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Stand der Technik
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Die
konfokale Lasermikroskopie ist das Werkzeug für die definierte Ansteuerung
von Mikroobjekten. Diese Methode stellt sehr hohe Anforderungen
an die Abbildungsleistung des optischen Systems, welche typischerweise
nahe dem beugungsbegrenzten Auflösungsvermögen liegt.
Auf Basis der konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie wurden vielfältige Methoden
zur Untersuchung und Beeinflussung Objekte vorgeschlagen, so z.B.
Denk in [
US 5,034,613 ,
TPA], Liu in mikroskopischer [
US 6,159,749 ,
Tweezer] oder Karl Otto Greulich in „Micromanipulation by Light
in Biology and Medicine" 1999.
Die Kombination aus einem bildgebenden Punkt- bzw. Linienscan-System
und einem Manipulator-System bilden demnach den Kern derartiger
Anordnungen. Das Interesse an der Beobachtung und Analyse schneller
mikroskopischer Prozesse bringt neue Geräte und Verfahren [ZR ZEISS
Linienscanner LSM 5 LIVE] hervor, deren Kombination mit obigen Manipulationsmethoden
zu neuen Einsichten führt.
Hierbei steht insbesondere die simultane Manipulation und Beobachtung
mikroskopischer Prozesse im Vordergrund (
US 6094300 ,
DE102004034987A1 ).
Moderne Mikroskope versuchen daher eine möglichst große Anzahl flexibler Aus- und
Einkoppelstellen anzubieten [
DE102004016433A1 , Tubus]. Die gleichzeitige
Verfügbarkeit
von mindestens zwei Einkoppelstellen für unabhängige Scan-Systeme ist dabei
besonders wichtig, um Beschränkungen
in der zeitlichen Auflösung
aufgrund langsamer mechanischer Schaltprozesse zu vermeiden. Neben
der Tubus-Schnittestelle sind an Mikroskopstativen weitere Einkoppelstellen an
den Seiten (vorzugsweise in einem erweiterten Unendlichraum; „Sideports") sowie an der Stativ-Rückseite („Rearports") sowie der Unterseite („Baseport”) denkbar.
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Prinzipiell
sind dabei Anordnungen mit gemeinsamer Einstrahlrichtung (entweder
Auflicht oder Durchlicht) oder entgegengesetzter Einstrahlrichtung (Auflicht
und Durchlicht) denkbar. Abgesehen vom applikativen Hintergrund
wird oftmals aus gerätetechnischer
Sicht die gemeinsame Einstrahlrichtung bevorzugt.
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Für diesen
Fall ist der Einsatz von mindestens einem Element erforderlich,
das die Strahlengänge
beider Geräte
im Raum zwischen den Scannern der simultan zu betreibenden Scan-Systeme und
dem Objektiv vereinigt. Um eine möglichst große System-Flexibilität gewährleisten
zu können,
sind bei der Stativanbindung von der Scan-Module sondern auch in
den Wellenlängen
und den Polarisationen der zusammengeführten Laser. Sowohl für das manipulierende
als auch für
das bildgebende System kann sich der spektrale Nutzbereich grundsätzlich vom
ultravioletten bis zum infraroten Spektralbereich erstrecken. Applikativ
typische Manipulationswellenlängen sind
z.B. 351, 355 und 364 nm (Photo-Uncaging), 405 nm (Photokonvertierung,
Kaede, Dronpa, PA-GFP), 488 und 532 nm (Photobleichen, FREI, FRAP,
FLIP) sowie 780-900 nm (Multi-Photonen-Bleichen z.B. MPFRAP, 2-Photonen Uncaging; direct
multiphoton stimulation). In Abhängigkeit
der zusammengeführten
Wellenlängen
als auch der Ankoppelpositionen von bildgebendem und manipulierendem
System ergeben sich zahlreiche applikativ sinnvolle Typen dichroischer
Strahlvereiniger. 1 zeigt eine Auswahl möglicher
Strahlvereiniger-Typen, wobei die Manipulationswellenlängen 355nm, 405
nm, 488 und 532 nm sowohl in Transmissions- wie auch in Reflektionsrichtung
eingesetzt werden können.
Neutralvereiniger (z.B. T20/R80) sind hierbei für verschiedene Applikationen
universell einsetzbar und ermöglichen
zudem auf einfache Weise Applikationen, bei denen sowohl für das bildgebende System
als auch für
das Manipulations-System gleiche Laserwellenlängen eingesetzt werden (insbesondere
FRAP). Typischerweise steht für
die verschiedenen Strahlvereinigertypen eine motorisierte Wechseleinrichtung
zur Verfügung,
wie z.B. ein motorisierter Reflektorrevolver im Bereich des Unendlichraumes
zwischen Objektiv und Tubuslinse.
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In
der praktischen Anwendung sind zahlreiche Anforderungen an das beschriebene
Strahlvereinigerelement zu erfüllen,
die bei der Auslegung dieses Elementes berücksichtigt werden müssen und nicht
in [
US 6,677,566 B2 ]
diskutiert werden.
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Typische
Probleme derartiger Strahlvereiniger bestehen im möglichen
Auftreten von Interferenzen gleicher Neigung, der Sicherung der
Bildqualität und
-deckung beider Strahlengänge.
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Zunächst einmal
ist zu beachten, dass das Strahlvereinigerelement die Abbildungsleistung
des Laser-Scan-Mikroskops nicht beeinträchtigt. So sind insbesondere
die Passeanforderungen des Strahlvereinigerelementes so zu wählen, dass
kein Astigmatismus auftritt.
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Aufgrund
des endlichen Reflexionskoeffizienten an Vorder- und Rückseite
eines planparallelen Strahlvereinigers können infolge der resultierenden Rückreflexe Interferenzen
gleicher Neigung auftreten, welche in der Fokalebene des Mikroskopobjektivs
zu einer Amplitudenmodulation des Anregungslichtes führen. Typische
Auswirkungen auf die Transmission T sind entsprechend
in
2 dargestellt,
wobei die Modulation m = 4R/(1 – R)
mit dem geometrischen Mittel der Reflexionskoeffizienten R
2 = R
1R
2 zusammenhängt, ☐ die
Wellenlänge,
d die Dicke und n die Brechzahl des Strahlvereinigers bezeichnen. ☐ repräsentiert
den Winkel unter dem der Teiler getroffen wird und liegt typischerweise
im Bereich bis 0.055 für
Sehfeldzahl
18. Das strahlvereinigende Element befindet
sich in einem Strahlengangbereich, in dem sich während des Scanprozesses (Bildaufnahme
oder Probenmanipulation) der Einfallswinkel ständig ändert. Entsprechend führen die
am planparallelen Strahlvereiniger auftretenden Interferenzen gleicher
Neigung innerhalb des Bildfeldes zu einer periodischen Amplitudenmodulation
der einfallenden Lichtintensität.
Dies führt
in der Praxis zu störenden
Streifen im bildgebenden System bzw. zu einer streifenförmig variierenden
Manipulationseffizienz. Die Reflektivitäten R
1 und
R
2 hängen
sowohl von der Wellenlänge
(besonders bei dichroischen Strahlvereinigern) als auch von der
Polarisation der einfallenden Laserstrahlung ab, wobei letztere
durch die Ausgangspolarisation des Scanmoduls und dessen Anbauposition
am Stativ vorgegeben ist. Mit zunehmender Wellenlänge werden
die im Bild auftretenden Interferenzstreifen breiter und ihre Modulationstiefe
größer. Bei
einem dielektrischen Strahlvereiniger wirkt sich die Polarisationsrichtung
hauptsächlich
auf die Wirksamkeit der Anti-Reflex (AR)-Beschichtung aus. Da der
Strahlvereiniger unter 45Grad im Strahlengang liegt, was nahe am
Brewster-Winkel für
Glas ist, wird die p-Komponente
naturgemäß weniger
stark reflektiert als die s-Komponente. Um zu einer Modulation unter m
= 0.04 zu gelangen, hat man R = 0.01 zu realisieren, was bei verschiedenen
Teilerverhältnissen
R
1 auf R
2 < 0.001 führt. Derartige
Entspiegelungen sind über
den teils großen
Spektralbereich (vgl.
1) aus technologischen Gründen selbst
unter p-Polarisation praktisch nicht zu erreichen. In der Praxis
ist es somit nicht möglich,
die störenden
Interferenzstreifen allein durch eine Optimierung der Anti-Reflex-Beschichtung
des Strahlvereinigers zu vermeiden.
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Ein
möglicher
Ausweg bestünde
in der softwaretechnischen Filterung der gemessenen Signale. Da
der Strahlvereiniger regelmäßige Interferenzstreifen
erzeugt bietet sich hierbei insbesondere die Methode der Fourier-Filterung
an. Softwaretechnische Filtermethoden gehen jedoch bekanntermaßen mit einem
räumlichen
Auflösungsverlust
einher und sind daher aus applikativer Sicht nicht akzeptabel.
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Technische Lösung der
beschriebenen Probleme
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Die
Einführung
eines Strahlvereinigers mit definiertem Keilwinkel löst das Problem
der an planparallelen Strahlvereinigern auftretenden Interferenzen
gleicher Neigung und der damit verbundenen Amplitudenmodulation
des Anregungs- und Manipulationslichtes in der Fokalebene des Objektivs.
Dabei ist zu beachten, daß der
an einem solchen Strahlvereinigerkeil auftretende Rückreflex
- 1. deutlich außerhalb eines Airy-Durchmessers liegt,
so dass eine gegenseitige Überlagerung
in der Objektebene (und damit eine Interferenz) ausgeschlossen ist
- 2. in seiner Intensität
so gering ist, dass ein „Geisterbild" praktisch nicht
nachsweisbar ist
- 3. bei einem Linienscanner (z.B. LSM 5 LIVE/ZEISS) zu keiner
parallelen Verschiebung der Beleuchtungslinie auf sich selber führt (was
wiederum Interferenzen zur Folge hätte)
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Darüber hinaus
sind die Passeanforderungen des Strahlvereinigerkeils so zu wählen, dass
die Abbildungsleistung des mikroskopischen Systems weiterhin nahe
dem beugungsbegrenzten Auflösungsvermögen liegt.
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Anforderung 1 führt auf
Keilwinkel ☐ > 1.22 ☐ ./NA'/164.5mm/3.74. Danach
bestimmen Objektive mit kleiner bildseitiger Apertur den Mindestkeilwinkel. Typischerweise
wird man mit einem wirksamen Keil von ca. 0.7' auskommen.
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In
Bezug auf den Keilwinkel ist anzumerken, daß es aufgrund zahlreicher Kombinationen
von Stativanbindung und Scan-Systemen besonders vorteilhaft ist,
die Keilrichtung unter 45Grad zu den Achsen verdreht auszurichten.
3a und
b verdeutlicht verdeutlicht diese Geometrie. Da der Strahlvereiniger unter
45° zur Einfallsrichtung
steht, muß die
Projektion auf die Hauptachsen betrachtet werden. Hierbei ergibt
sich eine Keilrichtung von
bzgl. der Strahlvereinigerkante
(
3b) und der Keilwinkel ist um den
Faktor √2
zu vergrößern.
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Die
in 3 dargestellte Geometrie ist insbesondere dann
vorteilhaft, wenn ein Linienscanner als bildgebendes System verwendet
wird. Die Keilrichtung liegt dann jeweils schräg (d.h. 45°) zu beiden denkbaren Hauptachsen
der Scanlinie (parallel zu den Strahlvereinigerkanten), so dass
unabhängig von
der Stativ-Ankoppelposition des Linien-Scanners der am Strahlvereinigerkeil
auftretende Rückreflex
zu keiner parallel auf sich selbst verschobenen Linie führt. Die
in 3 dargestellte Strahlvereinigergeometrie ermöglicht somit
auch bei einem Linien-Scanner bei allen denkbaren Stativanbindungen
eine wirksame Vermeidung der beschriebenen Interferenzstreifen.
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Bei
einem großen
Keilwinkel des Strahlvereinigers und schlechter AR-Beschichtung
wird der Strahlvereinigerkeil „Geisterbilder" verursachen. 4 zeigt
die für
ein bestimmtes Verhältnis
von Nutzsignal und 1. Reflex erforderlichen Entspiegelungseigenschaften
eines Strahlvereinigerkeils von etwa 0.7' . Die praktisch nicht störendende
Größe von T1/T0 = 0.01 liefert
dann R2 > 0.01,
was technologisch für
beide Polarisationskomponenten s und p sicher beherrscht wird. Anders
als bei einem planparallelen Strahlvereinigersubstrat ermöglicht eine
keilförmige
Strahlvereinigergeometrie somit bereits bei AR-Beschichtungen mit
einer Reflektivität
von R2 ≈ 1%
eine effiziente Vermeidung von Geisterbildern und Interferenzstreifen.
Da sich diese Anforderung für
beide Polarisationskomponenten problemlos realisieren lässt, können dieselben
Strahlvereinigerkeile bei beliebigen Polarisationsverhältnissen
der einfallenden Laserstrahlen verwendet werden. Der definierte
Keilwinkel erlaubt somit auch die Verwendung desselben Strahlvereinigertyps
bei verschiedenen Anbaupositionen der Scan-Module am Mikroskopstativ.
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In
der 5a) ist dreidimensional ein Strahlteiler
dargestellt, wie er beispielsweise in einem motorisierten Strahlteilerwechsler
angeordnet ist.
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A
ist die vorzugsweise in einem 45 Grad Winkel zur optischen Achse
des einfallenden Lichtes angeordnete Teilerfläche.
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Hier
ist der Strahlengang eines inversen Mikroskops schematisch dargestellt,
d.h. die Probe wird von unten beleuchtet.
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Ein
beispielsweise von unten kommender Strahlengang einer Manipulationsbeleuchtungseinheit
durchläuft
den Strahlteiler in Transmission und wird über die Teilerfläche A mit
dem Strahlengang einer bildgebenden Einheit (Reflektion am Strahlvereiniger)
vereinigt, wodurch beide Strahlen mit gleicher Einfallsrichtung
auf die Probe gelangen.
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In
der 5b) ist ein bezüglich des
Keilwinkels stark vergrößerter Querschnitt
entlang der Linie S in 5a) dargestellt,
um den Keilwinkel der Teilerfläche
zu verdeutlichen.
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Ein
Anstieg bzw. Abfall des Querschnittes erfolgt vorteilhaft in einem
Winkel ungleich Null Grad zu der Ebene, die von den Strahlen „Man" und „Im" (vgl. 5a))
aufgespannt wird.
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Die
beschriebene Lösung
hat den Vorteil, daß sie
im Durchgang auch bei Substraten mit 2mm Dicke noch keinen wesentlichen
Einfluß auf
die Abbildungseigenschaften (Pupillenausleuchtung, Farbquerfehler)
des durchgehenden Lichtes hat. Bei Einsatz von Strahlvereinigern
mit keilförmiger
Geometrie kommt es somit zu keinen störenden Aberrationen und Bildartefakten.
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Weitere
Lösungen
mit dicken Substraten und großen
Keilfehlern sind denkbar. Sie bieten eine gute Stabilität und sind
technologisch leicht beherrschbar, erfordern allerdings eine separate
Korrektur des durchgehenden Strahlweges.
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Verallgemeinernd
können
die beschriebenen Strahlvereiniger mit definiertem Keilwinkel zum
Zusammenführen
der Strahlengänge
von beliebigen bildgebenden und manipulierenden Systemen verwendet
werden. Neben (konfokalen) Punkt- und Linien-Scannern kann es sich hierbei insbesondere
auch um multifokale Laserscan-Systeme (z.B. auf Basis von Linsenarrays,
Diodenlaser-Arrays, beliebiger Strahlteileranordnungen) und Spinning
Disk Systeme/Nipkow-Systeme handeln. Darüber hinaus ist auch eine vorteilhafte
Verwendung der beschriebenen keilförmigen Strahlvereiniger bei
der simultanen Probenmanipulation und/oder Bildgebung mit Hilfe von
(strukturierten) Weitfeld-Beleuchtungssystemen denkbar; insbesondere
dann wenn diese mit kohärenten
Lichtquellen (Laser) ausgerüstet
sind.
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Die
beschriebene Erfindung betrifft unter anderem folgende applikative
Schwerpunkte:
- • Entwicklung von Organismen:
Analyse lebender Zellen in einer 3D-Umgebung (insbesondere einem
3D-Gewebeverband) mit Markierungen und Pharmaka, die gezielt
– durch
Laserbeleuchtung gebleicht (z.B. FRET-Experimente)
– durch
Laserbeleuchtung gebleicht und gleichzeitig auch außerhalb
der ROI beobachtet werden sollen (z.B. FRAP- und FLIP-Experimente
in 3D)
– manipulationsbedingte Änderungen
durch Laserbeleuchtung aufweisen (z.B. Aktivierung bzw. Uncaging
von Transmittern in 3D)
– manipulationsbedingte
Farbänderungen
durch Laserbeleuchtung aufweisen (z.B. paGFP, Dronpa, Kaede)
- • innerzelluläre Transportvorgänge, deren
Dynamik (meist im Bereich von Hundertstelsekunden) oftmals durch
Methoden wie FRAP mit ROI-Bleichen untersucht wird. Beipiele für solche
Studien sind z.B. hier beschrieben:
– Umenishi, F. et al.
beschreiben 2000 in Biophys J., 78:1024-1035 eine Analyse der räumlichen
Beweglichkeit von Aquaporin in GFP-transfizierten Kulturzellen.
Hierzu wurden in den Zellmembranen Punkte gezielt lokal gebleicht
und die Diffusion der Fluoreszenz in der Umgebung analysiert.
– Gimpl,
G. et al. beschreiben 2002 in Prog. Brain Res., 139:43-55 Experimente
mit ROI-Bleichen und Fluoreszenzimaging zur Analyse der Mobilität und Verteilung
von GFP-markierten Oxytocin-Rezeptoren in Fibroblasten.
Dabei stellen sich hohe Anforderungen an die räumliche Positionierung und
Auflösung
sowie die direkte zeitliche Folge von Bleichen und Imaging.
– Zhang
et al. beschreiben 2001 in Neuron, 31:261-275 live cell Imaging
von GFP-transfizierten
Nervenzellen, wobei die Bewegung von Granuli durch kombiniertes
Bleichen und Fluoreszenzimaging analysiert wurde. Die Dynamik der
Nervenzellen stellt dabei hohe Anforderungen an die Geschwindigkeit
des Imaging.
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• Wechselwirkungen
von Molekülen:
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Die
beschriebene Erfindung ist insbesondere für die Darstellung molekularer
und anderer subzellulärer
Wechselwirkungen geeignet. Hierbei müssen sehr kleine Strukturen
mit hoher Geschwindigkeit (im Bereich um die Hundertstelsekunde)
dargestellt werden. Um die für
die Wechselwirkung notwendige räumliche
Position der Moleküle
aufzulösen,
sind auch indirekte Techniken wie z.B. FRET mit ROI-Bleichen einzusetzen.
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• Signalübertragung
zwischen Zellen:
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Aktivierung
bzw. Freisetzung (Uncaging) von Transmittern bzw. direkte Zell-Stimulation
durch Lasereinstrahlung