesetzte Richtung, wo dann die Detektorhälfte 34a nicht
auf die Defokussierung anspricht, während nun die Detektorhälfte 34b mit
zunehmender Defokussierung eine größere Lichtmenge
erhält und das Signal entsprechend ansteigt, da die reflektierenden
Fläche 30 nur Licht aufsammeln kann, das mit Winkeln α < 0 auf die Probengrenzfläche 18 trifft und
dessen Probenrückreflex demnach auf der Detektorhälfte 34b landet.
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Zusammengefasst
wird die Situation in der 2: Ist die
reflektierende Probengrenzfläche 18 genau in der
Fokusebene 38 des Objektivs 10, sehen beide Detektorhälften 34a und 34b kein
Licht. Liegt die Fokusebene 38 in der Probe, dann sieht
nur Detektor 34a ein Signal, das kontinuierlich abnimmt
je mehr sich der Objektivfokus der Grenzfläche nähert. Der
Detektor 34b sieht derweil kein Signal. Das ändert
sich beim „Null-Durchgang”, d. h. wenn der Objektiv-Fokus 38 sich
durch die Probengrenzfläche 18 bewegt. Von diesem
Punkt an sieht Detektor 34b ein stetig zunehmendes Signal,
während Detektor 34a kein Signal mehr sieht. Somit
ergibt die Differenz der Signale (2C) der
Detektoren 34a (2A) und 34b (2B)
ein stetig mit der Fokusposition variierendes Signal.
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Um
das Detektorsignal unabhängig von Intensitätsschwankungen
der Lichtquelle 16 zu machen, wird vorzugsweise ein Referenzsignal
registriert. Dies kann gemäß 3 beispielsweise
dadurch erfolgen, dass ein Referenzsignal-Auskoppelelement, welches
aus einer zweiten reflektierenden Fläche 44 des
Begrenzungselements 26 gebildet wird, und ein Referenzsignal-Detektor 46 vorgesehen
werden, wobei die Fläche 44 so angeordnet ist,
dass ein Teil 48 des einfallenden Beleuchtungslichtstrahls 24 vor
dem Eintritt in die Einkoppeloptik des Objektivs 10 auf
den Referenzsignal-Detektor 46 ausgekoppelt wird (der ausgekoppelte
Teil 48 des Beleuchtungslichts würde dabei ohnehin
außerhalb des genutzten Gesichtsfelds ankommen). Auf diese
Weise kann das Signal des Detektors 34 bezüglich
der Intensität des Beleuchtungslichts kalibriert werden.
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In
den 4A und 4B ist
eine alternative Ausführungsform gezeigt. Während
bei der Ausführungsform gemäß 1A bis 1E das
Auskoppelelement 30 in der Feldebene 22 (d. h.
in einer zur Objektebene konjugierten Ebene) und der Detektor 34 in
einer zur Objektivpupille 12 konjugierten Ebene angeordnet
ist, ist bei der Ausführungsform gemäß 4A und 4B das
Auskoppelelement 130 in einer zur Objektivpupille 12 konjugierten
Ebene angeordnet, während sich der Detektor 34 in
einer zur Objektebene 38 bzw. Feldblendenebene 22 konjugierten
Ebene befindet. Gemäß 4A und 4B befinden
sich Strahlbegrenzungselement 122 und Auskoppelelement 130 in
unterschiedlichen Ebenen. Letzteres befindet sich in der Ebene 150,
einer zur Objektivpupille 12 konjugierten Ebene. Dort entspricht
jeder Punkt genau einem Strahl-Winkel im Raum jenseits des Objektivs 10.
Somit enthält der vom Auskoppelelement 130 ausgekoppelte
Anteil des an der Probenfläche 18 reflektierten
Beleuchtungslichtstrahls 132 nur die Winkelanteile „α”,
die der Position des Auskoppelelements 130 in der zur Objektivpupille 12 konjugierten
Ebene 150 entsprechen. Im in 4A und 4B gezeigten
Beispiel sind das nur Winkel „α”, die
mit negativem Vorzeichen auf die Probengrenzfläche 18 auftreffen
und mit positivem Vorzeichen reflektiert werden. Die entsprechenden
Winkel des Beleuchtungslichts 124 mit umgekehrten Vorzeichen
(α > 0) werden
auf „dem Hinweg” aus dem Strahl entfernt, d. h.
die Probe wird mit keiner symmetrischen Winkelverteilung beleuchtet. Das
tut der Homogenität der Beleuchtung jedoch keinen Abbruch.
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Die
Fläche des Dualdetektors 34 mit den beiden Detektorhälften 34a und 34b befindet
sich in einer zur Fokusebene 38 des Objektivs 10 und
zur Feldblendenebene 22 konjugierten Ebene 152.
Zum Abbilden des reflektierten Beleuchtungslichts 132 ist eine
Linse 154 zwischen dem Auskoppelelement 130 und
dem Detektor 134 vorgesehen. Zwischen der zur Objektivpupille 12 konjugierten
Ebene 150 und der Feldblendenebene 22 ist eine
Linse 156 angeordnet, in deren Brennebene die Ebene 150 liegt.
Die Linse 156 dient zusammen mit der Tubuslinse 14 dazu,
das Beleuchtungslicht auf die Objektivpupille 12 zu fokussieren.
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Das
Auskoppelelement 130 kann beispielsweise als Prisma ausgebildet
sein.
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Bei
der gezeigten Anordnung kann das Bild der Feldblende 122,
das zuerst mit Hilfe der Linsen 14 (Tubuslinse) und 10 (Objektiv)
auf die Probe abgebildet, dort reflektiert, von den Linsen 10 und 14 rückwärts
in die Feldblende 122 und danach von den Linsen 156 und 154 auf
den Dualdetektor 34 abgebildet wurde, dort nur dann dort
vollständig detektiert werden, wenn sich die reflektierende
Fläche 18 genau in der Fokusebene 38 des
Objektivs 10 befindet. Sobald das Bild der Feldblende 122 nicht
mehr in der Fokusebene 18 des Objektivs liegt, ändert sich
die Verteilung der Menge des auf die beiden Detektorhälften 34a und 34b fallenden
reflektierten Beleuchtungslichts 132 in Abhängigkeit
von der Fokusposition.
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In
dem in 4A gezeigten Fall, in welchem die
Probenfläche 18 genau in der Fokusebene 38 angeordnet
ist, passiert der reflektierte Strahl 132 die Feldebenenblende 22 in
symmetrischer Weise, was zu einer symmetrischen Verteilung des Reflexbilds auf
dem Detektor 34 führt, so dass hier die Differenz des
Signals der beiden Detektorhälften 34a und 34b gleich
Null ist. Tritt dagegen eine Defokussierung, wie in 4B gezeigt,
auf, so wird der reflektierte Strahl 132 gegenüber
dem einfallenden Strahl 124 senkrecht zur Strahlachse versetzt,
was zu einer asymmetrischen Beleuchtung des Detektors 34 und damit
zu einem von der Fokusposition abhängigen Differenzsignal
der beiden Detektorhälften 34a und 34b führt.
Letztlich wandert hier das Abbild der Begrenzungskante einer als
Begrenzungselement im einfallenden Lichtstrahl 124 wirkenden
Feldblende (in 4 ist ein Begrenzungselement 122 in
einer ersten Feldblendenebene 22 angebracht, es kann sich
jedoch auch in einer zur Ebene 22 konjugierten Ebene befinden)
in Abhängigkeit von der Fokusposition über den
Detektor 34, und zwar in einer Richtung senkrecht zur Trennungslinie
zwischen den beiden Detektorhälften 34a und 34b.
Dadurch nimmt das Signal auf der einen Detektorhälfte ab,
während es auf der anderen Detektorhälfte konstant
bleibt (in der in 4b gezeigten Konstellation)
oder zunimmt, wenn nämlich das Begrenzungselement bereits
in einer „früheren” konjugierten Ebene
angebracht ist (nicht gezeigt). Bei dieser Variante benötigt
man kein zusätzliches Referenzsignal, man kann stattdessen
die Summe der beiden Kanäle, d. h. der Detektorhälften 34a und 34b,
als Referenz hernehmen, während die Differenz der beiden
Detektorhälften 34a und 34b das fokusabhängige
Signal ergibt.
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In 5 bis 7 ist
eine weitere Ausführungsform dargestellt, die speziell
für TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) geeignet
ist. TIRF wird gewöhnlich mit Hilfe von kollimiertem Licht
einer kohärenten (Laser-)Lichtquelle durchgeführt,
wobei im TIRF-Modus, d. h. nach Überschreiten des kritischen
Winkels der Totalreflexion, nicht nur ein geringer Bruchteil, sondern
das gesamte eingestrahlte Licht an der Probengrenzfläche 18 reflektiert
wird. Dabei ist die Position des „Auskoppelelements” für den
Fokus-Positionsdetektor bei weitem unkritischer als im Falle inkohärenter
Beleuchtung. Das im folgenden beschriebene Konzept dient nicht nur
dem Zweck, eine gewünschte Fokusposition zu finden und
zu bewahren, sondern erlaubt darüber hinaus auch eine Optimierung
des TIRF-Beleuchtungsstrahls.
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Bei
der Anordnung gemäß 5 ist eine
Beleuchtungslichtquelle 216 in einer zur Pupillenebene 12 des
Objektivs 10 konjugierten Ebene angeordnet. Bei der Anordnung
gemäß 5 ist die Lichtquelle 216 dabei
im Brennpunkt einer Linse 256 angeordnet, die einen Unendlichraum
zwischen der Linse 256 und der Tubuslinse 14 erzeugt,
in welchem ein Auskoppelelement 230 angeordnet ist, welches
ein Großteil, z. B. 99%, des einfallenden Lichts von der Lichtquelle 216 durchlässt
und lediglich den verbleibenden kleinen Rest 248 des Anregungslichts 224 auf
einen Detektor 235 reflektiert. Der durchgelassene einfallende
Lichtstrahl 124 gelangt nach Durchlaufen der Tubuslinse 14,
der Objektivpupille 12 und des Objektivs 10 auf
die Probenfläche 18, wo im Normalfall (nicht TIRF)
ein relativ kleiner Teil des Lichts reflektiert wird und rückwärts
durch die genannten Elemente 10, 12, 14 und 22 auf
das Auskoppelelement 230 gelangt, wo – analog
zum „Hinweg” – ein Großteil,
z. B. 99%, des von der Probengrenzfläche 18 reflektierten
Lichts 232 durchgelassen werden und lediglich der verbleibende
kleine Rest 248 des reflektierten Lichts 232 auf
einen zweiten Detektor 234 reflektiert werden. Die Detektoren 234 und 235 sind
jeweils mit einer Maske 236 bzw. 237 versehen,
deren Position und Größe so bemessen ist, dass
die Detektoren 234 und 235 ein maximales Signal
sehen, wenn das Feld unter einem Winkel von 0° beleuchtet
wird, d. h. wenn der einfallende Strahl 124 perfekt zentriert ist,
wie dies in 5 gezeigt ist. Da unter solchen
Bedingungen keine totale interne Reflexion stattfindet, wird das
Signal auf dem Detektor 234 deutlich schwächer
sein als das Signal auf Detektor 235. Letzteres wird ca.
1% des eingestrahlten Lichts betragen, während ersteres
um den Prozentsatz reduziert sein wird, den die Probengrenzfläche 18 durchgelassen
d. h. nicht reflektiert hat.
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Rückt
man nun gemäß 6 den Fokus
des Beleuchtungsstrahls, d. h. die Lichtquelle 216, in
der Ebene 250 aus ihrer zentralen Position in der Brennebene
der Linse 256 heraus in eine Vektorposition „x”, ändert
sich entsprechend der Winkel α in der Fokusebene 38 des
Objektivs 10. Damit werden sowohl der einfallende Strahl 224 als
auch der reflektierte Strahl 232 im Unendlichraum zwischen
den Linsen 256 und 14 so gekippt, dass sie nur
noch in der Blendenebene 22 vollständig überlappen,
davor und dahinter jedoch auseinanderlaufen. Entsprechend landen
sie auch räumlich versetzt auf den Detektormasken 236 bzw. 237.
Dadurch sehen die beiden Detektoren 234 und 235 ein
entsprechend reduziertes Signal. Die Signalreduktion ist in beiden
Fällen ein Maß für den Betrag des Vektors
x. Sobald jedoch der Versatz x groß genug ist, um das Einsetzen
der totalen internen Reflexion zu ermöglichen, d. h. sobald
x und damit α einen kritischen Wert überschreiten,
wird die Intensität des zurückreflektierten Strahls 232 dramatisch
zunehmen.
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Die
von den beiden Detektoren registrierte Intensität wird
deshalb in der in 7 gezeigten Weise vom Winkel α (bzw.
der Größe des Vektors x) abhängen. Das
gilt für jeden Winkel β, mit dem α variiert werden
kann für eine vorgegebene Dezentrierung α bzw.
x gibt β den Winkel des Vektors x um die optische Achse 11 an;
der Winkel β spielt wegen der fehlenden Rotationssymmetrie
der Anordnung hinsichtlich der Detektoren 234, 235 und
des Auskoppelelements 230 eine Rolle).
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Wenn
man eine „Landkarte” der Signale der Detektoren 234 und 235 als
Funktion der Winkel α und β erzeugt, lässt
sich daraus die Zentrierung des einfallenden TIRF-Strahls und somit
der genaue TIRF-Winkel bestimmen. Aus der Steilheit des TIRF-Übergangs,
d. h. der Steilheit der Abhängigkeit der Detektorsignale
vom Winkel α, lässt sich zudem bestimmen;, wie
gut die Lichtquelle 216 in der Pupillenebene 12 des
Objektivs fokussiert ist. Je besser der Fokus, um so „schneller” setzt
TIRF ein und umso schneller nimmt das Detektorsignal mit zunehmendem
Vektor x zu, wenn man sich dem kritischen Winkel annähert.
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Bei
festem Winkel α bzw. β hängt das Detektorsignal
in charakteristischer Weise von dem Abstand der reflektierenden
Probenfläche 18 von der Objektivfokusebene 38 ab.
Deshalb kann das Detektorsignal auch dazu herangezogen werden, eine
gewünschte Fokusposition zu finden und zu erhalten. Hierbei
stellt die Signalamplitude jedoch nur dann ein eindeutiges Maß für
die Fokusposition dar, wenn man genau weiß, wo man sich
auf der Polarkoordinatenlandkarte von x (bzw. α) und β in
der Ebene 250 befindet.
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Ferner
können die Detektorsignale zum Aufbau einer Lasersicherheitsschaltung
herangezogen werden, wobei das Vorwärtssignal (d. h. das
Signal des Detektors 235) mit dem Rückwärtssignal
(d. h. dem Signal des Detektors 234) verglichen wird, und erst
wenn die beiden Signale annähernd gleich groß sind,
d. h. wenn TIRF eingesetzt hat und das Laserlicht die Probe nicht
mehr verlassen und somit keinen Schaden mehr anrichten kann, wird
die Laserleistung auf den vollen gewünschten Wert gesteigert.
Davor, d. h. während der TIRF-Einstellung, wird sie automatisch
auf einem Wert belassen, der der sicheren Laserklasse 1 entspricht.
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Zur
Realisierung einer solchen Sicherheitsschaltung kann eine Steuereinheit 260 vorgesehen sein,
welche das Signal der beiden Detektoren 234, 235 vergleicht
und die Intensität der Lichtquelle 216 in Abhängigkeit
von dem Verhältnis des Signale der beiden Detektoren 234, 235 so
steuert, dass sich die Intensität der Lichtquelle nach
erfolgtem TIRF-Übergang erhöht, wobei der TIRF-Übergang
festgestellt wird, wenn die Signale der beiden Detektoren 234, 235 in
etwa gleich groß sind.
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Der
Vollständigkeit halber sei noch erwähnt, dass
bei den gezeigten Beispielen natürlich auch ein Detektor
zum Erfassen des Emissionslichts von der Probe und ein üblicherweise
zwischen der Tubuslinse 14 und der Objektivpupille 12 Hauptstrahlteiler vorgesehen
sind, die jedoch in den Figuren nicht dargestellt sind. Es versteht
sich, dass, wie bereits erwähnt, für die erfindungsgemäße
Fokusmessung keine separate Lichtquelle erforderlich ist, sondern
ein Teil des Lichts der für die Fluoreszenzmessung erforderlichen
Beleuchtungs/Anregungslichtquelle verwendet wird. Außerdem
sei erwähnt, dass die beschriebenen Anordnungen auch bei
Durchlichtmessungen zur Fokusfindung und Bewahrung herangezogen
werden können, man muss dazu lediglich für die
Dauer der Fokusmessung das Fluoreszenz-Anregungslicht einschalten.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - US 4025785 [0005]
- - DE 10234757 B4 [0005]
- - EP 0273717 A2 [0006]
- - WO 01/88599 A1 [0007]