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Die Erfindung bezieht sich auf Massenspektrometer mit Lasern für die Erzeugung von Ionen von Analytmolekülen durch matrixunterstützte Laserdesorption für massenspektrometrische Analysen verschiedenartiger Zielsetzungen.
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Die Erfindung stellt Massenspektrometer mit Lasersystemen bereit, die Laserlichtpulse mit mindestens zwei verschiedenen Pulsdauern liefern können. Durch die Dauer der Laserlichtpulse lassen sich die Charakteristika der Ionisierung der Analytmoleküle, insbesondere das Auftreten der Fragmentierungsarten ISD (in-source decay) und PSD (post source decomposition), deren Fragmentionenspektren verschiedenartige Informationen liefern, auf die analytische Zielsetzung abstimmen.
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Stand der Technik
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Eine bedeutende Ionisierungsart für Biomoleküle ist die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI), die durch M. Karas und K. Hillenkamp vor etwa zwanzig Jahren entwickelt wurde. MALDI ionisiert die Biomoleküle, die sich in hoher Verdünnung in einer Mischung mit Molekülen einer Matrixsubstanz in Proben auf Probenträgern befinden, durch den Beschuss mit Laserlichtpulsen.
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MALDI steht in Konkurrenz zur Ionisierung durch Elektrosprühen (ESI), das in einer Flüssigkeit gelöste Analytmoleküle ionisiert und daher leicht mit Separationsverfahren wie Flüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese gekoppelt werden kann. Obwohl zur Zeit mehr Massenspektrometer mit Elektrosprüh-Ionenquellen ausgerüstet sind als mit MALDI-Ionenquellen, besitzt MALDI heute durch die Entwicklung moderner Laser- und Präparationstechniken viele Vorteile gegenüber ESI. Auf einem Probenträger können Hunderte von Proben aufgebracht werden. Dafür stehen Pipettierroboter zur Verfügung. Der Transport einer benachbarten Probe mit dem Probenträger in den Fokus eines UV-Pulslasers dauert nur Bruchteile von Sekunden, für die verschiedenartigen Analysenverfahren, die auf diese Probe angewendet werden sollen, steht dann so viel Zeit wie immer nötig zur Verfügung, nur begrenzt durch einen vollständigen Verbrauch der Probe. Das unterscheidet MALDI sehr vorteilhaft von der Elektrosprüh-Ionisierung, die nur einen sehr langsamen Probenwechsel bietet, und, bei Kopplung mit der Chromatographie, eine Beschränkung der Analysenzeit auf die Dauer des chromatographischen Peaks erzwingt. Außerdem liefert MALDI auch von sehr schweren Analytmolekülen nur einfach protonierte Molekülionen, was die Analyse von Biomolekülgemischen außerordentlich einfach macht, im Gegensatz zu den breit gefächert vielfach protonierten Molekülionen, die ESI liefert.
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So ist die MALDI-Untersuchung von Peptiden, die durch Flüssigkeitschromatographie getrennt und auf MALDI-Probenträger aufgebracht wurden, im Vormarsch („HPLC-MALDI”). Besonders interessant ist auch die Verwendung von MALDI in der bildgebenden Massenspektrometrie von histologischen Dünnschnitten, mit der die örtliche Verteilung einzelner Proteine, aber auch einzelner Pharmaka oder ihrer Metabolite gemessen werden kann. Ein weiterer Einsatzbereich von MALDI ist die Identifizierung von Mikroben anhand ihrer Proteinprofile, ein Verfahren, dass sich wegen seiner hohen Analysengeschwindigkeit und seiner überragenden Richtigkeit der Identifizierungen augenblicklich schnell ausbreitet.
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MALDI ist besonders ideal für die Identifizierung von tryptisch verdauten Proteinen, die zuvor durch 2D-Gelelektrophorese oder andere Verfahren getrennt wurden, und deren getrennte Fraktionen zu getrennten MALDI-Proben verarbeitet wurden. Für die Verarbeitung sind entsprechende Roboter erhältlich. Die Massenspektren der Verdaugemische zeigen praktisch ausschließlich die einfach protonierten Verdaumoleküle, deren Massen sich in entsprechenden Massenspektrometern präzise bestimmen lassen. Daraus wiederum bestimmen marktgängige Computerprogramme mit Hilfe von Proteindatenbanken die Ausgangsproteine.
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Für weitergehende Charakterisierungen dieser Verdaupeptide oder auch anderer Proteine, beispielsweise im Blick auf Sequenzfehler oder posttranslationale Modifikationen (PTM), bietet MALDI zusätzlich zwei hoch interessante Verfahren zur Erzeugung und Messung von Tochterionen ausgewählter Elternionen an: Eines der Verfahren basiert auf der Spontan-Fragmentierung (ISD = in-source decay), die unter Erhalt aller Bindungen zu PTM-Seitenketten vorwiegend c- und z-Fragmentionen liefert; das andere Verfahren dagegen basiert auf einer „ergodischen” (oder „thermischen”) Fragmentierung, die mit Verlust aller Seitenketten hauptsächlich b- und y-Fragmentionen des reinen Aminosäurenrückgrats ergibt (PSD = post-source decomposition). Für Strukturanalysen ist es außerordentlich wertvoll, beide Arten von Tochterionenspektren von derselben Probe aufnehmen zu können, da ein Vergleich sowohl die Sequenz der Aminosäuren wie auch die Positionen und Massen der Seitenketten (PTM) zu lesen gestattet. Darüber hinaus bietet MALDI sogar die Möglichkeit, ISD-Fragmentionen weiter zu fragmentieren, wobei die „Enkelionenspektren” Informationen über die Strukturen von besonderen Modifikationsgruppen geben, beispielsweise über die Polysaccharide der Glykosylierungen.
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Für MALDI wurden früher vorwiegend preiswerte UV-Stickstoff-Laser verwendet, die Laserlichtpulse von wenigen Nanosekunden Länge liefern und deren Lichtstrahlen durch Linsen auf einen Fokusfleck von etwa 50 bis 200 Mikrometer Durchmesser abgebildet werden. Da der „Fokusfleck” auf der Probe durch absichtliche Einstellung nicht dem wahren Fokusdurchmesser des Laserlichtstrahls entspricht, spricht man hier besser von „Spot” und „Spotdurchmesser”. Die Stickstoff-Laser haben jedoch eine geringe Lebensdauer von nur einigen Millionen Laserlichtpulsen, was für eine Hochdurchsatz-Analytik sehr hinderlich ist; heute werden an vielen Stellen Festkörper-Laser mit mehr als tausendfacher Lebensdauer eingesetzt, die aber besondere Maßnahmen für die Strahlformung erfordern, wie weiter unten näher erläutert werden wird.
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Die Ionen jedes einzelnen Laserlichtpulses werden heute noch überwiegend in besonders dafür konstruierten MALDI-Flugzeitmassenspektrometern (MALDI-TOF-MS) axial in eine Flugzeitstrecke hinein beschleunigt und nach Durchlaufen der Flugstrecke einem Detektor zugeführt, der die massenabhängige Ankunftszeit der Ionen und ihre Menge misst und die digitalisierten Messwerte als Flugzeitspektrum speichert. Dabei wurden früher Wiederholfrequenzen der Laserlichtpulse von 20 bis zu 200 Hertz verwendet, heute sind MALDI-TOF-Massenspektrometer mit bis zu 2 Kilohertz Lichtpulsfrequenz erhältlich. Es werden jedoch heute auch zunehmend Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF) mit MALDI-Ionenquellen ausgerüstet; diese nehmen Massenspektren mit Wiederholungsraten von 5 bis 10 Kilohertz auf. In beiden Arten von Massenspektrometern werden Detektoren für die Ionenströme eingesetzt, die aus jeweils einem speziellen Sekundärelektronen-Vervielfacher (SEM) mit nachgeschaltetem Transientenrekorder besteht, wobei der Transientenrekorder einen mit 2 bis 4 Gigahertz sehr schnell arbeitenden Analog-zu-Digital-Wandler (ADC) mit meist nur 8 bit Wandlungsbreite enthält. Die Massenspektren können 100 bis 200 Mikrosekunden lang sein, also 200000 bis 800000 Messwerte umfassen. Die Messwerte von einigen Hundert oder Tausend so aufeinanderfolgend gemessener Flugzeitspektren der Ionen werden zu einem Summenspektrum addiert, dieses wird einem Computerprogramm zur Peak-Erkennung unterworfen, und die Liste mit den Flugzeit-Peaks wird über eine Kalibrierkurve in eine Liste der Massen m und ihrer Intensitäten i umgewandelt. Diese Liste oder ihre graphische Darstellung i = f(m) wird als „Massenspektrum” verstanden. Die Massenspektren beider Arten von Massenspektrometern können Massenauflösungen von R = m/Δm = 20000 bis 50000 erreichen, wobei Δm die Breite des Ionenpeaks in halber Höhe ist.
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Wenn im Folgenden einfach von der „Aufnahme eines Massenspektrums” die Rede ist, so ist damit stets die beschriebene Aufnahme von Hunderten oder Tausenden von Einzelspektren und deren Zusammenfassung zu einem Summenspektrum gemeint. Das trifft für Massenspektren von Molekülionen ebenso zu wie für Tochterionenspektren.
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Wenn der Begriff „Masse der Ionen” oder auch nur einfach von „Masse” in Verbindung mit Ionen verwendet wird, so ist hier stets die „elementarladungsbezogene Masse” m/z gemeint, also die physikalische Masse m der Ionen geteilt durch die dimensionslose und absolut genommene Anzahl z der positiven oder negativen Elementarladungen, die dieses Ion trägt. Die elementarladungsbezogene (oder kürzer „ladungsbezogene”) Masse m/z wird auch oft etwas unschön als „Masse-zu-Ladungs-Verhältnis” bezeichnet, obwohl sie die Dimension einer Masse hat.
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Die matrixunterstützte Laserdesorption geht (mit wenigen Ausnahmen) von festen Probenpräparationen auf einem Probenträger aus. Die Proben bestehen im Wesentlichen aus kleinen Kriställchen der Matrixsubstanz, der in geringen Anteilen (nur etwa ein hundertstel Prozent) Moleküle der Analytsubstanzen beigemischt sind. Die Analytmoleküle sind einzeln in das Kristallgitter der Matrixkristalle eingebaut oder befinden sich in Kristallgrenzflächen. Die so präparierten Proben werden mit kurzen Pulsen von UV-Laserlicht bestrahlt. Die Dauer der Pulse beträgt üblicherweise einige Nanosekunden und hängt vom verwendeten Laser ab. Dabei entstehen Verdampfungsplasmen, die neben neutralen Molekülen sowohl Ionen der Matrixsubstanz wie auch einige Analyt-Ionen enthalten. Es steht zu vermuten, dass zumindest in der normalen Proteinanalytik der weitaus größte Anteil der Analytionen in reaktiver Weise im sehr dichten Plasma durch Protonenübertragung von den meist sauren Matrixmolekülen zu den Analytmolekülen gebildet wird, Das Plasma dehnt sich über einige Hundert Nanosekunden in das umgebende Vakuum hinein aus, nimmt sehr schnell in seiner Dichte ab und kühlt sich dabei adiabatisch ab, wodurch alle Plasmateilchen von weiteren Reaktionen abgehalten werden.
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Das Verhältnis von Analytmolekülen zu Matrixmolekülen beträgt üblicherweise höchstens etwa eins zu zehntausend, um die Analytmoleküle räumlich getrennt zu halten, so dass sie keine Dimerionen bilden. Dabei können aber die Analytsubstanzen ein Gemisch bilden, in dem zwischen den verschiedenen zu messenden Analytsubstanzen Konzentrationsverhältnisse herrschen können, die einige Größenordnungen überdecken. Die Messung der Analytmoleküle erfordert dann einen hohen dynamischen Messbereich des Massenspektrometers. Da der dynamische Messbereich im einzeln aufgenommenen Massenspektrum durch den Transientenrekorder meist auf 8 bit, also auf Messwerte im Umfang von 1 bis 256, beschränkt ist, kann der hohe dynamische Messbereich nur über die Aufnahme von Hunderten oder Tausenden von Einzelmassenspektren hergestellt werden.
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Es besteht in der MALDI-Massenspektrometrie eine hohe Kunst darin, durch Einstellung der Detektor-Verstärkung und durch Einstellung der MALDI-Bedingungen die 8 bit Wandlungsbreite des Transientenrekorders optimal auszunutzen, ohne diesen Messbereich durch Übersättigung zu verlassen oder durch Untersteuerung alle einzeln gebildeten Ionen unentdeckt zu verlieren. Da die Ausbeute an Sekundärelektronen beim ersten Aufprall eines Ions auf den Sekundärelektronenverstärker einer Poisson-Verteilung mit einem Mittelwert von etwa 2 bis 3 Elektronen genügt, ist die Verstärkung des Sekundärelektronen-Verstärkers dann optimal eingestellt, wenn ein einzelnes Ion im Mittel ein Signal von etwa 2,5 Zähleinheiten („Counts”) des ADC im Transientenrekorder erzeugt; der Messbereich für Ionen, die im Messzeitintervall des ADC von 0,5 oder 0,25 Nanosekunden den Detektor erreichen, beträgt dann 1:100. Da ein Ionensignal für Ionen gleicher Masse mehrere Messzeitintervalle überstreicht, dürfen sich in einem Ionensignal mit Ionen der gleichen Masse nicht mehr als wenige Hundert Ionen befinden, was durch die Einstellung der MALDI-Bedingungen erreicht werden muss. Die optimale Einstellung der MALDI-Bedingungen erfordert dabei sehr viel Wissen über die Einflüsse der Laserlicht-Parameter auf die MALDI-Prozesse.
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Es wird hier die weitere Beschreibung auf UV-Laserlicht eingeschränkt, obwohl es immer wieder Ansätze für IR-MALDI gibt. Durch die Einschränkung auf UV-Laserlicht soll die Anwendung der Erfindung auf Laser anderer Wellenlängen, beispielsweise IR-Laser, jedoch nicht ausgeschlossen werden.
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Durch die verwendeten Matrix-Substanzen, meist aromatische Säuren, ist einer der Parameter für das Laserlicht bereits weitgehend festgelegt: die Wellenlänge des UV-Lichts. Es haben sich Wellenlängen zwischen 330 und 360 Nanometer bewährt, die von den aromatischen Gruppen der Matrix-Substanzen gut absorbiert werden. Stickstoff-Laser liefern Licht der Wellenlänge λ = 337 nm, die meist verwendeten Neodym-YAG-Laser mit Verdreifachung der Energie eine solche von λ = 355 nm. Die Lichtpulse dieser beiden Wellenlängen haben anscheinend etwa die gleiche Wirkung auf die MALDI-Prozesse, genaueres ist nicht bekannt. Durch die Wellenlänge des Lichtes und den Absorptionskoeffizienten der Matrixsubstanz ist auch die Eindringtiefe der Laserstrahlung in das feste Material der Matrixkristalle festgelegt. Die Intensität der Laserstrahlung fällt beim Eindringen mit einer Halbwertstiefe von etwa einigen zehn bis zu einigen hundert Nanometern ab.
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Es sind neben UV-Wellenlänge und Eindringtiefe im Wesentlichen drei weitere Parameter, die den Laserlichtpuls auf der Probe charakterisieren:
- (1) die Gesamtenergie des Laserlichtpulses, für gewöhnlich gemessen in Mikrojoule (μJ),
- (2) die Energiedichte (Fluenz), also die Energie pro Flächeneinheit im Laserspot (oder in mehreren synchron erzeugten Laserspots), beispielsweise gemessen in Nanojoule pro Quadratmikrometer (nJ/μm2), und
- (3) die Leistungsdichte an der Oberfläche der Probe, also die Energiedichte pro Zeiteinheit, die durch die Länge des Laserlichtpulses bestimmt wird. Diese kann beispielsweise in Nanojoule pro Quadratmikrometer und Nanosekunde gemessen werden (nJ/(μm2 × ns)). Letztere stellt sich in unseren Untersuchungen als besonders wichtig heraus: Laserlichtpulse gleicher Energie, aber verschiedener Dauer haben durchaus nicht die gleiche Wirkung.
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In dem sehr detailreichen Review-Artikel „The Desorption Process in MALDI” von Klaus Dreisewerd (Chem. Rev. 2003, 103, 395–425) sind Arbeiten über die Einflüsse vieler Parameter wie Spotdurchmesser, Laserlichtpulsdauer oder Energiedichte auf die Desorption und die Entstehung der Matrix-Ionen und der Analyt-Ionen referiert. Obwohl die Einflüsse vieler dieser Parameter nicht voneinander unabhängig sind, sind kaum jemals sorgfältig alle Parameter gegeneinander variiert worden. So wurde beispielsweise berichtet, dass die Laserlichtpulslänge zwischen 0,55 und 3,0 Nanosekunden keinen Einfluss auf die Ionenbildung habe. Dabei wurde aber nicht der Spotdurchmesser variiert oder auch nur angegeben. Für variierende Spotdurchmesser wurde dagegen die Schwelle der Energiedichte für das erste Auftreten von Ionen untersucht, ohne aber das Profil der Energiedichte im Laserspot zu untersuchen, das nach eigenen Untersuchungen von außerordentlich hoher Bedeutung ist. Diese Schwelle soll übrigens nach dieser Literaturstelle für kleiner werdende Spotdurchmesser sehr stark ansteigen: für Spotdurchmesser von etwa 10 Mikrometer soll man etwa die zehnfache Energiedichte (Fluenz) wie für Spotdurchmesser von 200 Mikrometern brauchen. Wir können das für diese Spotdurchmesser nicht bestätigen, wenn auch für wesentlich kleinere Spotdurchmesser ein Anstieg der Schwellenenergiedichte zu erwarten ist, weil für winzige Spots zu viel Energie zu schnell seitlich in die Umgebung abfließen kann. Über den Einfluss von Spotdurchmesser und Laserpulslänge auf die Art der Ionisierung, insbesondere auf die Fragmentierung der Analytmoleküle ist in der Literatur anscheinend wenig bekannt.
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Die bisherigen Untersuchungen des MALDI-Prozesses waren aber durch Präparationsverfahren für die Proben beeinträchtigt, die nicht reproduzierbar waren. Es wurden im Allgemeinen einfach Tröpfchen mit gelösten Matrix- und Analytmolekülen auf die Probenträgerplatte aufgetragen und eingetrocknet. Diese Proben waren extrem inhomogen, man musste regelmäßig auf der Probe nach Stellen („hot spots”) suchen, die Analytmoleküle enthielten, um so eine Analyse dieser Substanzen vornehmen zu können. An ein quantitatives Arbeiten war nicht zu denken. Die meisten Untersuchungen des MALDI-Prozesses wurden mit diesen Proben vorgenommen, was viele Ungereimtheiten dieser Untersuchungen erklären mag.
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Inzwischen gelingt es für einige nicht wasserlösliche Matrixsubstanzen, beispielsweise für α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (CHCA), sehr reproduzierbar Dünnschichten herzustellen, die aus nur einer einzigen Schicht von dicht an dicht liegenden Kristallen mit nur etwa einem Mikrometer Durchmesser bestehen. Auf diese trockene Dünnschicht von Matrixkristallen wird dann eine überwiegend wässerige Lösung von Analytmolekülen aufgebracht, wobei die Matrixkristalle die Analytmoleküle oberflächlich binden, ohne sich dabei aufzulösen. Das überschüssige Lösungsmittel kann dann nach einer halben oder ganzen Minute wieder abgesaugt werden, wodurch viele Verunreinigungen, wie beispielsweise Salze, entfernt werden. Es kann dabei aber auch ein Anteil überschüssiger Analytmoleküle entfernt werden, was bei quantitativen Untersuchungen zu berücksichtigen ist. Die oberflächlich adsorbierten Analytmoleküle können nachträglich in die Matrixkriställchen eingelagert werden, indem nach dem Trocknen ein organisches Lösungsmittel aufgebracht wird, das die Matrixkriställchen anlöst. Nach dem Verdampfen dieses Lösungsmittels hat man eine sehr homogene Probe, die an jeder Stelle mit geringen statistischen Schwankungen die gleichen Ionenströme mit den gleichen analytischen Ergebnissen liefert. Inzwischen werden mit Dünnschichten von CHCA vorpräparierte Probenträgerplatten kommerziell hergestellt. Für die MALDI-Prozesse, die an diesen Dünnschichtproben ablaufen, wurden noch keine ausreichenden Untersuchungen veröffentlicht.
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In der zitierten Arbeit von Dreisewerd sind mehrere Messkurven wiedergegeben, die zeigen, dass die Ausbeute an Analytionen, bezogen auf die Anzahl der eingesetzten Analytmoleküle, über mehrere Zehnerpotenzen mit höherer Potenz (etwa 6. bis 7. Potenz) der Energiedichte der Laserstrahlung nichtlinear ansteigt, ab einer Schwelle der Energiedichte, an der die ersten Analytionen überhaupt auftauchen. Diese mehrfach bestätigten Messungen sind sehr interessant. Nimmt man an, dass der Abtrag der Substanz zur Energiedichte proportional ist, so sollte der Ionisierungsgrad der Analytmoleküle und damit die Probenausnutzung mit der Energiedichte mit dieser höheren Potenz ansteigen. Man müsste also durch Verkleinerung des Laserspots bei konstant gehaltener Gesamtenergie des Laserlichtpulses die Ausbeute an Analytionen erhöhen können. Interessanterweise konnte das für Stickstoff-Laser, mit denen die meisten Untersuchungen gemacht wurden, nicht bestätigt werden. Wie eigene Untersuchungen zeigen konnten, liegt der Grund darin, dass der Stickstoff-Laser kein homogenes Energiedichteprofil hat, sondern in jedem Laserschuss nur einen oder wenige Mikrospots hoher Energiedichte liefert, deren Lage aber von Schuss zu Schuss variiert. Bei Verringerung des Spotdurchmessers durch Fokussierung des Laserlichtstrahls ändert sich aber nicht der Durchmesser der Mikrospots, weil diese an der Grenze der Fokussierbarkeit der Linsensysteme liegen. Damit ändert sich auch nicht die Energiedichte in diesen Mikrospots. Die Mikrospots haben aber Durchmesser, die unter denen für eine optimale Ionenausbeute liegen.
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Das ist bei Festkörper-Lasern völlig anders. Sie liefern ein glattes Energiedichteprofil quer über den mit dem Linsensystem eingestellten Laserspot. Das Energiedichteprofil hat in etwa die Form einer Gauß-Verteilung. Mit der Einführung von Festkörper-Lasern in die MALDI-Technik statt der bisher verwendeten Stickstoff-Laser musste man nun überraschend feststellen, dass das glatte Strahlprofil dieser Festkörperlaser die Ionenausbeute an Dünnschicht-Präparationen verringerte. Nach eigenen Untersuchungen liegt der Grund darin, dass bei einer Einstellung der Energiedichte für eine optimale Ausnutzung des dynamischen Messbereichs des Ionendetektors die Ionenausbeute nur wenig über der Schwelle liegt. Es wurde daher ein Verfahren zur inhomogenen Strahlprofilierung entwickelt, die die Ionenausbeute sogar noch über die Ionenausbeute der Stickstoff-Laser hinaus erhöhte (A. Haase et al.,
DE 10 2004 044 196 A1 ;
GB 2 421 352 A ;
US 7 235 781 C1 ). Hier kann man also durch Optimierung der Anzahl und der Durchmesser der Laserspots eine Erhöhung der Ionenausbeute erreichen. Damit hat man ein Mittel an der Hand, durch Profilierung des Laserstrahls gleichzeitig eine hohe Ausbeute an Analytionen, gemessen an der originären Anzahl der Analytmoleküle in der Probe, und eine optimale Anpassung an den Messbereich des Transientenrekorders zu erreichen.
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Menzel et al. (Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2002, 13, 975–984) untersuchten den Einfluss der Laserpulsdauer auf die matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisation bei Verwendung von Laserlicht aus dem Infrarot-Wellenlängenbereich.
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Meffert und Grotemeyer beschreiben in einer Fachpublikation (International Journal of Mass Spectrometry, 210/211 (2001), 521–530) Zerfälle hervorrufende Protonentransferreaktionen bei Clusterionen aromatischer Carboxylsäuren, die Aminosäuren aufweisen.
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Aufgabe der Erfindung
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Es ist die Aufgabe der Erfindung, MALDI-Massenspektrometer bereitzustellen, die sowohl Massenspektren von ISD-Spontanfragmenten wie auch PSD-Tochter- oder ISD-Enkelionenspektren optimal mit guter Ausbeute und geringem Probenverbrauch zu messen gestatten.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung beruht auf der Beobachtung, dass die Leistungsdichte und Laserlichtpulsdauer einen großen Einfluss auf die Art der Fragmentierung haben, ganz im Gegensatz zur Bemerkung bei Dreisewerd, dass die Laserlichtpulslänge zwischen 0,55 und 3,0 Nanosekunden keinen Einfluss auf die Ionenbildung habe.
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Die Erfindung besteht darin, im Massenspektrometer Lasersysteme einzusetzen, die Laserlichtpulse verschiedener Dauer liefern. Günstig, aber nicht notwendig ist ein Lasersystem mit einer kontinuierlichen Einstellbarkeit der Laserlichtpulslängen; jedoch reicht aufgabengemäß bereits ein Lasersystem mit zwei Laserlichtpulsdauern aus.
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Die Dauern der Laserlichtpulse sollen mindestens von einer Nanosekunde bis zu drei Nanosekunden reichen. Der Erfindung entspricht bereits ein Lasersystem, das zwei Laserlichtpulse mit Dauern von etwa einer Nanosekunde und von etwa drei Nanosekunden liefert. Die kurzen Laserlichtpulse von eine Nanosekunde Dauer liefern bei extrem geringem Probenverbrauch hervorragende ISD-Fragmentionenspektren, die langen haben einen erhöhten Probenverbrauch, ermöglichen aber die Messung von PSD-Tochterionenspektren.
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Bisher sind die optimalen Laserlichtpulsdauern für die verschiedenartigen Prozesse noch nicht genügend genau bekannt. Es kann daher noch besser sein, wenn die kurzen Laserlichtpulse eine Dauer von nur 0,5 Nanosekunden oder darunter haben. Zu längeren Laserlichtpulsen hin ist bekannt, dass Laserlichtdauern von 5, 8 oder 10 Nanosekunden gute PSD-Fragmentionen liefern. Es ist zu erwarten, dass vorteilhaft auch ein Lasersystem verwendet werden kann, das Laserlichtpulse mit zeitlicher Modulation liefert, beispielsweise mit einer hohen Leistung in der ersten Nanosekunde und geringerer Leistung in den weiteren Nanosekunden. Eine besondere Art der Modulation besteht darin, dass zwei oder mehr Laserlichtpulse nacheinander im Abstand von Nanosekunden geliefert werden.
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Es gibt sehr viele Möglichkeiten der technischen Realisierbarkeit, die dem Laserfachmann weitgehend bekannt sind, da es in der Lasertechnik bereits Lasersysteme variabler Laserlichtpulsdauern für andere Anwendungen gibt, allerdings bisher nicht im Nanosekundenbereich. Eine sehr einfache Möglichkeit ist die Verwendung zweier Lasereinheiten, die jeweils Laserlichtpulse verschiedener Pulsdauern liefern. Es ist vorteilhaft, wenn sich die beiden Laser synchron mit nur geringer Fluktuation der Startzeiten starten lassen, um eine zeitlich modulierte Leistungsdichte zu erzeugen. Die beiden Lasereinheiten können auch in einem Gehäuse zusammengefasst sein und die beiden Laserresonatoren können möglicherweise sogar mit dem gleichen Pumpsystem bepumpt werden. Weitere Möglichkeiten bestehen in der Anwendung von Pockelzellen als Güteschalter (Q-switch), deren Öffnungszeiten und Transparenzen sich steuern lassen. Auch über Modenauswahl, parallele Schaltung von verzögernden Lichtleitern, oder Umschaltung zwischen verschiedenen Laserkristallen können Laserlichtpulse verschiedener Laserlichtdauer erzeugt werden.
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Da in den Forschungs- oder auch Routinelaboratorien für Proteinuntersuchungen der verschiedensten Art aus Kostengründen oft nur ein einziges Massenspektrometer angeschafft werden kann, das aber möglichst universell zu nutzen sein soll, ist ein MALDI-Flugzeitmassenspektrometer nach dieser Erfindung eine optimale Lösung, zumal bereits bestehende Massenspektrometer als Ausgangsbasis für die Entwicklung genommen werden können. Es mag sogar möglich sein, bestehende MALDI-Flugzeitmassenspektrometer durch den Austausch des Lasersystems auf ein Spektrometer nach dieser Erfindung umzurüsten.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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zeigt schematisch ein klassisches MALDI-Flugzeitmassenspektrometer, das aber nach dieser Erfindung zwei Lasereinheiten enthält, einen Kurzpulslaser (6) und einen Langpulslaser (7). Die Proben befinden sich auf der Probenträgerplatte (1) gegenüber den Beschleunigungselektroden (2) und (3) und können durch den Laserlichtpulsstrahl (4) ionisiert werden. Die beiden Lasereinheiten (6) und (7) liefern Laserlichtpulse verschiedener Längen, deren Strahlen in der Strahlformungseinheit (5) zu einem günstigen Strahlprofil geformt werden. Die Ionen werden durch die Beschleunigungselektroden (2) und (3) zu einem Ionenstrahl (8) beschleunigt, der eine Gaszelle (9), die bei Bedarf mit Stoßgas gefüllt werden kann, einen Elternionenselektor (10), eine Tochterionen-Nachbeschleunigungseinheit (11) und den Elternionen-Unterdrücker (12) passiert und dann vom Reflektor (13) auf den Ionendetektor (14) reflektiert wird.
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Beste Ausführungsformen
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Es wurde schon oben angemerkt, dass die Erfindung auf der Beobachtung beruht, dass die Leistungsdichte und Laserlichtpulsdauer einen großen Einfluss auf die Art der Fragmentierung und besonders auch auf den Probenverbrauch haben.
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Nach unseren Beobachtungen erzeugt ein kurzer Laserlichtpuls von nur einer Nanosekunde Dauer und hoher Leistungsdichte in einer Matrixsubstanz, die Wasserstoff-Radikale abzugeben vermag, aus schweren Analytmolekülen mit Massen oberhalb von etwa 1000 atomaren Masseneinheiten außerordentlich viele ISD-Spontanfragmente, wobei nur extrem wenig Probe verbraucht wird. Die ISD-Spontanfragmente können sehr gut gemeinsam beschleunigt und als Fragmentmassenspektrum mit c- und z-Fragmentionen gemessen werden. Dabei bleiben Seitenketten wie Phosphorylierungen oder Glykosylierungen gebunden. Vorzugsweise liegen die Spotdurchmesser der Laserstrahlung unterhalb von 10 Mikrometern, um eine Übersteuerung des Transientenrekorders zu vermeiden. Sehr schwere Analytmoleküle oberhalb von etwa 15000 bis 20000 atomaren Masseneinheiten werden praktisch vollkommen in Fragmentionen zerlegt; ihre Molekülionen lassen sich in den Massenspektren praktisch nicht mehr auffinden. Stoppt die Laserstrahlung nach der ersten Nanosekunde, so findet anscheinend keine weitere Erhöhung der inneren Energien der Moleküle statt und es nimmt die Instabilität der Proteinionen nicht weiter zu.
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Den ISD-Tochterionenspektren mit c- und z-Fragmentionen und dem Erhalt der Seitenketten und damit der posttranslationalen Modifikationen (PTM) stehen die PSD-Tochterionenspektren mit b- und y-Fragmentionen und Verlust aller Seitenketten gegenüber. Für Strukturanalysen ist es daher außerordentlich wertvoll, beide Arten von Tochterionenspektren aufnehmen zu können, da ein Vergleich sowohl die Sequenz der Aminosäuren wie auch die Positionen und Massen der Seitenketten (PTM) zu lesen gestattet.
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Die PSD-Fragmentionen entstehen bei Zerfällen von metastabilen Analytionen, die wiederum durch eine hohe innere Energie verursacht werden. Die aus diesem Zerfall entstehen Fragmentionen werden in Flugzeitmassenspektrometern mit Reflektoren normalerweise nicht gemessen, da sie nach dem Zerfall mangels genügender Energie nicht bis zum Detektor gelangen können. Tochterionenspektren aus diesen Zerfällen von Analytionen können aber durch besondere Messverfahren in besonders eingerichteten Flugzeitmassenspektrometern gemessen werden (Köster et al.,
DE 198 56 014 C2 ;
GB 2 344 454 B ;
US 6 300 627 B1 ). Die Instabilität der Analytionen wird anscheinend durch eine länger als eine Nanosekunde andauernde Laserlichtstrahlung erzeugt, indem die freien Moleküle und Ionen des jetzt gebildeten Plasmas Photonen aus der Strahlung absorbieren und damit ihre innere Energie erhöhen.
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Auch für eine weitergehende Strukturanalyse von ISD-Fragmentionen, insbesondere für die Sequenzierung der terminalen Aminosäuren, die durch Untergrund verdeckt sind, kann es interessant sein, diese Fragmentionen durch länger andauernde Laserlichtstrahlung instabil zu machen und die so durch metastabilen Zerfall entstehenden Enkelionen mit einem Flugzeitmassenspektrometer zu messen, das für die Aufnahme ergodisch erzeugter Fragmentionen eingerichtet ist (D. Suckau und A. Resemann:
DE 103 01 522 A1 ;
GB 2 399 218 B ;
US 7 396 686 B2 ).
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Die länger andauernde Laserlichtstrahlung ist aber auch nachteilig. Es wird insbesondere viel Probenmaterial verbraucht, ohne dass die Ausbeute an Ionen erhöht wird; diese wird im Gegenteil erniedrigt. Es ist das Plasma anscheinend so transparent, dass immer tiefere Schichten der Probe verdampft werden. Es konnte sogar beobachtet werden, dass die Massenauflösung für länger dauernde Laserlichtpulse abnahm, anscheinend, weil dann die Fokussierung durch verzögerte Beschleunigung nicht mehr optimal wirkte.
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Die Erfindung greift diese Beobachtungen auf und besteht darin, im Massenspektrometer Lasersysteme einzusetzen, die Laserlichtpulse verschiedener Dauer liefern, die jeweils für verschiedenartige Prozesse günstig sind. Günstig, aber nicht notwendig ist ein Lasersystem mit einer kontinuierlichen Einstellbarkeit der Laserlichtpulslängen; jedoch reicht aufgabengemäß bereits ein Lasersystem mit zwei Laserlichtpulsdauern aus.
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Eine einfache Ausführungsform eines universellen MALDI-Flugzeitmassenspektrometers mit zwei verschiedenen Lasereinheiten (6) und (7), die verschieden lange Laserlichtpulse liefern, ist schematisch in wiedergegeben. Auf der Probenträgerplatte (1) befinden sich in der Regel viele Proben, deren Analytionen in jeweils angepasster Weise analysiert werden sollen.
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Besteht das Ziel der Analyse darin, die Sequenz der Aminosäuren eines mittelgroßen Proteins zu bestimmen, so muss das Protein gereinigt vorliegen. Es wird mit einer geeigneten Matrixsubstanz zusammen als Probe auf die Probenträgerplatte (1) präpariert. Gut geeignet ist beispielsweise eine Präparation mit 1,5-Diaminonaphtalin (DAN), die die ISD-Spontanfragmentierung durch leichte Abgabe von Wasserstoffradikalen unterstützt.
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Für die Erzeugung der ISD-Fragmentionen wird hier der Kurzpulslaser (6) verwendet, der Pulse von höchstens einer Nanosekunde Dauer mit hoher Leistungsdichte erzeugt. Der Strahl dieses Lasers wird durch die Strahlformungseinheit (5) in eine kleine Anzahl zwischen 1 und 30 sehr kleiner Spots geformt und fokussiert, wobei die Spots jeweils Durchmesser zwischen drei und zehn Mikrometer haben. Die Energie und damit die Leistungsdichte in den Spots wird so gewählt, dass eine möglichst weitgehende ISD-Spontanfragmentierung erreicht wird. Das Massenspektrum zeigt dann die c-Fragmentionen in einer fast gleichmäßig intensiven Reihe von Ionensignalen bis zu maximal etwa 70 Aminosäuren an, da alle Aminosäuren mit Ausnahme von Prolin etwa gleich gut aufspalten. Vom C-Terminal lässt sich anhand der z-Fragmentionen eine Sequenz von maximal etwa 50 Aminosäuren lesen, wobei die z-Fragmentionen Intensitäten zeigen, die um einen Faktor fünf bis zehn unter denen der c-Fragmentionen liegen. Aus den Abständen können die Aminosäuren in bekannter Weise bestimmt werden, wobei nur Leucin und Isoleucin überhaupt nicht, und Glutamin und Lysin nur mit sehr hoher Massenauflösung zu unterscheiden sind. Doch bestehen auch hier Verfahren zu verfeinerter Bestimmung. Die Lücke, die das nicht spaltende Prolin erzeugt, kann durch die Kenntnis geschlossen werden, dass hier Prolin plus eine weitere Aminosäure hineinpassen muss. Dieses ISD-Verfahren ist dem Fachmann im Prinzip seit gut einem Jahrzehnt bekannt, wenn es auch bisher durch den Einsatz einer einzigen Lasereinheit konstanter Laserlichtpulslänge bisher nicht optimal gefahren werden kannte.
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Soll auf jeden Fall auch zwischen Leucin und Isoleucin unterschieden werden, so werden die ISD-Fragmentionen im Ionenstrahl mit Stoßgas in einer Stoßzelle (9) durch Hochenergiestöße (HE-CID = high energy collisionally induced decomposition) weiter fragmentiert, ein ISD-Fragmention im Ionenselektor (10) selektiert, dessen Enkelionen in der Nachbeschleunigungseinheit (11) beschleunigt, und durch Auftrennung im Ionenreflektor (13) als Enkelionenspektrum mit dem Ionendetektor (14) gemessen. Das Enkelionenspektrum zeigt durch Unterschiede in der Intensität der Ionensignale an, ob Leucin oder Isoleucin vorliegt.
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Ist für ein ISD-Fragmention die eindeutige Bestimmung der Aminosäurensequenz durch Seitenketten unbekannter Art gestört, oder sollen Seitenketten komplizierter Art (zum Beispiel Glykosylierungen) weiter analysiert werden, so kann durch einen ergodischen Zerfall eines der ISD-Fragmentionen, der durch Erhöhung der inneren Molekültemperatur herbeigeführt wird, durch das Abstreifen aller Seitenketten die Kette der Aminosäuren und häufig Art und Struktur der Seitenketten eindeutig bestimmt werden. Dazu ist ein Laserlichtpuls erforderlich, der nach der ersten Nanosekunde weiter anhält. Das kann durch Verwendung des Lasers (7) geschehen, der längere Laserlichtpulse liefert. Soll oder kann die Energie der Lasereinheit (7) nicht genügend hoch eingestellt werden, um in der ersten Nanosekunde genügend ISD-Fragmente zu erzeugen, so können auch beide Lasereinheiten synchron gestartet werden. Ein synchrones Starten beider Lasereinheiten mit nur leichten Fluktuationen der Startzeiten von etwa einer halben Nanosekunde ist technisch möglich und ausreichend.
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Besteht das Ziel der Analyse dagegen in der präzisen Massenbestimmung eines Gemischs der Verdaupeptide aus einem tryptischen Verdau eines größeren Proteins, ohne dass Spontanfragmente das Massenspektrum stören, so wird das Gemisch der Verdaupeptide auf einer Dünnschichtpräparation von HCHA aufgebracht und wie oben beschrieben präpariert. Die Matrix HCHA verhindert weitgehend die Bildung von ISD-Fragmentionen. Es wird jetzt wieder der Kurzpulslaser (6) eingesetzt, aber mit einer Leistungsdichte, die unterhalb der Bildung von ISD-Fragmentionen liegt. Es können so sehr saubere Massenspektren aufgenommen werden, aus denen die Massen der Ionen präzise bestimmt werden können. Diese Massen der Verdaupeptide können in bekannter Weise mit kommerziell erhältlichen Programmen unter Verwendung von Proteinsequenzdatenbanken zur Identifizierung der Proteine verwendet werden.
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Solange die Analysen allein mit dem Kurzpulslaser vorgenommen werden können, ist der Probenverbrauch außerordentlich gering.
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Ist ein Verdaupeptid wegen einer oder mehrerer ungewöhnlichen Modifikationen, die nicht in der Datenbank enthalten sind, mit einer nicht entschlüsselbaren Masse versehen, so kann für dieses Verdaupeptid ein PSD- oder ein CID-Fragmentionenspektrum aufgenommen werden. Zu diesem Zweck können entweder der Langpulslaser (7) oder die Stoßzelle (9) eingesetzt werden. Beide Arten von Tochterionenspektren liefern zumindest Bruchstücke der Aminosäurensequenz für eine eindeutige Identifizierung. Die Seitenketten der Modifikationen sind dabei abgelöst. Ein Vergleich beider Arten von Tochterionenspektren kann sogar zwischen Leucin und Isoleucin unterscheiden.
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In analoger Weise kann vorgegangen werden, wenn Massenbestimmungen von Proteinen oder Peptiden eines unbekannten Gemischs vorgenommen werden sollen. Besteht das Ziel der Analyse in der Aufnahme eines Tochterionenmassenspektrums eines der Peptide oder Proteine aus dem Gemisch, so kann wiederum das Massenspektrometer aus benutzt werden. Dazu wird die Energie des Langpulslasers (7) erhöht, um mehr metastabile Ionen für einen ergodischen Zerfall zu erhalten. Die richtige Ionensorte wird dann durch den Elternionenselektor (10) ausgewählt, deren Tochterionen werden durch die Nachbeschleunigungseinheit (11) nachbeschleunigt. Die nicht zerfallenen Elternionen werden durch den Elternionensuppressor (12) ausgeblendet, um nicht durch weitere Zerfälle zu Störsignalen beizutragen. Die Tochterionen werden jetzt im Ionenreflektor (13) nach Energien zeitlich aufgetrennt auf den Ionendetektor (14) reflektiert. Es ergibt sich ein Tochterionenspektrum der ergodischen Art, also mit b- und y-Fragmentionen, wie sie auch von Stoßfragmentierungen her bekannt sind.
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Es brauchen aber die beiden Lasereinheiten (6) und (7) nicht voneinander getrennt in verschiedenen Gehäusen untergebracht sein. Sie können zum Beispiel zusammen mit der Strahlformungseinheit (5) in einem einzigen Gehäuse sitzen, wobei möglicherweise sogar die Bepumpung der beiden Laserkristalle von einer einzigen Dioden-Pumpeinheit betrieben werden kann.
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Es sind weiterhin verschiedene technische Verfahren bekannt, die Pulsdauer von Festkörper-Lasern zu verändern. Es soll an dieser Stelle auf diese Maßnahmen nicht weiter eingegangen werden; sie sind dem Laserfachmann im Prinzip bekannt, wenn auch nicht für Nanosekunden-Pulslaser. Ein besonderes Verfahren zur Erzeugung eines kurzen und eines längeren Laserlichtpulses in einer einzigen Lasereinheit besteht darin, entweder einen einzigen Laserlichtpuls mit etwa einer Nanosekunde Dauer oder weniger zu erzeugen, oder nacheinander mindestens zwei solcher Einzellaserlichtpulse. Diese können im zeitlichen Abstand in der Größenordnung von Nanosekunden erzeugt werden. Sie bilden einen Sonderfall eines modulierten Laserlichtpulses. Der erste Laserlichtpuls bildet das Plasma aus, er kann allem stehend für alle Analysenarten verwendet werden, die keine hohe innere Energie der Ionen benötigen. Soll die innere Energie der Analytionen erhöht werden, um ergodische Zerfälle zu erzeugen, so kann der aus zwei oder mehr Einzellichtpulsen zusammengesetzte Laserlichtpuls verwendet werden.
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Kann man ein Lasersystem herstellen, das weitgehend die Größe bisheriger Lasersysteme hat, so ist sogar ein Austausch der Laser in einem Massenspektrometer möglich. Dadurch wird ein erweiterter Anwendungsbereich erzielt.
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In und in der bisherigen Beschreibung ist von Flugzeitmassenspektrometern mit axialem Ioneneinschuss die Rede. Es können jedoch MALDI-Ionenquellen auch mit anderen Arten von Massenspektrometern verwendet werden: mit Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern (ICR-MS), mit Ionenfallen-Massenspektrometern (IT-MS = ion trap mass spectrometry) oder auch mit Flugzeitmassenspektrometern mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF-MS). Auch die Ionenquellen für diese Massenspektrometer können von dieser Erfindung profitieren.
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Da diese Massenspektrometer alle die Ionen in Ionenführungssystemen von den Ionenquellen zu den Analysatoren fuhren, ist dabei zu beachten, dass metastabile Zerfälle weitgehend in diesen Ionenführungssystemen stattfinden. Die Aufenthaltsdauer der Ionen in diesen Ionenführungssystemen beträgt Hunderte von Mikrosekunden bis zu Millisekunden. So können von einer gereinigten Analytsubstanz durch Wahl der Matrixsubstanz und Laserpulslänge sowohl elektroneninduzierte Fragmente wie auch ergodische Fragmente gemessen werden. Ein Kurzpulslaser in Verbindung mit einer geeigneten Matrixsubstanz kann hervorragend ISD-Fragmentionen für die Aufnahme eines ISD-Fragmentionenspektrums liefern. Ein Langpulslaser liefert vom gleichen Analyten mit einer hierfür geeigneten Matrixsubstanz metastabile Ionen, die in der Überführungsstrecke zerfallen und als ergodisches Fragmentionenspektrum messbar sind.
