DE102005006125B4

DE102005006125B4 - Lasersystem für die Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse

Info

Publication number: DE102005006125B4
Application number: DE102005006125.7A
Authority: DE
Inventors: Andreas Haase; Markus Kayser; Jens Höhndorf; Armin Holle
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2004-09-14
Filing date: 2005-02-10
Publication date: 2021-04-29
Anticipated expiration: 2025-02-11
Also published as: DE102005006125A1

Abstract

Lasersystem (300) für die Ionisation einer Probe (301) durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasersystem (300) eine einstellbare Vorrichtung enthält, mit der die Laserstrahlung räumlich moduliert wird, und die Intensitätsverteilung der Laserstrahlung auf der Probe (301) in einer Einstellung der Vorrichtung aus einer einzelnen Intensitätsspitze und in einer anderen Einstellung aus einer Vielzahl von Intensitätsspitzen besteht, wobei die einstellbare Vorrichtunga) im Strahlengang des Lasersystems (300) hintereinander ein Linsenarray (306), ein variables optisches System (307), eine erste fokussierende Optik (309) und eine zweite fokussierende Optik (304) enthält, und wobeib) das variable optische System (307) so eingestellt werden kann, dass es in unterschiedlichen Einstellungen jeweils eine von mehreren optischen Ebenen hinter dem Linsenarray (306) in die vordere Fokusebene der ersten fokussierenden Optik (309) abbildet, und wobeic) sich die Probe (301) in der hinteren Fokusebene der zweiten fokussierenden Optik (304) befindet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Lasersystem für die Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse.
Die Erfindung besteht darin, dass ein einstellbares Lasersystem bereitgestellt wird, das in einer Einstellung eine einzelne Intensitätsspitze und in einer anderen Einstellung eine Vielzahl von Intensitätsspitzen auf der Probe erzeugt, wobei die einzelne Intensitätsspitze und/oder die Intensitätsspitzen bezüglich der Halbwertsbreite, der Intensität, der räumlichen Anordnung und/oder des räumlichen Modulationsgrades einstellbar sind.
Stand der Technik
In der massenspektrometrischen Analyse haben sich in den letzten 10 bis 15 Jahren zwei Verfahren zur weichen Ionisation von biologischen Makromolekülen durchgesetzt: die matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI, Abkürzung für „Matrix Assisted Laser Desorption Ionization“) und das Elektrosprühen (ESI, Abkürzung für „Electro Spray Ionization“). Die zu analysierenden biologischen Makromoleküle werden im Folgenden als Analytmoleküle bezeichnet. Beim MALDI-Verfahren sind die Analytmoleküle in der Regel auf der Oberfläche eines Probenträgers in einer festen Matrix präpariert, während sie beim ESI-Verfahren in einer Flüssigkeit gelöst sind. Beide Verfahren haben großen Einfluss auf die massenspektrometrische Analyse von biologischen Makromolekülen in der Genomik, Proteomik und Metabolomik; ihre Erfinder wurden im Jahr 2002 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.
In einer präparierten MALDI-Probe sind die Matrixmoleküle gegenüber den Analytmolekülen mit einem 10³ bis 10⁵ fachen Überschuss vorhanden und bilden eine polykristalline Matrix, in der die Analytmoleküle vereinzelt im Inneren der Kristalle oder an deren Korngrenzen eingebaut sind. Die präparierte MALDI-Probe wird kurzzeitig mit einem Laserpuls bestrahlt, der von den Matrixmolekülen stark absorbiert wird. Durch die gepulste Bestrahlung wird die Matrix explosionsartig aus dem festen Aggregatzustand in die Gasphase einer Verdampfungswolke überführt (Desorption). Die Ionisation der Analytmoleküle erfolgt in der Regel durch deren Protonierung oder Deprotonierung in Reaktionen mit Matrixmolekülen oder Matrixionen, wobei die Analytionen nach dem Verlassen der Verdampfungswolke vorwiegend einfach geladen vorliegen. Der Ionisationsgrad der Analytmoleküle beträgt nur etwa 10^-4. Man spricht von weicher Ionisation, wenn ein Analytmolekül isoliert in die Gasphase überführt und ionisiert wird, ohne einen Bindungsbruch zu erleiden.
Die matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation ist trotz der linearen Absorption durch die Matrix ein nichtlinearer Prozess, der für gepulste Laserstrahlung mit einer Dauer von einigen Nanosekunden erst ab einer Intensitätsschwelle von etwa 10⁶ Watt pro Quadratzentimeter einsetzt. Für eine weiche Ionisation liegt die maximale Intensität bei einer Obergrenze von ungefähr 10⁷ Watt pro Quadratzentimeter. Bei einer typischen Dauer der Laserpulse von etwa zehn Nanosekunden ergibt sich aus den genannten Intensitätsgrenzen eine Fluenz zwischen 10 bis 100 Millijoule pro Quadratzentimeter.
Der MALDI-Prozess ist komplex und wird durch viele und zum Teil voneinander abhängige Faktoren beeinflusst. Seit der Erstveröffentlichung des MALDI-Verfahrens im Jahr 1988 wurden viele Parameter untersucht und variiert. Trotzdem sind die Prozesse in der Matrix und in der Verdampfungswolke, die zur Ionisation der Analytmoleküle führen, noch nicht vollständig verstanden und werden weiterhin intensiv erforscht (K. Dreisewerd, Chem Rev. 103 (2003), 395-425: „The Desorption Process in MALDI‟).
Die chemischen Parameter des MALDI-Prozesses, wie zum Beispiel die Matrixsubstanzen selber, das Konzentrationsverhältnis zwischen Matrix- und Analytmolekülen und die Präparationsbedingungen, sind eingehend untersucht worden. Für Analytmoleküle unterschiedlicher chemischer Substanzklassen, wie etwa Proteine oder Nukleinsäuren, sind über einhundert verschiedene chemische Matrixsubstanzen bekannt, wie zum Beispiel Sinapinsäure, DHB (Abkürzung für „2,5-dihydroxy-bencoic acid“), CHCA (Abkürzung für „α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid“, Zimtsäure) oder HPA (Abkürzung für „3-hydroxypicolinic acid“). Die Matrixsubstanzen weisen im Wellenlängenbereich zwischen 330 und 360 Nanometer eine starke Absorption auf. Eine MALDI-Probe kann auf verschiedene Arten präpariert werden, zum Beispiel mit der „Dried Droplet“ Präparation oder der Dünnschichtpräparation (im Englischen „Thin Layer“). In der „Dried Droplet“ Präparation wird die Matrixsubstanz zusammen mit den Analytmolekülen in einem Lösungsmittel gelöst, auf einen Probenträger aufgetragen und anschließend langsam an Luft getrocknet. In der Dünnschichtpräparation hingegen wird die Matrixsubstanz ohne Analytmoleküle in einem flüchtigen Lösungsmittel, wie z.B. Aceton oder Acetonitril, gelöst und auf den Probenträger aufgetragen. Das flüchtige Lösungsmittel verdunstet im Vergleich zur „Dried Droplet“ Präparation sehr schnell und ermöglicht die Entstehung einer dünnen homogenen Matrixschicht. Danach wird eine Lösung mit Analytmolekülen auf die dünne Matrixschicht gegeben, wodurch diese teilweise erneut gelöst wird und die Analytmoleküle bei der anschließenden Trocknung in die Matrix eingebaut werden. Während in der Dünnschichtpräparation eine homogene MALDI-Probe mit Mikrokristallen entsteht, bilden sich in der „Dried Droplet“ Präparation größere Kristalle und die Oberfläche der MALDI-Probe zeigt eine ausgeprägte Morphologie mit unterschiedlichen Probendicken.
Bei den physikalischen Parametern des MALDI-Prozesses sind bisher vornehmlich die zeitliche Dauer der Laserpulse, die Intensität im Laserfokus und die Wellenlänge der gepulsten Laserstrahlung betrachtet worden.
Für kommerziell verfügbare Massenspektrometer mit MALDI werden heutzutage überwiegend gepulste Lasersysteme im ultravioletten Spektralbereich (UV) verwendet. Dafür stehen verschiedene Lasertypen und Wellenlängen zur Auswahl: Stickstofflaser (λ=337nm), Excimerlaser (λ=193nm, 248nm, 308nm), Nd:YLF Laser (λ=349nm) und Nd:YAG Laser (λ=266nm, 355nm), wobei für das MALDI-Verfahren kommerziell nur der Stickstofflaser und der Nd:YAG Laser bei der Wellenlänge 355 Nanometer von Bedeutung sind und der Stickstofflaser mit großem Abstand am häufigsten eingesetzt wird. Das Lasermedium des Stickstofflasers ist ein Gas, während es beim Nd:YAG Laser ein mit Neodym Ionen dotierter YAG-Kristall (Yttrium-Aluminium-Granat: Y₃Al₅O₁₂) ist. Beim Nd:YAG Laser wird die stärkste Laserlinie, die bei einer Wellenlänge von 1064 Nanometern liegt, in nichtlinearen optischen Kristallen in die angegebenen Wellenlängen umgewandelt. Die Dauer der im MALDI-Verfahren verwendeten Laserpulse beträgt im UV typischerweise zwischen 1 und 20 Nanosekunden, es sind aber im akademischen Bereich auch Pulsdauern im Bereich von Pikosekunden eingesetzt worden.
Für das MALDI-Verfahren werden zu Forschungszwecken gelegentlich auch Lasersysteme eingesetzt, die im infraroten Spektralbereich (IR) emittieren: Er:YAG (λ=2.94µm) und CO2 (λ=10.6µm). Während beim UV-MALDI-Verfahren den Matrixmolekülen über angeregte elektronische Zustände Energie zugeführt wird, werden im IR-MALDI-Verfahren Molekülschwingungen der Matrixmoleküle angeregt. Die Pulsdauer der IR-Lasersysteme im IR-MALDI-Verfahren beträgt zwischen 6 und 200 Nanosekunden. Im Gegensatz zum UV-MALDI-Verfahren werden im IR-MALDI-Verfahren neben festen Matrizes auch flüssige Matrizes verwendet, wie zum Beispiel Glycerin.
Im MALDI-Verfahren eingesetzte Lasersysteme unterscheiden sich nicht nur in der Wellenlänge, sondern auch in ihrem räumlichen Strahlprofil. Bei Festkörperlasern, wie zum Beispiel dem Nd:YAG LAser oder dem Er:YAG Laser, ist das Lasermedium ein mit Ionen dotierter Kristall. Das Lasermedium befindet sich in einem optischen Resonator, der dafür sorgt, dass das räumliche Strahlprofil aus einer transversalen Grundmode oder wenigen transversalen Strahlmoden besteht. Die radiale Intensitätsverteilung der transversalen Grundmode entspricht einer Gaußfunktion und ist zur Ausbreitungsrichtung der Laserstrahlung rotationssymmetrisch. Ein solcher Laserstrahl kann auf einen nur durch die Beugung begrenzten minimalen Durchmesser fokussiert werden.
Der Stickstofflaser bei einer Wellenlänge von 337 Nanometer ist der mit Abstand am häufigsten im MALDI-Verfahren verwendete Lasertyp, wobei diese Wellenlänge die intensivste Laserlinie des Stickstofflasers ist. Als Lasermedium wird gasförmiger Stickstoff verwendet, der durch eine elektrische Entladung zwischen zwei Elektroden angeregt wird. Da die intensivste Laserlinie eine hohe Verstärkung aufweist, kann ein Laserpuls die Besetzungsinversion der Energiezustände bereits dann abbauen, wenn er die Elektroden nur einmal durchläuft. Selbst bei Verwendung von Resonatorspiegeln überlagern sich im Strahlprofil des Stickstofflasers viele transversale Strahlmoden, wodurch der minimale Durchmesser eines Laserfokus von kommerziellen Stickstofflasern bei einer Wellenlänge von 337 Nanometer nur etwa drei Mikrometer beträgt. Der typische Durchmesser der in MALDI-Anwendungen bestrahlten Fläche beträgt etwa 20 bis 200 Mikrometer. Das Strahlprofil des Stickstofflasers hat an den Elektroden ein nahezu rechteckförmiges Plateau (im Englischen „flat top“), wobei die Breite und die Höhe des Strahlprofils durch den Abstand bzw. die Höhe der Entladungselektroden bestimmt werden. Die Wiederholfrequenz der Laserpulse im Stickstofflaser ist auf etwa 100 Hertz begrenzt, wenn nicht für einen schnellen Gasaustausch gesorgt wird. Für MALDI-Anwendungen werden Stickstofflaser mit einer typischen Wiederholfrequenz von 50 Hertz eingesetzt.
Die elektrische Gasentladung im Stickstofflaser ist in der Praxis nicht an jedem Punkt zwischen den Elektroden gleich und erzeugt ein räumlich inhomogenes Verstärkungsprofil, das sich bei der kurzen Dauer der Lasertätigkeit nicht ausgleicht, sondern auf das Strahlprofil des Stickstofflasers überträgt. Der Stickstofflaser hat somit ein räumlich moduliertes plateauförmiges Strahlprofil mit Intensitätsmaxima und -minima, das auf die Probe abgebildet oder auf diese fokussiert wird. Diese im Strahlprofil immanent vorhandenen Inhomogenitäten des Stickstofflasers führen dazu, dass die Intensitätsverteilung der Laserstrahlung auf der Probe räumlich moduliert ist und immer eine Vielzahl von Intensitätsspitzen aufweist.
Die bisher im MALDI-Verfahren eingesetzten gepulsten Festkörperlaser weisen meist ein Strahlprofil auf, das einer einzigen gaußförmigen Strahlmode sehr nahe kommt. Wird ein gepulster Laserstrahl auf die Probe fokussiert oder abgebildet, so ergibt sich am Ort der Probe eine gaußförmige Intensitätsverteilung mit einer einzigen Intensitätsspitze. Die Breite einer Intensitätsspitze wird in der Regel durch die so genannte Halbwertsbreite angegeben. Im Bereich der Halbwertsbreite ist die Intensität größer als die halbe maximale Intensität der Intensitätsspitze. Die Halbwertsbreite kann bei den Festkörperlasern im UV theoretisch weniger als einen Mikrometer betragen, liegt aber in MALDI-Anwendungen typischerweise zwischen 20 und 200 Mikrometer. Auch wenn bei Festkörperlasern prinzipiell Wiederholfrequenzen der Laserpulse von einigen hundert Kilohertz möglich sind, wird derzeit in den meisten MALDI-Anwendungen mit einer Wiederholfrequenz bis zu 200 Hertz gearbeitet. Die Energieschwankungen von Laserpuls zu Laserpuls sind bei Festkörperlasern typischerweise kleiner als beim Stickstofflaser.
Nach dem Stand der Technik wird auf der Probe oft eine räumlich homogene Intensitätsverteilung angestrebt, um die Inhomogenitäten der präparierten MALDI-Probe, wie zum Beispiel bei einer ungleichmäßigen Einlagerung der Analytmoleküle in die Matrix, herauszumitteln. Um bei einem gaußförmigen Strahlprofil eines Festkörperlasers eine homogene Intensitätsverteilung auf der Probe zu erhalten, kann das Strahlprofil durch die Ausbreitung in einer Faser räumlich homogenisiert und danach auf die Probe abgebildet werden. Der Laserstrahl wird dazu in eine Faser eingekoppelt, in der eine Vielzahl von transversalen Fasermoden mit unterschiedlichen radialen Intensitätsverteilungen ausbreitungsfähig ist (Multimodefaser). Durch die Ausbreitung des eingekoppelten Laserstrahls in der Multimodefaser wird Energie aus der gaußförmigen Strahlmode in viele transversale Fasermoden übertragen, die sich am Ausgang der Faser überlagern. Falls die zeitliche Kohärenz der verwendeten Laserstrahlung hinreichend klein bzw. die Multimodefaser hinreichend lang ist, ergibt sich die Intensitätsverteilung am Faserausgang aus der Summe der Intensitätsverteilungen der einzelnen transversalen Fasermoden. Durch die Vielzahl von transversalen Fasermoden mit unterschiedlichen radialen Intensitätsprofilen ergibt sich somit am Faserausgang eine homogene Intensitätsverteilung. Wird nun der Ausgang der Multimodefaser abgebildet, erhält man auch auf der Probe eine plateauförmige Intensitätsverteilung. Dieses Verfahren zur Homogenisierung des Strahlprofils wird auch beim Stickstofflaser verwendet, um die immanenten Inhomogenitäten im Strahlprofil zu minimieren.
Die Güte einer massenspektrometrischen Analyse wird allgemein durch die folgenden Kenngrößen festgelegt: die Massengenauigkeit, die Massenauflösung, das Nachweisvermögen, die quantitative Reproduzierbarkeit und das Signal-Rausch-Verhältnis. Dabei erhöht sich die Güte einer massenspektrometrischen Analyse, wenn mindestens eine Kenngröße verbessert wird und die anderen Kenngrößen dadurch nicht verschlechtert werden. Die Massengenauigkeit umfasst sowohl eine systematische Abweichung der gemessenen mittleren Ionenmasse zur wahren Ionenmasse (Massenrichtigkeit oder besser Massenunrichtigkeit) als auch die statistische Streuung der einzelnen Messwerte um den Mittelwert der Ionenmasse (Massenpräzision). Aus der Massenauflösung ergibt sich, welche Ionenmassen in der massenspektrometrischen Analyse noch unterschieden werden können. In der Praxis ist allerdings nicht nur die Güte, sondern auch die Robustheit der massenspektrometrischen Analyse wichtig. Eine massenspektrometrische Analyse ist dann robust, wenn sich deren Güte bei einer Variation der Messparameter, wie zum Beispiel der Energie der Laserpulse oder der Präparationsbedingungen der MALDI-Probe, wenig ändert.
Das Ionensignal eines Massenspektrometers mit MALDI ist proportional zur Ionisationseffizienz, zum desorbierten Probenvolumen und zur Konzentration der Analytmoleküle in der Probe. Die Ionisationseffizienz ergibt sich aus der Anzahl der auswertbaren Analytionen dividiert durch die Anzahl der Analytmoleküle im desorbierten Probenvolumen, d.h., wie viel Prozent der Analytmoleküle aus dem durch die Laserbestrahlung abgetragenen Probenvolumen einer massenspektrometrischen Analyse als Ionen zur Verfügung stehen. Für den Fall, dass Analytmoleküle schon vor dem Desorptionsvorgang in der Matrix ionisiert vorliegen, erhöht sich die Anzahl der Analytmoleküle um die Anzahl der schon ionisiert vorliegenden Analytionen. Da das desorbierte Probenvolumen durch die bestrahlte Probenfläche und durch die Fluenz relativ leicht erhöht werden kann, stellt die Ionisationseffizienz einen wichtigen Parameter zur Optimierung des MALDI-Prozesses dar. Eine hohe Ionisationseffizienz ermöglicht ein hohes Nachweisvermögen, da ein maximales Ionensignal bei geringer Konzentration (oder bei geringem Probenverbrauch) erzielt wird. Bei einem typischen Ionisationsgrad von nur 10^-4 besteht die Möglichkeit, den MALDI-Prozess erheblich zu verbessern. Die Definition der Ionisationseffizienz des MALDI-Prozesses berücksichtigt auch die Verluste, die durch eine Fragmentierung von Analytmolekülen bei der Überführung in die Gasphase entstehen und somit die Anzahl der auswertbaren Analytionen reduzieren.
Für die massenspetrometrische Analyse der im MALDI-Prozess erzeugten Analytionen kommen im Prinzip sowohl klassische Sektorfeld-Massenspektrometer und Quadrupol-Massenspektrometer wie auch Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer und Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer in Frage. Besonders geeignet sind aber Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss, die für die Messung der Flugzeit (TOF, Abkürzung für „Time Of Flight“) einen gepulsten Ionenstrom benötigen. Der Zeitpunkt für den Start der Flugzeitmessung wird dabei durch den ionisierenden Laserpuls vorgegeben. Der MALDI-Prozess ist ursprünglich für den Einsatz im Vakuum entwickelt worden. In neueren Entwicklungen wird die matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation ebenfalls bei Atmosphärendruck verwendet (AP MALDI, Abkürzung für „Atmospheric Pressure Matrix Assisted Laser Desorption Ionization“). Hier werden die Ionen mit einer Wiederholfrequenz von bis zu 2 Kilohertz erzeugt und mit Hilfe eines Ionenleitsystems einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Einschuss (OTOF, Abkürzung für „Orthogonal Time Of Flight“), einem Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer oder einem Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer zugeführt. In einem OTOF Massenspektrometer können die im MALDI-Prozess erzeugten Ionen fragmentiert und gespeichert werden, bevor die Messung der Flugzeit mit einer elektronischen Auspulsung gestartet wird.
Bei speziellen Analyseverfahren wird die Intensität auf der Probe so weit erhöht, dass die erzeugten Ionen hinreichend viel innere Energie aufweisen, um zu dissoziieren. Je nach der zeitlichen Dauer zwischen der Erzeugung der Ionen und ihrer Dissoziation spricht man von einem Zerfall innerhalb der Ionenquelle (ISD, Abkürzung für „In Source Decay“) oder außerhalb der Ionenquelle (PSD, Abkürzung für „Post Source Decay“).
Es gibt des Weiteren auch bildgebende massenspektrometrische Analyseverfahren (IMS, Abkürzung für „Imaging Mass Spectrometry“), in denen der MALDI-Prozess zur Erzeugung der Ionen verwendet wird. Bei der IMS wird ein dünner Gewebeschnitt, der beispielsweise mit einem Mikrotom aus dem Organ eines Menschen gewonnen wird, mit einer Matrixsubstanz präpariert und räumlich aufgelöst massenspektrometrisch untersucht. Die räumliche Auflösung der massenspektrometrischen Untersuchung kann entweder durch das Abrastern einzelner kleiner Punkte des Gewebeschnittes oder durch eine stigmatische Abbildung der erzeugten Ionen erfolgen. Beim Rasterverfahren wird der gepulste Laserstrahl auf einen kleinen Durchmesser auf der Probe fokussiert, wobei ein Massenspektrum für jeden einzelnen Rasterpunkt gemessen wird. Aus der Vielzahl der einzelnen räumlich aufgelösten Massenspektren wird eine ein- oder zweidimensionale Häufigkeitsverteilung für einzelne Proteine erstellt. Bei der stigmatischen Abbildung wird eine Fläche von bis zu 200 mal 200 Mikrometer homogen mit einem Laserpuls bestrahlt. Die dabei erzeugten Ionen werden Punkt für Punkt ionenoptisch auf einen ortsauflösenden Detektor abgebildet. Bisher kann mit einem einzelnen Laserpuls nur die Häufigkeitsverteilung einer Ionenmasse aufgenommen werden, da es keine hinreichend schnellen ortsauflösenden Ionendetektoren gibt. Allerdings kann die gemessene Ionenmasse von Laserpuls zu Laserpuls variiert werden.
Die Veröffentlichung der Patentanmeldung US 2003/0025074 A1 beschreibt ein Hochdurchsatz-Laser-Desorptions-/Ionisations-Massenspektrometer (LDI), das eine Ionenquelle mit einer Vielzahl von Lasern verwendet, die im Tandem auf eine oder mehrere Proben feuern, um die Rate zu erhöhen, mit der Ionenpakete in der Ionenquelle erzeugt werden.
Die internationale Anmeldung WO 2005/079360 A2 offenbart eine Anordnung von optischen Vorrichtungen zur schnellen Strukturierung von Laserprofilen, die für Desorptions- und/oder Ionisationsquellen in der analytischen Massenspektrometrie verwendet werden.
Die Anmeldung DE 10 2004 044 196 A1 der Anmelderin beschreibt Lasersysteme für die MALDI-Ionisierung, die Laserstrahlen mit spezifischen Strahlprofilen für die Desorption erzeugen.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Lasersystem für die Ionisation einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse bereitzustellen, das bei unterschiedlichen chemischen Parametern, Analyseverfahren und Massenspektrometern eine hohe Güte und Robustheit der massenspektrometrischen Analyse gewährleistet, und zwar insbesondere bei unterschiedlichen Probenpräparationen und bildgebenden massenspektrometrischen Analyseverfahren.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird durch ein Lasersystem gemäß dem angehängten Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausformungen des Lasersystems finden sich in den angehängten Unteransprüchen 2, 3 und 4.
Der vorliegenden Erfindung liegt die weit reichende Erkenntnis zugrunde, dass die Güte und die Robustheit der massenspektrometrischen Analyse von Ionen, die mit dem MALDI-Verfahren erzeugt werden, bei unterschiedlichen chemischen Parametern (z.B. Probenpräparationen), Analyseverfahren und Massenspektrometern wesentlich von der Intensitätsverteilung auf der MALDI-Probe bestimmt werden. Ein erfindungsgemäßes Lasersystem ist deshalb so einstellbar, dass die Intensitätsverteilung der Laserstrahlung auf der MALDI-Probe in einer Einstellung aus einer einzelnen Intensitätsspitze und in einer anderen Einstellung aus einer Vielzahl von Intensitätsspitzen besteht. Ferner ist mit einem erfindungsgemäßen Lasersystem die Halbwertsbreite oder die Intensität der einzelnen Intensitätsspitze oder beides einstellbar. Unter einer Vielzahl von Intensitätsspitzen sind mindestens zwei Intensitätsspitzen zu verstehen, die mit einem erfindungsgemäßen Lasersystem alle oder teilweise bezüglich der Halbwertsbreite, der Intensität, der räumlichen Anordnung und/oder des räumlichen Modulationsgrades eingestellt werden können. Auch die Anzahl der Intensitätsspitzen kann mit einem erfindungsgemäßen Lasersystem verändert werden.
Im völligen Gegensatz zum bisherigen Stand der Technik hat sich gezeigt, dass eine Intensitätsverteilung mit einer Vielzahl von feinen Intensitätsspitzen vorteilhaft für die Güte und Robustheit der massenspektrometrischen Analyse ist, wenn die MALDI-Proben mit der Dünnschichtpräparation hergestellt werden. Werden die Analytionen dabei insbesondere in einem Flugzeitmassenspektrometer mit axialem Einschuss analysiert, können die Ionisationseffizienz, die Massenauflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis gegenüber einer räumlich homogenen Intensitätsverteilung und einer Intensitätsverteilung mit nur einer einzelnen groben Intensitätsspitze deutlich gesteigert werden. Bei der Probenpräparation nach dem Dried-Droplet-Verfahren hingegen kann überraschenderweise eine Intensitätsverteilung mit einer einzigen relativ groben Intensitätsspitze Vorteile gegenüber einer Intensitätsverteilung mit vielen feinen Intensitätsspitzen aufweisen.
Insbesondere bei den beiden bildgebenden massenspektrometrischen Analyseverfahren sind unterschiedliche Intensitätsverteilungen vorteilhaft. Um im Rasterverfahren eine hohe Ortsauflösung in der massenspektroskopischen Analyse zu erzielen, sollte die Intensitätsverteilung auf der Probe aus einer einzelnen feinen Intensitätsspitze mit geringer Halbwertsbreite bestehen. Eine Vielzahl von feinen Intensitätsspitzen kann wiederum die stigmatische Abbildung begünstigen, da bei der Dünnschichtpräparation durch eine optimierte Ionisationseffizienz die Anzahl der auf der bestrahlten Fläche erzeugten Analytionen erhöht wird. Sind zudem die Positionen der Intensitätsspitzen auf der Probe bekannt, kann das ortsaufgelöste Detektorsignal in einfacher Weise einem Ort auf der Probe zugeordnet werden.
Ein erfindungsgemäßes Lasersystem besteht im Allgemeinen aus einem Lasermedium, einer Energiezufuhr zur Anregung der Lasertätigkeit, einem optischen Resonator sowie optischen und elektrooptischen Komponenten zur räumlichen und zeitlichen Modulation der Laserstrahlung. Unter einem Lasersystem wird im Folgenden der gesamte Aufbau aus optischen, elektrischen und elektrooptischen Komponenten verstanden, die für die Erzeugung und Modulation der Laserstrahlung vom Lasermedium bis zum Ort der MALDI-Probe notwendig sind. Die Komponenten zur räumlichen Modulation der Laserstrahlung können sich dabei sowohl innerhalb des optischen Resonators nahe am Lasermedium als auch außerhalb des optischen Resonators befinden. Beispiele für derartige Komponenten sind Linsen, Linsenarrays aus einer Vielzahl von Linsen, Spiegel, aktive Güteschalter zur Pulserzeugung, diffraktive optische Elemente (z.B. Gitter) und nichtlineare optische Kristalle. Für den Fachmann ist ersichtlich, dass nicht alle genannten Komponenten in einem erfindungsgemäßen Lasersystem verwendet werden müssen und durch weitere Komponenten ergänzt werden können.
Im Gegensatz zum bisherigen Stand der Technik kann ein erfindungsgemäßes Lasersystem auf der MALDI-Probe ganz verschiedene Intensitätsverteilungen erzeugen, die bei den jeweiligen chemischen Parametern, Analyseverfahren und Massenspektrometern eine Optimierung der Güte und Robustheit der massenspektrometrischen Analyse ermöglichen. Die Intensitätsverteilung wird dabei entweder manuell oder durch eine Steuersoftware automatisch an die jeweiligen Bedingungen angepasst. Für den Fachmann ist natürlich ersichtlich, dass die Realisierung eines erfindungsgemäßen Lasersystems in vielfältigen Ausführungsformen möglich ist.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die zeigt ein Lasersystem, in dem sich ein Linsenarray und eine sphärische Linse senkrecht zur optischen Achse des Lasersystems bewegen lassen.
Die bis zeigen ein Lasersystem, in dem sich eine sphärische Linse längs der optischen Achse bewegen lässt und dadurch verschiedene optische Ebenen hinter einem Linsenarray verkleinert auf die Probe abgebildet werden.
Die zeigt ein Lasersystem, in dem eine Vielzahl von parallelen Strahlenbündeln erzeugt wird, die alle unterschiedliche Richtungen zur optischen Achse aufweisen und von einer sphärischen Linse auf die Probe fokussiert werden.
Bevorzugte Ausführungsformen
Die zeigt eine erste bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lasersystems (100). Die Lasereinheit (103) ist ein Nd:YLF Laser, der bei einer frequenzverdreifachten Wellenlänge von 349 Nanometer einen zeitlich gepulsten Laserstrahl erzeugt. Das aktive Lasermedium ist dabei ein mit Neodym Ionen dotierter (LiY_1.0-xNd_xF₄)-Kristall. Die Laserpulse der gütegeschalteten Lasereinheit (203) haben eine Pulsdauer von etwa 10 Nanosekunden. Das räumliche Strahlprofil entspricht in guter Näherung einer einzigen gaußförmigen Strahlmode. Die Energie der Laserpulse kann mit einem in der Lasereinheit (103) integrierten Abschwächer eingestellt werden. Die Art des Lasermediums und die von der Lasereinheit (103) erzeugte Wellenlänge sind für alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich; es können alle für den MALDI-Prozess geeigneten Wellenlängen gleichermaßen verwendet werden.
Die Linse (106) und das Linsenarray (107) können nacheinander durch eine Mechanik so in den Strahlengang des Lasersystems (100) geschwenkt werden, dass die hinteren Fokusebenen der Linse (106) und des Linsenarrays (107) in der Ebene der Blende (108) liegen. Dabei bietet sich eine Art Revolvermechanik an, die aus der Mikroskopie für verschiedene Objektive bekannt ist. Das Linsenarray (107) und die Linse (106) erzeugen in der Ebene der Blende (108) eine räumliche Intensitätsverteilung, die aus einer Vielzahl von Intensitätsspitzen bzw. einer einzigen Intensitätsspitze besteht. Die Blende (108) wird durch die Linse (109) in die Zwischenbildebene (110) abgebildet, die wiederum durch die Linse (104) und den Umlenkspiegel (105) verkleinert auf die Probe (101) abgebildet wird. Der Abbildungsmaßstab beträgt typischerweise etwa 1:6. Die Verwendung der Zwischenbildebene (110) ist konstruktiv von Vorteil, da die mechanischen und optischen Elemente, die zur Erzeugung der verschiedenen Intensitätsverteilungen notwendig sind, im Abstand von der Probe im Strahlengang angeordnet werden können.
Die Probe (101) ist mit anderen nicht dargestellten Proben auf dem Probenträger (102) präpariert und enthält die in einer festen Matrix eingebauten Analytmoleküle. Wird die Schwellintensität für den MALDI-Prozess auf der Probe (101) überschritten, setzt die explosionsartige Verdampfung der Matrix ein. Die Analytmoleküle werden mit der Matrix in die Gasphase überführt und liegen in der Verdampfungswolke zu einem gewissen Anteil als Analytionen vor. Durch den Umlenkspiegel (105) wird das Lasersystem (100) räumlich von dem nicht dargestellten Massenspektrometer entkoppelt und dadurch die Überführung der im MALDI-Prozess erzeugten Ionen in das Massenspektrometer erleichtert.
Das Linsenarray (107) hat eine Grundfläche von 25 Quadratmillimeter, auf der in einem quadratischen Gitter sphärischen Linsen typischerweise in einem Abstand von 120 Mikrometer angeordnet sind. Jede einzelne Linse des Linsenarrays (107) hat eine Brennweite von etwa 10 Millimeter. Auf der Probe weisen die Intensitätsspitzen einen Abstand von 20 Mikrometer und eine Halbwertsbreite von 10 Mikrometer auf. Die einzelne Linse (106) hat eine Brennweite von 25 Millimeter und erzeugt auf der Probe eine einzelne Intensitätsspitze, die eine Halbwertsbreite von etwa einem Mikrometer aufweist.
Zwischen den Intensitätsspitzen wird die Probe (101) möglicherweise nicht an allen Stellen gleichmäßig ionisiert. Um die Probe (101) mit einer Folge von Laserpulsen möglichst vollständig zu verbrauchen, kann es deshalb notwendig sein, die Lage der Intensitätsspitzen relativ zur Probe (101) zu verändern. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass während einer Folge von Laserpulsen der Umlenkspiegel (105) verkippt wird oder der Probenträger (102) bewegt wird. Auch eine Verschiebung der abbildenden Linse (109) senkrecht zur optischen Achse ist möglich.
Wird im Lasersystem (100) anstelle der Linse (109) ein Zoomobjektiv verwendet, kann in vorteilhafter Weise der Abbildungsmaßstab zwischen den Blendenebenen (108) und (110) so eingestellt werden, dass Abstand zwischen den Blenden (108) und (110) erhalten bleibt. Durch einen variablen Abbildungsmaßstab können beispielsweise der Abstand zwischen den Intensitätsspitzen und die Halbwertsbreite der einzelnen Intensitätsspitze eingestellt werden. Die einzelne Intensitätsspitze kann stetig von einer feinen Intensitätsspitze mit einer Halbwertsbreite kleiner als 10 Mikrometer bis zu einer groben Intensitätsspitze mit einer Halbwertsbreite größer als 100 Mikrometer verändert werden.
Des Weiteren kann das Linsenarray (107) auch aus einer Vielzahl von Zylinderlinsen bestehen, die in der hinteren Fokusebene eine Vielzahl von Linienfokussen erzeugen. Die Linienfokusse lassen sich ebenfalls als Intensitätsspitzen auffassen, die allerdings längs und quer zum Linienfokus zwei unterschiedliche Halbwertsbreiten haben. Natürlich lassen sich neben der Linse (106) und dem Linsenarray (107) durch die gleiche Mechanik weitere Linsen oder Linsenarrays in den Strahlengang schwenken, so dass sich in der Blendenebene (108) und damit auf der Probe (101) mehr als zwei unterschiedliche Intensitätsverteilungen erzeugen lassen.
Die bis zeigen eine zweite bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lasersystems (200). Die Lasereinheit (203) besteht aus einem Nd:YAG Laser, der bei einer frequenzverdreifachten Wellenlänge von 355 Nanometer einen zeitlich gepulsten Laserstrahl erzeugt. Die Laserpulse der gütegeschalteten Lasereinheit (203) haben eine Pulsdauer von etwa 7 Nanosekunden. Das räumliche Strahlprofil entspricht nahezu einer gaußförmigen Strahlmode. Die Energie der Laserpulse kann mit einem in der Lasereinheit (203) integrierten Abschwächer eingestellt werden.
In der erzeugt das Linsenarray (206) in der hinteren Fokusebene eine Vielzahl von Intensitätsspitzen. Das Linsenarray (206) besteht wie in der ersten Ausführungsform aus einer Vielzahl von sphärischen Linsen und weist ähnliche geometrische Parameter auf. Das gesamte Linsenarray (206) ist vollständig aus Quarzglas gefertigt. Die Linse (207) bildet die hintere Fokusebene des Linsenarrays (206) in einer 1: 1-Abbildung in die Zwischenbildebene (208) ab, die wiederum durch die Linse (204) achtfach verkleinert auf die Probe (201) abgebildet wird. Die einzelnen Fokusse des Linsenarrays (206) werden also verkleinert auf die Probe abgebildet; es entsteht dort eine Vielzahl von Intensitätsspitzen. Im Gegensatz zur ersten Ausführungsform bleibt das Linsenarray (206) immer in der gleichen optischen Ebene, während die Linse (207) in den bis längs der optischen Achse bewegt wird.
In der ist die Linse (207) so in Richtung der Zwischenbildebene (208) verschoben, dass die Ebene direkt hinter dem Linsenarray (206) verkleinert in die Zwischenbildebene (208) abgebildet wird. Da der Laserstrahl direkt hinter dem Linsenarray (206) abgebildet wird und das Linsenarray (206) eine geringe Dicke hat und transparent ist, entsteht in der Zwischenbildebene (208) ein verkleinertes Bild des Laserstrahls. Der Laserstrahl hat vor dem Linsenarray (206) einen Durchmesser von ungefähr einem Millimeter. Durch die beiden Linsen (204) und (207) wird auf der Probe eine einzelne Intensitätsspitze mit einer Halbwertsbreite von etwa 80 Mikrometer erzeugt. Wird die Linse (207) in Richtung des Linsenarrays (206) verschoben und diese vergrößert auf die Zwischenbildebene (208) abgebildet, entsteht auf der Probe (201) eine einzelne Intensitätsspitze mit einer Halbwertsbreite von etwa 200 Mikrometer.
In der befindet sich die Linse (207) in einfacher Brennweite vor der Zwischenbildebene (208) und fokussiert den Laserstrahl. Die Intensitätsverteilung in der Zwischenbildebene (208) weist neben einem dominierenden Hauptmaximum weitere Nebenmaxima auf. Die Nebenmaxima entstehen aufgrund der Beugung des Laserstrahls am Linsenarray (206). Das Hauptmaximum entspricht der nullten Beugungsordnung. Da das Linsenarray (206) relativ grobe Strukturen im Bereich von 100 Mikrometer aufweist, sind die Intensitäten der Nebenmaxima um Größenordnungen geringer als die Intensität des Hauptmaximums. Die Halbwertsbreite des Hauptmaximums in der Zwischenbildebene (208) beträgt etwa 5 Mikrometer. Aufgrund von Abbildungsfehlern und dem begrenzten Auflösungsvermögen hat das Hauptmaximum der Intensitätsverteilung auf der Probe (201) lediglich eine Halbwertsbreite von 3 Mikrometer. Die Intensitäten der Nebenmaxima sind auf der Probe (201) so gering, dass dort die Schwelle für den MALDI-Prozess nicht erreicht wird und somit der MALDI-Prozess nur im Bereich einer einzelnen feinen Intensitätsspitze stattfindet.
Um die Probe (201) auch zwischen den Intensitätsspitzen gleichmäßig aufzubrauchen, wird vorzugsweise das Linsenarray (206) gedreht, so dass die Positionen der Intensitätsspitzen auf der Probe (201) verändert werden. Die Probe (201) und weitere Proben auf dem Probenträger (202) können mit einer einzelnen Intensitätsspitze nacheinander räumlich abgerastert werden, indem der Probenträger (202) bewegt wird. Die feine Intensitätsspitze, die mit dem Lasersystem (200) in erzeugt wird, ist sehr gut geeignet, um im Rasterverfahren eine bildgebende massenspektrometrische Analyse mit hoher Ortsauflösung zu erreichen.
Eine sehr vorteilhafte Erweiterung der zweiten Ausführungsform besteht darin, dass auch so genannte fraktale Talbotebenen nach der hinteren Fokusebene des Linsenarrays (206) in die Zwischenbildebene (208) abgebildet werden. Der Talboteffekt tritt bei allen periodischen Strukturen auf und damit auch beim Linsenarray (206) (K. Besold et al., Pure Appl. Opt. 6 (1997), 691-698: „Practical limitations of Talbot imaging with microlens arrays‟). Der Abstand z_T der Talbotebene von der hinteren Fokusebene des Linsenarrays (206) ergibt sich aus dem Abstand p der periodisch angeordneten Linsen des Linsenarrays (206) und der Wellenlänge λ: z_T = 2· p²/λ. In der Talbotebene treten Intensitätsspitzen auf, die wie die Linsenfokusse in der hinteren Fokusebene des Linsenarrays (206) angeordnet sind. Interessanterweise gibt es zwischen der hinteren Fokusebene und der Talbotebene auch fraktale Talbotebenen, in denen sich die Anzahl der Intensitätsspitzen vervielfacht und die Halbwertsbreite reduziert. Durch die Abbildung geeigneter fraktaler Talbotebenen kann also sogar der Abstand der Intensitätsspitzen auf der Probe (201) eingestellt werden. Insbesondere kann auch der räumliche Modulationsgrad der Intensitätsspitzen eingestellt werden, indem die fraktalen Talbotebenen nicht scharf abgebildet werden, wodurch die Intensität zwischen den Intensitätsspitzen nicht vollständig verschwindet.
Die zeigt eine dritte bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Lasersystems (300). Die Lasereinheit (303) ist hier wieder ein Nd:YAG Laser, der bei einer frequenzverdreifachten Wellenlänge von 355 Nanometer einen zeitlich gepulsten Laserstrahl erzeugt. Das räumliche Strahlprofil entspricht nahezu einer gaußförmigen Grundmode. Die Energie der Laserpulse kann mit einem in der Lasereinheit (203) integrierten Abschwächer eingestellt werden.
Das Linsenarray (306) erzeugt in der hinteren Fokusebene eine Vielzahl von Intensitätsspitzen, die von einem Zoomobjektiv (307) in die vordere Fokusebene (308) der Linse (307) abgebildet werden. Das Linsenarray (306) hat ähnliche geometrische und optische Parameter wie in den ersten beiden Ausführungsformen. Das Zoom objektiv (307) setzt sich aus zwei sphärischen Linsen zusammen, die unabhängig voneinander verschoben werden können. Aus jeder Intensitätsspitze in der Fokusebene (308) erzeugt die Linse (307) ein paralleles Strahlenbündel, wobei jedes Strahlenbündel einen anderen Winkel zur optischen Achse aufweist. In der ist der Übersichtlichkeit halber nur das Strahlenbündel parallel zur optischen Achse dargestellt. Die Probe (301) befindet sich in der hinteren Fokusebene der Linse (304), so dass die verschiedenen parallelen Strahlenbündel auf die Probe (301) fokussiert werden. Da die parallelen Strahlenbündel unter unterschiedlichen Winkeln auf die Linse (304) treffen, ergibt jedes Strahlenbündel eine einzelne Intensitätsspitze, die je nach Richtung und Winkel des Strahlenbündels eine bestimmte Position auf der Probe (301) hat. Auf diese Weise wird auf der Probe (301) eine Vielzahl von Intensitätsspitzen erzeugt. Durch die Brennweiten der Linsen (304) und (309) wird der Abstand der Intensitätsspitzen auf der Probe (301) bei gegebenem Abstand der Intensitätsspitzen in der Fokusebene (308) festgelegt.
Ein wesentlicher Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass der Abstand der beiden Linsen (304) und (309) nicht durch eine Abbildung festgelegt wird, sondern im Prinzip beliebig ist. Des Weiteren kann durch das Zoomobjektiv (307) der Abbildungsmaßstab zwischen der hinteren Fokusebene des Linsenarrays (306) und der Fokusebene (308) stufenlos eingestellt werden. Dadurch wird es in sehr vorteilhafter Weise möglich, die Abstände der Intensitätsspitzen auf der Probe (301) einzustellen. Wie in der zweiten Ausführungsform gezeigt, können natürlich auch fraktale Talbotebenen oder andere optische Ebenen verwendet werden, in denen die Intensitätsspitzen eine höhere Periodizität aufweisen bzw. einen geringen räumlichen Modulationsgrad haben.
Mit dem Zoomobjektiv (307) kann außerdem in sehr vorteilhafter Weise auch die Ebene direkt hinter dem Linsenarray (306) in die Fokusebene (308) abgebildet werden. Dadurch wird in der Fokusebene (308) eine einzelne Intensitätsspitze erzeugt, die durch die beiden Linsen (304) und (309) auf die Probe (301) übertragen wird. Mit dem Zoomobjektiv kann der Abbildungsmaßstab stufenlos verändert werden und die Halbwertsbreite der einzelnen Intensitätsspitze auf der Probe (301) eingestellt werden.
Wie in den ersten beiden Ausführungsformen kann die Probe (301) gleichmäßig aufgebraucht werden, in dem die Position der Intensitätsspitzen auf der Probe (301) während einer Folge von Laserpulsen verändert wird. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass der Umlenkspiegel (305) verkippt wird oder der Probenträger (302) bewegt wird oder vorzugsweise das Linsenarray (306) gedreht wird.
Anstelle des Linsenarrays (206) kann auch eine Kombination aus einem Dammann-Gitter und einer einzelnen sphärischen Linse verwendet werden, um eine Vielzahl von Intensitätsspitzen zu erzeugen. Ein Dammann-Gitter ist ein diffraktives optisches Element (DOE), das den Laserstrahl zwar wie ein übliches Gitter in unterschiedliche Ordnungen beugt, aber den Laserstrahl dabei gleichmäßig auf eine Vielzahl von Ordnungen verteilt. Die verschiedenen Beugungsordnungen des Dammann-Gitters, die als parallele Strahlenbündel mit unterschiedlichen Richtungen zur optischen Achse angesehen werden können, werden durch die einzelne sphärische Linse in deren hintere Fokusebene fokussiert und ergeben eine Vielzahl von Intensitätsspitzen. Diese Intensitätsspitzen können wie in der dritten Ausführungsform beschrieben, durch das Zoomobjektiv (307) in die Fokusebene (308) abgebildet werden. Möglicherweise kann die Erzeugung der parallelen Strahlenbündel, die durch die Linse (304) auf die Probe (301) fokussiert werden, vollständig durch ein einzelnes Damman-Gitter erfolgen, das variabel einstellbar ist. Ein solches variables Damman-Gitter kann prinzipiell aus einem programmierbaren Chip bestehen, der in Flüssigkristallbildschirmen oder -projektoren verwendet wird.
Mit der Kenntnis der Erfindung ist es dem Fachmann möglich, weitere Ausformungen von erfindungsgemäßen Lasersystemen zu entwerfen.

Claims

Lasersystem (300) für die Ionisation einer Probe (301) durch matrixunterstützte Laserdesorption in der massenspektrometrischen Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasersystem (300) eine einstellbare Vorrichtung enthält, mit der die Laserstrahlung räumlich moduliert wird, und die Intensitätsverteilung der Laserstrahlung auf der Probe (301) in einer Einstellung der Vorrichtung aus einer einzelnen Intensitätsspitze und in einer anderen Einstellung aus einer Vielzahl von Intensitätsspitzen besteht, wobei die einstellbare Vorrichtung a) im Strahlengang des Lasersystems (300) hintereinander ein Linsenarray (306), ein variables optisches System (307), eine erste fokussierende Optik (309) und eine zweite fokussierende Optik (304) enthält, und wobei b) das variable optische System (307) so eingestellt werden kann, dass es in unterschiedlichen Einstellungen jeweils eine von mehreren optischen Ebenen hinter dem Linsenarray (306) in die vordere Fokusebene der ersten fokussierenden Optik (309) abbildet, und wobei c) sich die Probe (301) in der hinteren Fokusebene der zweiten fokussierenden Optik (304) befindet.
Lasersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das variable optische System die Ebene direkt hinter dem Linsenarray (306) oder die hintere Fokusebene des Linsenarrays (306) oder beide in die vordere Fokusebene der ersten fokussierenden Optik (309) abbildet.
Lasersystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Abbildungsmaßstab der Abbildung einstellbar ist.
Lasersystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Linsenarray (306) nach jedem Laserpuls oder einigen Laserpulsen bewegt wird.