WO2020078854A1

WO2020078854A1 - Verfahren und mikroskop zur bestimmung einer verkippung eines deckglases

Info

Publication number: WO2020078854A1
Application number: PCT/EP2019/077631
Authority: WO
Inventors: Christian Schumann
Original assignee: Leica Microsystems Cms Gmbh
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2020-04-23
Also published as: DE102018125995A1; EP3867682A1; US20210341281A1

Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zur Bestimmung einer Verkippung eines Deckglases (24) in einem Mikroskop (10, 78), das ein dem Deckglas (24) zugewandtes Objektiv (12) aufweist. Auf einer Oberfläche (64, 68) des Deckglases (24) werden mindestens drei Messpunkte, die eine Ebene aufspannen, definiert und für jeden der drei Messpunkte werden folgende Schritte durchgeführt: Lenken eines Messlichtbündels (34) durch das Objektiv (12) auf den Messpunkt; Erzeugen eines Reflexionslichtbündels (54), indem das Messlichtbündel (54) zumindest zum Teil an dem jeweiligen Messpunkt reflektiert wird; Lenken des Reflexionslichtbündels (54) durch das Objektiv (12) auf einen positionssensitiven Sensor (60); Erfassen des Einfallsortes des Reflexionslichtbündels (54) auf dem positionssensitiven Sensor (60); und Ermitteln des Abstands des jeweiligen Messpunktes von dem Objektiv (12) längs dessen optischer Achse (O3) auf Grundlage des erfassten Einfallsortes. Auf Grundlage der ermittelten Abstände wird eine Verkippung der durch die drei Messpunkte aufgespannten Ebene relativ zur optischen Achse (O3) des Objektivs (12) als Verkippung des Deckglases (24) bestimmt.

Description

Verfahren und Mikroskop zur Bestimmung einer Verkippung

eines Deckglases

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Verkippung eines Deckgla ses in einem Mikroskop, das ein dem Deckglas zugewandtes Objektiv aufweist. Die Er findung betrifft ferner ein Mikroskop mit einer Einrichtung zur Bestimmung einer Ver kippung eines Deckglases.

Die Qualität einer lichtmikroskopischen Abbildung mit Hilfe eines Objektivs hoher nu merischer Apertur wird stark durch die Lage eines Deckglases beeinflusst, das die abzu bildende Probe bedeckt. Beispielsweise werden durch eine Verkippung des Deckglases relativ zur optischen Achse des Objektives Abbildungsfehler induziert. Dabei führt eine Verkippung des Deckglases dazu, dass das der Abbildung dienende Detektionslicht schräg in das Objektiv fällt. Hierdurch entsteht eine Koma. Um eine wirksame Korrek tion der Koma, die durch eine Verkippung des Deckglases verursacht wird, zu ermögli chen, ist es wichtig, die Verkippung möglichst genau zu kennen.

Eine Messung der Verkippung des Deckglases kann taktil, d.h. mithilfe eines Messtas ters erfolgen. Dies ist jedoch mit einem hohen verfahrenstechnischen Aufwand ver bunden und erfordert das Einbringen des Messtasters in den Probenraum.

Zum Stand der Technik wird ferner auf DE 10 2010 030 430 Al verwiesen, worin eine triangulierende Autofokuseinrichtung für ein Mikroskop offenbart ist. Diese Autofokus einrichtung erzeugt ein Spaltbild auf der Probe, das auf einen positionssensitiven De tektor abgebildet wird. Über die durch den Detektor erfasste Einfallsposition wird der Autofokus gesteuert.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und ein Mikroskop anzugebenen, die eine einfache und präzise Bestimmung einer Verkippung eines Deckglases ermöglicht. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch ein Mikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 12 gelöst. Vorteilhafte Weiter bildungen finden sich in den abhängigen Ansprüchen.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient der Bestimmung einer Verkippung eines Deck glases in einem Mikroskop, das ein dem Deckglas zugewandtes Objektiv aufweist. Auf einer Oberfläche des Deckglases werden mindestens drei Messpunkte, die eine Ebene aufspannen, definiert. Es werden für jeden der drei Messpunkte folgende Schritte durchgeführt: Lenken eines Messlichtbündels durch das Objektiv auf den Messpunkt; Erzeugen eines Reflexionslichtbündels, indem das Messlichtbündel zumindest zum Teil an dem jeweiligen Messpunkt reflektiert wird; Lenken des Reflexionslichtbündels durch das Objektiv auf einen positionssensitiven Sensor; Erfassen des Einfallsortes des Reflexionslichtbündels auf dem positionssensitiven Sensor; und Ermitteln des Abstands des jeweiligen Messpunktes von dem Objektiv längs dessen optischer Achse auf Grundlage des erfassten Einfallsortes. Anschließend wird auf Grundlage der ermittel ten Abstände eine Verkippung der durch die drei Messpunkte aufgespannten Ebene relativ zur optischen Achse des Objektivs als Verkippung der Oberfläche des Deckglases bestimmt.

Erfindungsgemäß wird angenommen, dass die durch die mindestens drei Messpunkte aufgespannte Ebene koplanar zur genannten Oberfläche des Deckglases ist. Die Verkip pung dieser Ebene relativ zur optischen Achse des Objektivs spiegelt daher die Verkip pung des Deckglases wider. Jeder der mindestens drei Messpunkte ist jeweils durch drei Koordinaten bestimmt, von denen eine den zu bestimmenden Abstand des Mess punktes von dem Objektiv längs dessen optischer Achse angibt, während die beiden anderen Koordinaten die Lage des jeweiligen Messpunktes auf der Oberfläche des Deckglases festlegen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, die Verkippung des Deckglases inner halb des Mikroskops einfach und zuverlässig zu bestimmen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die mindestens drei Messpunkte defi niert, indem das Deckglas und das Objektiv quer zu dessen optischer Achse relativ zuei nander bewegt werden. Die Festlegung der Messpunkte kann nach Vorgabe einer Be dienperson oder automatisiert erfolgen. Beispielsweise können die Punkte definiert werden, während das Deckglas zum Suchen einer Probe quer zur optischen Achse des Objektivs bewegt wird.

Vorzugsweise wird das Deckglas mittels eines verfahrbaren Mikroskoptisches relativ zu dem Objektiv quer zu dessen optischer Achse bewegt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Messlichtbündel in einen Teilbereich einer Eintrittspupille des Objektivs geleitet, der gegenüber der Mitte der Eintrittspupille versetzt ist. Auf diese Weise wird die Eintrittspupille des Objektivs durch das Messlichtbündel dezentral unterleuchtet, wodurch das Messlichtbündel beim Austritt aus dem Objektiv schräg zu dessen optischer Achse gestellt wird. Die de zentrale Unterleuchtung der Eintrittspupille des Objektivs hat den Vorteil, dass achs- nahe Strahlanteile vermieden werden, die sogenannten Reflexe erster Ordnung, die am stärksten an den Flächenscheiteln der das Objektiv bildenden Linsen entstehen, verursachen und dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis verschlechtern. Das Reflexions lichtbündel wird vorzugsweise so zurück in das Objektiv geleitet, dass es in der der Ausbreitungsrichtung des Messlichtbündels entgegengesetzten Richtung einen ande ren Teilbereich der Eintrittspupille durchsetzt, der gegenüber dem vorgenannten Teil bereich der Eintrittspupille versetzt ist.

Es ist vorteilhaft, wenn das Messlichtbündel an der Oberfläche ein Messmuster erzeugt wird und das Messmuster durch das Reflexionslichtbündel auf den positionssensitiven Sensor abgebildet wird. So ist es beispielsweise möglich, das Messmuster in Form ei nes Bildes einer Spaltblende zu generieren, die der das Messlichtbündel emittierenden Lichtquelle vorgeordnet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet die Oberfläche des Deckglases, an der das Messlichtbündel zu Erzeugung des Reflexionslichtbündels reflektiert wird, mit ei nem angrenzenden optischen Medium eine teilreflektierende Grenzfläche. Insbeson dere ist das optische Medium ein Einbettmedium, das an die genannte Oberfläche des Deckglases grenzt.

In dieser Ausführungsform nutzt die an dem jeweiligen Messpunkt vorgenommene Ab standsmessung, auf der die erfindungsgemäße Ermittlung der Verkippung des Deckgla ses basiert, eine Teilreflexion des Messlichtbündels an der Oberfläche des Deckglases. Diese Teilreflektion wird dadurch verursacht, dass die Oberfläche mit dem an sie gren zenden optischen Medium, das einen anderen Brechungsindex als das Deckglas hat, eine Grenzfläche bildet, an der ein Sprung im Brechungsindex auftritt. Auf diese Weise ist es möglich, die Verkippung des Deckglases innerhalb des Mikroskops besonders ein fach und zuverlässig zu bestimmen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird auf Grundlage der mindestens drei Messpunkte die Ausrichtung eines Normalenvektors, der senkrecht zu der genann ten Ebene liegt, ermittelt. Daraus wird dann die Verkippung des Deckglases bestimmt. Insbesondere kann der durch den Normalenvektor und die optische Achse des Objek tivs eingeschlossene Winkel bestimmt werden. Durch diesen Winkel ist die Verkippung der durch die Messpunkte definierten Ebene und damit die Verkippung des Deckglases eindeutig quantifizierbar.

Vorzugsweise werden mehr als drei Messpunkte definiert, deren Abstände von dem Objektiv zur Bestimmung der Verkippung des Deckglases ermittelt werden. Je mehr Messpunkte auf der Oberfläche des Deckglases definiert werden, desto genauer kann die Verkippung der durch die Messpunkte festgelegten Ebene und damit die Verkip pung des Deckglases bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Deckglas zum Ausgleichen der ermit telten Verkippung verstellt. Alternativ kann die ermittelte Verkippung für die Berech nung einer Filterfunktion zur Inversion des Abbildungsvorganges verwendet werden, beispielsweise einer Dekonvolution oder einer quantitativen Phasenrekonstruktion.

Die Erfindung betrifft ferner ein Mikroskop, das ein Deckglas, ein dem Deckglas zuge wandtes Objektiv und eine Einrichtung zum Bestimmen einer Verkippung des Deckgla ses umfasst. Die Einrichtung ist ausgebildet, auf einer Oberfläche des Deckglases min destens drei Messpunkte, die eine Ebene aufspannen, zu definieren und für jeden die ser Messpunkte folgende Schritte durchzuführen: Lenken eines Messlichtbündels durch das Objektiv auf den Messpunkt; Erzeugen eines Reflexionslichtbündels, indem das Messlichtbündel zumindest zum Teil an dem jeweiligen Messpunkt reflektiert wird; Lenken des Reflexionslichtbündels durch das Objektiv auf einen positionssensitiven Sensor; Erfassen des Einfallsortes des Reflexionslichtbündels auf dem positionssensiti ven Sensor; und Ermitteln des Abstands des jeweiligen Messpunktes von dem Objektiv längs dessen optischer Achse auf Grundlage des erfassten Einfallsortes. Die Einrichtung ist ferner ausgebildet auf Grundlage der ermittelten Abstände eine Verkippung der durch die drei Messpunkte aufgespannten Ebene relativ zur optischen Achse des Ob jektivs als Verkippung der Oberfläche des Deckglases zu bestimmen.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Einrichtung eine Aperturblende mit einer Blendenöffnung auf, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse des Objek tivs angeordnet ist.

In einer speziellen Ausgestaltung hat die Einrichtung eine Lichtquelle, die das Mess lichtbündel im Infrarot-Wellenlängenbereich emittiert. Dies hat den Vorteil, dass das durch das Messlichtbündel an dem Deckglas erzeugte Messmuster für das menschliche Auge nicht sichtbar ist und somit die Beobachtung der Probe durch das Mikroskop nicht stört. Es ist jedoch ebenso möglich, ein Messlichtbündel im sichtbaren Wellenlän genbereich einzusetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der positionssensitive Sensor ein Zeilen sensor ist. Der Zeilensensor ist vorzugsweise derart ausgebildet, dass er die Intensitäts verteilung des Reflexionslichtbündels in seiner Gesamtheit erfassen kann. Alternativ kann der positionssensitive Sensor auch als Flächensensor, z.B. als zweidimensionale CCD-Kamera ausgeführt sein.

Vorzugsweise umfasst das Mikroskop Mittel zum Korrigieren der ermittelten Verkippung des Deckglases. Diese Mittel umfassen beispielsweise einen manuell oder motorisiert bewegbaren Mikroskoptisch.

Die erfindungsgemäße Einrichtung ist aufgrund ihrer vorliegend beschriebenen struk turellen und funktionellen Eigenschaften auch dazu geeignet, in dem Mikroskop als Au tofokuseinrichtung genutzt zu werden. Zudem bietet die Einrichtung aufgrund ihrer Ei genschaften die Möglichkeit, neben der Verkippung des Deckglases andere, die licht mikroskopische Abbildung beeinflussende Größen zu bestimmen, wie etwa die Dicke des Deckglases und/oder den Brechungsindex eines optischen Mediums.

Die Erfindung ist auf eine Vielzahl von Mikroskoptypen anwendbar, z.B. inverse oder aufrechte Durchlichtmikroskope.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Be schreibung, die die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren näher erläutert.

Es zeigen:

Figur 1 eine schematische Darstellung eines inversen Durchlichtmikroskops als ers tes Ausführungsbeispiel; Figur 2 eine zur Bestimmung der Verkippung des Deckglases bestimmte Einrich tung, die Teil des Mikroskops nach Figur 1 ist;

Figur 3 eine schematische Darstellung, die einen Probenraum des Mikroskops nach

Figur 1 zeigt;

Figur 4 eine durch einen positionssensitiven Detektor der Einrichtung nach Figur 2 erfasste Intensitätsverteilung;

Figur 5 eine schematische Darstellung, die eine durch drei Messpunkte festgelegte

Ebene zeigt;

Figur 6 ein Flussdiagramm, das eine spezielle Ausführungsform des erfindungsge mäßen Verfahrens zur Bestimmung der Dicke des Deckglases zeigt;

Figur 7 eine schematische Darstellung, die einen verschiebbaren Mikroskoptisch zeigt; und

Figur 8 eine schematische Darstellung eines aufrechten Durchlichtmikroskop, das ein zweites Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Mikroskops bil det.

Figur 1 zeigt ein Mikroskop 10 als erstes Ausführungsbeispiel, auf das die erfindungsge mäße Verkippungsbestimmung anwendbar ist.

Das Mikroskop 10 ist als inverses Durchlichtmikroskop ausgeführt. Es umfasst demnach ein Objektiv 12, das von unten einem in Figur 1 mit dem Bezugszeichen 14 versehenen Probenraum zugewandt ist, sowie eine Lichtquelle 16, die von oben auf den Proben raum 14 gerichtet ist. Das Mikroskop 10 weist ferner einen Tubus 18 mit einem Okular 20 auf, durch das eine Bedienperson ein durch das Objektiv 12 eingefangenes Proben bild betrachten kann. Zudem ist eine Steuereinheit 22 vorgesehen, welche die ver schiedenen Mikroskopkomponenten ansteuert.

In dem Probenraum 14 des Mikroskops 10 befindet sich ein Deckglas 24, das eine in Fi gur 1 nicht explizit dargestellten Probe bedeckt. Auf dem Deckglas 24 befindet sich ein optisches Medium 26, in das die Probe eingebettet ist und das im Weiteren als Einbett medium 26 bezeichnet wird. In dem Probenraum 14 ist ferner ein Immersionsmedium 28 angeordnet, das in Figur 1 von oben an das Objektiv 12 und von unten an das Deck glas 24 grenzt.

Das Mikroskop 10 weist ferner eine in Figur 1 allgemein mit dem Bezugszeichen 30 be- zeichnete Einrichtung auf, die dazu dient, die Verkippung des Deckglases 14 zu ermit teln. Die Einrichtung 30 ist in Figur 2 genauer dargestellt.

Wie in Figur 2 gezeigt, weist die Einrichtung 30 eine Lichtquelle 32 auf, die ein Mess lichtbündel 34 im Infrarot-Wellenlängenbereich emittiert. Die Lichtquelle 32 ist bei spielweise eine LED, die eine Spaltblende 33 aufweist, durch die das Messlichtbündel 34 auf eine Beleuchtungsoptik 36 gerichtet wird. Nach Durchtritt durch die Beleuch tungsoptik 36 fällt das Messlichtbündel 34 auf eine Aperturblende 38, die zwar mittig auf der optischen Achse Ol der Beleuchtungsoptik 36 positioniert ist, jedoch eine Blen denöffnung 39 aufweist, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse Ol der Be leuchtungsoptik 36 angeordnet ist. Die Blendenöffnung 39 der Aperturblende 38 be grenzt den Strahlquerschnitt des Messlichtbündels 34 derart, dass nur der in Figur 2 unterhalb der optischen Achse Ol der Beleuchtungsoptik 36 liegende Teil des Mess lichtbündels 34 die Aperturblende 38 in Richtung eines Umlenkprismas 40 passiert.

Das in seinem Strahlquerschnitt begrenzte Messlichtbündel 34 wird an dem Umlenk prisma 40 in eine Transportoptik 42 reflektiert, die aus einer längs ihrer optischen Achse 02 verschiebbaren Fokussierlinse 44, einer Le uchtfe Id blende 46 und einer wei teren Linse 48 gebildet ist. Nach Durchtritt durch die Transportoptik 42 fällt das Mess lichtbündel 34 auf einen dichroitischen Strahlteiler 50, der Licht im Infrarot-Wellenlän genbereich reflektiert, während er Licht im sichtbaren Bereich transmittiert. Durch den dichroitischen Spiegel 50 wird das Messlichtbündel 34 in Richtung des Objektivs 12 re flektiert. Das an dem dichroitischen Spiegel 50 reflektierte Messlichtbündel 34 verläuft dabei mit einem Parallelversatz zur optischen Achse 03 des Objektivs 12. Auf diese Weise wird das Messlichtbündel 34 in einen Teilbereich einer Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 geleitet, der gegenüber der optischen Achse 03 des Objektivs 12 und da mit gegenüber der Mitte der Eintrittspupille 52 seitlich versetzt ist (vgl. Figur 4). Die Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 wird somit dezentral unterleuchtet, was dazu führt, dass das Messlichtbündel 34 unter einem Winkel a schräg zur optischen Achse 03 in den Probenraum 14 gelenkt wird.

Der Einfachheit halber sind in der Darstellung nach Figur 2 das Einbettmedium 26 und das Immersionsmedium 28, die in dem Probenraum 14 von entgegengesetzten Seiten her an das Deckglas 24 grenzen, weggelassen. Das unter schrägem Einfall in den Pro benraum 14 geleitete Messlichtbündel 34 wird, wie weiter unten unter Bezugnahme auf Figur 4 genauer erläutert ist, an dem Deckglas 24 reflektiert, wodurch ein in das Objektiv 12 zurückgeleitetes Reflexionsbündel 54 entsteht.

Nach Durchtritt durch das Objektiv 12 fällt das Reflexionslichtbündel 54 auf den dich roitischen Spiegel 50, der das Reflexionslichtbündel 54 in die Transportoptik 42 lenkt. Nach Passieren der Transportoptik 42 fällt das Reflexionslichtbündel 54 auf das Um lenkprisma 40, welches das Reflexionslichtbündel 54 auf eine Detektoroptik 56 reflek tiert. Die Detektoroptik 56 richtet das Reflexionslichtbündel 54 auf ein Spektralfilter 58, das nur für Licht im Infrarot-Wellenlängenbereich durchlässig ist und Streulicht au ßerhalb dieses Wellenlängenbereichs blockiert. Das durch das Spektralfilter 58 trans- mittierte Reflexionslichtbündel 54 fällt schließlich auf einen positionssensitiven Detek tor 60, der im Stande ist, die Intensität des Reflexionslichtbündels 54 ortsaufgelöst zu erfassen.

In der Figur 2 ist der Vollständigkeit halber auch die über den dichroitischen Spiegel 50 realisierte Ankopplung des Tubus 18 an die Einrichtung 30 veranschaulicht. Demnach dient der dichroitische Spiegel 50 im vorliegenden Ausführungsbeispiel auch dazu, für die eigentliche mikroskopische Bildgebung genutztes, sichtbares Detektionslicht 62, welches das Objektiv 12 aus dem Probenraum 14 in Richtung des dichroitischen Spie gels 50 leitet, durch Transmission dem Tubus 18 zuzuführen.

Im Weiteren wird unter Bezugnahme auf die Figuren 3 bis 6 erläutert, wie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren im Wege einer Abstandsmessung an drei Messpunkten PI, P2 und P3 (vgl. Figur 5) eine Verkippung des Deckglases 24 gegenüber der opti schen Achse 03 des Objektivs 12 ermittelt wird.

In Figur 3 ist zunächst veranschaulicht, wie für jeden der Messpunkte PI bis P3 durch Reflexion des Messlichtbündels 34 das Reflexionslichtbündel 54 generiert wird, das er findungsgemäß dazu genutzt wird, den Abstand des jeweiligen Messpunktes von dem Objektiv 12 zu ermitteln. In Figur 3 ist der betrachtete Messpunkt mit Pi und der zuge hörige Abstand längs der optischen Achse 03 des Objektivs 12 mit zi bezeichnet (i = 1,2,3).

Gemäß Figur 3 wird das die Eintrittspupille 52 des Objektivs 12 dezentral unterleuch tende Messlichtbündel 34 durch das Objektiv 12 unter einem Winkel a schräg zur opti schen Achse 03 auf dem Objektiv 12 zugewandte, in Figur 3 mit 64 bezeichnete Vor derfläche des Deckglases 24 gelenkt. Da das Deckglas 24 und das an dessen Vorderflä che 64 grenzende Immersionsmedium 28 unterschiedliche Brechungsindizes aufwei sen, bilden die Vorderfläche 64 des Deckglases 24 und das daran angrenzende Immer sionsmedium 28 eine Grenzfläche, an der das einfallende Messlichtbündel 34 zum Teil reflektiert wird. Der an dieser Grenzfläche reflektierte Teil des Messlichtbündels 34 er zeugt das Reflexionslichtbündel 54, das zurück in das Objektiv 12 geleitet wird.

Figur 4 zeigt eine Intensitätsverteilung V, die das Reflexionslichtbündel 54 auf dem po sitionssensitiven Detektor 60 erzeugt. Dabei gibt die Abszisse des Diagramms nach Fi gur 4 den Einfallsort auf dem Detektor 60 und die Ordinate die an dem jeweiligen Ein fallsort gemessene Intensität wieder. Die Intensitätsverteilung V nach Figur 4 zeigt ei nen Peak P, dessen Lage Xi, die auf dem positionssensitiven Detektor 60 bezüglich ei ner Referenzlage Xref bestimmbar ist, ein Maß für den Abstand zi ist, den die Oberflä che 64 des Deckglases 24 längs der optischen Achse 03 von dem Objektiv 12 aufweist.

In der schematischen Darstellung nach Figur 5 ist veranschaulicht, dass die drei Mess punkte PI, P2 und P3 erfindungsgemäß so definiert werden, dass durch sie eine Ebene aufgespannt wird, deren Verkippung die zu ermittelnde Verkippung der Vorderfläche 64 gegenüber der optischen Achse 03 des Objektivs 12 widerspiegelt. Jeder der Mess punkte PI, P2 und P3 ist durch drei Koordinaten (xi, yi, zi) definiert (i=l,2,3). Dabei sind die Koordinaten xi, yi vorgegeben, während die Koordinate zi, die den Abstand des zu gehörigen Messpunktes Pi von dem Objektiv angibt, die erfindungsgemäß zu ermit telnde Größe darstellt. In dem Beispiel nach Figur 5 ist die optische Achse 03 des Ob jektivs 12 auf den Messpunkt PI ausgerichtet, was bedeutet, dass in diesem Beispiel der Abstand des Punktes PI bestimmt wird. Sollen die Abstandsbestimmungen für die beiden anderen Messpunkte P2 und P3 durchgeführt werden, so sie diese Messpunkte entsprechend anzufahren. Hierzu werden beispielsweise das Deckglas 24 und das Ob jektiv 12 quer zu dessen optischer Achse 03 gegeneinander bewegt, bis die optische Achse 03 auf den gewünschten Messpunkt P2 bzw. P3 eingestellt ist. In Figur 5 ist fer ner ein Normalenvektor N gezeigt, der senkrecht auf der durch die Messpunkte PI, P2 und P3 festgelegten Ebene steht. Der Normalenvektor N schließt mit der optischen Achse 03 des Objektivs einen Winkel ß ein, der die Verkippung der durch die Mess punkte PI, P2 und P3 festgelegten Ebene und damit der Vorderfläche 64 des Deckgla ses 24 angibt. Das Flussdiagramm nach Figur 6 zeigt ein Beispiel, wie das Verfahren zur Ermittlung der Verkippung des Deckglases 24 realisiert werden kann.

In einem ersten Schritt S1 werden die drei Messpunkte PI, P2, P3 auf der Oberfläche 64 des Deckglases 24 so definiert, dass durch die Punkte PI, P2 und P3 eine die Ober fläche 64 repräsentierende Ebene gemäß Figur 5 festgelegt ist.

In Schritt S2 wird der erste Messpunkt PI, sofern er nicht schon ohnehin eingestellt ist, so angefahren, dass die optische Achse 03 des Objektivs 12 auf den ersten Messpunkt PI ausgerichtet ist. Anschließend wird, wie oben unter Bezugnahme auf die Figuren 3 und 4 beschrieben, der Abstand zl des ersten Messpunktes PI von dem Objektiv 12 längs dessen optischer Achse 03 gemessen.

In Schritt S3 wird dann der zweite Messpunkt P2 angefahren, indem die optische Achse 03 des Objektivs 12 auf den Messpunkt P2 ausgerichtet wird, und der Abstand z2, den der zweite Messpunkt von dem Objektiv 12 aufweist, in gleicher Weise wie für den ers ten Messpunkt PI bestimmt.

In Schritt S4 wird der dritte Messpunkt P3 angefahren, indem die optische Achse 03 des Objektivs 12 auf den dritten Messpunkt ausgerichtet wird. Dann wird der Abstand z3, den der dritte Messpunkt P3 von dem Objektiv 12 aufweist, in gleicher Weise wie für die Messpunkte PI und P2 bestimmt.

In Schritt S5 wird dann auf Basis der in den Schritten S2, S3 und S4 durchgeführten Ab standsmessungen der Normalenvektor N bestimmt, der senkrecht auf der durch die drei Messpunkte PI, P2 und P3 festgelegten Ebene steht, und der Winkel ß bestimmt, den der Normalenvektor N mit der optischen Achse 03 des Objektivs 12 einschließt. Anhand des Winkels ß wird schließlich die Verkippung der Oberfläche 64 des Deckgla ses 12 ermittelt. Das Anfahren der verschiedenen Messpunkte PI, P2 und P3 kann beispielsweise mit tels eines rein schematisch in Figur 7 gezeigten Mikroskoptisches 86 erfolgen. Dieser lässt sich quer zur optischen Achse des Objektivs 12 verstellen, um die gewünschten Abstandsmessungen vorzunehmen.

Im Unterschied zur Ausführungsform nach Figur 1 ist bei dem in Figur 8 dargestellten Mikroskop 78 das Objektiv 12 oberhalb des Probenraums 18 angeordnet, während sich die Lichtquelle 16 unterhalb des Probenraums 18 befindet. Dementsprechend befindet sich das Immersionsmedium 28, das zum einen an das Objektiv 12 und zum anderen an das Deckglas 24 grenzt, oberhalb des Deckglases 24, während sich das Einbettmedium 26 unterhalb des Deckglases 24 angeordnet ist.

Die erfindungsgemäße Bestimmung der Verkippung des Deckglases 24 erfolgt bei dem Mikroskop 78 nach Figur 8 in gleicher Weise wie bei dem in Figur 1 gezeigten Mikro skop 10.

Die Erfindung wurde vorstehend anhand spezieller Ausführungsbeispiele erläutert. Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung nicht auf diese Ausführungsbeispiele be schränkt ist und eine Reihe von Abwandlungen möglich sind.

So wird in dem Beispiel nach Figur 3 das Messlichtbündel 34 durch die Grenzfläche teil reflektiert, die durch die Vorderfläche 64 des Deckglases 24 und das daran angren zende Immersionsmedium 28 gebildet ist. Es ist jedoch ebenso möglich, dass das Messlichtbündel 34 durch eine Grenzfläche teilreflektiert wird, die durch eine dem Ob jektiv 12 abgewandte rückseitige Fläche 68 des Deckglases 24 und das daran angren zende Einbettmedium 26 gebildet ist. Bezugszeichenliste

10 Mikroskop

12 Objektiv

14 Probenraum

16 Lichtquelle

18 Tubus

20 Okular

22 Steuereinheit

24 Deckglas

26, 28 optisches Medium 30 Einrichtung

32 Lichtquelle

34 Messlichtbündel 36 Beleuchtungsoptik 38 Aperturblende

40 Umlenkprisma

42 Transportoptik

44 Fokussierlinse

46 Leuchtfeldblende 50 Strahlteiler

52 Eintrittspupille

54 Reflexionslichtbündel 56 Detektoroptik

58 Spektralfilter

60 Detektor

62 Abbildungsstrahlengang

64, 68 Oberfläche

80, 82, 84 Messpunkt

N Normalenvektor 01, 02, 03 optische Achse VI, V2 Vektor a, ß Winkel

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur Bestimmung einer Verkippung eines Deckglases (24) in einem Mikroskop (10, 78), das ein dem Deckglas (24) zugewandtes Objektiv (12) auf weist,

dadurch gekennzeichnet, dass auf einer Oberfläche (64, 68) des Deckglases (24) mindestens drei Messpunkte (80, 82, 84), die eine Ebene aufspannen, definiert werden und für jeden der drei Messpunkte (80, 82, 84) folgende Schritte durch geführt werden:

Lenken eines Messlichtbündels (34) durch das Objektiv (12) auf den Mess- punkt,

Erzeugen eines Reflexionslichtbündels (54), indem das Messlichtbündel (34) zumindest zum Teil an dem jeweiligen Messpunkt reflektiert wird,

Lenken des Reflexionslichtbündels (54) durch das Objektiv (12) auf einen positionssensitiven Sensor (60),

Erfassen des Einfallsortes des Reflexionslichtbündels (54) auf dem positions- sensitiven Sensor (60), und

Ermitteln des Abstands des jeweiligen Messpunktes von dem Objektiv (12) längs dessen optischer Achse (03) auf Grundlage des erfassten Einfallsortes, und dass auf Grundlage der ermittelten Abstände eine Verkippung der durch die drei Messpunkte (80, 82, 84) aufgespannten Ebene relativ zur optischen Achse (03) des Objektivs (12) als Verkippung der Oberfläche (64, 68) des Deck glases (24) bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens drei Messpunkte (80, 82, 84) definiert werden, indem das Deckglas (24) und das Ob jektiv (12) quer zu dessen optischer Achse (03) relativ zueinander bewegt wer den.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Deckglas (24) mittels eines verfahrbaren Mikroskoptisches relativ zu dem Objektiv (12) quer zu dessen optischer Achse (03) bewegt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Messlichtbündel (40) in einen Teilbereich einer Eintrittspupille des Objektivs (12) geleitet wird, der gegenüber der Mitte der Eintrittspupille versetzt ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass durch das Messlichtbündel (34) an der Oberfläche (64, 68) ein Messmuster er zeugt wird und dass das Messmuster durch das Reflexionslichtbündel (54) auf den positionssensitiven Sensor (60) abgebildet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das auf den positi onssensitiven Sensor (60) abgebildete Messmuster in Form einer räumlichen Intensitätsverteilung erfasst wird, aus der Einfallort des Reflexionslichtbündels (54) bestimmt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (64, 68) des Deckglases (24), an der das Messlichtbündel (34) zu Er zeugung des Reflexionslichtbündels (54) reflektiert wird, mit einem angrenzen den optischen Medium (26, 28) eine teilreflektierende Grenzfläche bildet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Me dium ein Einbettmedium (26) ist, das an die genannte Oberfläche (64, 68) des Deckglases (24) grenzt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf Grundlage der mindestens drei Messpunkte (PI, P2, P3) die Ausrichtung eines Normalenvektors (N), der senkrecht zu der genannten Ebene liegt, ermittelt und daraus die Verkippung des Deckglases (24) bestimmt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als drei Messpunkte (80, 82, 84) definiert werden, deren Abstände von dem Objektiv (12) zur Bestimmung der Verkippung des Deckglases (24) ermit telt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Deckglas (24) zum Ausgleichen der ermittelten Verkippung verstellt wird.

12 Mikroskop (10, 78), umfassend:

ein Deckglas (24),

ein dem Deckglas (24) zugewandtes Objektiv (12), und

eine Einrichtung (30) zum Bestimmen einer Verkippung des Deckglases (24), dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (30) ausgebildet ist, auf einer Oberfläche (64, 68) des Deckglases (24) mindestens drei Messpunkte (PI, P2, P3), die eine Ebene aufspannen, zu definieren und für jeden dieser Messpunkte (PI, P2, P3) folgende Schritte durchzuführen:

Erzeugen eines Reflexionslichtbündels (54), indem das Messlichtbündel (54) zumindest zum Teil an dem jeweiligen Messpunkt (80, 82, 84) reflektiert wird,

Erfassen des Einfallsortes des Reflexionslichtbündels (54) auf dem positions- sensitiven Sensor (60),

und Ermitteln des Abstands des j eweiligen Messpunktes (P 1 , P2, P3) von dem Objektiv (12) längs dessen optischer Achse (03) auf Grundlage des erfassten Einfallsortes, und dass die Einrichtung (30) ausgebildet ist, auf Grundlage der ermittelten Ab stände eine Verkippung der durch die drei Messpunkte (PI, P2, P3) aufge spannten Ebene relativ zur optischen Achse (03) des Objektivs (12) als Verkip pung der Oberfläche (64, 68) des Deckglases (24) zu bestimmen.

13. Mikroskop (10, 78) nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (30) eine Aperturblende (38) mit einer Blendenöffnung aufweist, die dezentriert mit Abstand zur optischen Achse (03) des Objektivs (12) angeordnet ist.

14. Mikroskop (10, 78) nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (30) eine Lichtquelle (18) hat, die das Messlichtbündel (34) im Infrarot-Wellenlängenbereich emittiert.

15. Mikroskop (10, 78) nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der positionssensitive Sensor (60) ein Zeilensensor ist.