DE19856014C2 - Tochterionenspektren mit Flugzeitmassenspektrometern - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Gerät zur Messung von Tochterionenspektren (auch Fragmentionenspektren oder MS/MS-Spektren genannt) in Flugzeitmassenspektrometern. Die Erfindung besteht darin, die Ionen einer Ionenquelle zunächst nur auf eine geringe Energie zu beschleunigen und sie auf dieser Energiestufe durch metastabilen Zerfall oder durch Stoßfragmentierung zerfallen zu lassen, sodann aber auf eine hohe Energie nachzubeschleunigen, wobei leichte Fragmentionen eine höhere Geschwindigkeit erhalten als schwerere Fragmentionen oder unzerfallene Elternionen. Ein Ionenselektor auf der niedrigen Energiestufe sucht eine einzige Elternionensorte aus, um Überlagerungen mit Fragmentionen anderer Elternionen zu vermeiden. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform hebt das Potential fliegender Ionen in einer kleinen Flugstrecke während des Durchfliegens an.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Gerät zur Messung von Tochterionenspektren (auch Fragmentionenspektren oder MS/MS-Spektren genannt) in Flugzeitmassenspektrometern.

Die Erfindung besteht darin, die Ionen einer Ionenquelle zunächst nur auf eine geringe Energie zu beschleunigen und sie auf dieser Energiestufe durch metastabilen Zerfall oder durch Stoß­ fragmentierung zerfallen zu lassen, sodann aber auf eine hohe Energie nachzubeschleunigen, wobei leichte Fragmentionen eine höhere Geschwindigkeit erhalten als schwerere Fragmentio­ nen oder unzerfallene Mutterionen. Ein Ionenselektor auf der niedrigen Energiestufe sucht eine einzige Mutterionensorte aus, um Überlagerungen mit Fragmentionen anderer Mutterionen zu vermeiden. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform hebt das Potential fliegender Ionen in einer kleinen Flugstrecke während des Durchfliegens an.

Stand der Technik

Das gewohnte Verfahren der Flugzeitmassenspektrometrie besteht darin, die Ionenquelle auf eine konstant anliegende Hochspannung von 6 bis 30 Kilovolt zu legen, dem in einer Entfer­ nung von einigen Millimetern eine Grundelektrode auf Erdpotential gegenüberliegt. Die aus der Ionenquelle pulsförmig ausgestoßenen Ionen werden in der Beschleunigungsstrecke zwi­ schen Ionenquelle und Grundelektrode beschleunigt, durchfliegen dann eine feldfreie Flug­ strecke, und werden zeitaufgelöst mit einem Ionendetektor gemessen. Aus der Flugzeit der Ionen kann wegen gleicher Energie die Masse m der Ionen (besser: das Masse-zu-Ladungs- Verhältnis m/z) bestimmt werden. Im Folgenden wird der Einfachkeit halber immer nur von der Masse m gesprochen, auch wenn es sich in der Massenspektrometrie immer nur um die Mes­ sung des Masse-zu-Ladungsverhältnisses m/z handelt, wobei z die Anzahl der Elementarladun­ gen ist, die das Ion trägt. Da viele Ionisierungsarten, wie zum Beispiel MALDI, ganz überwie­ gend nur einfach geladene Ionen liefern (z = 1), fällt hier der Unterschied praktisch fort.

Da die aus der Ionenquelle stammenden Ionen häufig bereits eine nicht für alle Ionen einheitli­ che Anfangsenergie besitzen, haben sich höhere Beschleunigungsverfahren von 20 bis 30 Kilo­ volt durchgesetzt, weil dann Streuungen der Anfangsenergie der Ionen das Massenauflösungs­ vermögen weniger verschlechtern. Für noch bessere Massenauflösungsvermögen hat sich das geschwindigkeitsfokussierende Verfahren mit einem zweistufigen Ionenreflektor nach Mamyrin durchgesetzt, dem eine zweite lineare, feldfreie, rückwärts weisende Flugstrecke folgt. In der ersten Bremsstufe des Reflektors werden die Ionen stark abgebremst, in der zweiten Brems­ stufe nur schwach. In das lineare, relativ schwache Bremsfeld der zweiten Stufe des Reflektors dringen schnellere Ionen weiter ein als langsamere und legen daher einen längeren Weg zurück, der bei richtiger Einstellung der beiden Bremsfelder die schnellere Fluggeschwindigkeit genau kompensieren kann und somit das Massenauflösungsvermögen erhöht.

Eine der meist verwendeten Ionenquellen benutzt die matrixunterstützte Laserdesorption zur Ionisierung (MALDI = matrix assisted laser desorption and ionization). Die Proben befinden sich in einer Matrixsubstanz auf einer Probenträgerplatte. Die durch einen Laserlichtpuls von 1 bis 20 Nanosekunden Dauer erzeugten Ionen verlassen die Oberfläche mit einer größeren Streuung der Geschwindigkeiten.

Da diese Streuung der Geschwindigkeiten auch von einem guten Reflektor nicht mehr gut fo­ kussiert werden, hat sich für MALDI eine weitere Methode zur Verbesserung der Massenauf­ lösung durch gesetzt, die in einer verzögert einsetzenden Beschleunigung besteht. Das Grund­ prinzip für diese Erhöhung des Massenauflösungsvermögens unter Bedingungen der reinen Energiestreuung der Ionen ist schon seit über 40 Jahren bekannt. Die Methode ist in der Arbeit W. C. Wiley and I. H. McLaren, "Time-of-Flight Mass Spectrometer with Improved Resoluti­ on", Rev. Scient. Instr. 26, 1150, 1955 veröffentlicht worden. Es handelt sich um eine Metho­ de, die von ihren Autoren "time lag focusing" genannt wurde. Sie wird in jüngster Zeit unter verschiedenen Namen (beispielsweise "delayed extraction") in wissenschaftlichen Arbeiten in bezug auf die MALDI-Ionisierung untersucht und auch in kommerziell erhältlichen Flugzeit­ massenspektrometern angeboten.

Der Reflektor eines Flugzeitmassenspektrometers kann aber auch zur Untersuchung von Fragmentionen verwendet werden, die durch metastabile oder stoßinduzierte Zerfälle von Io­ nen einer bestimmten Ausgangssorte erzeugt werden. Die Ausgangssorte wird häufig "Eltern­ ionen" oder "Mutterionen" genannt (englisch: "parent ions" oder auch "precursor ions").

Werden Fragmentionen durch einen Zerfall der Mutterionen nach der Beschleunigung erzeugt, so fliegen alle Fragmentionen weiterhin mit der gleichen Geschwindigkeit ν wie ihre Mutterio­ nen, haben aber durch ihre geringere Masse eine kleinere kinetische Energie E_k = mv²/2. Sie dringen daher in das zweite Bremsfeld des Reflektors entsprechend ihrer geringeren kineti­ schen Energie weniger weit ein, kehren daher früher zurück und können am Ende der zweiten feldfreien Flugstrecke getrennt nach Masse gemessen werden.

Im MALDI-Prozeß der Ionisierung unterliegen die Ionen in der durch den Laserpuls erzeugten Dampfwolke sehr vielen Stößen, die die innere Energie der Ionen durch vielfache, aber milde Anregung von Schwingungen erhöht. Dadurch werden eine Anzahl dieser Ionen "metastabil", das heißt, diese Ionen zerfallen mit einer Halbwertszeit in der Größenordnung von einigen Mi­ krosekunden, so daß ein Nachweis der Zerfallsionen im Massenspektrometer möglich wird. Ein Nachweis solcher Fragmentionen, die in der ersten feldfreien Flugstrecke des Massenspektro­ meters entstehen, durch den Reflektor eines Flugzeitspektrometers ist als PSD-Methode be­ kannt geworden (PSD = post source decay). Es können die fliegenden Mutterionen aber auch eine mit Stoßgas gefüllte Zelle im feldfreien Raum durchlaufen und so stoßinduzierte Frag­ mentionen bilden, die in gleicher Weise nachgewiesen werden können (CID = collisionally in­ duced decomposition).

Die Methode des Nachweises von Fragmentionen durch den Reflektor hat aber gravierende Nachteile. Es können mit einigermaßen guter Fokussierung immer nur Ionen eines relativ klei­ nen relativen Energiebereiches nachgewiesen werden, in den normalen Ausführungen kommer­ ziell erhältlicher Geräte etwa 25 bis 30 Prozent. Der Grund hierfür ist, daß die Ionen auf jeden Fall das erste Bremsfeld passieren müssen, um geschwindigkeitsfokussiert reflektiert werden zu können. Dieses erste Bremsfeld verbraucht aber bereits gut 2/3 der originalen Beschleuni­ gungsenergie. Das heißt, von Mutterionen einer Ausgangsmasse von 3200 atomaren Massen­ einheiten können in einem ersten Fragmentionenspektrum nur Fragmentionen von etwa 2400 bis 3200 atomaren Masseneinheiten, in einem zweiten nur Fragmentionen zwischen 1800 bis 2400 Masseneinheiten, in einem dritten Spektrum zwischen 1350 bis 1800 Masseneinheiten aufgenommen werden, und so weiter. Für ein Peptid mittlerer Größe sind so etwa 10 bis 15 Spektren zu nehmen, wenn das ganze Fragmentionenspektrum aufgenommen werden soll. Alle diese Spektren müssen durch ein kompliziertes Massenkalibrierverfahren aufeinander abge­ stimmt werden. Nur dann können diese Teilspektren im Datensystem zu einem künstlich er­ zeugten Kompositspektrum zusammengesetzt werden.

Die Anzahl der Einzelspektren kann im Prinzip verringert werden, wenn der Reflektor stark verlängert wird. Es kann dann das erste Bremsfeld verringert werden. Dann verbringt jedoch das Ion den größten Zeit seiner Lebenszeit zwischen Erzeugung in der Ionenquelle und seiner Vernichtung im Ionendetektor in eben diesem Reflektor. Das führt dazu, daß die meisten Zer­ fälle nicht mehr in der ersten feldfreien Flugstrecke, sondern im Reflektor stattfinden. Diese Ionen verteilen sich als Untergrundionen über das gesamte Spektrum und bilden so ein kräfti­ ges Untergrundrauschen, das zu einem schlechten Signal-zu-Rausch-Verhältnis führt und die Detektion der zerfallenen Ionen erschwert.

Ein prinzipiell besserer Weg ist in US 5 464 985 (T. J. Cornish and R. J. Cotter) vorgeschlagen worden. Hier wird im Reflektor nicht ein gleichmäßiges Bremsfeld, sondern ein ansteigendes Bremsfeld benutzt ("curved potential"). Ein linear ansteigendes Bremsfeld ergibt beispielsweise ein quadratisch ansteigendes Potential. Es kann so ein sehr großer Massenbereich der Frag­ mentionen in einer einzigen Spektrenakquisition aufgenommen werden. Leider ergeben sich hier optimale Fokussierungsbedingungen nur dann, wenn die feldfreie Flugstrecke vor dem Reflektor relativ kurz im Vergleich zur Reflektorlänge ist, daher tritt auch hier das Problem eines sehr großen Untergrundrauschens auf.

Wenn hier von der Akquisition (oder Aufnahme) eines Flugzeitspektrums die Rede ist, so ist im allgemeinen die Aufnahme und Addition vieler einzelner, unter gleichen Bedingungen auf­ genommener Einzelspektren gemeint. Diese Addition erfolgt, um die Aufnahmedynamik zu erhöhen und um zu besseren Signal-zu-Rausch-Verhältnissen zu kommen.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren und Gerät für die Aufnahme von metastabil oder stoßinduziert erzeugten Fragmentionen in Flugzeitmassenspektrometern anzugeben, die bei geringem Untergrundrauschen eine Aufnahme des Fragmentionenspektrums in einem großen Massenbereich ermöglicht.

Beschreibung der Erfindung

Es ist die Grundidee der Erfindung, Mutterionen aus einer Ionenquelle in einer ersten Be­ schleunigungsstrecke zunächst nur gering zu beschleunigen, sie in einer feldfreien Teilflug­ strecke in relativ langsamem Fluge metastabil oder stoßinduziert zerfallen zu lassen, sie dann in einer zweiten Beschleunigungsstrecke einer Nachbeschleunigung auszusetzen, die die Frag­ mentionen verschiedener Massen auf massenspezifisch verschiedene Geschwindigkeiten bringt, und sie dann nach einer zweiten (oder, bei Anwendung eines Reflektors, dritten) feldfreien Teilflugstrecke massengetrennt nachzuweisen.

Das Flugzeitmassenspektrometer kann dabei im linearen Betriebsmodus ohne Reflektion der Ionen benutzt werden, oder aber auch im reflektierenden Modus. Für den reflektierenden Mo­ dus ist es jetzt für den Nachweis eines vollen Massenbereiches in einer Spektrenaufnahme nur­ mehr erforderlich, daß die erste Beschleunigung nur einen kleinen Teil der Gesamtbeschleuni­ gung ausmacht (beispielsweise etwa 25 Prozent), so daß die Energien aller nachbeschleunigten Fragmentionen der verschiedenen Massen relativ hoch sind und daher alle vom Reflektor gut fokussierend reflektiert werden können (in unserem Beispiel zwischen 75 und 100 Prozent der Energie der Mutterionen).

Werden in der Ionenquelle nicht nur die zu untersuchenden Mutterionen erzeugt, sondern auch andere Ionen, so ist es erforderlich, einen schon jetzt üblichen Mutterionenselektor ("precursor ion selector") einzusetzen. Dieser besteht in einem schnell schaltbaren Ablenkkondensator, der alle Ionen außer den gewünschten Mutterionen aus der Flugbahn soweit ablenkt, daß die Ionen nicht mehr zum Detektor gelangen. Der Mutterionenselektor kann irgendwo in der Flugbahn zwischen erster und zweiter Ionenbeschleunigung liegen. Die optimale Stelle befindet sich kurz vor der zweiten Beschleunigungsstrecke, da hier die Ionen am weitesten massendispergiert sind.

Die besonderen Vorteile dieses Verfahrens liegen in den folgenden Punkten:

• 1. Die Kalibrierkurve für die Massen braucht nur für ein einziges Spektrum aufgenommen zu werden, nicht für die bisherige Vielzahl von Fragmentspektren. Das Zusammenbasteln des Kompositspektrums entfällt.
• 2. Die leichten Fragmentionen erhalten eine größere Energie und lassen sich daher viel besser im Ionendetektor nachweisen. Die hier in der Regel gebrauchten Sekundärionen-Verviel­ facher können nur Ionen mit relativ hoher Energie nachweisen.
• 3. Der größte Vorteil liegt jedoch im Zeitgewinn und in der sparsamen Ausnutzung der zur Verfügung stehenden Probe, da für das vollständige Fragmentionenspektrum nur eine ein­ zige Spektrenaufnahme erfolgt.

Die Ionen können beispielsweise auf hohem Potential erzeugt werden und in einer ersten Be­ schleunigungsstrecke auf ein etwas niedrigeres Potential beschleunigt werden. Sie fliegen dann feldfrei durch ein längeres Rohr auf diesem etwas niedrigeren Potential und können hier zer­ fallen. Am Ende dieses Rohrs werden sie auf Erdpotential hin weiter beschleunigt. Diese An­ ordnung hat aber den Nachteil, daß ein längeres Rohrstück auf relativ hohem Potential zu hal­ ten ist. Meist ist bei kommerziell gebauten Massenspektrometern zwischen Ionenquelle und Flugstrecke ein Hochvakuumventil eingebaut, das eine leichte Reinigung der Ionenquelle ohne Belüftung des gesamten Gerätes erlaubt; in solcherart gebaute Massenspektrometer läßt sich diese Anordnung weder von Anbeginn, noch im Nachhinein einbauen.

Es ist daher weiterhin eine besondere Erfindungsidee, die Potentiale für die beiden Beschleu­ nigsvorgänge nicht einfach stationär hintereinander mit zwei feldfreien Teilflugstrecken auf verschiedenem Potential anzuordnen, sondern für die Fragment- und Mutterionen der ge­ wünschten Sorte einen "Fahrstuhl" (Lift) bereitzustellen, der sie vom Potential der ersten feld­ freien Teilflugstrecke (vorzugsweise Erdpotential) auf das Beschleunigungspotential für die zweite Beschleunigung bringt. Die zweite feldfreie Teilflugstrecke befindet sich vorzugsweise wiederum auf Erdpotential. Dieser Potentialfahrstuhl ist ein elektrisch leitfähiges Behältnis, das beispielsweise als kleines, elektrisch leitendes Rohrstück ausgebildet ist, dessen Potential wäh­ rend des Durchfliegens der dann noch ungetrennten Fragment- und Mutterionen durch sehr schnelles Schalten einer Spannung um eine hohe Potentialdifferenz angehoben wird.

Die Beschleunigung der Ionen kann am Eingang dieses Behältnisses erfolgen, wenn das Be­ hältnis sich bei Eintritt der Ionen auf tieferem Potential befindet und dann auf das Potential der zweiten Teilflugstrecke angehoben wird. Es kann aber auch das Behältnis während des Ein­ dringens der Ionen auf dem Potential der ersten Teilflugstrecke sein, wobei die Beschleunigung nach Potentialerhöhung am Ausgang stattfindet. Schließlich kann es auch eine Mischform mit einer Beschleunigung an beiden Enden des relativ kurzen Behältnisses geben. Die im Inneren des "Fahrstuhls" fliegenden Ionen erleben dabei im Rohrstück keine Änderung ihrer Energie, weil sie kein Feld erleben; sie können aber beim Eintritt oder Austritt durch ein entsprechend zu dieser Zeit herrschendes Feld beschleunigt werden.

Das Rohrstück des Fahrstuhls wird zweckmäßigerweise am Eingang und am Ausgang mit Gittern verschlossen, um im Inneren ein ungestört feldfreies Potential auszubilden. Rohrstück und Verschlußgitter sind dann am besten in zwei weitere Gitter auf Erdpotential einzuschlie­ ßen, damit keine Potentialstörung der Umgebung erzeugt wird. Eines oder beide der Doppel­ gitter an Ein- oder Ausgang bilden dann die zweite Beschleunigungsstrecke.

Diese Ausführung mit einem "Fahrstuhl" hat die weiteren besonderen Vorteile:

• 1. Die Anordnung kann in ein existierendes Massenspektrometer eingebaut werden, selbst wenn dieses Massenspektrometer zwischen Ionenquelle und Flugrohr ein Hochvakuum­ ventil besitzt und somit auf eine "potentialfreie" (auf Masse- oder Erdpotential befindliche) Flugstrecke festgelegt ist.
• 2. Die Ionenquelle kann für diesen Betrieb auf sehr viel niedrigerem Potential betrieben wer­ den.
• 3. Es kann ein solcher "Fahrstuhl" durch entsprechend gesteuertes Schalten gleichzeitig als Mutterionenselektor verwendet werden.
• 4. Durch ein zeitlich leicht ansteigendes Potential des Fahrstuhls beim zweiten Beschleunigen der Ionen kann eine Nachfokussierung erzeugt werden, die es erlaubt, auf die verzögert einsetzende Beschleunigung ("delayed extraction") in der ersten Beschleunigungsstrecke zu verzichten oder sie zumindestens die Verzögerung zu verkürzen. Die verzögert einsetzende Beschleunigung verringert die Anzahl der metastabilen Ionen für den PSD-Betrieb, da die Ionen erst dann beschleunigt werden, wenn sich die Verdampfungswolke weitgehend ver­ dünnt hat und daher während der Beschleunigung nicht mehr viele energieübertragende Stöße in der Wolke stattfinden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines Reflektor-Flugzeitmassenspektrometers nach dieser Erfindung mit einem Rohr (2), das auf einem Zwischenpotential liegt. Die Ionen, die aus der Ionenquelle (1) austreten, werden um nur 5 kV (als Differenz des Ionenquellenpo­ tentials von 30 kV und des Zwischenpotentials von 25 kV) auf das Rohr (2) hin beschleunigt. Die Ionen fliegen feldfrei durch das Rohr (2) und zerfallen dort metastabil. Im Ende des Rohrs befindet sich der Mutterionenselektor (3), der nur in der Zeitspanne der Passage der zu unter­ suchenden Ionen ohne Ablenkspannung bleibt, so daß nur diese Ionen so passieren können, daß sie einen der Detektoren (9 oder 10) treffen können. Ist am Reflektor (5, 6) keine Span­ nung eingeschaltet, so können die am Ausgang des Rohrs (2) zur Masseelektrode (4) hin nach­ beschleunigten Ionen den ersten Detektor (9) (Detektor-1) für den linearen Betriebsmodus erreichen und dort massenaufgelöst registriert werden. Ist die Gegenspannung am Reflektor (5, 6) dagegen eingeschaltet, so werden die Ionen im Reflektor, wie in der Abbildung ersichtlich, reflektiert und erreichen den zweiten Detektor (10) (Detektor-2), wobei der Strahl für die leichten Ionen (7) etwas anders verläuft als der Strahl für die schweren Ionen (8).

Abb. 2 zeigt dagegen eine Ausführung des Flugzeitmassenspektrometers mit einem Fahr­ stuhl (13) für das Potential der durchfliegenden Ionen. Die Ionenquelle (1) befindet sich jetzt auf einem niedrigen Potential von nur 5 Kilovolt. Die austretenden Ionen werden zur geerdeten Gegenelektrode (11) um diese 5 Kilovolt beschleunigt. Die zu untersuchenden Mutterionen fliegen dann in der ersten feldfreien Teilflugstrecke (15) auf Massepotential, zerfallen dort teil­ weise durch in der Ionenquelle erhaltene Metastabilität, und treten, in einem hier betrachteten Betriebsfall, durch die auf Masse befindliche Gitterblende (12) in den zu diesem Augenblick ebenfalls auf Massepotential befindlichen Fahrstuhl (13) ein. Während diese Ionen den Fahr­ stuhl durchfliegen, wird das Potential des Fahrstuhls auf etwa 25 Kilovolt angehoben, so daß die Ionen am Ausgang eine Potentialdifferenz von 25 Kilovolt zur geerdeten Elektrode (14) sehen und dort nachbeschleunigt werden. Die zweite feldfreie Teilflugstrecke (16) befindet sich ebenfalls auf Massepotential. Die nachbeschleunigten Ionen werden im Reflektor reflektiert und gelangen, wie in Abb. 1, auf den zweiten Detektor (10). Der Fahrstuhl kann dabei als Mutterionenselektor verwendet werden, wenn sein Potential erst zur Ankunft der zu untersu­ chenden Ionen auf Massepotential geschaltet wird. Auch hier ist ein linearer Betrieb möglich, wenn das Potential des Reflektors (5, 6) auf Masse gelegt wird. Die Ionen werden dann im Detektor (9) nachgewiesen.

Optional kann in die erste feldfreie Teilflugstrecke (15) eine Stoßzelle (17) mit einer Gaszufüh­ rung eingebaut werden, um stoßinduzierte Fragmentionen zu erzeugen.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen

Eine einfache, aber bereits wirksame Ausführungsform eines Verfahrens und eines Gerätes nach dieser Erfindung ist in Abb. 1 als Prinzipskizze wiedergegeben. Die Ionen werden in der Ionenquelle (1) beispielsweise durch einen MALDI-Prozeß mit Hilfe eines Laserpulses von einer Probe erzeugt, die auf einem Probenträger aufgetragen ist, der sich auf hohem Potential befindet. Aber auch andere Arten von Ionenquellen sind geeignet, sofern sie die Ionen in einem kurzen Puls erzeugen oder ausstoßen. Die Ionen werden zwischen Ionenquelle und dem Rohr (2), das sich auf einem Zwischenpotential befindet, mäßig beschleunigt. In dem längeren Rohr (2) wird wegen der relativ langsamen Fluggeschwindigkeit ein großer Teil der Ionen, die im MALDI-Prozeß metastabil geworden sind, zerfallen. Kurz vor dem Ende des Rohres befindet sich in ihm ein Mutterionenselektor (3), der alle Ionen, die nicht der zu untersuchenden Ionen­ sorte angehören, zur Seite ablenkt, so daß sie nicht mehr einen der Ionendetektoren erreichen können. Dieser Mutterionenselektor (3) wird durch schnellschaltende Spannungsversorgung gesteuert, die Auswahl der Ionen geschieht durch Spannungspulse, die nur Ionen der richtigen Flugzeit geradeaus durchlassen. Da hier die Mutterionen und die Fragmentionen verschiedener Massen alle die gleiche Geschwindigkeit haben, passieren sie den Mutterionenselektor alle zur gleichen Zeit (der Begriff "Mutterionenselektor" trifft daher nicht genau zu; es ist vielmehr ein Selektor für die Mutterionen und für alle Ionen, die durch Fragmentierung von derselben Mut­ terionensorte stammen).

Zwischen dem Ende des Rohres (2) auf Zwischenpotential und der Elektrode (4) auf Masse­ potential werden die Ionen dann in ein zweites Mal beschleunigt. Diese Nachbeschleunigung endet mit massenspezifischen Geschwindigkeiten, leichte Ionen sind schneller als schwere. Die zweite Teilflugstrecke befindet sich auf Massepotential (Erdpotential). Die Ionen können jetzt entweder im linearen Modus (bei ausgeschaltetem oder nicht vorhandenem Reflektor) im er­ sten Detektor (9) massenaufgelöst gemessen werden, oder sie können, nach Reflektion im Re­ flektor, nach einer weiteren feldfreien Teilflugstrecke im zweiten Detektor (10) als Massen­ spektrum aufgenommen werden.

Der Reflektor hat im Eingangsbereich (5) ein starkes Gegen- oder Bremsfeld, das erst im Inne­ ren (6) durch ein schwächeres Brems- oder Refektionsfeld abgelöst wird. Nur durch diese An­ ordnung läßt sich eine gute Geschwindigkeitsfokussierung erreichen. Dadurch können aber nicht mehr Ionen aller Energien geschwindigkeitsfokussierend reflektiert werden; Die Ionen brauchen dabei eine recht hohe Mindestenergie. Diese Mindestenergie wird aber durch diese Erfindung in der zweiten Beschleunigungsstrecke bereitgestellt.

Beträgt die Potentialdifferenz der ersten Beschleunigung (beispielsweise die in der Abbildung angegeben 5 Kilovolt) nur einen kleinen Bruchteil der gesamten Potentialdifferenz (beispiels­ weise 30 Kilovolt) zur Beschleunigung, so kann der Reflektor die nachbeschleunigten Ionen aller Massen gemeinsam geschwindigkeitsfokussierend reflektieren, wobei allerdings die leich­ ten Ionen eine viel geringere Eindringtiefe in der zweiten Bremsstufe (6) besitzen als die schweren. Nehmen wir an, daß die Mutterionen eine Masse von 2000 atomaren Masseneinhei­ ten haben, und die leichtesten eine Masse von nur 80 Masseneinheiten, so haben die leichten Ionen durch den Zerfall nur eine kinetische Energie von 200 Elektronenvolt, im Gegensatz zu den 5 Kiloelektronenvolt der Mutterionen. Durch die Nachbeschleunigung erhalten alle Ionen eine zusätzlich kinetische Energie von 25 Kiloelektronenvolt hinzu, die Energien reichen also von 25,2 Kiloelektronenvolt für die leichten Ionen bis zu 30 Kiloelektronenvolt für die schwe­ ren. Werden in der ersten Bremsstufe etwa 2/3 der Energie der Mutterionen abgebremst, also etwa 20 Kiloelektronenvolt, so können alle Ionen, also auch die leichten Ionen von nur 80 atomaren Masseneinheiten, bis in die zweite Bremsstufe vordringen und werden daher ge­ schwindigkeitsfokussierend reflektiert.

Durch einen gitterfreien Reflektor, der im Eingangsbereich auch eine raumfokussierende Kom­ ponente hat, können dabei die leichten Ionen wie auch die schweren besser gemeinsam auf den einen kleinflächigen zweiten Detektor gelenkt werden, als das in den Abbildungen mit gitterbe­ setzten Reflektoren gezeigt ist.

Da die leichten Ionen dabei eine erheblich höhere Energie bekommen, lassen sie sich im Ionen­ detektor besser nachweisen als im bisherigen Betrieb. Ionen der Energie von nur 200 Elektro­ nenvolt werden von einem Multiplier normalerweise gar nicht detektiert. Nur der Umstand, daß vor dem Detektor eine leichte Nachbeschleunigung um 1 bis 3 Kilovolt stattfindet, macht diese Ionen bei bisherigem Betrieb überhaupt sichtbar.

Die favorisierte Ausführungsform ist jedoch in Abb. 2 wiedergegeben. Hier befinden sich die beiden ersten feldfreien Teilflugstrecken (15) und (16) beide auf Massepotential. Die Io­ nenquelle wird auf viel niedrigerem Potential betrieben als in Abb. 1 (nur auf 5 Kilovolt). Die zu untersuchenden, in der ersten feldfreien Teilflugstrecke (15) durch Zerfall der metasta­ bilen Mutterionen erzeugten Fragmentionen kommen zusammen mit restlichen Mutterionen nach einer vorbestimmten Flugzeit an der Elektrode (12) an, die sich wie auch Elektrode (14) dauernd auf Massepotential befindet. Genau zu diesem Zeitpunkt ist das Potential des Fahr­ stuhls (13) ebenfalls auf Massepotential geschaltet, die Fragmentionen können also eintreten. Vorher war dieses Potential auf einem hohen Niveau, alle vorher ankommenden Ionen wurden daher reflektiert. Während sich die Untersuchungsionen im Fahrstuhl (13) befinden, wird des­ sen Potential durch schnelles Schalten auf ein hohes Potential von beispielsweise 25 Kilovolt angehoben. Die Untersuchungsionen sehen nun beim Austritt aus dem Fahrstuhl zwischen Fahrstuhl (13) und Blende (14) ein hohes Beschleunigungsfeld, das sie gemäß der Erfindung nachbeschleunigt. Das hohe Potential am Fahrstuhl verhindert gleichzeitig, daß weitere Ionen eintreten, der Fahrstuhl wirkt also gleichzeitig als Mutterionenselektor.

Die Zeit zum Durchfliegen des Fahrstuhls reicht aus, um das Potential zu schalten. Ionen der Masse 3000 atomare Masseneinheiten haben bei 5 Kilovolt kinetischer Energie eine Geschwin­ digkeit von etwa 4 Millimetern pro Mikrosekunde. Ist der Fahrstuhl etwa 20 Millimeter lang, so muß das Schalten mit einer Anstiegsgeschwindigkeit von etwa einer Mikrosekunde gesche­ hen. Das ist heute technisch möglich, wenn es auch besonderer Maßnahmen bedarf, die aber dem elektronischen Fachmann bekannt sind.

Natürlich ist es auch möglich, die Ionen schon bei ihrem Eintritt in den Fahrstuhl zu beschleu­ nigen, in dem der Fahrstuhl sich zu dieser Zeit auf einem tieferen Niveau als das Massepotenti­ al befindet. Dann ist aber die Geschwindigkeit der Ionen im Fahrstuhl bereits größer, das Schalten muß schneller erfolgen. Außerdem ist dann die Geschwindigkeit bereits massenab­ hängig, Ionen kleiner Masse haben ein sehr hohe Geschwindigkeit, was das Schalten nochmals schwieriger macht.

Es ist mit dieser Anordnung nicht nur möglich, die Untersuchungsionen zu selektieren, es kann auch eine Fokussierungsverbesserung vorgenommen werden. Wir nehmen dazu an, daß am Ausgang des Fahrstuhls beschleunigt wird. Es kommen solche Ionen, die in der Ionenquelle eine etwas geringere Anfangsenergie mitbekommen haben, etwas später zur Beschleunigungs­ strecke als solche höherer Anfangsenergie. Wird jetzt nicht mit einem zeitkonstanten Potential des Fahrstuhls beschleunigt, sondern mit einem zeitlich langsam ansteigenden Potential, so kann eine Nachfokussierung erfolgen, indem die langsameren Ionen eine etwas höhere Nachbe­ schleunigung erfahren.

Diese Nachfokussierung ist von besonderem Interesse bei einer Ionenerzeugung durch MALDI. Die Ionen erhalten hier durch die rasante adiabatische Ausdehnung der durch den Laserblitz erzeugten Dampfwolke im Vakuum eine Anfangsgeschwindigkeit von etwa 0,5 bis 1 Millimeter pro Mikrosekunde, die aber sehr stark streut. Der Geschwindigkeitsunterschied verringert sich stark durch die erste Beschleunigung, trägt aber erheblich zur Massenunschärfe bei. Durch verzögerten Einsatz der Beschleunigung kann die Streuung der Anfangsgeschwin­ digkeiten verringert werden, dabei wird aber gleichzeitig auch die Produktion von metastabilen Ionen verringert. Die Möglichkeit einer Nachfokussierung im Fahrstuhl (oder auch am Ende des Rohrs (2)) bietet nun die Möglichkeit, zwischen Fokussierung und Produktion von meta­ stabilen Ionen auszubalancieren.

Die Konstruktion mit einem Fahrstuhl erlaubt es, diese Einrichtung auch nachträglich in Flug­ zeitmassenspektrometer einzubauen. Es lassen sich damit auch Flugzeitmassenspektrometer bauen, die in der ersten feldfreien Teilflugstrecke (15) mit einem Hochvakuumventil versehen sind, um die Ionenquelle (1) zu Reinigungszwecken getrennt vom Spektrometer belüften zu können.

Die Einrichtung des Fahrstuhls kann auch ausklappbar konstruiert werden. Dann kann der Fahrstuhl, der immerhin vier Gitter trägt, für Zwecke hochempfindlicher Messung der originä­ ren Gemischspektren aus dem Ionenstrahl herausgenommen werden.

Es muß aber nicht auf metastabile Ionen allein abgestellt werden. Es kann auch wahlweise in die erste feldfreie Flugstrecke (15) irgendwo eine Stoßzelle (17) mit einer Zufuhr von Stoßgas eingebaut werden, die stoßinduzierte Fragmentionen erzeugt. Eine solche Anordnung ist unab­ hängig von der Erzeugung metastabiler Ionen in der Ionenquelle. Auch für die Betriebsweise mit einer Stoßzelle (17) ist die Konstruktion mit einem Fahrstuhl vorteilhaft, da sich dann die Stoßzelle (17) auf Massepotential befinden kann. Es kann aber auch der Fahrstuhl selbst als Stoßzelle benutzt werden. Befindet sich die Stoßzelle nahe an der Ionenquelle, so können auch die in ihr entstehenden metastabilen Ionen nachgewiesen werden. Eine Stoßzelle nahe am Fahr­ stuhl dagegen bevorzugt nur den Nachweis der spontan in der Stoßzelle zerfallenden Ionen. Zwischen spontan und metastabil zerfallenen Ionen gibt es erhebliche Unterschiede, die zu ei­ ner Identifizierung der Ionen ausgenutzt werden kann. Beispielsweise können Peptide, die ent­ weder Leucin oder das genau gleich schwere Isoleucin enthalten, durch ein verschiedenes Zer­ fallsmuster der spontanen Ionen voneinander unterschieden werden. Es ist daher sinnvoll und möglich, auch Massenspektrometer mit zwei Stoßzellen zu bauen.

Natürlich ist eine Stoßzelle auch bei der Konstruktion mit einem Rohr (2) möglich. So kann beispielsweise das ganze Rohr (2) mit Stoßgas gefüllt werden und als Stoßzelle wirken.

Selbstverständlich können auch ganz andere Ausführungsformen von Flugzeitmassenspektro­ metern mit einer erfindungsgemäßen zweiten Beschleunigung, insbesondere einer solchen in einem Fahrstuhl, ausgestattet werden, beispielsweise Flugzeitspektrometer mit mehr als einem Reflektor. Jedem massenspektrometrisch tätigen Fachmann werden in Kenntnis dieser Erfin­ dung solche Einbauten und Ausstattungen möglich sein.

Claims (15)

1. Verfahren für die Aufnahme von Spektren metastabil oder stoßinduziert aus Mutterionen entstehender Fragmentionen in Flugzeitmassenspektrometern, die unter anderem mit einer Ionenquelle für einen pulsförmigen Ausstoß von Ionen, einer Ionenbeschleunigungsein­ richtung, längeren feldfreien Teilflugstrecken und mindestens einem Ionendetektor aus­ gestattet sind, dadurch gekennzeichnet, daß die in einer ersten feldfreien Teilflugstrecke durch Zerfall entstehenden Fragmentionen zusammen mit gleich schnell fliegenden unzerfallenen Mutterionen in einer zweiten Ionen­ beschleunigungseinrichtung auf massenabhängige Geschwindigkeiten nachbeschleunigt werden, so daß sie nach mindestens einer weiteren feldfreien Teilflugstrecke in einem der Ionendetektoren massengetrennt nachgewiesen werden können.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fragment- und Mutterionen zwischen erster und zweiter Teilflugstrecke ein elektrisch leitfähiges Behältnis durchflie­ gen, dessen Potential während des Durchflugs der Ionen so verändert wird, daß die Ionen zwischen erster und zweiter feldfreier Teilflugstrecke nachbeschleunigt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich erste und zweite feldfreie Teilflugstrecke jeweils auf Massepotential befinden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Potential des Behältnisses nicht nur während des Durchflugs, sondern auch wäh­ rend des Eintritts oder Austritts der Ionen so verändert wird, dass durch eine erhöhte Be­ schleunigung der etwas langsameren und daher später am Behältnis eintreffenden Ionen ein gleichzeitiges Ankommen der Ionen am Ort des Detektors und damit eine bessere Massenauflösung erreicht wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionen durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) erzeugt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die im MALDI-Prozeß er­ zeugten metastabilen Ionen als Fragmentionen nachgewiesen werden.

7. Massenspektrometer zur Ausführung der Verfahren nach Ansprüchen 2 bis 6, mindestens bestehend aus einer pulsförmig arbeitenden Ionenquelle mit Beschleunigungsfeldern für die entstandenen Ionen, einer feldfreien Flugstrecke für die Ionen und einem zeitauflösen­ den Detektor für die Messung der Flugzeit der Ionen, dadurch gekennzeichnet, dass sich in der feldfreien Flugstrecke ein elektrisch leitfähiges Behältnis befindet, das von den Ionen durchflogen wird, und dass das Behältnis an eine Spannungsversorgung ange­ schlossen ist, die das Potential des Behältnisses während des Durchflugs der Ionen verän­ dern kann.

8. Massenspektrometer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrisch leitfä­ hige Behältnis am Ioneneintritt und am Ionenaustritt je durch ein feinmaschiges Gitter ver­ schlossen ist, so dass sich im Inneren des Behälters ein feldfreies Potential ausbildet.

9. Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich das elektrisch leitfähige Behältnis zwischen zwei abschirmenden Gittern befindet, die sich auf dem Potential der feldfreien Flugstrecken befinden, damit durch das jeweilige Potential des elektrisch leitfähigen Behältnisses keine Potentialstörung der umgebenden feldfreien Flugstrecken erzeugt wird.

10. Massenspektrometer nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sich das elektrisch leitfähige Behältnis und die abschirmenden Gitter aus der Flugstrecke der Ionen heraus­ bewegen lassen.

11. Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das elektrisch leitfähige Behältnis eine Gaszufuhr für ein Stoßgas enthält.

12. Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sich in der feldfreien Flugstrecke vor dem elektrisch leitfähigen Behältnis ein Mutterionen­ selektor befindet.

13. Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sich in der feldfreien Flugstrecke vor dem elektrisch leitfähigen Behältnis eine Stoßzelle zur stoßinduzierten Fragmentierung befindet.

14. Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sich zwischen dem elektrisch leitfähigen Behältnis und dem Ionendetektor ein Ionen­ reflektor und eine zweite feldfreie Flugstrecke befinden.

15. Massenspektrometer nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die pulsförmig arbeitende Ionenquelle eine Ionisierungseinrichtung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) enthält.