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Die
Erfindung bezieht sich auf die ortsaufgelöste massenspektrometrische
Messung und Darstellung der Verteilung kleiner Moleküle
des Massenbereichs von etwa 150 bis 500 Dalton wie beispielsweise
Pharmaka und deren Metaboliten in Dünnschnitten oder anderen
flächigen Proben, vorzugsweise mit Ionisierung der Moleküle
durch matrixunterstützte Laserdesorption.
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Die
Erfindung besteht darin, nicht das ionisierte kleine Analytmolekül
selbst, sondern ein durch erzwungenen Zerfall des Molekülions
erzeugtes Tochterion zu messen, das ein wesentlich besseres Verhältnis
von Signalstärke zu Untergrundrauschen zeigt, und für
die Messung des Tochterions nicht die komplizierten Verfahren der
teuren Flugzeit-Tandem-Massenspektrometer einzusetzen, sondern die Tochterionen
in einem einfachen Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer nachzuweisen.
Dadurch kann bei mindestens gleicher Massenauflösung und
Empfindlichkeit eine wesentlich schnellere und preiswertere Aufnahme
der Tausende von Massenspektren erreicht werden, die als Grundlage
für die Darstellung der Ortsverteilung des Analytmoleküls
dienen.
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Stand der Technik
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Die
bildgebende Massenspektrometrie an histologischen Dünnschnitten
oder anderen flächigen Proben mit Ionisierung der interessierenden
Moleküle durch matrixunterstützte Laserdesorption
(MALDI) hat jüngst einen außergewöhnlichen
Aufschwung erlebt. Dabei werden in der Regel Verteilungen bestimmter
Proteine gemessen, die allein oder in Verbindung mit anderen Proteinen
als Biomarker für die Charakterisierung der Stress- oder
Krankheitszustände von einzelnen Gewebebereichen des Dünnschnitts
dienen können. Ein solches Verfahren ist in der Offenlegungsschrift
DE 10 2004 037 512.7 (
D. Suckau
et al.) dargestellt.
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Der
Dünnschnitt muss dabei in besonderer Weise mit einer Schicht
aus Matrixkriställchen belegt werden, um eine gute Ionisierbarkeit
der Proteine, aber auch anderer interessierender Substanzen, zu gewährleisten.
Ein solches Belegungsverfahren ist in der Offenlegungsschrift
DE 10 2006 019 530.2 (
M. Schürenberg
et al.) beschrieben.
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Bei
Verwendung besonders geformter Laserstrahlprofile, wie sie beispielsweise
in der Offenlegungsschrift
DE 10 2004 044 196 A1 (
A. Hase et
al.) dargelegt sind, ergeben sich Ortsauflösungen
von etwa 50 Mikrometern bei der Messung der Verteilungen von Molekülen
in Dünnschnitten, was für die meisten Anwendungen
völlig ausreicht. Für eine gute Messung mit hoher
Empfindlichkeit und genügend hoher Genauigkeit für
die Konzentrationsmessung genügt nicht die Aufnahme eines
einzelnen Massenspektrums, es sind vielmehr zwischen 50 und 500 Einzelspektren
zu einem Summenspektrum zu addieren. Bei voller Ausschöpfung
der Ortsauflösung durch einen Rasterabstand der Messungen
von 50 Mikrometern bedeutet das, dass pro Quadratzentimeter Dünnschnitt
40 000 Summenspektren aufzunehmen sind, die aus mehreren Millionen
Einzelspektren zusammengesetzt werden müssen. Daraus ergibt
sich, dass die Aufnahmezeit für ein einzelnes Summenspektrum
für die Anwendbarkeit des Verfahrens eine große
Rolle spielt. Selbstredend können auch geringere Ortsauflösungen
gewählt werden, so können beispielsweise für
Körperquerschnitte von Mäusen oder Ratten mit
Rasterabständen von 200 bis 500 Mikrometer sehr gute Verteilungen
der Analytsubstanzen auf die einzelnen Organe und Organzwischenräume
gemessen werden, wobei nur 2500 bzw. 400 Summenspektren pro Quadratzentimeter
auf zunehmen sind, die aber immer noch Hunderttausend bis eine Million
Einzelspektren umfassen können. Es ist auch in diesem Falle
eine hohe Frequenz der Spektrenaufnahme mit möglichst mehr
als 1000 Einzelspektren pro Sekunde wünschenswert.
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Das
Interesse richtet sich aber nicht nur auf Proteine und andere große
Moleküle, sondern zunehmend auf die Verteilung kleiner
Moleküle wie Pharmaka oder deren Metabolite in den Gewebebereichen
der Dünnschnitte. Die Ansammlung von Pharmaka und ihrer
Metabolite in bestimmten Organen oder in bestimmten Gewebearten
wie Sehnen, Bindegeweben, Nervensträngen, Muskelfasern,
arteriellen oder venösen Blutgefäßen
ist von höchstem Interesse für das Studium der
Wirksamkeit dieser Pharmaka. Diese kleinen Moleküle haben
in der Regel Molekulargewichte im Bereich von etwa 150 bis 500 Dalton
und liegen daher in einem Massenbereich, der in der MALDI-Flugzeitmassenspektrometrie
durch Ionen von Komplexen der Matrix-Substanz und ihrer Fragmente
so überdeckt wird, dass hier keine gute Nachweisempfindlichkeit
erreicht wird. Es ist hier jede einzelne Masse der Massenskala bereits mit
mehreren verschiedenen Arten von Komplexionen belegt, die somit
ein starkes chemisches Untergrundrauschen bilden, das jede empfindliche
Messung von kleinen Molekülen stört oder sogar
ausschließt.
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Ein
Ausweg aus diesem Dilemma besteht darin, nicht die Molekülionen
dieser kleinen Moleküle selbst zu messen, sondern nach
deren Fragmentierung ein ausgewähltes Tochterion. Solche
Verfahren, die zur Verbesserung des Verhältnisses von Signal zu
Rauschen, aber auch zur Erhöhung der Spezifität des
Nachweises dienen, sind bereits in anderen Anwendungsgebieten der
Massenspektrometrie unter dem Kürzel SRM (selective reaction
monitoring) bekannt geworden. Für die Messung der Tochterionen stehen
moderne Tandem-Flugzeitmassenspektrometer zur Verfügung,
wie sie in der Patentschrift
DE 198 56 014 C2 (
C. Köster
et al.) beschrieben werden. Diese Tandem-Flugzeitmassenspektrometer
bestehen aus zwei aufeinander folgenden Flugzeitmassenspektrometem
und werden generisch mit dem Kürzel „TOF-TOF"
bezeichnet. Das erste Flugzeitmassenspektrometer dient der Auswahl
der Elternionen, das zweite misst die durch Fragmentierung der Elternionen
entstehenden Tochterionen. Die Fragmentierung kann durch eine verstärkte
Lasereinstrahlung im MALDI-Prozess vorgenommen werden, wobei metastabile
Ionen entstehen, die während des Fluges zerfallen, oder
auch durch Stöße in gasbefüllten Stoßkammern.
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Neben
der Verwendung von TOF-TOF-Geräten ist auch eine Messung
der Tochterionen durch ein Gerät möglich, dass
den MALDI-Prozess zur Innenerzeugung verwendet, die Tochterionen
aus den Analytionen durch Stoßprozesse generiert und in
einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Inneneinschuss
nachweist. Diese Geräte sind jedoch mindestens ähnlich
teuer wie Tandem-Flugzeitmassenspektrometer.
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Die
Tandem-Flugzeitmassenspektrometer haben das früher übliche
Verfahren zur Messung von Tochterionen in einfachen Flugzeitmassenspektrometern
mit Reflektor, das unter dem Kürzel „PSD" (post
source decay) bekannt geworden ist, praktisch vollkommen abgelöst,
da sie eine wesentlich bessere Massenauflösung, eine höhere
Substanzausnutzung und eine weitaus bequemere Handhabung bieten. Die
PSD-Spektren konnten zwar in relativ preiswerten Reflektor-Flugzeitmassenspektrometern
erhalten werden, sie mussten aber in kompliziert gesteuerten Verfahren
aus 12 bis 15 einzeln mit jeweils neuer Ionisierung von Probe aufzunehmenden
Spektrenabschnitten zusammengesetzt werden. Die modernen Tandem-Flugzeitmassenspektrometer
sind aber auch nicht ohne Nachteile; sie sind verhältnismäßig teuer
und können für die Messung der Tochterionen aus
elektronischen Gründen bisher keine hohe Frequenz der Spektrenaufnahme
für Tochterionen bieten.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, ein preiswertes und besonders schnell
durchzuführendes Verfahren für die Messung der
Verteilung von kleinen Analytmolekülen in histologischen
Dünnschnitten oder anderen flächigen Proben bereitzustellen.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung besteht darin, die Verteilung einer ausgewählten
Sorte kleiner Analytmoleküle in einer flächigen
Probe in einem Flugzeitmassenspektrometer mit Reflektor dadurch
zu messen, dass
- (a) die Analytmoleküle
eines Ortes der Probe mindestens teilweise ionisiert und die Molekülionen zu
einem Innenstrahl beschleunigt werden,
- (b) die Molekülionen mindestens teilweise zum Zerfall
zu Tochterionen gebracht werden,
- (c) die Molekülionen und ihre Tochterionen durch einen
Ionenselektor selektiert werden,
- (d) eine ausgewählte Tochterionensorte durch eine vorgegeben
einjustierte Spannung am Reflektor auf den Detektor gelenkt und
dort in Form eines Tochterionenspektrums gemessen wird,
- (e) die Schritte (a) bis (d) am selben Ort der Probe wiederholt
und die Tochterionenspektren dieses Ortes zu Summenspektren zusammengefasst werden,
- (f) die Schritte (a) bis (e) zur Messung der örtlichen
Verteilung der Analytionen an anderen Orten der Probe wiederholt
werden, und
- (g) aus den Summenspektren die Signalstärken der Tochterionen
und damit die relativen Konzentrationen der Analytionen an den einzelnen
Orten der Probe gewonnen werden.
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Unter „kleinen
Molekülen" werden hier Moleküle von Substanzen
mit Molekulargewichten unter 1000 Dalton, im engeren Sinne mit Molekulargewichten
zwischen etwa 150 und 500 Dalton verstanden. Der Ausdruck „small
molecules" bezeichnet, wie der Fachmann weiß, ein wieder
auflebendes Fachgebiet innerhalb der Massenspektrometrie, das auch
auf Fachkonferenzen zunehmend eigene Sessionen erhält.
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Das
Selektieren im Ionenselektor soll bedeuten, dass im Wesentlichen
nur die selektierten Ionen ungestört durchgelassen werden,
und dass alle anderen Ionen so abgelenkt werden, dass sie nicht mehr
zur Detektion kommen können. Das Selektieren bezieht sich
dabei naturgemäß nicht auf die Masse, sondern
auf die Geschwindigkeit der Ionen, so dass auch die Tochterionen
aus bereits vorher erfolgten Zerfällen ungestört
durchgelassen werden.
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Bei
den flächigen Proben handelt es sich vorzugsweise um histologische
Dünnschnitte, aber es können auch Platten für
Dünnschicht-Chromatographie, Acryl-Gele für ein-
oder zweidimensionale Gel-Elektrophorese, oder andere Proben mit
einer Verteilung der Analytmoleküle auf oder in einer Oberfläche
in ähnlicher Weise analysiert werden. Dabei findet die
Ionisierung der Analytmoleküle vorzugsweise durch matrixunterstützte
Laserdesorption statt; es sind jedoch auch andere Verfahren zur
Ionisierung von Substanzen an Oberflächen, wie die einfache
Laserdesorption (LD), Nanowire Assisted Laserdesorption (NALDI)
oder die Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS), anwendbar.
Die matrixunterstützte Laserdesorption bedarf des Aufbrin gens
einer Schicht von Matrixkriställchen, die aus aufgebrachten
Tröpfchen der Matrixlösung relativ langsam auskristallisieren
sollen, so dass das Lösungsmittel die Analytmoleküle
aus der flächigen Probe herausziehen und während
der Kristallisation in die Matrixkriställchen einlagern
kann. Eine solche Schicht aus Matrixkriställchen kann wiederum
mit einer dünnen Metallschicht, insbesondere mit einer
Goldschicht, belegt sein, damit die Schicht auch bei einer hohen Wiederholungsrate
für die Spektrenaufnahme keine Aufladungserscheinungen
zeigt.
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Es
ist von Vorteil, wenn die Beschleunigung der Molekülionen
gegenüber der Laserdesorption verzögert einsetzt,
weil dadurch nicht nur in bekannter Weise das Massenauflösungsvermögen
des Flugzeitmassenspektrometers erhöht wird, sondern auch eine
zeitliche Fokussierung der Ionen einer Sorte an einer Stelle im
Flugzeitmassenspektrometer bewirkt wird. Die Ionen, die diese Stelle
mit Zeitfokus passieren, werden dann vom geschwindigkeitsfokussierenden
Reflektor auf den Detektor fokussiert. Wird der Ionenselektor für
die Molekülionen genau an diese Stelle des Zeitfokus' der
verzögerten Beschleunigung gesetzt, so erhöht
sich dessen Auflösungsvermögen für die
Innenselektion. Der Zerfall der Molekülionen zu Tochterionen
kann übrigens sowohl vor dem Ionenselektor wie auch danach
eintreten, weil der Ionenselektor die Ionen gleicher Geschwindigkeit
selektiert. Da sich beim Zerfall die Geschwindigkeit der Ionen nur
völlig unwesentlich ändert, werden die bereits
vor dem Ionenselektor entstandenen Tochterionen mit ausgewählt.
Damit kann der Zerfall der Molekülionen zu Tochterionen
bereits durch eine leicht erhöhte Lasereinstrahlung während
der matrixunterstützten Laserdesorption eingeleitet werden.
Diese Lasereinstrahlung erzeugt, zumal bei Erhöhung der eingestrahlten
Energiedichte, einen großen Anteil metastabiler Ionen,
die mit einer Halbwertszeit von einigen Mikrosekunden zerfallen
und so Tochterionen liefern. Andererseits kann der Zerfall auch
durch Stoßfragmentierung in einem gasbefüllten
Stoßraum bewirkt werden.
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Das
frühere PSD genannte Verfahren war für sein schlechtes
Massenauflösungsvermögen in den Tochterionenspektren,
für seine geringe Empfindlichkeit und sein langsames Arbeiten
bekannt. Die in Schritt (d) beschriebene Verwendung des Reflektors ähnelt
diesem alten Verfahren. Es ist daher auch für den Fachmann überraschend,
dass sich durch günstige Einstellung der elektrischen Parameter
des Flugzeitmassenspektrometers im Tochterionenspektrum an der Stelle
des nachzuweisenden Tochterions ein Massenauflösungsvermögen
und eine Empfindlichkeit ergeben, die dem der modernen Tandem-Flugzeitspektrometer überhaupt
nicht nachstehen, sondern sogar übertreffen. Das erfindungsgemäße
Verfahren hat aber nicht nur den Vorteil der Benutzung eines preiswerteren
Gerätes, sondern gegenüber den modernen Tandem-Flugzeitspektrometern
den weiteren Vorteil, sich wesentlich leichter und mit viel weniger
elektronischem Verschleiß auf eine hohe Spektrenaufnahmefrequenz
von etwa zwei Kilohertz einstellen zu lassen, weil nur mäßige
Spannungen im Takte dieser Frequenz zu schalten sind. Dadurch wird,
bei nicht zu hoher Anzahl der Einzelspektren pro Summenspektrum,
durchaus die Aufnahme von über zehn Summenspektren pro
Sekunde für die Tochterionenmessung möglich. Ein
Quadratzentimeter Dünnschnitt kann dann bei voller Ausreizung
der Ortsauflösung mit der Messung von 40 000 Summenspektren
in der Größenordnung von nur einer Stunde abgerastert
werden, während mit Tandem-Flugzeitmassenspektrometern
etwa zehn Stunden benötigt würden.
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Der
wesentliche Schritt für eine günstige Einjustierung
der Reflektorspannung in Schritt (d) besteht übrigens darin,
die angelegte Reflektorspannung so zu reduzieren, dass das ausgewählte Tochterion
im Reflektor etwa dieselbe Trajektorie durchfliegt, die bei voller
Reflektorspannung vom Analytion durchflogen würde.
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Das
Abrastern der Probenoberfläche geschieht zweckmäßigerweise
durch eine Bewegung der Probe, die auf einem beweglichen Halter
befestigt ist.
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Es
ist manchmal von besonderer Bedeutung, nicht nur die Verteilung
eines einzigen kleinen Analytmoleküls zu messen, sondern
die Verteilungen mehrerer kleiner Analytmoleküle miteinander
vergleichen zu können. Als Beispiel möge ein Pharmakon
und eine seiner ersten Reaktionsstufen im Körper, also
eines seiner Metaboliten, dienen. Die beiden Analytmoleküle,
also das Pharmakon und sein Reaktionsprodukt haben dabei in der
Regel zwei Massen, die nicht weit auseinander liegen. Auch die auszuwählenden
Tochterionen werden nicht weit in ihrer Masse auseinander liegen,
wenn nicht sogar das gleiche Tochterion ausgewählt werden
kann. Durch eine zweimalige oder eine länger dauernde Öffnung
des Ionenselektors können jetzt die beiden Analytionen für
die Erzeugung eines einzigen Tochterionenspektrums ausgewählt
werden. Die Tochterionen der beiden Analytionen werden jetzt mit
leichter zeitlicher Verzögerung im selben Tochterionenspektrum
gemessen, selbst wenn die beiden Tochterionen die gleiche Masse
haben. Es können also mit diesem leicht geänderten
Verfahren beide Verteilungen gemeinsam ohne Verlängerung
der Messzeit im direkten Vergleich gemessen werden
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Kurze Beschreibung der Abbildung
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Die 1 zeigt
ein Schema eines MALDI-Flugzeitmassenspektrometers mit Reflektor
(13) und Eltemionenselektor (10).
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Beste Ausführungsformen
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Eine
erste Ausführungsform bezieht sich auf die Messung der örtlichen
Verteilung einer einzigen Molekülsorte in einem histologischen
Dünnschnitt mit einer Ionisierung der Analytmoleküle
durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI). Die Ortsverteilung
dieser ausgewählten Sorte kleiner Analytmoleküle
auf der flächigen Probe wird in einem einfachen MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
mit Reflektor gemessen, wie es als Schema in 1 dargestellt ist.
Der Pulslaser (3) soll vorzugsweise im Takt von etwa zwei
Kilohertz arbeiten können. Die Probe befindet sich auf
einer Probenplatte (1), die sich durch eine Bewegungseinrichtung
(2) mit einer hohen Ortsgenauigkeit von nur wenigen Mikrometern
in der Ebene der Probe, also in zwei Dimensionen, verschieben lässt.
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Die
Dünnschnitte werden in üblicher Weise von gefrorenem
Gewebe mit einem Kryo-Mikrotom gewonnen. Für gewöhnlich
sind sie etwa 20 Mikrometer dick. Sie werden für die massenspektrometrische
Analyse auf Objektträger aufgelegt, wo sie adhäsiv
festgehalten werden. Die Objektträger sind in bekannter
Weise oberflächlich leitend gemacht, um ein gut definiertes
Potential für die spätere Beschleunigung der Ionen
zu geben. Der Dünnschnitt wird, wie in der bildgebenden
MALDI-Massenspektrometrie üblich, mit einer Schicht von
Matrixsubstanz versehen, um eine Ionisierung der Analytmoleküle
durch die matrixunterstützte Laserdesorption zu ermöglichen.
Die Objektträger werden dann auf den Probenplatten befestigt.
Sie bilden mit der Probenplatte (1) eine Einheit und werden
zusammen mit der Probenplatte (1) in die Innenquelle des
Massenspektrometers eingefahren.
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Durch
Lichtblitze aus dem Laser (3), die durch eine Linse (4)
fokussiert über einen Spiegel (5) auf einen Ort
(6) der Probe auf der Probenplatte (1) gelenkt
werden, werden Analytmoleküle dieses Ortes (6)
der Probe desorbiert und ionisiert. Die Lichtblitze haben zeitliche
Dauern zwischen 100 Picosekunden und 10 Nanosekunden; ihr Profil
kann in spezieller Weise geformt sein, wie bereits oben dargelegt.
Die Laserenergiedichte wird dabei so hoch gewählt, dass ein
beträchtlicher Anteil der Molekülionen metastabil wird,
und zwar mit einer kurzen Zerfallshalbwertszeit von nur einigen
10 Mikrosekunden. Sie zerfallen daher zu großen Anteilen
in der Flugstrecke zum Reflektor (13) des Flugzeitmassenspektrometers.
Durch Spannungen an den Beschleunigungsblenden (7) und
(8) werden die Ionen zu einem Innenstrahl (9) beschleunigt.
Dabei wird die Spannung an der Beschleunigungsblende (7)
so geschaltet, dass die Beschleunigung erst mit einer einstellbaren
Verzögerungszeit, die zwischen etwa 50 bis 500 Nanosekunden
liegt, nach der Laserdesorption einsetzt; dadurch können
die Analytionen der desorbierten Plasmawolke (und die bis dahin
entstehenden Tochterionen) zeitlich auf den Elternionenselektor
(10) fokussiert werden. Dieses Verfahren ist unter dem
Namen „delayed extraction" (DE) für MALDI-Flugzeitmassenspektrometer
weithin bekannt.
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Der
Elternionenselektor (10) wird nun so beschaltet, dass er
nur für kurze Zeit öffnet und sonst alle Ionen,
die nicht die Geschwindigkeit der ausgewählten Sorte kleiner
Analytmoleküle besitzen, so weit seitlich auf den Pfad
(12) ablenkt, dass sie nicht mehr zum Detektor (14)
gelangen können. Nur die selektierten Analytionen und ihre
durch Zerfall entstandenen Tochterionen verbleiben ungestört
auf ihrem Pfad (11) zum Reflektor (13). Die Tochterionen haben
im Wesentlichen die gleiche Geschwindigkeit wie ihre Elternionen,
weil sie beim Zerfall praktisch keine Geschwindigkeitsänderung
erfahren, und werden zusammen mit ihren Elternionen selektiert.
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Am
Reflektor (
13) werden für gewöhnlich zwei
Spannungen angelegt, eine Bremsspannung und eine Reflektionsspannung.
Nur in Ausnahmefällen werden nur eine Spannung oder mehrere
Spannungen verwendet. Durch die Einstellung von Brems- und Reflektionsspannungen
im Reflektor (
13) kann jetzt eine ausgewählte
Sorte der Tochterionen auf den Detektor (
14) gelenkt werden.
Der wesentliche Schritt für eine günstige Einjustierung
der Reflektorspannungen besteht darin, die angelegten Reflektorspannungen
so zu reduzieren, dass das ausgewählte Tochterion im Reflektor
dieselbe Trajektorie durchfliegt, die bei voller Reflektorspannung
vom Analytion durchflogen würde. Die dazu notwendige Reduktion der
Spannungen am Reflektor kann aus den beiden Werten der Massen von
ausgewähltem Tochterion und Analytion automatisch berechnet
werden. Die Reduktion folgt streng dem Quotienten der beiden Massen,
da die Massen den Energien dieser beiden Ionen entsprechen, und
bezieht sich proportional auf beide Reflektorspannungen. Ionen reduzierter
Energie lässt der Reflektor auf den gleichen Trajektorien fliegen,
wenn seine Spannungen im gleichen Verhältnis wie die Energie
reduziert werden. Diese Einstellung ergibt insbesondere dann eine
Erhöhung der Empfindlichkeit, wenn der Reflektor durch
besondere Ausformung des elektrischen Feldes im hinteren Teil eine
Raumwinkelfokussierung erzeugt, wie sie in der Offenlegungsschrift
DE 101 56 604 A1 (A.
Holle) beschrieben ist. Es wird dann die ausgewählte Sorte der
Tochterionen voll und ohne Verluste auf den Detektor (
14)
fokussiert.
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Dabei
treten die schwereren Ionen der Analytmoleküle hinten aus
dem Reflektor (13) aus und stören den weiteren
Messablauf nicht. Der Reflektor ist häufig hinten mit einem
Gitter abgeschlossen und besitzt einen weiteren Detektor, um die
hier austretenden Ionen messen zu können.
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Das
Signal der Analytionen und der sie begleitenden Komplexionen, die
den Reflektor rückseitig verlassen, kann unter Umständen
für Normierungszwecke verwendet werden, beispielsweise
für eine Korrektur der relativen Konzentrationsmessungen
durch nachlassende Laserenergiedichte.
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Mit
dem Detektor (14) wird ein kurzes Massenspektrum um die
ausgewählte Tochterionensorte herum aufgenommen. Dabei
wird der Innenstrom in üblicher Weise verstärkt
und digitalisiert. Durch optimale Einstellungen der Verzögerungszeit
für die Beschleunigung, der Beschleunigungsspannung zwischen
Probenplatte (1) und Beschleunigungsblende (7),
und der Brems- und Reflektionsspannungen am Reflektor (13)
kann man für die ausgewählte Sorte der Tochterionen
eine exzellente Massenauflösung erreichen. Das ist auch
für den Fachmann überraschend, weil das zugrunde
liegende PSD-Verfahren für eine nur sehr mäßige
Massenauflösung und eine mäßige Empfindlichkeit
bekannt ist. Der schlechte Ruf des PSD-Verfahrens zur Messung von
Tochterionenspektren hält den Fachmann eher davon ab, Teile dieses
Verfahrens einzusetzen. Mit der überraschend erzeugten
guten Massenauflösung steigt aber das Verhältnis
von Signalstärke zu Untergrundrauschen, und damit die Empfindlichkeit
des Verfahrens. Durch die oben angegebene Justierung der Reflektorspannungen
und durch die dadurch erzeugte gute räumliche Fokussierung
der Tochterionen auf den Detektor (13) wird durch die gute
Ausnutzung der Tochterionen zusätzlich eine optimal gute Empfindlichkeit
erreicht. Mit diesem Verfahren lassen sich auch dann noch die Ortsverteilungen
für kleine Moleküle messen, wenn sich das Signal
der Molekülionen der Analytsubstanz selbst gar nicht mehr
aus dem Untergrundrauschen heraushebt.
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Das
Untergrundrauschen besteht aus vielen komplex aufgebauten Innenarten,
die aus der Matrixsubstanz gebildet werden, besonders dann, wenn
die Laserenergiedichte erhöht wird. Dabei sind Matrixionen
selbst, ihre Polymere, ihre Fragmentionen, und besonders Komplexe
aus allen diesen Ionen beteiligt. Die Anzahl der verschiedenartigen
Ionen ist so groß, dass bei jeder Masse mehrere solcher
Innenarten nachgewiesen werden können. Da ein Teil dieser Ionen
auch noch ionenoptischen Störungen unterliegt, beispielsweise
durch Stöße, überlagert sich den Massensignalen
des Untergrundes auch noch ein nicht massenweise aufzulösender
Streu-Untergrund. Das Tochterionenspektrum zeigt dagegen einen nur geringen
chemischen Untergrund, der allerdings vor Einrichtung des bildgebenden
Analysenverfahrens zu prüfen ist, damit nicht durch Zufall
eines der vom Elternionenselektor durchgelassenen Matrix-Komplexionen
Zerfallsionen liefert, die an der Stelle der ausgewählten
Tochterionen der Analytmoleküle liegen.
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Mit
einer einzigen Messung eines Spektrenausschnitts um die Tochterionen
herum ist es aber in der Regel nicht getan. Um ein gut reproduzierbares und
genügend empfindliches Signal zu erhalten, ist diese Messung
an der gleichen Stelle etwa 50 bis 500 mal zu wiederholen. Dabei
wird die Probenplatte nicht bewegt. Die digitalisierten Spektren
von dieser Stelle der Probe werden addiert und ergeben so ein auswertbares
Summenspektrum, wobei die Signalstärke der Tochterionen
im Summenspektrum die Konzentration der ausgewählten kleinmolekularen Substanz
an dieser Stelle der Probe relativ zu Konzentrationen an anderen
Stellen wiedergibt. Die Genauigkeit der relativen Konzentrationsmessung hängt
von der Konzentration der Substanz selbst, aber auch von der Anzahl
der Einzelspektren im Summenspektrum ab. Durch die Wahl der Anzahl
der Einzelspektren im Summenspektrum können also die Empfindlichkeit
des Verfahrens und die Genauigkeit der relativen Konzentrationsmessung
eingestellt werden.
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Diese
Messung des Summenspektrums der Tochterionen der interessierenden
Sorte kleiner Moleküle wird nun an anderen Stellen der
Probe wiederholt, bis aus den Messungen eine Ortsverteilung der Konzentration
dargestellt werden kann. Kommerzielle Flugzeitmassenspektrometer
mit Reflektoren besitzen bereits in der Regel genügend
schnelle und genügend genaue Bewegungsmöglichkeiten
für die Probenplatte. Das Abrastern der Probenoberfläche geschieht
zweckmäßigerweise durch eine Bewegung der Probenplatte.
Für die Wahl des Ortes der nächsten Messung kann
ein beliebiges Verfahren verwendet werden. So kann, um Störungen
durch Aufladungen zu vermeiden, die nächste Messstelle
weit von der gegenwärtigen Messstelle entfernt sein. Es
sind dann allerdings weite Verfahrwege für die Probenplatte
in Kauf zu nehmen. Diese Verfahrwege kosten Zeit. Es ist daher oft
vorteilhafter, in einem engen Raster zu von Punkt zu Nachbarpunkt
scannen. Aufladungen der Probe können dabei in an sich
bekannter Weise vermieden werden, indem man die Schicht aus Matrixkriställchen
in einer Vakuumapparatur mit einer sehr dünnen Goldschicht
bedampft. Diese Goldschicht verbessert dabei bereits das einzelne Massenspektrum.
Diese Goldschicht ist dabei keineswegs dicht geschlossen, wenn man
sie unter dem Mikroskop untersucht, leitet aber alle Aufladungen der
Oberfläche genügend gut ab.
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Die
Summenspektren jeder Stelle können sofort aus der Aufnahmeelektronik
abgeholt und in einem angeschlossenen Computer auf die Signalstärke
des Tochterions untersucht werden. Ist das Erkennungsverfahren für
die Tochterionen genügend sicher, so ist es möglich,
nur die Signalstärken des Tochterions für die
verschiedenen Ortskoordinaten abzuspeichern und für die
spätere graphische Darstellung der Verteilung zu verwenden.
Um Speicherplatz zu sparen, können dann die Tausende von Summenspektren
verworfen werden, soweit die Zulassungsvorschriften für
Pharmaka oder ähnliche Vorschriften dies zulassen. Für
die graphische Darstellung der Ortsverteilungen stehen kommerziell vertriebene
Computerprogramme zur Verfügung. Den Bildern der Verteilungen
können dabei auch mikroskopisch gewonnene Bilder angefärbter
Nachbar-Dünnschnitte überlagert werden, um die
Lage von Organen sichtbar zu machen, Die Ortsauflösung ist
oberhalb der durch die Querdiffusion der Analytsubstanzen beim Auftragen
der Matrixschicht gegebenen Grenzauflösung durch den Rasterabstand
der Messungen wählbar. Bei voller Ausnutzung der durch die
Matrix-Aufbringung gegebenen Ortsauflösung liegen die Rasterpunkte
der Messung nur etwa 50 Mikrometer auseinander. Es werden dann 40
000 Messpunkte pro Quadratzentimeter abgerastert. Kann eine Aufnahmefrequenz
von zwei Kilohertz erreicht werden, und sind beispielsweise 200
Einzelspektren pro Summenspektrum für den Messpunkt notwendig, so
dauert die Abrasterung eines Quadratzentimeters nur wenig länger
als eine Stunde, während moderne Tandem-Flugzeitmassenspektrometer
dafür etwa 10 Stunden benötigen.
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Die
maximal mögliche Ortsauflösung ist aber häufig
gar nicht nötig. Es sei dafür ein Beispiel gegeben.
Olanzapin hat ein Molekulargewicht von 313 Dalton und wird auf seine
Eignung als Medikament zur Behandlung schizophrener Zustände
untersucht. Füttert man eine Ratte oral mit Olanzapin in
einer Dosis von 8 mg/kg, und tötet man die Ratte nach zwei Stunden,
so kann man vom Dünnschnitt das Tochterion der Masse 256
Dalton des Olanzapins mit 400 Einzelspektren pro Summenspektrum
sehr gut nachweisen. Für einen Rattenbauchquerschnitt von
zwei mal sechs Zentimetern genügt ein Raster mit Abständen
von 400 Mikrometern. Für die hier günstigen 400 Einzelspektren
pro Summenspektrum lassen sich gut 4 Summenspektren pro Sekunde
auf nehmen, so dass die gesamten zwölf Quadratzentimeter
des Verteilungsbildes in etwa 30 Minuten gemessen werden können.
In solch einem Verteilungsbild ist die Verteilung des Olanzapins
sehr gut zu erkennen, wobei es sich besonders in Zwischenräumen
zwischen einzelnen Organen anreichert. Da für eine Studie
mehrere Dünnschnitte von Ratten nach verschiedenen Einwirkungsdauern
anzufertigen sind, ist eine erträglich lange Messdauer
für eine solche Verteilungsmessung wesentlich. Außerdem
sind jeweils auch die Verteilungen einiger Metabolite zu messen,
um auch die Abbaupfade und mögliche Wirkungsorte dieser Metabolite
zu untersuchen.
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Die
massenspektrometrische Messung hat gegenüber den bisher
angewandten Methoden große Vorteile. So wurde die Verteilung
des Olanzapins bisher durch radioaktive Markierung des Olanzapins gemessen.
Es lassen sich dann aber die Verteilungen des originalen Olanzapin-Moleküls
nicht von denen seiner Metabolite trennen, da diese in der Regel auch
die radioaktive Markierung tragen. Allein die Massenspektrometrie
ist in der Lage, die verschiedenen Verteilungen der Originalmoleküle
und die der verschiedenartigen Metabolite zu erfassen.
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Der
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt
darin, ganz gewöhnliche, preiswerte Flugzeitmassenspektrometer
mit Reflektoren verwenden und mit ihnen eine hohe Aufnahmerate erzielen
zu können. Diese Flugzeitmassenspektrometer sind üblicherweise
bereits mit Elternionenselektoren ausgerüstet, um gelegentlich
PSD-Spektren aufnehmen zu können. Für eine volle
Ausnutzung der hohen Aufnahmegeschwindigkeit sind sie allerdings
mit entsprechend schnellen Laser auszurüsten, und selbstredend
auch mit einer entsprechenden Software zur Steuerung des Verfahrens.
Die erwünscht hohe Laserpulsrate von zwei Kilohertz kann
heute nur mit Festkörperlasem erreicht werden, nicht mit
den bisher bevorzugt für MALDI verwendeten Stickstoff-Lasern.
Die Festkörperlaser bedürfen aber, wie schon einleitend
erwähnt, besonderer Strahlformung, um eine hohe Effektivität
der Ionisierung von Analytmolektilen zu zeigen. Als Festkörperlaser
können beispielsweise Neodym-YAG-Laser mit einer Verdreifachung
der Quantenenergie eingesetzt werden.
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Außer
histologischen Gewebedünnschnitten sind auch andere flächige
Proben für die Messung von Verteilungen von kleinen Molekülen
geeignet. So können beispielsweise die Verteilungen von
Molekülen in Platten für die Dünnschicht-Chromatographie oder
in Acryl-Gelen für die ein- oder zweidimensionale Gel-Elektrophorese
gemessen werden. Interessant ist beispielsweise auch die Messung
der Verteilung von organischen Verunreinigungen auf der Oberfläche
elektronischer Bauteile. Ganz allgemein können Verteilungen
von Analytmolekülen auf oder in einer beliebigen Oberfläche
analysiert werden.
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Die
Ionisierung der Analytmoleküle an jeweils einem Ort der
Probe findet vorzugsweise durch matrixunterstützte Laserdesorption
statt; es sind jedoch auch andere Verfahren zur Ionisierung der
Substanzen anwendbar, wie beispielsweise die einfache Laserdesorption
(LD), die Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS) oder
der Beschuss der Probe mit kleinsten geladenen Tröpfchen,
der ebenfalls Oberflächenmoleküle ionisiert. Je
nach Ionisierungsart können neben der laserinduzierten
Fragmentierung auch andere Fragmentierungsmechanismen angewendet
werden. So kann der Zerfall beispielsweise durch Stoßfragmentierung
bei Einschuss der Molekülionen in einen gasbefüllten
Stoßraum bewirkt werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber
Verfahren mit modernen Tandem-Flugzeitspektrometern den Vorteil,
sich wesentlich leichter und mit viel weniger elektronischem Verschleiß auf eine
hohe Spektrenaufnahmefrequenz von etwa zwei Kilohertz einstellen
zu lassen, weil nur mäßige Spannungen im Takte
dieser Frequenz zu schalten sind. Das Schalten der Spannung bezieht
sich dabei auf die Spannung der Beschleunigungsblende (7),
die nur um einige Hundert Volt (bis maximal etwa zwei Kilovolt)
zu schalten ist. In Verbindung mit der Verwendung eines schnellen
Pulslasers lassen sich Aufnahmeraten der Einzelspektren von etwa
zwei Kilohertz erreichen, womit durchaus zehn Summenspektren pro
Sekunde mit jeweils 200 Einzelspektren für die Tochterionenmessung
möglich werden.
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Es
ist manchmal von besonderer Bedeutung, nicht nur die Verteilung
eines kleinen Analytmoleküls zu messen, sondern die Verteilungen
mehrerer kleiner Analytmoleküle miteinander vergleichen
zu können. Das bezieht sich insbesondere auf die Verteilungen
von Pharmaka und der im Körper daraus entstehenden Metabolite.
Die Moleküle der Pharmaka werden im Körper sofort
durch Enzyme angegriffen und verändert. Dabei können
etwas schwerere Reaktionsprodukte entstehen, beispielsweise durch
Oxidation, oder auch leichtere Reaktionsprodukte, beispielsweise
durch Abspaltungen von Methyl-, Amino- oder Hydroxylgruppen. Die
ersten Reaktionsstufen der enzymatischen Angriffe haben oft Molekulargewichte,
die sich nur relativ wenig von denen der Ausgangsmoleküle
unterscheiden. Von therapeutischer Wichtigkeit ist dabei, dass es
oft gar nicht die Moleküle der Ausgangssubstanz sind, die
die therapeutischen Wirkungen entfalten, sondern die der Metaboliten;
daher ist die Messung von deren Ortsverteilungen besonders wichtig.
Die Verteilungen stimmen dabei häufig nicht mit denen der
Ausgangssubstanzen überein; beispielsweise können
sich durch Änderung der hydrophil-hydrophoben Eigenschaften,
aber auch durch andersartige Transport- oder Festhaltemechanismen,
stark verschiedene Ortsverteilungen einstellen.
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Für
die vergleichende Messung zweier (oder auch mehrerer) Ortsverteilungen
kann nun ein besonders günstiges Verfahren verwendet werden,
das durch leichte Modifikation aus dem erfindungsgemäßen
Verfahren entsteht. Dabei werden die beiden Analytmolekülionen,
also die Molekülionen des Pharmakons und die Molekülionen
des metabolen Reaktionsprodukts, durch zweimaliges Öffnen
des Elternionenselektors gemeinsam hintereinander in die Flugstrecke
zum Reflektor durchgelassen, und es werden zwei Tochterionen dieser
beiden Sorten von Ausgangsmolekülen ausgesucht, die in
ihrer Masse nahe zusammen liegen. Diese beiden Tochterionen werden
jetzt durch Reflektion auf den Detektor gemeinsam in einem Tochterionenspektrum
gemessen. Selbst wenn zwei Tochterionen der gleichen Masse ausgesucht
werden, was bei Metaboliten oft der Fall sein kann, erscheinen die
Tochterionen leicht getrennt im Tochterionenspektrum, weil ihre
Elternionen aufgrund ihrer verschiedenen Massen verschiedene Flugzeiten
zum Elternionenselektor hatten, und auch weil die beiden Tochterionen
leicht verschiedene Energien haben. Das gilt auch für solche
Tochterionen, die beide durch die Abspaltung einer gleichen Gruppe
aus den beiden Analytionen entstehen; auch hier werden die beiden
Tochterionen an leicht verschiedenen Stellen im Tochterionenspektrum
gemessen.
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Liegen
die beiden Massen der Analytionen dicht beieinander, so kann der
Elternionenselektor auch für eine kleine Zeitspanne offen
gehalten werden, um beide Analytionen durchzulassen.
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Auch
hier kann eine günstige Justierung der Reflektorspannungen
darin bestehen, eine der beiden Tochterionen in etwa auf der Trajektorie
fliegen zu lassen, auf der bei vollen Reflektorspannungen das Analytion
fliegen würde. Es kann aber auch günstig sein,
Reflektorspannungen zu wählen, bei der beide Tochterionen
möglichst nahe zu dieser Trajektorie fliegen.
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Es
können mit diesem leicht geänderten Verfahren
die beiden Ortsverteilungen von Pharmamolekülen und Metaboliten
gemeinsam und in direktem Vergleich ohne Verlängerung der
Zeitdauer für die Messung gemessen werden. Auch der Vergleich
der Verteilungen verschiedenartiger Metabolite ist möglich.
Das Verfahren kann auch auf mehr als zwei Analytionen ausgedehnt
werden, wobei möglicherweise durch eine Erhöhung
der Anzahl der Einzelspektren pro Summenspektrum eine Erhöhung
des Verhältnisses von Signal zu Rauschen eingestellt werden muss.
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Dem
massenspektrometrisch kundigen Fachmann ist es durch Kenntnis dieses
Verfahrens mit seinen überraschenden Vorteilen möglich,
leicht weitere Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
vorzunehmen. Diese weiteren Ausgestaltungen sollen ebenfalls dem
Schutzrecht dieser Erfindung unterliegen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 102004037512 [0003]
- - DE 102006019530 A [0004]
- - DE 102004044196 A1 [0005]
- - DE 19856014 C2 [0007]
- - DE 10156604 A1 [0025]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - D. Suckau
et al. [0003]
- - M. Schürenberg et al. [0004]
- - A. Hase et al. [0005]
- - C. Köster et al. [0007]