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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer
biologischen Probe, die durch dieses Verfahren erhältliche
behandelte biologische Probe, die Verwendung von Butendisäure
oder von deren Derivaten, eine behandelte biologische Probe sowie
ein Kit.
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Technischer Hintergrund
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Es
ist seit langem bekannt, dass die genetische Herkunft und die funktionelle
Aktivität einer Zelle durch Studien ihrer Nukleinsäuren
bestimmt und untersucht werden kann. Die Analysen der Nukleinsäuren
und der Proteine ermöglichen direkte Rückschlüsse
auf die Ursache der Aktivitäten von Zellen. Sie sind somit
indirekten, konventionellen Methoden, wie zum Beispiel dem Nachweis
von Stoffwechselprodukten, potentiell überlegen. Daher
ist für die Zukunft mit einer noch starken Verbreitung
von Nukleinsäure- und Proteinanalysen zu rechnen. So werden
molekularbiologische Analysen bereits in vielen Bereichen eingesetzt,
zum Beispiel in der medizinischen und klinischen Diagnostik, in
der Pharmazie, bei der Entwicklung und Evaluierung von Arzneimitteln,
in der Lebensmittelanalytik sowie bei der Überwachung der
Lebensmittelherstellung, in der Agrarwirtschaft bei der Züchtung
von Nutzpflanzen und Nutztieren, in der Forensik, in der Umweltanalytik
sowie in vielen anderen Forschungsgebieten.
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Durch
die Analyse der RNA, speziell der mRNA in Zellen, lassen sich die
Aktivitäten von Genen direkt bestimmen. Die quantitative
Analyse von Transkriptions mustern (mRNA-Mustern) in Zellen durch
moderne molekularbiologische Methoden, wie zum Beispiel Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR
(„Real time RT PCR") oder Genexpressions-Chip-Analysen
ermöglichen zum Beispiel die Erkennung fehlerhaft exprimierter
Gene, wodurch zum Beispiel Stoffwechselkrankheiten, Infektionen
oder die Entstehung von Krebs erkannt werden können. Die
Analyse der DNA aus Zellen durch molekularbiologische Methoden wie
zum Beispiel PCR, RFLP, AFLP oder durch Sequenzierung ermöglicht
zum Beispiel den Nachweis genetischer Defekte oder die Bestimmung
des HLA-Typs sowie anderer genetischer Marker. Die Analyse genomischer
DNA und RNA wird auch zum direkten Nachweis von infektiösen
Erregern, wie zum Beispiel Viren, Bakterien usw. eingesetzt.
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Unbedingte
Voraussetzung für die Analyse von Biomolekülen,
insbesondere von Nukleinsäuren und Proteinen, in biologischen
Proben ist jedoch die sofortige Stabilisierung der biologischen
Probe, da sich gerade der Status (Genexpressionsprofil oder Proteinmuster)
der für die molekularbiologische Untersuchung wichtigen
Bestandteile der frischen Proben bereits direkt nach der Entnahme
der Probe aus ihrer natürlichen Umgebung rapide verändern
kann. Eine längere Lagerung der Proben in einem unbehandelten
Zustand, z. B. bedingt durch einen ungewollt verzögerten
Transport in ein Labor, kann eine molekularbiologische Analyse verfälschen
oder diese gar gänzlich unmöglich machen. Auch
weitere Biomoleküle wie z. B. Metabolite sowie die Morphologie
einer Probe können durch Lagerung in unbehandeltem Zustand
nachteilig beeinflusst werden.
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Gerade
der Nukleinsäure-Status einer biologischen Probe verändert
sich umso stärker, je mehr Zeit zwischen der Entnahme der
Probe und ihrer Analyse verstreicht. Besonders schnell erfolgt hierbei
der Abbau der Ribonukleinsäuren (RNA) durch allgegenwärtige
RNasen. Ebenso kommt es neben dem Abbau von Nukleinsäuren
auch zur Induktion von beispielsweise Stressgenen und damit zur Synthese
neuer mRNA-Moleküle, die das Transkriptmuster der Probe
ebenfalls stark verändern. Daher ist es erforderlich, zum
Erhalt des zu untersuchenden Genexpressionsprofils eine sofortige
Stabilisierung der Probe durchzuführen. Das Gleiche gilt, wenn
eine tiefgefrorene biologische Probe zum Zwecke ihrer Untersuchung
aufgetaut wird. Auch hier kommt es nach dem Auftauen zu einer raschen
Veränderung des Nukleinsäure-Status, insbesondere
durch Abbau von Biomolekülen.
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Nicht
nur für die Analyse von Nukleinsäuren, sondern
auch für detaillierte Untersuchungen des Proteoms einer
biologischen Probe ist eine sofortige Stabilisierung der Probe notwendig,
da auch das Proteinmuster unmittelbar nach Entnahme der Probe verändert
wird. Dies erfolgt zum einen durch Degradation bzw. Neusynthese,
zum anderen aber besonders rasch durch Veränderungen der
Proteinmodifikationen, wie z. B. Phosphorylierung/Dephosphorylierung.
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Um
insbesondere das Expressionsmuster in der biologischen Probe zum
Zeitpunkt der Entnahme vollständig zu konservieren, muss
die Stabilisierung möglichst sofort nach der Zugabe der
Lösung einsetzen, ohne vorherige Vorbehandlungen der Probe.
Für die Stabilisierung von Nukleinsäuren in kompakten
Gewebeproben ergibt sich im Vergleich zu anderen biologischen Proben
eine besondere Schwierigkeit. Gewebe sind, bezüglich ihrer
Zusammensetzung, ihrer Inhaltsstoffe sowie dem Aufbau vielschichtig
und heterogen. Für die Stabilisierung von Nukleinsäuren
in kompakten Gewebeproben muss sich die Wirkung des stabilisierenden
Reagenzes nicht nur an der Oberfläche der Zellen bzw. innerhalb
einer Zellschicht entfalten, sondern auch tief innerhalb des vielschichtigen
Probenmaterials wirken. Zudem müssen häufig innerhalb
ein und derselben biologischen Probe sehr verschiedene Gewebe- und/oder
Zelltypen adressiert werden können, die sich beispielsweise
in der Zellstruktur, dem Membranaufbau, den Kompartimentierungen und
den Biomolekülen, beispielsweise hinsichtlich der Proteine,
der Kohlenhydrate und/oder dem Fettgehalt, unterscheiden.
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Im
Laufe der Jahre wurden eine Vielzahl von unterschiedlichsten Fixierungs-
oder Stabilisierungsreagenzien bzw. Methoden zur Fixierung bzw.
Stabilisierung entwickelt, um einen großen Bereich an verschiedenartigen
biologischen Proben zu fixieren bzw. stabilisieren.
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So
ist als eine Methode der Stabilisierung das Einfrieren biologischer
Proben seit langem bekannt. Dabei wird die Probe direkt nach der
Entnahme aus ihrer natürlichen Umgebung bei –80°C
und tiefer, z. B in flüssigem Stickstoff, tiefgefroren.
Die so behandelte Probe kann dann ohne Integritätsveränderungen
bei etwa –70°C nahezu unbegrenzt gelagert werden.
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Bei
histologischen Analysen müssen Gewebestrukturen sowie zelluläre
und subzelluläre Strukturen in ihrem morphologischen Erscheinungsbild
während der Lagerung erhalten bleiben. Bei Gewebeproben
ist dabei die Fixierung mittels Formalin und gegebenenfalls das
anschließende Einbetten der fixierten Proben in Paraffin
seit langem bekannt.
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Weitere
bekannte Stabilisierungsverfahren umfassen den Einsatz bestimmter
Stabilisierungsreagenzien. Diese Stabilisierungsreagenzien umfassen
beispielsweise kationische Detergentien (
US 5.010,184 ,
US 5.300,545 ,
WO-A-02/00599 und
WO-A-02/00600 ),
oder hochkonzentrierte Ammoniumsulfatlösungen (
US 6,204,375 ).
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Der
Nachteil der aus dem Stand der Technik bekannten Stabilisierungsverfahren
besteht jedoch darin, dass entweder die Stabilisierung von Biomolekülen
wie etwa Nukleinsäuren in den biologischen Proben nur unbefriedigend
und insbesondere die Ausbeute an diesen Biomolekülen aus
den herkömmlich stabilisierten Proben häufig nur
gering ist und/oder dass die Morphologie der Proben nicht in ausreichendem
Maße erhalten bleibt.
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Im
Falle der Stabilisierung durch Einfrieren kommt noch der Nachteil
hinzu, dass dieses Stabilisierungsverfahren durchweg sehr aufwendige,
logistische Voraussetzungen erfordert, da ein Auftauen der Proben
während des Transports, der Lagerung oder während
der unterschiedlichsten An- bzw. Verwendungsprozesse verhindert
werden muss. Neben den zusätzlichen Kosten für
spezielle Probenaufnahmegefäße sowie für
die permanente Kühlung der Proben, ist zudem der Einsatz
von flüssigem Stickstoff nicht nur sehr umständlich,
sondern auch nur unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen durchführbar.
Darüber hinaus gestaltet sich eine nachfolgende Analyse
des gefrorenen Probenmaterials, insbesondere einzelner Bestandteile
der Probe, zumeist sehr schwierig. Zur Verringerung der Nachteile
beim Verarbeiten von gefrorenen Proben sind aus dem Stand der Technik
sogenannte Transitionslösungen bekannt. Dabei wird zunächst
das gefrorene Gewebe in eine auf –70°C bis –80°C
vorgekühlte Lösungen überführt
und anschließend darin für einige Stunden (mindestens
16 Std.) bei etwa –20°C gelagert wird. Nachfolgend
kann dann die mit der Transitionslösung durchtränkte Probe
nur für einen kurzen Zeitraum, beispielsweise maximal zum
Zerteilen der Probe, auf Arbeitstemperaturen von –4°C
bis zu Raumtemperatur erwärmt werden, ohne dass sich der
Nukleinsäurestatus der Probe verändert. Derartige,
beispielsweise aus der
WO-A-2004/72270 bekannte
Transitionslösungen bestehen vornehmlich aus einwertigen
Alkoholen.
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Der
vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem
Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.
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Insbesondere
lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zur Behandlung einer biologischen Probe, vorzugsweise zur Stabilisierung
einer biologischen Probe, anzugeben, mit dem Biomoleküle,
insbesondere Nukleinsäuren, Proteine und Metaboliten, in
der biologischen Probe besser stabilisiert werden können.
Dabei sollte im Vergleich zu den herkömmlichen Stabilisierungsverfahren
die Menge an isolierbaren Biomolekülen erhöht
und/oder die Qualität der Biomoleküle, welche
im Falle von Nukleinsäuren beispielsweise durch Gel-Analyse
oder durch die Anzahl der PCR-Zyklen bis zum Erreichen einer bestimmten
Nukleinsäuremenge bestimmt werden kann, verbessert werden.
Auch die Morphologie der biologischen Probe sollte durch das Stabilisierungsverfahren
gut erhalten bleiben.
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Darüber
hinaus lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein
Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe anzugeben,
mit dem sowohl gefrorene als auch frische biologische Proben bei
möglichst moderaten Temperaturbedingungen, beispielsweise
auch bei Raumtemperatur, ohne Beeinträchtigung des Expressionsprofils
oder des Proteoms der biologischen Probe stabilisiert werden können.
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Weiterhin
sollte das Verfahren zur Behandlung, vorzugsweise zur Stabilisierung
einer biologischen Probe zu einer behandelten, vorzugsweise stabilisierten
biologischen Probe führen, die nicht nur bei moderaten
Temperaturen, beispielsweise bei Raumtemperatur, analysiert werden
kann, sondern gegebenenfalls vor oder nach einer solchen Analyse
für möglichst lange Zeit bei solchen moderaten
Temperaturbedingungen gelagert werden kann.
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Im
Falle von Biomolekülen soll dabei unter dem Begriff „Stabilisierung"
vorzugsweise die Hemmung des Abbaus, der Modifikation, der Induktion
oder der Änderung der Aktivität von Biomolekülen
verstanden werden. Im Falle von histo logischen Analysen der biologischen
Proben soll unter dem Begriff „Stabilisierung" vorzugsweise
das Verhindern einer wesentlichen Änderung der Morphologie
der Proben verstanden werden.
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Einen
Beitrag zur Lösung der Eingangs genannten Aufgaben leistet
ein Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe, umfassend
die Verfahrensschritte
- i) Bereitstellen einer
biologischen Probe, und
- ii) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit Butendisäure
oder mit einem Derivat der Butendisäure.
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Butendisäure
liegt in zwei verschiedenen sterischen Konformationen vor, nämlich
als trans-Butendisäure, die auch als Fumarsäure
bezeichnet wird, und als cis-Buteindisäure, die auch als
Maleinsäure bezeichnet wird. Die Strukturformeln der beiden
Konformationen sehen wie folgt aus.
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Überraschend
wurde festgestellt, dass sich durch das in Kontakt bringen einer
biologischen Probe mit Butendisäure oder mit deren Derivaten,
insbesondere mit Fumarsäure, Maleinsäure sowie
deren Derivaten, insbesondere den Maleimiden, Biomoleküle
wie etwa Nukleinsäuren in der biologischen Probe besser
stabilisie ren lassen. Dabei können die Butendisäure
oder deren Derivate als Additiv auch herkömmlichen Stabilisierungs-
bzw. Fixierungszusammensetzungen zugesetzt werden. Die Zusammensetzungen
mit diesem Additiv zeichnen sich im Vergleich zu den Zusammensetzungen
ohne das Additiv durch ein besseres Stabilisierungsvermögen
von Biomolekülen in einer biologischen Probe, insbesondere
durch ein verbessertes Stabilisierungsvermögen für
Nukleinsäuren, aus.
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Die
Derivate der Maleinsäure weisen vorzugsweise die Struktur
(III)
auf, in der X
- a) ein Sauerstoffatom,
- b) eine Gruppe der Struktur (IV)
- c) oder eine Gruppe NR1 ist,
wobei
R1
- – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter
Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Koh lenstoffatomen,
beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen,
- – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter
Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6,
7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen,
- – ein COOR3-Rest, in dem R3 ein Wasserstoffatome oder ein Alkyl-Rest
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen
und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise
mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen ist,
- – ein Wasserstoffatom oder
- – ein NR4R5-Rest
ist, in dem R4 und R5 ein
Wasserstoffatom, ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter
Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen,
beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen oder ein
gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest
mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10,
11 oder 12 Kohlenstoffatomen ist, und
wobei R2
- – ein Wasserstoffatom,
- – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter
Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis
4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Koh lenstoffatomen,
beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, oder
- – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter
Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6,
7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen,
ist.
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Bevorzugte
Verbindungen der Struktur (III) sind insbesondere Verbindungen ausgewählt
aus den nachfolgenden Strukturen (V), (VI) und (VII):
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Bei
diesen Verbindungen handelt es sich vorzugsweise um Maleinsäureanhydride
(III), Maleimide (IV) und Ester der Maleinsäure (VII).
Hinzu kommt, als ebenfalls unter die erste Definition fallendes
Agens, Fumarsäure (I).
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Bei
der im Verfahrensschritt i) bereitgestellten biologischen Probe
kann es sich um eine gefrorene oder um eine nicht gefrorene biologische
Probe handeln, wobei als biologische Probe alle dem Fachmann bekannten
biologischen Proben eingesetzt werden können. Bevorzugte
biologische Proben sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend
Biomoleküle, beispielsweise natürliche, vorzugsweise
isolierte lineare, verzweigte oder zirkuläre Nukleinsäuren
wie RNA, insbesondere mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA oder
Ribozyme, DNA und dergleichen, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren,
beispielsweise Oligonukleotide, insbesondere für die PCR
verwendete Primer, Sonden oder Standards, mit Digoxigenin, Biotin
oder Fluoreszensfarbstoffen markierte Nukleinsäuren oder
sogenannte PNAs („peptide nucleic acids"), natürliche,
vorzugsweise isolierte Proteine oder Oligopeptide, synthetische
oder modifizierte Proteine oder Oligopeptide, beispielsweise mit
Fluoreszenzmarkern oder Enzymen gekoppelte Antikörper,
Hormone, Stoffwechselprodukte und Metaboliten, Wachstumsfaktoren,
Lipide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Proteoglukane, Körperflüssigkeiten
wie Blut, Sperma, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Sputum,
Crusta Phlogistica oder Urin, Flüssigkeiten, welche beim
Aufarbeiten von Blut erhalten werden, wie etwa Serum oder Plasma,
Leukozyten-Fraktionen oder „buffy coat", Blutegelspeichel
(Saliva), Fäkalien, Abstriche, Punktate, Schuppen, Haare,
Hautfragmente, forensische Proben, Lebensmittel- oder Umweltproben,
die freie oder gebundene Biomoleküle, insbesondere freie
oder gebundene Nukleinsäuren enthalten, Stoffwechselprodukte,
ganze Organismen, vorzugsweise ganze nicht lebende Organismen, Gewebe
von Mehrzellern, vorzugsweise von Insekten und Säugetieren,
insbesondere vom Menschen, beispielsweise in Form von Gewebeschnitten
oder -fragmenten oder Organen, isolierte Zellen, beispielsweise
in Form adhärenter oder suspendierter Zellkulturen, Organellen,
beispielsweise Chloroplasten oder Mitochondrien, Vesikel, Zellkerne
oder Chromosomen, Pflanzen, Pflanzenteile, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen,
Bakterien, Viren, Viroide, Prionen, Hefen und Pilze.
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Als
eine nichtgefrorene biologische Probe wird im Verfahrensschritt
i) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise
eine frisch hergestellte biologische Probe eingesetzt, beispielsweise
eine frische Gewebeprobe oder frisch isolierte Blut zellen aus einem
lebendigen oder toten Organismus oder, im Falle synthetischer Biomoleküle
als biologische Probe, frisch synthetisierte Nukleinsäuren
oder Proteine. Unter einer „frischen" biologischen Probe
wird dabei erfindungsgemäß vorzugsweise eine Probe
verstanden, die, bevor sie mit der Butendisäure oder mit
deren Derivat im Verfahrensschritt ii) in Kontakt gebracht wird,
vor nicht mehr als 96 Stunden, vorzugsweise vor nicht mehr als 48
Stunden, besonders bevorzugt vor nicht mehr als 24 Stunden, darüber hinaus
bevorzugt vor nicht mehr als 10 Stunden, darüber hinaus
noch mehr bevorzugt vor nicht mehr als 60 Minuten und am meisten
bevorzugt vor nicht mehr als 10 Minuten entnommen oder, im Falle
eines synthetischen Biomoleküls, synthetisiert worden ist.
Die Bezeichnung „frische" biologische Probe umfasst jedoch
auch solche Proben, die innerhalb der vorstehend genannten Zeiträume
entnommen worden sind, die jedoch vor dem in Kontakt bringen mit
der Butendisäure oder mit deren Derivat noch vorbehandelt
worden sind, beispielsweise mit herkömmlichen Fixativen,
wie etwa Formalin, mit Farbstoffen, wie etwa Eosin, mit Antikörpern
und dergleichen. Die Herstellung frischer Zell- oder Gewebeproben
kann dabei durch alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Präparationsverfahren
erfolgen, im Falle einer Gewebeprobe beispielsweise mittels eines
Skalpells, etwa bei einer Operation oder einer Autopsie, im Falle
einer Blutzellprobe durch Zentrifugation von frisch entnommenem
Blut und dergleichen. Im Falle eines Einsatzes einer frischen biologischen
Probe dient die Butendisäure oder deren Derivat, bzw. eine
Zusammensetzung, welche diese Verbindung als Additiv umfasst, in
erster Linie als Stabilisierungsreagenz bzw. als Stabilisierungszusammensetzung.
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Als
eine gefrorene biologische Probe wird im Verfahrensschritt i) des
erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise eine
biologische Probe eingesetzt, die, nachdem sie beispielsweise auf
die zuvor beschriebene Art und Weise isoliert worden ist, vor dem
in Kontakt bringen mit der Butendisäure oder mit deren
Derivat im Verfahrensschritt ii) zunächst auf Temperaturen
von 0°C oder weniger, vorzugs weise auf Temperaturen von –20°C
oder weniger und am meisten bevorzugt auf Temperaturen von –70°C
oder weniger, etwa durch das in Kontakt bringen mit flüssigem
Stickstoff, abgekühlt worden ist. Wird eine auf diese Weise
eingefrorene biologische Probe im erfindungsgemäßen
Verfahren eingesetzt, so dient die Butendisäure oder deren
Derivat bzw. eine Zusammensetzung, welche diese Verbindung als Additiv
umfasst, in erster Linie als Transitionsreagenz bzw. als Transitionszusammensetzung.
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Im
Verfahrensschritt i) wird die biologische Probe mit Butendisäure
oder mit deren Derivat, vorzugsweise mit einer Verbindung der Struktur
III, in Kontakt gebracht.
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Wenn
es sich bei der Gruppe -X- um eine NR1-Gruppe
handelt, so kann es sich bei dem Rest R1 dieser Verbindung
der Struktur III, neben einem Wasserstoffatom, um einen gegebenenfalls
Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen
handeln. Die Formulierung „Stickstoff substituierter Alkyl-Rest"
soll erfindungsgemäß diejenigen Alkyl-Reste umfassen,
in denen ein oder mehrere Wasserstoffatome durch NH2-Rest,
NHR-Reste oder NR2-Reste, in denen R vorzugsweise
ein Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt
ein Methyl-Rest oder ein Ethyl-Rest ist, substituiert ist. Die Formulierung „Halogen
substituierter Alkyl-Rest" soll demnach erfindungsgemäß diejenigen
Alkyl-Reste umfassen, in denen ein oder mehrere Wasserstoffatome
durch ein Halogenatom, vorzugsweise durch Fluor, Chlor, Brom oder
Iod, besonders bevorzugt durch Fluor oder Chlor, substituiert ist/sind.
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Besonders
bevorzugte Alkyl-Reste Reste R1 sind ausgewählt
aus der Gruppe umfassend
-CH3,
-CH2CH3,
-CH2CH2CH3,
-CH(CH3)2,
-CH2Cl, -CHCl2,
-CCl3,
-CH2CH2Cl,
-CHClCH3,
-CH2NH2 und
-CH2CH2NH2,
wobei
-CH3 und -CH2CH3 am meisten bevorzugt sind.
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Weiterhin
kann es sich bei dem Rest R1 um einen gegebenenfalls
Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen
handeln. Auch hier hat die Formulierung „Stickstoff oder
Halogen substituierter Aryl-Rest" die vorstehend im Zusammenhang
mit dem Alkylrest beschriebene Bedeutung.
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Besonders
bevorzugte Aryl-Reste sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend
-C6H5 (Phenyl-Rest),
-C6H4Cl,
-CH2-C6H5 (Benzyl-Rest),
-CH2-C6H4Cl,
-C10H7 (Naphthyl-Rest)
und
-C10H6Cl,
wobei
der Phenyl-Rest am meisten bevorzugt ist.
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Auch
kann es sich bei dem R1 um einen COOR3-Rest handeln, wobei R3 ein
Wasserstoffatom oder ein Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt
mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5
oder 6 Kohlenstoffatomen ist.
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Besonders
bevorzugte COOR3-Reste sind ausgewählt
aus der Gruppe umfassend
-COOH,
-COOCH3,
und
-COOCH2H3,
wobei
der Rest -COOH am meisten bevorzugt ist.
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Schließlich
kann es sich bei dem Rest R1 auch um einen
-NR4R5-Rest handeln,
in dem R4 und R5 ein Wasserstoffatom,
ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Rest
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein gegebenenfalls Stickstoff
oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen
ist, wobei die Formulierung „Stickstoff oder Kohlenstoff
substituierter Alkyl-Rest" bzw. „Stickstoff oder Halogen
substituierter Aryl-Rest" die vorstehend genannte Bedeutung hat.
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Besonders
bevorzugte -NR4R5-Rest-Reste
sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend
-NH2,
-HCH3,
-N(CH3)2,
-NH(CH2CH3), und
-N(CH2CH3)2,
wobei
der Rest NH2 am meisten bevorzugt ist.
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Bei
dem Rest R2 in der Struktur III sowie in
den Strukturen IV, V, VI und VII kann es sich, neben einem Wasserstoffatom,
um einen gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierten Alkyl-Rest
mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen handeln, wobei die Formulierung „Stickstoff
oder Halogen substituierten Alkyl-Rest" die vorstehend genannte
Bedeutung hat und bevorzugte Alkyl-Reste R2 diejenigen
Alkyl-Reste sind, die bereits im Zusammenhang mit dem Rest R1 als bevorzugte Alkyl-Reste genannt wurden.
Auch kann es sich bei dem Rest R2 in der
Struktur III sowie in den Strukturen IV, V, VI und VII um einen
gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest
mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10,
11 oder 12 Kohlenstoffatomen, handeln. Grundsätzlich können
die Reste R2 in den Strukturen III bis VII
gleich oder verschieden sein.
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Erfindungsgemäß am
meisten bevorzugte Verbindungen der Struktur III sind ausgewählt
aus der Gruppe umfassend Maleinsäureanhydrid, Maleimid,
Methylmaleimid und Ethylmaleimid, wobei Methylmaleimid und Ethylmaleimid
am meisten bevorzugte Derivate der Maleinsäure sind.
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Gemäß einer
besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird die Butendisäure oder wird deren Derivat
als solche bzw. als solches, also ohne weitere feste oder flüssige
Bestandteile, mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht. Diese
Vorgehensweise kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn eine
flüssige biologische Probe behandelt werden soll. In diesem
Fall kann die Butendisäure oder deren Derivat in geeigneter
Menge in der biologischen Probe gelöst oder dispergiert,
vorzugsweise gelöst sein, wobei die Konzentration der Butendisäure
oder des Derivates der Butendisäure in der flüssigen
biologischen Probe nach dem in Kontakt bringen mit derselben bis
zur Sättigungskonzentration der Butendisäure oder
des Derivates der Butendisäure in der jeweiligen Zusammensetzung
reichen kann, vorzugsweise jedoch in einem Bereich von 0,1 mMol
bis 10 Mol/l, besonders bevorzugt von 10 mMol/l bis 5 Mol/l und
am meisten bevorzugt von 100 mMol/l bis 1 Mol/l liegt. Im Falle
einer festen biologischen Probe kann die feste Probe auch in der
festen Butendisäure oder deren Derivat eingelegt werden.
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Gemäß einer
anderen besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird jedoch die Butendisäure oder deren Derivat
nicht alleine, sondern in Form eines in einer Zusammensetzung enthaltenen
Additivs mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht.
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In
diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass die Zusammensetzung neben
der Butendisäure oder deren Derivat mindestens eine weitere
Komponente ausgewählt aus einem Lösungsmittel,
einem Zusatzstoff oder einer Mischung hieraus umfasst.
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Bei
dem Lösungsmittel, welches gegebenenfalls in der Zusammensetzung
enthalten sein kann, kann es sich um jedes Lösungsmittel
handeln, einschließlich Lösemittel welche üblicherweise
in Zusammensetzungen zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierung
biologischer Proben enthalten sind. Vorzugsweise handelt es sich
bei dem Lösungsmittel um ein Lösungsmittel ausgewählt
aus der Gruppe umfassend Wasser, einwertige Alkohole (Monoole),
mehrwertige Alkohole, Aldehyde, Ketone, Dimethylsulfoxid, aromatische
Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Etter, Carbonsäuren,
Carbonsäureamide, Nitrile, Nitroalkane, Ester oder Mischungen
aus mindestens zwei dieser Lösungsmittel.
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Unter
diesen Lösungsmitteln besonders bevorzugt sind insbesondere
Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe umfassend
Wasser, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1,2-Propandiol,
1,3-Propandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 1,5-Pentandiol,
2,4-Pentandiol, Ethylenglykol, Propylenglykol, Diethylenglykol,
Dipropylenglykol, Triethylenglykol, Tripropylenglykol, 1,2,3-Propantriol,
1,2,6-Hexantriol, 3-Methyl-1,3,5-Pentan-triol, 1,2,4-Butantriol,
Acetonitril, Aceton, Anisol, Benzonitril, Benzylalkohol, 1-Methoxy-2-Propanol,
Quinolin, Cyclohexanon, Diacetin, Dichloromethan, Chloroform, Diethylether,
Dimethylether, Toluol, Dimethylketon, Diethylketon, Dimethyladipat,
Dimethylcarbonat, Dimethylsulfit, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Methylacetat,
Ethylacetat, Benzoesäure, Methylbenzoat, Ethylbenzoat,
Ethylbenzol, Formamid, Glycerintriacetat, Ethylacetoacetat, Methylacetoacetat,
N,N-Diethylacetamid, N-Methyl-N-ethylacetamid, N,N-Dimethylacetamid,
N,N-Dimethylformamid, N-Methyl-N-ethylformamid, N,N-Diethylformamid,
N,N-Dimethylthioformamid, N,N-Diethylthioformamid, N-Methyl-N-ethylthioform-amid,
N,N-Dimethylacetamid, N-Methyl-N-Ethylacetamid, N,N-Diethylacetamid,
Nitroethan, Nitromethyltoluol, Triethylphosphat oder Mischungen aus
mindestens zwei dieser Lösungsmittel.
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Bei
dem Zusatzstoff, der gegebenenfalls in der Zusammensetzung enthalten
sein kann, kann es sich um jeden Zusatzstoff handeln, der üblicherweise
in Zusammensetzungen zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierung
biologischer Proben enthalten ist. Bevorzugte Zusatzstoffe sind
dabei ausgewählt aus der Gruppe umfassend Salze, wie beispielsweise
Ammoniumsulfit, Ammoniumsulfat, Caesiumsulfat, weitere Ammoniumsalze,
weitere Sulfatsalze, Litiumnitrat, Natriumacetat, Kaliumacetat,
Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Calciumchlorid, osmotisch aktive
Substanzen, wie etwa Mannitol, Detergentien, Inhibitoren, welche
den Abbau von Nukleinsäuren oder Proteinen hemmen, wie
beispielsweise der Protease-Inihibor PMSF oder die kommerziell erhältlichen
Produkte ANTI-RNase (Ambion, St. Austin, USA), RNAsecure® (Ambion) oder DEPC, Alkylierungsmittel,
Acetylierungsmittel, Halogenierungsmittel, Nukleotide, Nukleotid-analoge-Verbindungen,
Aminosäuren, Aminosäure-analoge Verbindungen,
Betain, Visko sitätsregulierer, Farbstoffe, insbesondere
Farbstoffe zum spezifischen Anfärben bestimmter Zellstrukturen,
Pufferverbindungen, beispielsweise MES, HEPES, MOPS oder IRIS, Konservierungsstoffe,
Komplexbildner, wie beispielsweise EDTA oder EGTA, Reduktionsmittel,
wie beispielsweise 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT), Hydrogensulfid,
Ascorbinsäure, NADPH, Tricarboxyethylphosphin (TCEP) und
Hexamethylphosphorsäuretriamid (Me2N)3P, Oxidationsmittel
wie 5,5'-Dithio-bis(2-Nitrobenzesäure) (DTNB), Substanzen,
welche die Permeabilität von Zellen verbessern, beispielsweise
DMSO oder DOPE, chaotrope Substanzen, wie beispielsweise Guanidiniumisothiocyanat
oder Guanidinium-Hydrochlorid, Fixative, kreuzvernetzende Agentien,
wie beispielsweise Formaldehyd oder Glutardialdehyd, Essigsäure
oder Trichloressigsäure, Zucker, trocknungsmittel wie etwa
Silikagel, Phenol und Phenolderivate sowie Mischungen aus mindestens
zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf oder
mindestens sechs dieser Zusatzstoffe.
-
Wenn
es sich bei der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung um eine
flüssige Zusammensetzung handelt, so kann die Butendisäure
oder deren Derivat in dieser flüssigen Zusammensetzung
in einer Konzentration bis hin zur Sättigungskonzentration
in der jeweiligen Zusammensetzung vorliegen, wobei sie jedoch vorzugsweise
in einer Konzentration in einem Bereich von Bereich von 0,01 mMol
bis 10 Mol/l, besonders bevorzugt von 1 mMol/l bis 5 Mol/l und am
meisten bevorzugt von 10 mMol/l bis 4 Mol/l vorliegt.
-
Weiterhin
ist es im Falle eines Einsatzes der Butendisäure oder eines
Derivates der Butendisäure in Form der vorstehend beschriebenen
Zusammensetzung bevorzugt, wenn die Zusammensetzung
- – 0 bis 99,99 Gew.-%, besonders bevorzugt 25 bis 99
Gew.-% und am meisten bevorzugt 50 bis 90 Gew.-% des Lösungsmittels,
- – 0 bis 99,99 Gew.-%, besonders bevorzugt 22 bis 99
Gew.-% und am meisten bevorzugt 40 bis 80 Gew.-% des Zusatzstoffes,
sowie
- – im Falle einer flüssigen Zusammensetzung
die Butendisäure oder deren Derivat in den vorstehend beschriebenen
Konzentrationsbereichen und im Falle einer festen Zusammensetzung
die Butendisäure oder deren Derivat in einer Menge in einem
Bereich von 0,001 bis 99,9 Gew.-%, besonders bevorzugt in einem Bereich
von 0,01 bis 90 Gew.-% und am meisten bevorzugt in einer Menge in
einem Bereich von 0,1 bis 80 Gew.-%,
wobei die Gesamtmenge
aus Lösungsmittel, Zusatzstoff und Verbindung Butendisäure
bzw. Derivat der Butendisäure 100 Gew.-% beträgt.
-
Die
Herstellung der Zusammensetzung aus dem Lösungsmittel,
dem Zusatzstoff und der Butendisäure bzw. dem Derivat der
Butendisäure erfolgt vorzugsweise durch einfaches Vermischen
der Komponenten. Sollte eine der Komponenten einen Schmelzpunkt
oberhalb der Raumtemperatur haben, so kann es bevorzugt sein, diese
Komponente bis zum Schmelzpunkt zu erhitzen und dann mit den übrigen
Komponenten zu vermischen. Denkbar ist aber auch, dass, wenn eine
der Komponenten bei der Herstellung der Zusammensetzung in fester
und eine andere Komponente in flüssiger Form vorliegt,
die feste Komponente in der flüssigen Komponente zu lösen.
So kann beispielsweise eine feste Verbindung der Struktur III in
einem flüssigen Zusatzstoff oder Lösemittel gelöst
werden.
-
Das
in Kontakt bringen der Zusammensetzung mit der biologischen Probe
im Verfahrensschritt ii) erfolgt im Falle einer flüssigen
Zusammensetzung vorzugsweise dadurch, dass die biologische Probe
in die Zusammensetzung eingetaucht wird, so dass die gesamte Probe
von der Zusammensetzung durchtränkt werden kann. Wird als
biologische Probe ein Fluid oder isolierte Zellen oder z. B. eine
granuläre Probe eingesetzt, so erfolgt das in Kontakt bringen
durch Vermischen der biologischen Probe mit der Zusammensetzung
oder durch Suspendieren der biologischen Probe in der Zusammensetzung.
Alternativ können bei der gewählten Temperatur
feste Zusammensetzungen direkt in einer flüssigen biologischen
Probe (z. B. Blut, Plasma, Urin, Speichel) gelöst werden.
Im Falle einer festen biologischen Probe und einer festen Zusammensetzung
kann die feste Probe auch in der festen Zusammensetzung eingelegt
werden.
-
Es
ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass
das in Kontakt bringen der biologischen Probe mit der Butendisäure
oder mit deren Derivat bzw. mit der Zusammensetzung beinhaltend
die Butendisäure oder deren Derivat bei einer Temperatur
in einem Bereich von –80°C bis +80°C,
bevorzugt in einem Bereich von 0°C bis +80°C,
noch mehr bevorzugt in einem Bereich von 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8°C
bis +80°C und darüber hinaus bevorzugt in einem
Bereich von 18°C bis +80°C erfolgt, beispielsweise
bei einer Temperatur von mindestens –20°C, –19°C, –18°C, –17°C, –16°C, –15°C, –14°C, –13°C, –12°C, –11°C, –10°C, –9°C, –8°C, –7°C, –6°C, –5°C, –4°C, –3°C, –2°C, –1°C,
0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C,
5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C,
10°C, 11°C, 12°C, 13°C, 14°C,
15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C,
20°C, 21°C, 22°C, Raumtemperatur, 23°C,
24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C,
29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C,
34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C,
39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C,
45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C,
50°C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C,
55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C
oder 60°C erfolgt.
-
Dabei
bedeutet die Formulierung, dass das „in Kontakt bringen
der biologischen Probe mit der Butendisäure oder mit deren
Derivat bzw. mit der Zusammensetzung beinhaltend die Butendisäure
oder deren Derivat bei einer Temperatur in einem Bereich von –80°C
bis +80°C" oder bei einer der anderen, vorstehend genannten
Temperaturen erfolgt, dass nach dem in Kontakt bringen der biologischen Probe
mit der Butendisäure oder mit deren Derivat bzw. der Zusammensetzung
die Temperatur der auf diese Weise erhaltenen Mischung innerhalb
der vorstehend genannten Temperaturen liegt. So kann es beispielsweise
sein, dass als biologisches Material eine auf Temperaturen von weniger
als –20°C tiefgefrorene Probe, beispielsweise
eine in flüssigem Stickstoff gelagerte Probe eingesetzt
wird, wobei in diesem Falle eine solche Menge an Maleinsäure
oder an Derivat bzw. an Zusammensetzung mit einer solchen Temperatur
eingesetzt wird, dass nach dem in Kontakt bringen der tiefgefrorenen
biologischen Probe mit der Butendisäure oder mit deren
Derivat bzw. mit der Zusammensetzung die Temperatur der Mischung
(und somit auch die Temperatur der biologische Probe) im vorstehend
genannten Temperaturbereich liegt.
-
Weiterhin
kann es gemäß einer besonderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens auch bevorzugt
sein, dass die biologische Probe nach dem in Kontakt bringen mit
der Butendisäure oder mit deren Derivat bzw. mit der Zusammensetzung
beinhaltend die Butendisäure oder deren Derivat im Verfahrensschritt
ii), vorzugsweise unter den vorstehend genannten Temperaturbedingungen,
noch in einem sich an den Verfahrensschritt ii) anschließenden
Verfahrensschritt iii) bei einer Temperatur in einem Bereich von –80°C
bis +80°C, bevorzugt in einem Bereich von 0°C
bis +80°C, noch mehr bevorzugt in einem Bereich von 2,
3, 4, 5, 6, 7 oder 8°C bis +80°C und darüber
hinaus bevorzugt in einem Bereich von 18°C bis +80°C
erfolgt, beispielsweise bei einer Temperatur von mindestens –20°C, –19°C, –18°C, –17°C, –16°C, –15°C, –14°C, –13°C, –12°C, –11°C, –10°C, –9°C, –8°C, –7°C, –6°C, –5°C, –4°C, –3°C, –2°C, –1°C,
0°C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C,
5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C,
10°C, 11°C, 12°C, 13°C, 14°C,
15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C,
20°C, 21°C, 22°C, Raumtemperatur, 23°C,
24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C,
29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C,
34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C,
39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C,
44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C,
49°C, 50°C, 51°C, 52°C, 53°C,
54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C,
59°C oder 60°C gelagert wird, wobei diese Lagerung
gegebenenfalls über einen Zeitraum von mindestens einem
Tag, mindestens 2 Tagen, mindestens 3 Tagen, mindestens einer Woche,
von mindestens zwei Wochen, von mindestens einem Monat, von mindestens
drei Monaten, von mindestens sechs Monaten oder auch von mindestens
12 Monaten erfolgen kann.
-
Das
Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht
die Lagerung einer behandelten biologischen Probe bei Kühlschranktemperaturen,
bei Raumtemperatur oder bei noch höheren Temperaturen,
ohne dass es zu einem erkennbaren Abbau von Biomolekülen
wie Nukleinsäuren oder Proteinen in der biologische Probe
kommt. Dieses stellt einen signifikanten Vorteil gegenüber
herkömmlichen Stabilisierungsverfahren dar, da das Verfahren
ohne den Einsatz von flüssigem Stickstoff oder von Tiefkühlvorrichtungen
durchgeführt und die stabilisierte Probe auch ohne den
Einsatz von flüssigem Stickstoff oder von Tiefkühlvorrichtungen
gelagert werden kann. Insbesondere zum Zwecke einer längerfristigen
Archivierung können die Proben natürlich, wie allgemein üblich,
auch bei niedrigen Temperaturen, etwa bei –20°C
oder –80°C, gelagert werden, wobei dieses jedoch
nicht zwingend ist.
-
Nach
der erfindungsgemäßen Behandlung und gegebenenfalls
vor oder auch nach einem möglichen Lagerungsschritt iii)
kann die behandelte biologische Probe auch in geeignete Einbettungsmittel
eingebettet werden, beispielsweise in Paraffin oder dergleichen,
um dann aus der biologischen Probe für histologische Untersuchungen
geeignete Gewebeschnitte einfacher anfertigen zu können.
-
Weiterhin
kann es gemäß einer besonderen Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt sein,
dass sich an den Verfahrensschritt i) und ii) noch ein Verfahrensschritt
iv)
Analyse von Biomolekülen in der oder aus der mit der Butendisäure
oder mit deren Derivat (bzw. mit einer Zusammensetzung beinhaltend
die Butendisäure oder deren Derivat) in Kontakt gebrachten
biologischen Probe und/oder histologische Analyse der mit der Butendisäure
oder mit deren Derivat (bzw. mit einer Zusammensetzung beinhaltend
die Butendisäure oder deren Derivat) in Kontakt gebrachten
biologischen Probe, besonders bevorzugt jedoch die Analyse von Biomolekülen
in der oder aus der mit der Butendisäure oder mit deren Derivat
(bzw. mit einer Zusammensetzung beinhaltend die Butendisäure
oder deren Derivat) in Kontakt gebrachten biologischen Probe,
anschließt,
wobei dieser Verfahrensschritt iv) gegebenenfalls auch vor oder
nach einer Lagerung gemäß dem vorstehend beschriebenen
Verfahrensschritt iii) durchgeführt werden kann.
-
Unter
einer histologischen Untersuchung wird vorzugsweise jedes Untersuchungsverfahren
verstanden, welches geeignet ist, den morphologischen Zustand eines
Gewebes, eines Gewebeschnittes, einer Zelle oder von subzellulären
Strukturen zu analysieren, beispielsweise mittels Mikroskopie und
gegebenenfalls unter Einsatz von dem Fachmann bekannten Färbe-
oder Markierungstechniken.
-
Als
Biomoleküle, die analysiert werden können, kommen
alle dem Fachmann bekannten Biomoleküle in Betracht, insbesondere
natürliche, modifizierte oder synthetische Nukleinsäuren,
natürliche, modifizierte oder synthetische Proteine oder
Oligopeptide, Hormone, Wachstumsfaktoren, Substrate des Stoffwechsels, Metabolite,
Lipide, Oligosaccharide oder Proteoglukane. Als Nukleinsäuren
kommen alle dem Fachmann bekannten Nukleinsäuren in Betracht,
insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), beispielsweise mRNA,
siRNA, miRNA, snRNA, t-RNA, hnRNA oder Ribozyme, oder Deoxyribonukleinsäuren
(DNA). Grundsätzlich kann es sich um jeden Typ von Polynukleotid
handeln, der ein N-Glykosid oder C-Glykosid einer Purin- oder Pyrimidinbase
darstellt. Die Nukleinsäure kann einzel-, doppel- oder
mehrsträngig, linear, verzweigt oder zirkulär
sein. Sie kann einem in einer Zelle vorkommenden Molekül
entsprechen, wie etwa genomische DNA oder Boten-RNA (mRNA), oder
in vitro erzeugt werden wie Komplementär-DNA (cDNA), Gegenstrang-RNA
(aRNA), oder synthetische Nukleinsäuren. Die Nukleinsäure
kann aus wenigen Untereinheiten, mindestens zwei Untereinheiten,
bevorzugt acht oder mehr Untereinheiten bestehen, wie etwa Oligonukleotide,
mehreren hundert Untereinheiten bis hin zu mehreren tausend Untereinheiten,
wie etwa bestimmte Expressionsvektoren, oder bedeutend mehr Untereinheiten,
wie genomische DNA. Bevorzugt enthält die Nukleinsäure
die kodierende Information für ein Polypeptid in funktionellem
Zusammenhang mit regulatorischen Sequenzen, die die Expression des
Polypeptids in der Zelle erlauben, in die die Nukleinsäure
eingebracht wird oder natürlich vorliegt. So ist die Nukleinsäure
in einer bevorzugten Ausführungsform ein Expressionsvektor.
In einer anderen Ausführungsform ist sie eine pDNA (Plasmid-DNA),
eine siRNA, eine siRNA-Duplizes oder eine siRNA-hetero-Duplizes,
wobei unter dem Begriff „siRNA" Ribonukleinsäuren
mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden verstanden werden,
die durch Spaltung einer doppelsträngigen RNA (dsRNA) durch
das Enzym „Dicer" entstehen und in den Enzymkomplex „RISC"
(RNA-induced silencing complex) eingebaut werden.
-
Am
meisten bevorzugt als Biomoleküle sind jedoch Proteine
und Nukleinsäuren, wobei Nukleinsäuren besonders
bevorzugt und RNAs am meisten bevorzugt sind.
-
Die
Formulierung „Analyse von Biomolekülen in der
oder aus der mit der Butendisäure oder mit deren Derivat
bzw. mit einer Zusammensetzung beinhaltend die Butendisäure
oder deren Derivat in Kontakt gebrachten biologischen Probe" bedeutet
dabei, dass die Analyse sowohl in situ als auch ex situ, also beispielsweise nach
Isolierung der Biomoleküle aus der biologischen Probe erfolgen
kann. Sollen Biomoleküle aus einer biologischen Probe zum
Zwecke der Analyse isoliert werden, so kann es vorteilhaft sein,
insbesondere im Falle von Zellen, Geweben oder anderen komplexen
oder kompakten Proben die Proben zunächst zu homogenisieren,
wobei dieses Homogenisieren auf mechanischem Weg, beispielsweise
mittels Kanülen, Mörsern, Rotor-Stator-Homogenisatoren,
einer Kugelmühle oder dergleichen, auf chemischem Weg durch
den Einsatz geeigneter Lysepuffer, welche üblicherweise
Detergenzien und/oder chaotrope Substanzen und/oder Phenol beinhalten,
auf enzymatischem Weg, beispielsweise unter Einsatz von Proteasen,
oder durch eine Kombination dieser Maßnahmen, durchgeführt
werden kann.
-
Zur
histologischen Analyse oder zur Analyse von Biomolekülen
in der oder aus der biologischen Probe können dabei alle
dem Fachmann bekannten und geeignet erscheinenden Analyseverfahren
eingesetzt werden, vorzugsweise Verfahren ausgewählt aus
der Gruppe umfassend die Lichtmikroskopie, die Elektronenmikroskopie,
die konfokale Laserscanningmikroskopie, die Laser-Micro-Dissection,
Scanningelektronenmikroskopie, das Western-Blotting, das Southern-Blotting,
das Northern-Blotting, den Enzyme-linked Immonosorbent-Assay (ELISA),
die Immunpräzipitation, die Affinitätschromatographie,
die Mutationsanalyse, die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE),
insbesondere die zweidimensionale PAGE, die HPLC, die Polymerasekettenreaktion
(PCR), die RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism-Analyse),
die SAGE-Analyse (Serial Analysis of Gen Expression), die FPLC-Analyse
(Fast Protein Liquid Chromatography), die Massenspektrometrie, beispielsweise
die MALDI-TOFF-Massenspektrometrie oder die SELDI-Massenspektrometrie,
die Microarray-Analyse, die LiquiChip-Analyse, die Analyse der Aktivität
von Enzymen, HLA-Typing, Sequenzierung, WGA („Whole Genome
Amplification"), WTA ("Whole Transcriptome Amplification"), RT-PCR, Real-Time-PCR
bzw -RT-PCR, RNase-Protection-Analyse oder Primer-Extension-Analyse.
-
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens umfasst der Verfahrensschritt iv) eine Analyse von Nukleinsäuren
in der oder aus der biologischen Probe und/oder eine Analyse von
Proteinen in der oder aus der biologischen Probe.
-
Einen
Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet
auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren
behandelte biologische Probe.
-
Einen
weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben
leistet auch die Verwendung von Butendisäure oder einem
Derivat der Butendisäure, vorzugsweise von einer Verbindung
der Struktur III
in der X und R
2 wie
vorstehend im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren definiert sind, zur Behandlung einer biologischen Probe,
insbesondere zur Stabilisierung von Biomolekulen, besonders bevorzugt
von Nukleinsäuren oder Proteinen, darüber hinaus
bevorzugt von Nukleinsäuren und am meisten bevorzugt von
RNAs, wie etwa mRNAs, in einer oder aus einer biologischen Probe
und/oder zur histologischen Analyse einer biologischen Probe, wobei
als Verbindungen der Struktur III, als Biomoleküle und
als biologische Probe diejenigen Verbindungen der Struktur III,
Biomoleküle und biologischen Proben bevorzugt sind, die
bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgenannten Verfahren
als bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurden.
-
Einen
Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet
auch ein Kit, umfassend
- (a) Maleinsäure
oder ein Derivat der Maleinsäure, vorzugsweise die vorstehend
beschriebene Verbindung der Struktur III, sowie
- (b) Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oder
aus einer biologischen Probe und/oder zur Analyse der Morphologie
einer biologischen Probe.
-
Die
Butendisäure oder deren Derivat kann dabei in dem erfindungsgemäßen
Kit als Einzelkomponente vorliegen, denkbar ist jedoch auch, dass
das Kit als Additiv in einer Zusammensetzung, wie im Zusammenhang mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben, vorliegt.
-
Bei
den Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oder aus
einer biologischen Probe oder zur Analyse der Morphologie einer
biologischen Probe kann es sich grundsätzlich um alle dem
Fachmann bekannten Reagenzien handeln, die zur oder bei der morphologischen
Analyse einer biologischen Probe oder zur oder bei der Analyse von
Biomolekülen in einer oder aus einer biologischen Probe
verwendet werden können. Diese Reagenzien umfassen insbesondere
Farbstoffe zum Färben von Zellen oder Zellbestandteilen,
Antikörper, gegebenenfalls markiert mit Fluoreszenzfarbstoffen
oder Enzymen, eine Absorptionsmatrix, wie etwa DEAE-Zellulose oder
eine Silica-Membran, Substrate für Enzyme, Agarose-Gele,
Polyacrylamid-Gele, Lösungsmittel wie Ethanol, chaotrope
Reagenzien oder Phenol, wässrige Pufferlösungen,
RNase-freies Wasser, Lyse-Reagenzien, alkoholische Lösungen
und dergleichen.
-
Weiterhin
kann ein erfindungsgemäßes Kit als Komponente
beispielsweise mindestens eine Vorrichtung (c), beispielsweise in
Form eines verschließbaren Gefäßes, zur
Sammlung oder Aufnahme einer festen oder flüssigen biologischen
Probe enthalten. Dabei kann die Vorrichtung gegebenenfalls vor Sammlung
oder Aufnahme der biologischen Probe Butendisäure oder
deren Derivate bzw. eine Zusammensetzung beinhaltend Butendisäure
oder deren Derivate enthalten. Bei der Vorrichtung (c) kann es sich
um jedes dem Fachmann bekannte Gefäß zur Sammlung
oder Aufnahme einer festen oder flüssigen biologien Probe
handeln. Bevorzugte Gefäße sind beispielsweise
Falcon-Tubes, Eppendorf-Gefäße, Greiner-Röhrchen,
oder eines der in den Druckschriften
US
6,602,718 ,
US
2004/0043505 A1 ,
US 2005/0160701 A1 ,
US 2003/0086830 A1 ,
US 2003/0087423 A1 oder
WO 2005/014173 A1 beschriebenen
Gefäße.
-
Ein
erfindungsgemäßes Kit kann dabei
- (a) Butendisäure oder ein Derivat der Butendisäure,
vorzugsweise die vorstehend beschriebene Verbindung der Struktur
III, sowie
- (b) eine Vorrichtung zur Sammlung oder Aufnahme einer festen
oder flüssigen biologischen Probe, wobei die Vorrichtung
gegebenenfalls vor Sammlung oder Aufnahme der biologischen Probe
mindestens eine der unter (a) genannten Verbindungen oder eine Zusammensetzung
beinhaltend mindestens eine unter (a) genannten Verbindungen enthalten
kann.
-
Alternativ
kann ein weiteres erfindungsgemäßes Kit die oben
beschriebenen Komponenten enthalten.
-
Einen
Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet
auch die Verwendung des Kits zur Analyse von Biomolekülen
in oder aus einer biologischen Probe und/oder zur histologischen
Analyse einer biologischen Probe.
-
Einen
weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben
leistet auch ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, umfassend
die Verfahrensschritte:
- (a) Diagnose der Krankheit
durch ein Diagnoseverfahren, welches die Analyse einer biologischen
Probe durch vorstehend beschriebene Verfahren umfassend die Verfahrensschritt
i), ii) und iv), gegebenenfalls auch iii), umfasst, sowie
- (b) therapeutische Behandlung der diagnostizierten Krankheit.
-
Die
Erfindung wird nun anhand nichtlimitierender Figuren und Beispiele
näher erläutert.
-
Es
zeigt die 1 den im Beispiel 3 hergestellten
Western-Blot.
-
Es
zeigt die 2 das im Beispiel 6 erhaltene
Agarose-Gel.
-
Es
zeigt die 3 das im Beispiel 8 erhaltene
Agarose-Gel.
-
Beispiele
-
1. Stabilisierung von RNA in biologischen
Proben in Gegenwart von N-Ethylmaleimid
-
Nierengewebe
der Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit 500 μl
einer Zusammensetzung bestehend aus DMSO und 50 mM N-Ethylmaleimid
bzw. 30% Phenol in DMSO und 50 mM N-Ethylmaleimid versetzt und bei
verschiedenen Temperaturen gelagert (siehe Tabelle 1). N-Ethylmaleimid
weist die folgende Strukturformel (VIII) auf:
-
Im
Anschluss an die Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Proben
isoliert.
-
Dazu
wird das Gewebe nach Lagerung aus den Lösungen entfernt
und je 5 mg Gewebe 500 μl eines handelsüblichen
Guanidinium-Isothiocyanat-Puffers, wie z. B. RLT-Puffer der Firma
QIAGEN zugeben. Die Probe wird mit Hilfe einer Kugelmühle,
wie z. B. TissueLyzer der Firma QIAGEN, über einen Zeitraum
von 2 × 5 min bei 25 Hz mit einer 5 mm Stahlkugel homogenisiert,
wobei der Guanidinium-Isothiocyanat-Puffer auf aus dem Stand der
Technik bekannte Weise die Zellen lysiert und die freigesetzten
Proteine denaturiert. Anschließend werden die Lysate bei
14000 UpM für 3 min zentrifugiert. Vom Überstand
werden 500 μl, die 5 mg Gewebe repräsentieren,
abgenommen. Zu diesen Proben wird 1 Volumen (500 μl) 70%-iges
Ethanol zugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren
oder durch Vortexen über einen Zeitraum von ca. 5 s gemischt.
Das Lysat wird anschließend in eine handelsübliche
Silicamembran enthaltene 96well-Platte, wie z. B. Rneasy 96-plate
der Firma QIAGEN, aufgetragen und durch Zentrifugation (4 min bei
6000 UpM) durch die Membran hindurchgeführt. Die RNA bleibt
an der Membran gebunden und wird anschließend mit einem
ersten handelsüblichen Guanidinium-Isothiocyanat-haltigen
Waschpuffer, beispielsweise mit dem Puffer RW1 der Firma QIAGEN,
gewaschen. Anschließend wird zur enzymatichen Entfernung
etwaig gebundener gesamt-DNA DNAseI in einem geeigneten Puffer auf
die Säule aufgeben und für 15 min bei Raumtemperatur
zwecks Abbau der gebundenen DNA inkubiert. Im Anschluss wird erneut
mit einem ersten handelsüblichen Guanidinium-Isothiocyanat-haltigen
Waschpuffer, beispielsweise mit dem Puffer RW1 der Firma QIAGEN,
und danach mit einem zweiten Tris-haltigen bzw. Tris- und alkoholhaltigen
Waschpuffer, z. B. Puffer RPE der Firma QIAGEN, gewaschen. Dabei
werden die Waschpuffer jeweils durch Zentrifugation (4 min bei 6000
UpM) durch die Membran hindurchgeführt. Die Waschung mit
dem zweiten Tris-haltigen bzw. Tris- und alkoholhaltigen Waschpuffer
wird wiederholt, wobei gleichzeitig die Membran durch die Zentrifugation
(10 min 6000 UpM) getrocknet wird. Zur Elution werden 50 μl
RNase-freies Wasser auf die Membran pipettiert, um die gereinigte
RNA von der Membran abzulösen. Nach einer Inkubation von
1 min bei einer Temperatur im Bereich von 10–30°C
wird das Eluat durch Zentrifugation (1 min bei 10000 × g)
durch die Membran hindurchgeführt und der Elutionsschritt
wird zum Zwecke einer vollständigen Elution noch einmal
wiederholt.
-
Die
Menge an isolierter Gesamt-RNA wird nach Verdünnung in
Wasser durch photometrische Messung der Lichtabsorption bei einer
Wellenlänge von 260 nm ermittelt. Die Qualität
der so gewonnenen RNA wird durch die photometrische Bestimmung des
Verhältnisses der Lichtabsorption bei 260 nm zu derjenigen bei
280 nm bestimmt. Die Ergebnisse der Isolierungen sind in Tabelle
1 dargestellt. Tabelle 1
| Behandlungszusammensetzung | Lagerung | 260
nm/280 nm | RNA-Ausbeute
[μg] |
| DMSO +
50 mM N-Ethylmaleimid | 1d
37°C | 2,08 | 6,0 |
| 3d
RT | 2,01 | 5,1 |
| 7d
RT | 2,02 | 3,7 |
| 3d
4°C | 2,03 | 3,0 |
| 30% Phenol
in DMSO + 50 mM N-Ethylmaleimid | 1d
37°C | 2,01 | 10,7 |
| 7d
RT | 2,08 | 12,1 |
| 3d
4°C | 2,10 | 7,2 |
| 7d
4°C | 2,07 | 12,1 |
-
Wie
der Tabelle 1 zu entnehmen ist, können durch den Zusatz
von N-Ethylmaleimid als Additiv in Stabilisierungszusammensetzungen
biologische Proben für lange Zeiträume bei moderaten
Temperaturen gelagert und trotzdem noch ausreichende Mengen an RNA
in guter Qualität aus den Proben isoliert werden.
-
2. Stabilisierung von DNA
in biologischen Proben in Gegenwart von N-Ethylmaleimid
-
Nierengewebe
der Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit 500 μl
DMSO + 50 mM N-Ethylmaleimid bzw. 30% Phenol in DMSO + 50 mM N-Ethylmaleimid
versetzt und bei verschiedenen Temperaturen gelagert (siehe Tabelle
2). Im Anschluss an die Lagerung wird die DNA aus den gelagerten
Proben isoliert.
-
Zur
DNA-Isolierung wird das Gewebe nach Lagerung aus den Lösungen
entfernt und je 10 mg Gewebe in 180 μl des Puffers ALT
des Herstellers QIAGEN zugeben. Die Probe wird mit Hilfe einer Kugelmühle,
wie z. B. TissueLyzer der Firma QIAGEN, über einen Zeitraum
von 30 s bei 25 Hz mit einer 5 mm Stahlkugel homogenisiert und anschließend
für 15 s bei 14000 × g zentrifugiert. Nach Zugabe
von 120 μl der Protease K-Lösung (Hersteller QIAGEN)
werden die Lysate für 2 Stunden bei 55°C unter
Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation werden 4 μl
RNAse A (100 mg/ml) zugeben, gemischt und die Mischung für
2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird 300 μl
eines handelsüblichen Guanidinium-Hydrochloridhaltigen
Lysepuffers, wie der Puffer AL des Herstellers QIAGEN, zugegeben
und die Proben mittels Vortexen durchmischt. Es erfolgt eine Inkubation
bei 70°C für 10 min. Nach Mischung mit 300 μl
100% Ethanol werden die Proben auf eine Silicamembran enthaltende
96 well-Platte (DNeasy 96-plate der Firma QIAGEN) aufgetragen und
das Lysat mittels Zentrifugation für 10 min bei 6000 UpM
durch die Membran geführt. Die DNA bleibt an der Membran gebunden
und wird zunächst mit einem ersten handelsüblichen
Guanidinium-Hydrochlorid-haltigen Waschpuffer, beispielsweise mit
dem Puffer AW1 der Firma QIAGEN, und danach mit einem zweiten alkoholhaltigen Waschpuffer,
z. B. Puffer AW2 der Firma QIAGEN, gewaschen. Dabei werden die Waschpuffer
jeweils durch Zentrifugation (5 min bei 6000 UpM) durch die Membran
hindurchgeführt. Im Anschluss wird die Platte für
10 min bei 70°C inkubiert. Die Elution der DNA erfolgt
durch Auftrag von 200 μl des auf 70°C vorgewärmten
Elutionspuffers AE (QIAGEN). Nach einminütiger Inkubation
wird der Elutionspuffer durch Zentrifugation durch die Membran hindurchgeführt
(5 min bei 6000 UpM) und die Elution wiederholt.
-
Die
Menge an isolierter Gesamt-DNA wird nach Verdünnung in
Wasser durch photometrische Messung der Lichtabsorption bei einer
Wellenlänge von 260 nm ermittelt. Die Qualität
der so gewonnenen DNA wird durch die photometrische Bestimmung des
Verhältnisses der Lichtabsorption bei 260 nm zu derjenigen bei
280 nm bestimmt. Die Ergebnisse der Isolierungen sind in Tabelle
2 dargestellt. Tabelle 2
| Behandlungszusammensetzung | Lagerung | 260
nm/280 nm | DNA-Ausbeute
[μg] |
| DMSO +
50 mM N-Ethylmaleimid | 1d
37°C | 1,87 | 14,6 |
| 3d
RT | 1,97 | 18,3 |
| 7d
RT | 2,01 | 21,5 |
| 3d
4°C | 2,02 | 27,2 |
| 30% Phenol in DMSO + 50 mM N-Ethylmaleimid | 3d
25°C | 1,97 | 14,0 |
| 7d
25°C | 1,98 | 19,5 |
| 3d
4°C | 1,99 | 19,3 |
| 7d
4°C | 1,99 | 19,9 |
-
Wie
der Tabelle 2 zu entnehmen ist, können durch den Zusatz
von N-Ethylmaleimid als Additiv in Stabilisierungszusammensetzungen
biologische Proben für lange Zeiträume bei moderaten
Temperaturen gelagert und trotzdem auch noch ausreichende Mengen
an DNA in guter Qualität aus den Proben isoliert werden.
-
3. Stabilisierung von Proteinen in biologischen
Proben in Gegenwart von N- Ethylmaleimid
-
Lebergewebe
der Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit je
1 ml 30% Phenol in DMSO + 50 mM N-Ethylmaleimid (Probe 1), DMSO
+ 50 mM N-Ethylmaleimid (Probe 2) und 100% DMSO (als Negativkontrolle,
Probe 3) für 3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Im Anschluss
an die Lagerung wird ein Proteinextrakt aus den gelagerten Proben
hergestellt.
-
Zur
Herstellung des Proteinextraktes wird das Gewebe nach Lagerung aus
den Lösungen entfernt und je 10 mg Gewebe 400 μl
eines üblichen Extraktionspuffers, hier in einer Zusammensetzung
von 8 M Harnstoff, 100 mM Natriumdihydrogenphosphat und 10 mM Tris,
pH 8,0, zugeben und die Probe mit Hilfe einer Kugelmühle,
z. B. dem TissueLyzer der Firma QIAGEN, homogenisiert. Das so entstandene
Lysat wird für 15 s bei möglichst hoher Drehzahl
(z. B. ca. 20000 × g) zentrifugiert um ungelöste
Bestandteile zu pelletieren. Der proteinhaltige Überstand
wird abgenommen und die Proteinkonzentration mittels eines Bradford-Testes
bestimmt. Je 1,5 μg Protein wird auf einem SDS-Polyacrylamidgel
nach üblichem Verfahren aufgetrennt und mittels einer Semidry-Blotting-Apperatur
nach Angaben des Herstellers auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. Die
Membran wird nach dem Stand der Technik mit Milchpulver abgesättigt
und mit einem ERK2-spezifischen Antikörper sowie einem
Tubulin-spezifischen Antikörper nach Angaben des Herstellers
hybridisiert, und eine Immunodetektion durchgeführt. Die
Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
-
Der
Nachweis spezifischer Proteine belegt, dass die Proteine durch die
N-Ethylmaleimidhaltige Zusammensetzung bei Raumtemperatur in Geweben
stabilisiert werden, während ohne Zusatz dieses Additivs (Bahn
3) keinerlei Protein nachweisbar ist.
-
4. Transition gefrorener biologischer
Proben in Gegenwart von N-Ethylmaleimid
-
Lebergewebe
aus Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wird
für diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionssexperiment
werden 20 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen,
nicht-gekühlten (Raumtemperatur) Transistionssreagenzien
(DMSO bzw. Mischungen aus DMSO und Phenol) versetzt und für
3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Für die Transition
werden zum einen je 1 ml der Lösung direkt verwendet und
zum anderen je 950 μl der Lösung mit 50 μl
1 M N-Ethylmaleimid gemischt zu einer Endkonzentration von 50 mM
NEM (verwendete Lösungen siehe Tabelle 3). Im Anschluss
an die Transition wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert.
-
Dazu
wird das Gewebe nach Lagerung aus den Behandlungslösungen
entfernt und zu je 10 mg Gewebe 350 μl eines handelsüblichen
Guanidinium-Isothiocyanat-Puffers, wie z. B. RLT-Puffer der Firma
QIAGEN zugeben. Die Probe wird mit Hilfe einer Kugelmühle,
wie z. B. MM300 der Firma QIAGEN, über einen Zeitraum von
2 × 2 min bei 20 Hz mit einer 5 mm Stahlkugel homogenisiert,
wobei der Guanidinium-Isothiocyanat-Puffer auf aus dem Stand der
Technik bekannte Weise die Zellen lysiert und die freigesetzten
Proteine denaturiert. Anschließend werden die Lysate bei
14000 UpM für 3 min zentrifugiert. Vom Überstand
werden zwei Portionen von je 350 μl, die entsprechend 10
mg Gewebe repräsentieren, abgenommen. Zu diesen Proben
wird 1 Volumen (350 μl) 70%-iger Ethanol zugefügt
und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren oder durch Vortexen über
einen Zeitraum von ca. 5 s gemischt. Das Lysat wird anschließend
in eine handelsübliche Silicamembran enthaltene sein-Säule,
wie z. B. RNeasy-Säulen der Firma QIAGEN, aufgetragen und
durch Zentrifugation (1 min bei 10.000 × g) durch die Membran
hindurchgeführt. Die RNA bleibt an der Membran gebunden und
wird anschließend mit einem ersten handelsüblichen
Guanidinium-Isothiocyanat-haltigen Waschpuffer, beispielsweise mit
dem Puffer RW1 der Firma QIAGEN, und danach mit einem zweiten Tris-haltigen bzw.
Tris- und alkoholhaltigen Waschpuffer, z. B. Puffer RPE der Firma
QIAGEN, gewaschen. Dabei werden die Waschpuffer jeweils durch Zentrifugation
(1 min bei 10.000 × g) durch die Membran hindurchgeführt.
Die Waschung mit dem zweiten Tris-haltigen bzw. Tris- und alkoholhaltigen
Waschpuffer wird mit einem geringeren Volumen wiederholt, wobei
gleichzeitig die Membran durch die Zentrifugation (2 min bei 20.000 × g)
getrocknet wird. Zur Elution werden 40 μl RNase-freies
Wasser auf die Membran pipettiert, um die gereinigte RNA von der
Membran abzulösen. Nach einer Inkubation von 1 min. bei
einer Temperatur im Bereich von 10–30°C wird das
Eluat durch Zentrifugation (1 min bei 10.000 × g) durch
die Membran hindurchgeführt und der Elutionsschritt wird
zum Zwecke einer vollständigen Elution noch einmal wiederholt.
-
Im
Anschluss werden die Menge und Qualität an isolierter Gesamt-RNA
bestimmt, wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind
ebenfalls in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
| Behandlungszusammensetzung | 260
nm/280 nm | RNA-Ausbeute
[μg] |
| 100%
DMSO | 1,79 | 18,7 |
| 100%
DMSO + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 1,83 | 41,5 |
| 5,4
ml DMSO + 0,27 g Phenol | 1,75 | 18,5 |
| 5,4
ml DMSO + 0,27 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 1,83 | 54,2 |
| 4,97
ml DMSO + 0,497 g Phenol | 1,79 | 31,9 |
| 4,97
ml DMSO + 0,497 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 1,83 | 52,3 |
| 5,32
ml DMSO + 1,33 g Phenol | 1,77 | 35,0 |
| 5,32
ml DMSO + 1,33 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 1,79 | 56,0 |
| 4,28
ml DMSO + 1,71 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 1,78 | 31,3 |
| 4,28
ml DMSO + 1,71 g Phenol + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 1,82 | 45,2 |
-
Der
Tabelle 3 ist zu entnehmen, dass N-Ethylmaleimid auch in Transitionslösungen
einen positiven Einfluss auf die Stabilisierung von RNA in biologischen
Proben aufweist.
-
5. Transition gefrorener biologischer
Proben in Gegenwart von N-Ethylmaleimid
-
Lebergewebe
aus Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wird
für diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionssexperiment
werden 20 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen,
nicht-gekühlten (Raumtemperatur) Transitionsreagenzien
versetzt und für 3 Tage bei 4°C gelagert. Für
die Transition werden zum einen je 1 ml der Lösung direkt verwendet
und zum anderen je 950 μl der Lösung mit 100 μl
1 M N-Ethylmaleimid gemischt (verwendete Lösungen siehe
Tabelle 4). Im Anschluss an die Transition wird die RNA aus den
gelagerten Proben isoliert und die Menge und Qualität der
RNA bestimmt, wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse sind
ebenfalls der Tabelle 4 zu entnehmen. Tabelle 4
| Behandlungszusammensetzung | 260
nm/280 nm | RNA-Ausbeute
[μg] |
| 35%
Ammoniumsulfit | 2,1 | 6 |
| 35%
Ammoniumsulfit + 100 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 1,94 | 21,5 |
| 12,4M
Lithiumnitrat | 1,99 | 3,3 |
| 12,4
M Lithiumnitrat + 100 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 2,07 | 14,7 |
| 10,5
M Kaliumacetat | 1,97 | 6 |
| 10,5
M Kaliumacetat + 100 μl 1 MN-Ethylmaleimid | 2,1 | 8,6 |
| 100%
Ethylenglycol | 2,03 | 18,9 |
| 100%
Ethylenglycol + 100 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 1,9 | 29,3 |
-
Auch
der Tabelle 4 ist zu entnehmen, dass N-Ethylmaleimid in Transitionslösungen
einen positiven Einfluss auf die Stabilisierung von RNA in biologischen
Proben aufweist.
-
6. Transition biologischer Proben in Gegenwart
von N-Ethylmaleimid
-
Nierengewebe
aus Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wird
für diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionssexperiment
werden 10 bis 30 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen,
nicht-gekühlten (Raumtemperatur) Transistionssreagenzien
versetzt und für 5 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Für
die Transition werden zum einen je 1 ml der Lösung mit
50 μl 1 M N-Ethylmaleimid gemischt (verwendete Lösungen
siehe Tabelle 5). Im Anschluss an die Transition wird die RNA aus
den gelagerten Proben isoliert und die Menge und Qualität
der RNA bestimmt, wie unter Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse
sind ebenfalls der Tabelle 5 zu entnehmen. Tabelle 5
| Behandlungszusammensetzung | 260
nm/280 nm | RNA-Ausbeute
[μg] |
| 75%
DMSO | 1,91 | 6,9 |
| 75%
DMSO + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 1,87 | 24,6 |
| 50%
Ethanol + 50% Aceton + 10 μl Trichloressigsäure | 2,00 | 5,7 |
| 50%
Ethanol + 50% Aceton + 10 μl Trichloressigsäure
+ 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 19,2 | 28,3 |
| 50%
Ethanol + 50% Aceton + 10 μl Essigsäure | 1,91 | 9,8 |
| 50%
Ethanol + 50% Aceton + 10 μl Essigsäure + 50 μl
1 M N-Ethylmaleimid | 1,98 | 1,45 |
-
Auch
der Tabelle 5 ist zu entnehmen, dass durch den Zusatz von N-Ethylmaleimid
in den hier beschriebenen Transitionslösungen die Stabilisierung
von RNA in biologischen Proben verbessert wird.
-
Die
isolierte RNA wird auf Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid angefärbt
sind, analysiert. Hierzu werden beispielsweise 1,0%ige Formaldehyd-Agarose-MOPS-Gele
angefertigt. Es werden jeweils 5 μl des Eluates eingesetzt.
Das Ergebnis ist in der 2 gezeigt. Aus dieser 2 ist
ersichtlich, dass N-Ethylmaleimid auch einen positiven Einfluss
auf die Qualität der RNA aufweist.
-
7. Transition biologischer
Proben in Gegenwart von verschiedenen Maleimid-Derivaten
-
Lebergewebe
aus Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wird
für diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionsexperiment
werden 10 bis 30 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen,
nicht vorgekühlten (Raumtemperatur) Transitionsreagenzien
versetzt und für 3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Für
die Stabilisierung werden zum einen 0,5 ml 100% DMSO als Kontrolle
verwendet. Zum anderen werden je 0,5 ml einer Lösung aus
DMSO und den verschiedenen, in A. dest gelösten Additiven
hergestellt (verwendete Lösungen siehe Tabelle 6). Im Anschluss
an die Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert
und die Menge und die Qualität der isolierten RNA bestimmt,
wie im Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse sind ebenfalls der
Tabelle 6 zu entnehmen. Tabelle 6
| Behandlungszusammensetzung | 260
nm/280 nm | RNA-Ausbeute
[μg] |
| 500 μl
100% DMSO | 1,92 | 16,6 |
| 450 μl
100% DMSO + 50 μl 1 M N-Ethylmaleimid | 2,08 | 54,2 |
| 375 μl
100% DMSO + 125 μl 1 M N-Methylmaleimid | 2,06 | 5,25 |
| 487 μl
100% DMSO + 13 μl 3,75 M Maleinsäure | 2,07 | 30,0 |
| 375 μl
100% DMSO + 125 μl in Wasser gesättigter Fumarsäurelösung | 20,04 | 2,57 |
-
Der
Tabelle 6 ist zu entnehmen, dass neben N-Ethylmaleimid auch N-Methylmaleimid,
Maleinsäure und Fumarsäure in Transitionslösungen
einen positiven Einfluss auf die Stabilisierung von RNA in biologischen Proben
aufweisen.
-
N-Methylmaleimid
weist folgende Strukturformel (IX) auf:
-
8. Lagerung biologischer Proben außerhalb
der Behandlungs-Zusammensetzungen
-
Lebergewebe
der Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wird
für diesen Versuch verwendet. Als Transitionszusammensetzung
wird eine Lösung aus 30% Phenol gelöst in DMSO
angesetzt und 1.350 μl dieser Lösung mit 150 μl
1 M NEM vermischt, so dass die Endkonzentration an NEM 100 mM beträgt.
Für das Transitionsexperiment wird ca. 150 mg Gewebe abgewogen und
gefroren mit der im Kühlschrank auf 2 bis 8°C
vorgekühlten Lösung versetzt. Die Probe wird über
Nacht bei 2 bis 8°C im Kühlschrank gelagert.
-
Nach
der Transition werden die Proben aus der Transitionszusammensetzung
entnommen, zerteilt und in Teile (ca. 10–30 mg) trocken
bei Raumtemperatur für 30 min, 45 min, 60 min, 90 min,
2 h 30 min und 4 h 30 min gelagert. Anschließend wird die
RNA, wie unter Beispiel 4 beschrieben, isoliert und, wie im Beispiel 6
beschrieben, auf ein Agarose-Gel aufgetragen. Das Ergebnis ist in 3 gezeigt.
-
Aus
der 3 wird ersichtlich, dass die erfindungsgemäß stabilisierten
Proben auch außerhalb der Behandlungszusammensetzungen
für lange Zeit gelagert werden können, ohne dass
die Qualität der aus diesen Proben isolierten RNA erkennbar
verschlechtert wird.
-
9. Transition biologischer
Proben in Gegenwart von verschiedenen Maleimid-Derivaten
-
Lebergewebe
der Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff
eingefroren und bei –70°C gelagert wurde, wird
für diesen Versuch verwendet. Für die Transitionsexperimente
werden 15 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit 1 M N-Ethylmaleimid
bzw. mit 0,2 M N-Methylmaleimid, jeweils gelöst in Wasser, versetzt
und bei 4°C oder Raumtemperatur gelagert. Die Transitionslösungen
werden dabei vor dem Einsatz nicht vorgekühlt, dass heißt
sie werden bei Raumtemperatur verwendet. Im Anschluss an die Lagerung
wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert und die Menge und
die Qualität der isolierten RNA bestimmt, wie im Beispiel
4 beschrieben. Die Ergebnisse sind der Tabelle 7 zu entnehmen. Tabelle 7:
| Behandlungszusammensetzung | Lagerung | 260
nm/280 nm | RNA-Ausbeute
[μg] |
| 1 M N-Ethylmaleimid | 1d
4°C | 1,75 | 31,1 |
| 1d
RT | 1,80 | 21,4 |
| 3d
RT | 1,79 | 20,0 |
| 0,2
M N-Methylmaleimid | 3d
RT | 1,96 | 24,9 |
-
Der
Tabelle 7 ist zu entnehmen, dass N-Ethylmaleimid und N-Methylmaleimid
auch in Wasser, das selber keine Stabilisierungseigenschaften aufweist,
als Transitionslösungen die Stabilisierung von RNA bei
moderaten Temperaturen in biologischen Proben ermöglichen.
-
10. Stabilisierung biologischer
Proben in Gegenwart von Fumarsäuren
-
Lebergewebe
der Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme in Mischungen
aus Polyolen und Fumarsäure (siehe Tabelle 8) versetzt
und 3 Tage bei Raumtemperatur gelagert. Die Fumarsäure
wurde 10%ig in Ethanol gelöst und mit den in den in der
Tabelle 8 aufgeführten Polyolzusammensetzungen vermischt.
Im Anschluss an die Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Proben
isoliert und die Menge und die Qualität der isolierten
RNA bestimmt, wie im Beispiel 4 beschrieben. Die Ergebnisse sind
der Tabelle 8 zu entnehmen. Tabelle 8:
| Behandlungszusammensetzung | RNA-Ausbeute
[μg] |
| 10
vol% Fumarsäurelösung + 90 vol% einer Mischung
aus 25% 1,2,3-Propantriol + 75% 3-Methyl-1,3,5-Propantriol | 42,6 |
| 25
vol% Fumarsäurelösung + 75 vol% einer Mischung
aus 25% 1,2,3-Propantriol + 75% 3-Methyl-1,3,5-Propantriol | 41,6 |
| 10
vol% Fumarsäurelösung + 90 vol% einer Mischung
aus 75% 1,2,6-Hexantriol + 75% 3-Methyl-1,3,5-Propantriol | 21,8 |
| 25
vol% Fumarsäurelösung + 75 vol% einer Mischung
aus 75% 1,2,6-Hexantriol + 75% 3-Methyl-1,3,5-Propantriol | 39,9 |
-
Die
vorstehend beschriebenen Beispiele zeigen, dass Fumarsäure,
Maleinsäure, Maleinsäurederivate und Maleimide
wie N-Ethylmaleimid oder N-Methylmaleimid in unterschiedlichsten
Zusammensetzungen einen positiven Einfluss auf die Stabilisierung
von Biomolekülen, insbesondere von Nukleinsäuren
oder Proteinen, sowohl bei der Behandlung frischer, nicht-geforener
biologischer Proben als auch bei der Behandlung gefrorner biologischer
Proben hat.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 5010184 [0011]
- - US 5300545 [0011]
- - WO 02/00599 A [0011]
- - WO 02/00600 A [0011]
- - US 6204375 [0011]
- - WO 2004/72270 A [0013]
- - US 6602718 [0066]
- - US 2004/0043505 A1 [0066]
- - US 2005/0160701 A1 [0066]
- - US 2003/0086830 A1 [0066]
- - US 2003/0087423 A1 [0066]
- - WO 2005/014173 A1 [0066]
c) oder eine Gruppe NR1 ist, wobei R1 – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen, – ein COOR3-Rest, in dem R3 ein Wasserstoffatome oder ein Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen ist, – ein Wasserstoffatom oder – ein -NR4R5-Rest ist, in dem R4 und R5 ein Wasserstoffatom, ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen oder ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen ist, und wobei R2 – ein Wasserstoffatom, – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, oder – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen, ist.
f) oder eine Gruppe NR1 ist, wobei R1 – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen, – ein COOR3-Rest, in dem R3 ein Wasserstoffatome oder ein Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen ist, – ein Wasserstoffatom oder – ein NR4R5-Rest ist, in dem R4 und R5 ein Wasserstoffatom, ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen oder ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen ist, und – wobei R2 – ein Wasserstoffatom, – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Alkyl-Rest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und besonderes bevorzugt mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, oder – ein gegebenenfalls Stickstoff oder Halogen substituierter Aryl-Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, beispielsweise mit 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Kohlenstoffatomen, ist, zur Behandlung einer biologischen Probe, insbesondere zur Stabilisierung von Biomolekülen in einer biologischen Probe.