DE10034074A1 - Verbesserte Tochterionenspektren mit Flugzeitmassenspektrometern - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Gerät zur Messung von Tochterionenspektren (auch Fragmentionenspektren oder MS/MS-Spektren genannt) in Reflektor-Flugzeitmassenspektrometern mit Nachbeschleunigung selektierter Eltern- und Tochterionen durch Anheben des Potentials eines "Potentialfahrstuhls" während des Durchflugs der Ionen. DOLLAR A Die Erfindung besteht darin, dass der Potentialfahrstuhl mit einer Einrichtung zur Geschwindigkeitsfokussierung durch verzögert einschaltende Beschleunigung ausgestattet ist, wodurch es möglich wird, eine gleichzeitige Geschwindigkeitsfokussierung der Ionen aller Massen eines Spektrums am Detektor zu erreichen. Zusätzlich kann durch eine zeitliche Veränderung der Nachbeschleunigungspotentiale nach dem verzögerten Einschalten die Einstellung des Massenspektrometers für die gleichzeitige Geschwindigkeitsfokussierung der Ionen aller Massen eines Spektrums am Detektor erleichtert werden.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Gerät zur Messung von Tochterionenspektren (auch Fragmentionenspektren oder MS/MS-Spektren genannt) in Reflektor-Flugzeitmassenspek­ trometern mit Nachbeschleunigung selektierter Eltern- und Tochterionen durch Anheben des Potentials eines "Potentialfahrstuhls" während des Durchflugs der Ionen.

Die Erfindung besteht darin, dass der Potentialfahrstuhl mit einer Einrichtung zur Geschwin­ digkeitsfokussierung durch verzögert einschaltende Beschleunigung ausgestattet ist, wodurch es möglich wird, eine gleichzeitige Geschwindigkeitsfokussierung der Ionen aller Massen eines Spektrums am Detektor zu erreichen. Zusätzlich kann durch eine zeitliche Veränderung der Nachbeschleunigungspotentiale nach dem verzögerten Einschalten die Einstellung des Mas­ senspektrometers für die gleichzeitige Geschwindigkeitsfokussierung der Ionen aller Massen eines Spektrums am Detektor erleichtert werden.

Stand der Technik

In einem Flugzeitmassenspektrometer können die Masse-zu-Ladungsverhältnisse m/z der Ionen aus ihrer Flugzeit bestimmt werden. Auch wenn es sich in der Massenspektrometrie immer nur um die Messung des Verhältnisses m/z von Masse zu Ladung handelt, wobei z die Anzahl der Elementarladungen ist, die das Ion trägt, wird im Folgenden der Einfachkeit halber immer nur von der Masse m und ihrer Bestimmung gesprochen. Da viele Ionisierungsarten, wie zum Bei­ spiel MALDI, ganz überwiegend nur einfach geladene Ionen liefern (z = 1), fällt für diese Ioni­ sierungsarten der Unterschied praktisch fort.

In einem Flugzeitmassenspektrometer, das mit einem Ionenselektor und einem geschwindig­ keitsfokussierendem Reflektor ausgestattet ist, können Tochter- oder Fragmentionenspektren der durch den Ionenselektor auf Grund ihrer Flugzeit selektierten Elternionen gemessen wer­ den. Der Zerfall der Elternionen in Tochter- oder Fragmentionen kann durch den Eintrag von Überschussenergie bei der Ionisierung (so genannte PSD-Spektren, "Post Source Decay") oder durch andere Prozesse, beispielsweise durch Stoßfragmentierung (so genannte CID-Spektren, "Collisionally Induced Decomposition"), bewirkt werden.

Als geschwindigkeitsfokussierender Reflektor hat sich der zweistufige Ionenreflektor nach Mamyrin weitgehend durchgesetzt. In der ersten Bremsstufe des Reflektors werden die Ionen stark abgebremst, in der zweiten Bremsstufe nur schwach. In das lineare, relativ schwache Bremsfeld der zweiten Stufe des Reflektors dringen schnellere Ionen weiter ein als langsamere und legen daher einen längeren Weg zurück, der bei richtiger Einstellung der beiden Bremsfel­ der die schnellere Fluggeschwindigkeit der Ionen aus einem Primärfokus so kompensieren kann, dass sie genau im Sekundärfokus wieder gleichzeitig eintreffen. Die Fokuslänge der Ge­ schwindigkeitsfokussierung ist energieabhängig.

Treten die Elternionen und die aus ihnen durch Zerfall entstandenen Tochterionen gleichzeitig und mit gleicher Geschwindigkeit, also mit massenabhängig verschiedenen Energien, in den Reflektor ein, werden sie im Reflektor durch ihre verschiedenen Energien massendispergiert.

Die Methode des Nachweises von Tochter- oder Fragmentionen durch solche Reflektoren hat aber gravierende Nachteile. Es können mit einigermaßen guter Fokussierung immer nur Ionen eines relativ kleinen relativen Energiebereiches nachgewiesen werden, in den normalen Ausfüh­ rungen kommerziell erhältlicher Geräte etwa 25 bis 30 Prozent des Energiebereichs. Der Grund hierfür ist, daß die Ionen auf jeden Fall das erste Bremsfeld passieren müssen, um ge­ schwindigkeitsfokussiert reflektiert werden zu können. Dieses erste Bremsfeld verbraucht aber bereits gut 2/3 der originalen Beschleunigungsenergie. Das heißt, von Elternionen einer Aus­ gangsmasse von 3200 atomaren Masseneinheiten können in einem ersten Fragmentionen­ spektrum nur Fragmentionen von etwa 2400 bis 3200 atomaren Masseneinheiten, in einem zweiten (bei reduzierter Reflektorspannung) nur Fragmentionen zwischen 1800 bis 2400 Mas­ seneinheiten, in einem dritten Spektrum zwischen 1350 bis 1800 Masseneinheiten aufgenom­ men werden, und so weiter. Für ein Peptid mittlerer Größe sind so etwa 10 bis 15 Spektren aufzunehmen, wenn das ganze Fragmentionenspektrum gemessen werden soll. Alle diese Spektren müssen durch ein kompliziertes Massenkalibrierverfahren aufeinander abgestimmt werden. Nur dann können diese Teilspektren im Datensystem zu einem künstlich erzeugten Kompositspektrum zusammengesetzt werden.

In der Offenlegungsschrift DE 198 56 014 A1 sind nun Wege zur Aufzeichnung von Tochter­ ionenspektren in einem Flugzeitmassenspektrometer mit zweistufigem Reflektor in einer einzi­ gen Spektrenaufnahme vorgeschlagen worden. Don sind auch weitere Erklärungen über PSD, CID, die Ionisierungsmethode MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization) und die Geschwindigkeitsfokussierung durch verzögert einsetzende Beschleunigung zu finden.

Eines der vorgeschlagenen Verfahren besteht darin, die Ionen in einer Ionenquelle mit verzö­ gert einsetzender Beschleunigung nur relativ gering zu beschleunigen, sie in einer ersten Drift­ strecke zerfallen zu lassen, sie während des Durchflugs durch eine kleine Potentialzelle (einen "Potentialfahrstuhl" oder "Potentiallift") sehr schnell auf ein zweites Beschleunigungspotential anzuheben und sie in einer nachfolgenden zweiten Beschleunigungsstrecke zu einer zweiten Driftstrecke hin zu beschleunigen. Die zweite Driftstrecke kann sich auf demselben Potential befinden wie die erste Driftsdtrecke, vorzugsweise werden beide Driftstrecken auf Erd- oder Massepotential betrieben. In der zweiten Driftstrecke haben dann sehr leichte Ionen eine Min­ destenergie, die das zweite Beschleunigungspotential liefert; die unzerfallenen Elternionen ha­ ben eine Maximalenergie, die der Summe aus zweiter und erster Beschleunigung entspricht.

Kann ein Reflektor Teilchen mit Energieabweichungen reflektieren, die etwa 30% der Maxi­ malenergie entsprechen und liefert das zweite Beschleunigungspotential etwa 70% der ge­ samten Energie, so kann nunmehr der Reflektor alle Tochterionen gleichzeitig reflektieren; es ist damit die Aufnahme des gesamten Tochterionenspektrums möglich.

Dabei kann der Potentialfahrstuhl selbst als Selektor für die Auswahl der Elternionen für das Tochterionenspektrum benutzt werden; es kann aber auch ein zusätzlicher Selektor verwendet werden, der gewöhnlich eine bessere Zeitauflösung für die Elternionen bietet, also für die Ab­ trennung anderer potentieller Elternionen ähnlicher Massen.

Diese sehr einfache Anordnung hat jedoch immer noch Nachteile. Erstens lässt sich die Mas­ senauflösung durch die Geschwindigkeitsfokussierung der verzögert einsetzenden Beschleuni­ gung in der Ionenquelle nur in einem Punkt des Spektrums einigermaßen gut einstellen; bei allen anderen Massen ist sie sehr schlecht. Zweitens hat das Tochterionenspektrum insgesamt keine besonders gute Massenauflösung und damit auch kein gutes Signal-zu-Rausch-Ver­ hältnis.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung der Aufnahme von Tochter­ ionenspektren mit einem "Potentialfahrstuhl" zu finden, wobei sich die Verbesserung auf die Massenauflösung, das Signal-zu-Rausch-Verhältnis und die Nachweisempfindlichkeit für alle Massen des Spektrums beziehen soll.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, ein Beschleunigungsfeld zwischen den beiden Gittern des Potentialfahrstuhls selbst oder in einer anschließenden Beschleunigungsstrecke verzögert so einzuschalten, dass in Verbindung mit einer willkürlich herzustellenden Korrelation von Ort und Geschwindigkeit der Ionen jeweils einer Masse nach dem bekannten Prinzip von Wiley und McLaren eine Geschwindigkeitsfokussierung für diese Ionen erreicht wird. Es können sich dabei auch mehr als eine Beschleunigungsstrecke an den Potentialfahrstuhl anschließen, um nicht die gesamte Spannung schalten zu müssen.

Es kann dabei ausgenutzt werden, dass man den Ort der Geschwindigkeitsfokussierung der Ionen, die durch ein verzögert eingeschaltetes Beschleunigungsfeld in der Ionenquelle erzeugt wird, nicht genau in den Potentialfahrstuhl legt, sondern im Potentialfahrstuhl eine Ortsvertei­ lung der Ionen gleicher Masse, aber verschiedener Geschwindigkeiten, erzeugt.

Dabei ist es besonders günstig, zwischen Ionenquelle und Potentialfahrstuhl einen Ionenselek­ tor anzuordnen, auf den die Geschwindigkeitsfokussierung für die Elternionen aus der verzö­ gert einsetzenden Beschleunigung der Ionenquelle gerichtet ist. Es muss dabei zwischen Ionen­ selektor und Potentialfahrstuhl ein bestimmter Abstand eingehalten werden, damit die Ionen beim Eintritt in den Potentialfahrstuhl auf Grund ihrer verschiedenen Geschwindigkeiten wie­ der auseinandergelaufen sind. Diese Korrelation von Ort und Geschwindigkeit der Ionen ist es ja, die bei verzögert einschaltender Beschleunigung eine Geschwindigkeitsfokussierung be­ wirkt.

Zusammen mit einer entsprechenden Einstellung der Potentiale an einem zweistufigen Reflek­ tor kann dabei erreicht werden, dass im selben Spektrum sowohl für die Elternionen wie auch für die aus ihnen entstehenden Fragmentionen aller Massen eine Geschwindigkeitsfokussierung beim Aufprall auf den Detektor erreicht wird, wodurch sich eine hohe Massenauflösung über das gesamte Spektrum hinweg ergibt. Die Fokuslängenverhältnisse für die Geschwindigkeits­ fokussierung leichter und schwerer Ionen lassen sich in einem zweistufigen Reflektor durch die Wahl der Potentiale und die Geometrie des Reflektors in Grenzen beliebig einstellen.

Die günstigste Einstellung kann durch Variation der Abstände der Ionenquelle zu Selektor, Potentialfahrstuhl, zweistufigem Reflektor und Detektor, durch Variation der Spannungen an Reflektor und Potentialfahrstuhl, und durch die Variation der Verzögerungszeit der Nachbe­ schleunigung durch den Potentialfahrstuhl oder seiner Beschleunigungsfelder gefunden werden. Die Einstellung verlangt dabei einen hohen experimentellen Aufwand. Die Simulation durch entsprechende Simulationsprogramme verlangt einen ähnlichen Aufwand.

Es ist daher ein weiterer Gedanke der Erfindung, die schwierig durchzuführenden mechani­ schen Abstandsänderungen durch die Einführung weiterer, an sich redundanter, elektronisch steuerbarer Parameter zu erleichtern. Diese weitere Erfindungsidee besteht darin, die Spannun­ gen an den Beschleunigungsstrecken des Potentialfahrstuhls nach dem Einschalten der Beschleungung zeitlich so veränderlich zu machen, dass die Ionen aller Massen durch den Re­ flektor gleichzeitg geschwindigkeitsfokussierend auf den Detektor abgebildet werden.

Normalerweise bewirkt die verzögert einschaltende Beschleunigung immer, dass leichte Ionen eine kürzere Wegstrecke bis zu ihrer Geschwindigkeitsfokussierung zeigen als schwerere Io­ nen. Eine solche Verteilung der Fokusorte für die Geschwindigkeiten der Ionen verschiedener Masse kann jedoch durch einen nachfolgenden Reflektor nur unter günstigen geometrischen Verhältnissen aller Abstände im Massenspektrometer geschwindigkeitsfokussierend auf den Detektor abgebildet werden. Mit normaler Einstellung besitzt der Reflektor ebenfalls für leich­ tere Ionen eine kürzere Fokuslänge der Geschwindigkeitsfokussierung. Eine solche Einstellung des Reflektors verlangt für die leichten Ionen einen Zwischenfokus der Geschwindigkeiten näher am Reflektor als für schwerere Ionen, um die Ionen aller Massen gleichzeig am Detektor geschwindigkeitsfokussieren zu können; die verzögert einsetzende Beschleunigung im Potenti­ alfahrstuhl liefert aber eine Verteilung der Geschwindigkeitsfokuspunkte, bei der die schwere­ ren Ionen näher am Reflektor liegen.

Durch eine zeitliche Veränderung der Beschleunigungsfelder am Potentialfahrstuhl nach dem verzögerten Enschalten der Beschleunigung kann man jedoch erreichen, dass sich die Vertei­ lung der Zwischenfokusorte umkehrt: die leichten Ionen werden nach längerer Wegstrecke geschwindigkeitsfokussiert, also näher am Reflektor, als die schwereren Ionen.

Dabei kann man ausnutzen, dass sich die Fahrstuhl- und Beschleunigungsspannungen durch Zuleitungsinduktivitäten und Streukapazitäten nicht im Nanosekundenmaßstab momentan schalten lassen, sondern immer eine Zeitkonstante besitzen und mehr oder weniger ein expo­ nentielles Einkriechen in den Endwert zeigen. Ein gezieltes Zuschneidern dieser Zeitkonstanten und Einschwingvorgänge reicht bereits aus, um den gewünschten Effekt zu erreichen. Für noch bessere Ergebnisse kann die Zeitkonstante auch einstellbar gemacht werden.

Es lässt sich damit erreichen, dass die Eltern- und Fragmentionen im Massenbereich von 60 bis 3000 atomaren Masseneinheiten gleichzeitig isotopenaufgelöst gemessen werden können. Die­ ser Massenbereich ist besonders für die Strukturaufklärung von Peptiden interessant. Durch die gute Massenauflösung werden die nunmehr schlankeren Massensignale gleichzeitig auch we­ sentlich höher und zeigen somit ein verbessertes Verhältnis von Signalhöhe zum Rauschen. Durch die schlanken, hohen Massensignale, die sich besser aus dem Untergrundrauschen he­ rausheben, wird gleichzeitig auch eine bessere Nachweisempfindlichkeit erreicht.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Die Abb. 1 zeigt eine Ausführung des Flugzeitmassenspektrometers nach dieser Erfin­ dung mit einer Ionenquelle (1) und zwei Beschleunigungsstrecken, die durch die Gitter (2) und (3) gebildet werden. Ein Ionenselektor (4) erlaubt die Auswahl der gewünschten Ionen. Der Potentialfahrstuhl besteht zunächst aus den beiden Gittern (5) und (6), die sich in diesem Bei­ spiel auf gleichem Potential befinden, das sich beim Durchflug der gewünschten Ionen auf eine hohe Spannung schalten lässt. Auch hier gibt es zwei Beschleunigungsstrecken, die durch die Gitter (7) und (8) gebildet werden, und die erfindungsgemäße Geschwindigkeitsfokussierung der Ionen erzeugen lassen. Im Fall dynamischer Geschwindigkeitsfokussierung lässt sich eine Reihenfolge der Fokusorte für die Geschwindigkeiten erzeugen, die für schwere Ionen (9) nah am Fahrstuhl, für mittelschwere Ionen (10, 11) weiter weg, und für leichte Ionen (12) noch weiter in Richtung Reflektor liegen. Der zweistufige Reflektor wird hier aus den Gittern (13), (14) und (15) gebildet, er fokussiert die Ionen auf den Detektor (16).

Abb. 2 zeigt ein Spektrum von Tochterionen eines Peptids (Angiotensin II) mit einer Auflösung aller isotopen Massensignale im Spektrum durch eine Einstellung des Massen­ spektrometers nach Anspruch 4.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen

Die Ionen werden in der Ionenquelle (1, 2, 3) mit einer nur mäßigen Energie, beispielsweise nur mit 5 Kilovolt, beschleunigt. Dadurch fliegen sie in der ersten feldfreiene Driftstrecke zwi­ schen der Ionenquelle (1, 2, 3) und dem Potentialfahrstuhl (S. 6, 7, 8) relativ langsam, viele der Ionen können durch ihre bei der Ionisierung erhaltene Überschussenergie zerfallen. Wird bei­ spielsweise MALDI für die Ionisierung eingesetzt, so kann durch eine geringe Erhöhung der Laserleistung eine starke Erhöhung dieser Zerfälle erreicht werden.

Die verzögert einsetzende Beschleunigung zwischen den Gittern (1) und (2) der Ionenquelle wird so eingestellt, dass die auszuwählenden Elternionen genau im Ionenselektor (4) ge­ schwindigkeitsfokussiert werden. Damit ergibt sich eine gut zeitaufgelöste Ionenselektion für Eltern- und Tochterionen.

Die Ionenquelle muss aber nicht mit Gittern aufgebaut werden, es gibt hervorragend arbeitende Ionenquellen vollkommen ohne Gitter; auch ein Potentiallift ohne Gitter ist möglich.

Die selektierten Elternionen und ihre zerfallenen Fragmentionen treten beim Weiterflug in die erste Strecke des Potentialfahrstuhls zwischen den Gittern (5) und (6) ein, die in diesem Bei­ spiel miteinander kurzgeschlossen sind und sich auf dem Potential der ersten Driftstrecke be­ finden. Gitter (7) befindet sich währenddessen auf einem einstellbaren Nachbeschleunigungs­ potential von etwa 15 Kilovolt; Gitter (8) befindet sich fest auf Erdpotential, dem Potential der zweiten Driftstrecke nach dem Potentialfahrstuhl. Die Gitter (5) und (6) des Potentialfahrstuhls werden im Moment des Durchfluges der Ionen durch ihren Zwischenraum auf das hohe Poten­ tial der Nachbeschleunigung von etwa 15 Kilovolt geschaltet.

Die selektierten Ionen fliegen nun nach Abschluss des Potentialschaltens in den hier feldfrei gewählten Zwischenraum zwischen den Gittern (6) und (7) hinein, dabei sind die schnelleren Ionen aller Massen vorn, die langsameren kommen nach. Es herrscht eine Korrelation von Ort und Geschwindigkeit der Ionen, die als Grundlage für eine Geschwindigkeitsfokussierung durch die nachfolgend einsetzende Beschleunigung durch ein elektrisches Feld dient.

Die durch diese Geschwindigkeitsfokussierung erreichten Zwischenfokuspunkte können unter günstiger geometrischer Anordnung aller Funktionselemente des Massenspektrometers vom Reflektor für Ionen aller Massen auf den Detektor geschwindigkeitsfokussiert werden. In Abb. 2 ist ein so gewonnenes Tochterionenspektrum gezeigt. Dieses Spektrum zeigt eine Auflösung der isotopen Massensignale über den gesamten Massenbereich des Spektrums. Eine solche Einstellung des Massenspektrometers ist allerdings schwierig.

Man kann daher durch eine zusätzliche Veränderung der Beschleunigungspotentiale des Po­ tentialfahrstuhls nach dem Einschalten der Beschleunigungsfelder eine weitere Einstellung vor­ nehmen, die die Anordnung der Geschwindigkeitszwischenfokuspunkte so beeinflusst, dass sie leichter vom Reflektor auf den Detektor abgebildet werden können.

Dazu wird beispielsweise wird das Potential des Gitters (7) nach dem Eintritt der Ionen aus dem Potentialfahrstuhl in den Raum zwischen den Gittern (6) und (7) mit vorgegebener Ge­ schwindigkeit abgesenkt: die Nachbeschleunigung beginnt zu greifen. Dadurch werden die leichten Ionen insgesamt sehr schnell beschleunigt, sie verlassen den Raum zwischen den Git­ tern (6) und (7) sehr früh. Dadurch ist die Beschleunigungsdifferenz zwischen langsamen und schnellen leichten Ionen nicht allzu hoch, sie sind erst nach einer längeren Strecke vom Poten­ tiallift aus im Zwischenfokus (12) geschwindigkeitsfokussiert.

Die schwereren Ionen bleiben länger in der Beschleunigungsstrecke zwischen den Gittern (6) und (7), sie erhalten wegen der weiteren Absenkung des Potentials des Gitters (7) eine höhere Potentialdifferenz zwischen schnellen und langsameren Ionen und sind damit nach einer kürze­ ren Strecke in ihrem Zwischenfokus (9) geschwindigkeitsfokussiert. Die Verteilung der Zwi­ schenfokuspunkte (9, 10, 11, 12) für die Geschwindigkeitsfokussierung der Ionen kann damit so eingestellt werden, dass die Ionen nach Reflektion im geschwindigkeitsfokussierenden Re­ flektor genau alle am Ort des Detektors (16) wieder geschwindigkeitsfokussiert werden. Das betrifft natürlich nur die Geschwindigkeitsfokussierung, die leichten Ionen kommen insgesamt viel früher an als die schweren Ionen. Es kann somit ein gut massenaufgelöstes Massenspekt­ rum aufgenommen werden.

Die Geschwindigkeit der Absenkung des Potentials am Gitter (7) kann bereits durch die Zeit­ konstante des Schaltens, durch Induktivität der Zuleitung, durch Leitungswiderstände und durch Streukapazitäten, insbesondere durch die Kapazität des Gitters (7), so eingestellt wer­ den, dass der gewünschte Effekt erreicht wird. Auch ein exponentielles Annähern der Nachbe­ schleunigungsspannung an den Gittern (5) und (6) an den Sollwert unterstützt diesen Effekt.

Auch die Zeitkonstante für das Schalten des Potentialfahrstuhls hilft, die Anordnung der Ge­ schwindigkeitsfokuspunkte in die gewünschte Anordnung zu bringen.

Es kann aber auch, anders in Abb. 1 gezeigt, die Beschleunigung bereits zwischen den Gittern (5) und (6) des Potentialfahrstuhls verzögert einsetzen, indem die beiden Gitter auf zwei verschiedene Spannungen hochgeschaltet werden.

Nach Verlassen des Potentialfahrstuhls und seiner Beschleunigungsstrecken haben die leichten Ionen nunmehr eine Energie von etwas über 15 Kiloelektronenvolt, die unzerfallenen Elternio­ nen eine von 20 Kiloelektronenvolt; beides sehr günstig für den Nachweis in einem Sekundä­ relektronenvervielfacher (SEV).

Durch einen gitterfreien Reflektor, der im Eingangsbereich auch eine raumfokussierende Kom­ ponente hat, können dabei die leichten Ionen wie auch die schweren besser gemeinsam auf einen kleinflächigeren Detektor gelenkt werden, als das in Abb. 1 mit gitterbesetztem Reflektor gezeigt ist.

Die Zeit zum Durchfliegen des Fahrstuhls reicht aus, um das Potential zu schalten. Elternionen der Masse 3000 atomare Masseneinheiten haben bei 5 Kilovolt kinetischer Energie eine Ge­ schwindigkeit von etwa 4 Millimetern pro Mikrosekunde, Elternionen einer Masse von 750 atomaren Masseneinheiten legen etwa 8 Millimeter pro Mikrosekunde zurück. Ist der Fahrstuhl etwa 20 Millimeter lang, so muß das Schalten mit einer Anstiegsgeschwindigkeit von etwa einer halben Mikrosekunde geschehen. Das ist heute technisch möglich, wenn es auch besonde­ rer Maßnahmen bedarf, die aber dem Elektronik-Fachmann bekannt sind. Die erfindungsgemä­ ße Veränderung der Potentiale nach dem Einschalten erleichtert diese Aufgabe, da eine Annä­ herung der Potentiale an die Sollwerte langsam erfolgen kann.

Die besonderen Vorteile dieses erfindungsgemäßen Verfahrens liegen in den folgenden Punk­ ten:

• 1. Der größte Vorteil liegt im Zeitgewinn und in der sparsamen Ausnutzung der zur Verfü­ gung stehenden Probe, da für das vollständige Fragmentionenspektrum nur eine einzige Spektrenaufnahme erfolgt. Eine Spektrenaufnahme besteht dabei gewöhnlich aus etwa 20 bis 100 addierten Einzelspektren, die mit einer ebensolchen Anzahl von Laserschüssen ge­ wonnen werden.
• 2. Die Kalibrierkurve für die Massen braucht nur für ein einziges Spektrum aufgenommen zu werden, nicht für die bisherige Vielzahl von Fragmentspektren. Das Zusammenbasteln des Kompositspektrums entfällt.
• 3. Die leichten Fragmentionen erhalten eine größere Energie und lassen sich daher viel besser im Ionendetektor nachweisen. Die hier in der Regel gebrauchten Sekundärionen-Verviel­ facher können nur Ionen mit relativ hoher kinetischer Energie nachweisen.
• 4. Die Anordnung kann unter Umständen in existierende Massenspektrometer eingebaut wer­ den, selbst wenn diese Massenspektrometer zwischen Ionenquelle und Flugrohr ein Hoch­ vakuumventil besitzen und somit auf "potentialfreie" (auf Masse- oder Erdpotential befind­ liche) Flugstrecken festgelegt sind; dieser nachträgliche Einbau erfordert aber Abstriche an die Qualität der Tochterionenspektren, da die erforderlichen Fokuslängen nicht voll zur Verfügung stehen.
• 5. Die Ionenquelle kann für diesen Betrieb auf sehr viel niedrigerem Potential betrieben wer­ den.

Die Einrichtung des Fahrstuhls kann auch ausklappbar konstruiert werden. Dann kann der Fahrstuhl, der immerhin mindestens drei Gitter trägt, für Zwecke hochempfindlicher Messung der originären Gemischspektren aus dem Ionenstrahl herausgenommen werden.

Es muß aber nicht auf metastabile Ionen, also auf Ionen, die im Ionisierungsprozess eine Über­ schussenergie mitbekommen haben, allein abgestellt werden. Es kann auch beispielsweise in die erste feldfreie Flugstrecke zwischen der Blende (3) und dem Ionenselektor (4) eine Stoßzelle mit einer Zufuhr von Stoßgas eingebaut werden, die stoßinduzierte Fragmentionen erzeugt. Eine solche Anordnung ist unabhängig von der Erzeugung metastabiler Ionen in der Ionen­ quelle. Auch für die Betriebsweise mit einer Stoßzelle ist die Konstruktion mit einem Fahrstuhl vorteilhaft, da sich dann die Stoßzelle auf Massepotential befinden kann.

Befindet sich die Stoßzelle nahe an der Ionenquelle, so können auch die in ihr entstehenden metastabilen Ionen nachgewiesen werden. Eine Stoßzelle nahe am Fahrstuhl dagegen bevor­ zugt nur den Nachweis der spontan in der Stoßzelle zerfallenden Ionen.

Ein erfindungsgemäßes Massenspektrometer kann insbesondere für die Proteinidentifizierung und für die Erkennung mutierter oder anderweitig veränderter Proteine verwendet werden. Dabei werden die Proteine zunächst durch Enzyme verdaut, beispielsweise durch Trypsin. Eine Spektrennahme des Gemischs der Verdaupeptide mit einer Ionisierung durch MALDI ergibt ein so genanntes "Fingerprintspektrum", das zur sofortigen Identifizierung in Proteinsequenz­ datenbanken benutzt werden kann. Ergibt sich dabei keine eindeutige Identifizierung, oder stimmen einige Peptide nicht mit den aus der Datenbank gewonnenen Massen überein, so kön­ nen von diesen Peptiden sofort Tochterionenspektren genommen werden. Die Aufnahme eines Tochterionenspektrums dauert mit dieser Erfindung nicht mehr länger als die Aufnahme eines Fingerprintspektrums. Die Tochterionenspektren machen die Identifizierung eindeutig oder zeigen Unterschiede zur Sequenz in den Datenbanken auf, die auf Mutationen oder posttrans­ lationale Modifikationen zurückgehen. Alle diese Untersuchungen können durchgeführt wer­ den, ohne die Probe aus dem Massenspektrometer zu nehmen. Moderne Massenspektrometer benutzen Probenträger mit 384 oder sogar 1536 Proben.

Selbstverständlich können auch ganz andere Ausführungsformen von Flugzeitmassenspektro­ metern mit einer erfindungsgemäßen zweiten Beschleunigung in einem Fahrstuhl ausgestattet werden, beispielsweise Flugzeitspektrometer mit mehr als einem Reflektor. Jedem massen­ spektrometrisch tätigen Fachmann werden in Kenntnis dieser Erfindung solche Einbauten und Ausstattungen möglich sein.

Claims (16)

1. Verfahren für die Aufnahme von Spektren metastabil oder stoßinduziert aus Elternionen entstehender Fragmentionen in Reflektor-Flugzeitmassenspektrometern mit einem Poten­ tialfahrstuhl, dessen Potential während des Durchflugs zur Nachbeschleunigung der zu untersuchenden Eltern- und Fragmentionen angehoben wird, dadurch gekennzeichnet,
dass sich an den Potentialfahrstuhl mindestens eine Beschleunigungsstrecke anschließt und
dass sich ein Beschleunigungsfeld im Potentialfahrstuhl oder in einer der anschließenden Beschleunigungsstrecken zur Geschwindigkeitsfokussierung von Ionen verzögert ein­ schalten lässt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionen in einer Ionenquelle erzeugt werden und dass die Ionenquelle eine Einrichtung zur Geschwindigkeitsfokussie­ rung der Ionen durch eine verzögert einschaltbares Beschleunigungsfeld besitzt.

3. Verfahren nach Ansprach 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Elternionen und die aus ihnen entstehenden Fragmentionen gleicher mittlerer Geschwindigkeit durch einen Ionen­ selektor zwischen Ionenquelle und Potentialfahrstuhl selektiert werden und dass die zu selektierenden Ionen genau im Ionenselektor geschwindigkeitsfokussiert werden.

4. Verfahren nach einem der bisherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ab­ stände der Ionenquelle zu Selektor, Potentialfahrstuhl, Reflektor und Detektor, die Span­ nungen an Reflektor und Potentialfahrstuhl, und die Verzögerungszeit des Einschaltens des Beschleunigungsfeldes im Potentialfahrstuhl oder in einer Nachbeschleunigungsstre­ cke so gewählt werden, dass eine Geschwindigkeitsfokussierung am Detektor sowohl für die Elternionen wie auch für alle ihre Fragmentionen im selben Spektrum eintritt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Geschwindigkeitsfo­ kussierung des Potentialfahrstuhls eine Verteilung der Geschwindigkeitszwischenfokus­ punkte erreicht wird, die vom Reflektor für die Eltern- und alle Fragmentionen jeweils ge­ nau am Detektor geschwindigkeitsfokussiert werden.

6. Verfahren nach einem der bisherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Be­ schleunigungspotentiale des Potentialfahrstuhls oder seiner Beschleunigungsstrecken nach dem Einschalten des Beschleunigungsfeldes dynamisch so verändert werden, dass eine Geschwindigkeitsfokussierung sowohl für die Elternionen wie auch für alle ihre Fragment­ ionen am Detektor für dieselbe Spektrenaufnahme eintritt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschleunigungspotentiale des Potentialfahrstuhls oder seiner Beschleunigungsstrecken nach dem Einschalten des Beschleunigungsfeldes zeitlich in solcher Weise verändert werden, dass die leichteren Io­ nen eine längere Fokuslänge der Geschwindigkeitsfokussierung besitzen als die schwere­ ren.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich die feldfreien Flugstrecken vor und nach dem Potentialfahrstuhl jeweils auf Massepotential befinden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gitteranordnung des Po­ tentialfahrstuhls und seiner Nachbeschleunigungsstrecken aus der Flugstrecke der Ionen herausbewegt werden kann.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionen durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) erzeugt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die im MALDI-Prozeß er­ zeugten metastabilen Ionen, die in der Flugstrecke zwischen Ionenquelle und Potential­ fahrstuhl zerfallen, als Fragmentionen nachgewiesen werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sich in der feldfreien Flugstrecke zwischen Ionenquelle und Potentiallift eine gasgefüllte Stoßkammer für eine stoßinduzierte Fragmentierung von Elternionen befindet.

13. Flugzeitmassenspektrometer zur Ausführung der Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 12.

14. Flugzeitmassenspektrometer mit einer Ionenquelle einschließlich einer Spannungsversor­ gung für die Ionenquelle und einer Versorgungseinheit für eine verzögert einsetzende Be­ schleunigungsspannung, mit einem Ionenselektor einschließlich seiner Spannungsversor­ gung, mit einem Potentialfahrstuhl einschließlich seiner schaltbaren Spannungsversorgung, mit einem Reflektor einschließlich seiner Spannungsversorgung und mit einem Detektor einschließlich seiner Spannungsversorgung, dadurch gekennzeichnet, dass der Potentialfahrstuhl mindestens eine Nachbeschleunigungsstrecke besitzt, und dass die Spannungversorgungen des Potentialfahrstuhls oder der Nachbeschleunigungsstrecken eine verzögert einschaltendes Beschleunigungsfeld erzeugen können.

15. Flugzeitmassenspektrometer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die verzö­ gert einsetzende Beschleunigungsspannug für das Beschleunigungsfeld des Potentialfahr­ stuhls oder seiner Beschleunigungsstrecken eine Zeitkonstante von einigen hundert Nano­ sekunden besitzt.

16. Flugzeitmassenspektrometer nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeit­ konstante der verzögert einsetzenden Beschleunigungsspannug für den Potentialfahrstuhl oder seine Nachbeschleunigungsstrecke einstellbar ist.