WO2014191381A1

WO2014191381A1 - Vorrichtung zur abbildung einer probe

Info

Publication number: WO2014191381A1
Application number: PCT/EP2014/060891
Authority: WO
Inventors: Wolfgang Singer; Ralf Wolleschensky; Wilhelm Ulrich; David Shafer; Artur Degen
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy Gmbh; Carl Zeiss Ag
Priority date: 2013-05-30
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2014-12-04
Also published as: DE102013105586B4; US20160131884A1; DE102013105586A1; US10073256B2

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Abbildung einer in einem ersten Medium (3) in einer Objektebene (2) angeordneten Probe (1). Eine solche Vorrichtung umfasst ein optisches Übertragungssystem (4), welches die Probe (1) in der Objektebene (2) in ein Zwischenbild (5) in einer Zwischenbildebene (6) abbildet, wobei die Objektebene (2) und die Zwischenbildebene (6) mit einer optischen Achse des Übertragungssystems (4) einen von 90° verschiedenen Winkel einschließen und das optische Übertragungssystem (4) aus zwei Teilsystemen (4a, 4b) mit mehreren Linsen symmetrisch bezüglich einer Symmetrieebene (7) aufgebaut ist, so dass die Abbildung durch das Übertragungssystem mit einem Maßstab von 1:1 erfolgt. Die Vorrichtung umfasst außerdem ein optisches Abbildungssystem (11) mit einem Objektiv (12), dessen optische Achse senkrecht auf der Zwischenbildebene (6) steht und welches auf die Zwischenbildebene (6) fokussiert ist, so dass die Objektebene (2) unverzerrt auf einen Detektor (13) abbildbar ist. Bei einer solchen Vorrichtung sind beide Teilsysteme (4a, 4b) telezentrisch und das optische Übertragungssystem (4) bezüglich einer Pupillenebene symmetrisch aufgebaut, wobei die Objektebene (2) und die Zwischenbildebene (6) die Scheimpflugbedingung erfüllen, und wobei das Zwischenbild (5) in einem zweiten Medium (9), welches einen zum ersten Medium (3) nahezu identischen Brechungsindex aufweist, liegt. Außerdem umfasst die der Probe (1) bzw. dem Zwischenbild (5) am nächsten angeordnete Linsengruppe der Teilsysteme (4a, 4b) mindestens eine katadioptrische Baugruppe.

Description

Vorrichtung zur Abbildung einer Probe

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Abbildung einer in einem ersten Medium in einer Objektebene angeordneten Probe. Die Vorrichtung umfasst ein optisches Übertragungssystem, welches die Probe in der Objektebene in ein Zwischenbild in einer Zwischenbildebene abbildet, wobei die Objektebene und die Zwischenbildebene mit einer optischen Achse des Übertragungssystems einen von 90° verschiedenen, gleichen Winkel einschließen und das optische Übertragungssystem aus zwei Teilsystemen mit mehreren Linsen symmetrisch aufgebaut ist, so dass die Abbildung durch das optische Übertragungssystem mit einem Maßstab von 1 :1 erfolgt. Die Vorrichtung umfasst außerdem ein optisches Abbildungssystem mit einem Objektiv, dessen optische Achse senkrecht auf der Zwischenbildebene steht und welches auf die Zwischenbildebene fokussiert ist, so dass die Objektebene unverzerrt auf einen Detektor abbildbar ist.

Eine solche Vorrichtung wird insbesondere bei der Untersuchung von biologischen Proben eingesetzt, bei der die Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt, dessen Ebene die optische Achse der Detekiion in einem von Null verschiedenen Winkel schneidet, erfolgt. Üblicherweise schließt dabei das Lichtblatt mit der Detektionsrichtung, die in der Regel der optischen Achse des Mikroskopobjektivs entspricht, einen rechten Winkel ein. Mit dieser auch als SPIM (Seiecti- ve Plane llumination Microscopy) bezeichneten Technik lassen sich in relativ kurzer Zeit räumliche Aufnahmen auch dickerer Proben erstellen. Auf der Basis von optischen Schnitten kombiniert mit einer Relativbewegung in einer Richtung senkrecht zur Schniitebene ist eine bildliche, räumlich ausgedehnte Darstellung der Probe möglich.

Die SPIM-Technik wird bevorzugt in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, wo sie dann auch als LSFM {Light Sheet Fluorescenc Microscopy) bezeichnet wird. Gegenüber anderen etablierten Verfahren wie der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder der Zwei-Photonen- Mikroskopie weist die LSFM-Technik mehrere Vorzüge auf: Da die Detektion im Weitfeld erfolgen kann, lassen sich größere Probenbereiche erfassen. Zwar ist die Auflösung etwas geringer als bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, jedoch lassen sich mit der LSFM-Technik dickere Proben analysieren, da die Eindringtiefe höher ist. Darüber hinaus ist die Lichtbelastung der Proben bei diesem Verfahren am geringsten, was die Gefahr des Ausbleichens einer Probe reduziert, da die Probe nur durch ein dünnes Lichtblatt in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung beleuchtet wird.

Statt ein rein statisches Lichtblau zu verwenden, kann auch ein quasistatisches Lichtblau erzeugt werden, indem die Probe mit einen rotationssymmetrischen Lichtstrahl schnell abgetastet wird. Die lichtblattartige Beleuchtung entsteht, indem der rotationssymmetrische Lichtstrahl einer sehr schnellen Relativbewegung zu der zu beobachteten Probe unterworfen wird und dabei zeitlich aufeinanderfolgend mehrfach aneinandergereiht wird. Dabei wird die Integrationszeit der Kamera, auf deren Sensor die Probe abgebildet wird, so gewählt, dass die Abtastung innerhalb der Integrationszeit abgeschlossen wird.

Die SPIM-Technik ist in der Literatur inzwischen vielfach beschrieben, beispielsweise in der DE 102 57 423 A1 und der darauf aufbauenden WO 2004/0535558 A1. Verfahren und Anordnungen, mit denen sich ein besonders dünnes Lichtblatt konstruieren lässt, sind beispielsweise in der nicht vorveröffentiichten DE 10 2012 013 163.1 beschrieben.

Bei den üblichen SPIM-Anordnungen erfolgt die Beleuchtung über ein Linsensystem, welches in der Ebene der Probe liegt, die beleuchtet wird. Wird also beispielsweise von oben beobachtet, so muss die Beleuchtung von der Seite erfolgen. Übliche Präparationstechniken können daher nicht verwendet werden. Ein weiterer wesentlicher Nachteil liegt darin, dass sowohl das Beleuchtungsobjektiv als auch das Beobachtungsobjektiv räumlich nah beieinander angeordnet werden müssen, so dass für die Detektion eine Linse mit einer hohen numerischen Apertur benutzt werden kann, die also aus einen weiten Bereich Licht herholt, wobei gleichzeitig ein Lichtblatt erzeugt werden muss. Diese mechanischen Beschränkungen können zu einer Einschränkung der numerischen Apertur und damit der Auflösung des abbildenden Systems führen.

Im Artikel„Highly inclined thin Illumination enables clear single-molecule imaging in cells" von M. Tokunaga et a/., erschienen in Nature ethods 5 (2), S. 159-161 im Jahre 2008, wird eine Anordnung beschrieben, die es ermöglicht, dasselbe Objektiv für die Beleuchtung mit einem Lichtblau und für die Detektion von Fluoreszenz, die von der Probe kommt, zu verwenden. Dabei erfolgt die Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt über einen Teilbereich des Objektivs, welcher einen Randbereich dieses Objektivs einschließt, so dass die Beleuchtung also unter einem zur optischen Achse des Objektivs schrägen Winkel erfolgt. Für die Detektion wird dann ein gegenüberliegender Randbereich des Objektivs verwendet, so dass die Detektion im Mittel ebenfalls unter einem zur optischen Achse des Objektivs von Null verschiedenen Winkel erfolgt. Dieser Winkel beträgt aufgrund der beschränkten numerischen Apertur des Objekts dabei in der Regel weniger als 90°, wie es sonst in der SPIM-Technik üblich ist. Darüber hinaus liegt das Lichtblatt nicht in der Fokusebene des Objektivs, sondern in einem Winkel schräg zu dieser, so dass es sie nur in einem Punkt schneidet- Dies hat zur Folge, dass auch im Bild der durch das Lichtblatt beleuchtete Schnitt durch die Probe nicht in der Bildebene liegt, sondern diese nur an einen Punkt schneidet und somit in weiten Bereichen defokussiert ist. Ein Kippen des Detektors derart, dass die beleuchtete Sektion der Probe mit der Detektorebene zusammenfällt, würde die Bildqualität erheblich verschlechtern, da das Kippen des Detektors relativ zur optischen Achse zum Auftreten von sphärischen Abberationen führen würde, die sich um so stärker bemerkbar machen, je weiter die beleuchteten Probenbereiche außerhalb der Fokus- bzw. Bildebene liegen.

Dieses Problem lässt sich mit einem Aufbau beseitigen, wie er beispielsweise in der US 2011/0261446 A1 beschrieben ist. Dort ist ein Aufbau offenbart, welcher das abbildende System von Tokunaga ei al. durch ein Übertragungssystem ersetzt. Dieses Übertragungssystem besteht aus der spiegelsymmetrischen Aneinanderkopplung zweier abbildender Systeme. Die beiden abbildenden Systeme sind bzgl. ihrer optischen Elemente, spiegelsymmetrisch angeordnet, wobei die Spiegelebene der ursprünglichen Bildebene des ersten abbildenden Systems entspricht, bei der also der beleuchtete Bereich der Probe im Bild die Bildebene schräg schneidet. Die Vergrößerung des Übertragungssystems wird so gewählt, dass sie dem Verhältnis der Brechzahlen eines ersten Mediums, in dem sich die Probe befindet, zu einem zweiten Medium, in dem das Zwischenbild lokalisiert ist, entspricht.

Sofern keine Immersionsmedien verwendet werden, können die optischen Komponenten der beiden abbildenden Teilsysteme sind identisch gewählt werden, sind jedoch spiegelverkehrt angeordnet, sodass die Abbildung in dem Maßstab 1 :1 erfolgt. Falls eines der beiden Teilsysteme als Immersionssystem ausgestaltet ist, sich das optische Element, welches der Probe am nächsten ist, also in einem Immersionsmedium befindet, so sollen gemäß der US 2011/026 446 A1 Vergrößerungen gewählt werden, die dem Verhältnis der Brechzahlen des objektseitigen und eines bildseitigen Mediums oder Immersionsmediums entsprechen.

Mit Hilfe des - bis auf die Verwendung von Immersionsmedien symmetrischen - optischen Übertragungssystems wird also die Objektebene in ein Zwischenbiid in einer Zwischenbildebene abgebildet, wobei die Zwischenbildebene wieder mit der Lichtblattebene zusammenfällt, so dass die Objektebene bezüglich der Zwischenbildebene unverzerrt und nicht vergrößert dargestellt ist.

Um nun eine vergrößerte Darstellung der Probe in der Objektebene zu erhalten, ist in der US 201 1/0261446 A1 ein als Mikroskop ausgestaltetes optisches Abbildungssystem vorgesehen, welches ein Objektiv aufweist, dessen optische Achse senkrecht auf der Zwischenbildebene steht. Außerdem ist es auf die Zwischenbildebene fokussiert, die Fokusebenen des Übertra- gungssysiems und des Abbildungssystems schneiden sich im Zentrum des Zwischenbildes. Auf diese Weise kann eine unverzerrte Abbildung der Probe, d.h. eine Abbildung frei von Abberationen, mit einer vom Mikroskop abhängigen Vergrößerung auf einen Detektor erfolgen. Das zugrunde liegende Prinzip wird beispielsweise in der WO 2008/078083 A1 beschrieben, demnach kann unter Verwendung eines solchen Systems ein Objekt in einem gewissen Volumenbereich in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Bildebene komafrei und öffnungsfehlerfrei in der Tiefe abgebildet werden.

Nachteilig bei der in der US 201 1/0261446 A1 beschriebenen Anordnung ist die Vielzahl von Linsen, die für das optische Übertragungssystem verwendet werden, da es sich bei jedem der beiden Teilsysteme um ein mikroskopisches System mit einer Tubuslinse handelt. Das Gesamtsystem beansprucht deshalb viel Raum, die Vielzahl der Linsen führt zudem zu einen Lichtverlust, der sich negativ bemerkbar macht. Ein weiteres Problem entsteht dadurch, dass die Objektebene gekippt ist, so dass eine Vielzahl von Objektpunkten, die abgebildet werden sollen, nicht im Fokus liegen. Üblicherweise sind Mikroskoplinsen jedoch für solche Bereiche weit außerhalb der Fokusebene nicht korrigiert.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art dahingehend weiterzuentwickeln, dass diese Nachteile überwunden werden. Insbesondere soll ein kompaktes, platzsparendes System entwickelt werden, welches mit möglichst wenig Linsen auskommt und zudem hinsichtlich der Vermeidung von Abbildungsfehlern möglicht wenig korrigiert werden muss.

Diese Aufgabe wird bei einer Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass beide Teilsysteme telezentrisch und das optische Übertragungssystem bezüglich einer Pupillenebene symmetrisch aufgebaut ist, wobei die Objektebene und die Zwischenbildebene die Scheimpflugbedingung erfüllen, und wobei das Zwischenbild in einem zweiten Medium, welches einen zum ersten Medium nahezu identischen Brechungsindex aufweist, liegt. Eine kompakte Bauweise, welche zudem wenig Korrekturen benötigt, lässt sich erreichen, indem die der Probe bzw. dem Zwischenbäld am nächsten angeordnete Linsengruppe der Teilsysteme mindestens eine katadioptrische Baugruppe umfasst.

Der Aufbau des optischen Übertragungssystems mit einer katadioptrischen Baugruppe bietet gegenüber einem System aus Linsen mehrere Vorteile. Zum einen sind keine besonderen Korrekturen von Farbfehlern notwendig, da das Licht gespiegelt wird, anstatt durch eine Linse zu gehen. Außerdem ist es leichter, Petzval-Korrekturen anzuwenden. Mit Hilfe einer katadioptrischen Baugruppe ist es außerdem möglich, das optische Übertragungssystem unkompliziert mit telezentrischen Teilsystemen und hinsichtlich einer Pupillenebene symmetrisch aufzubauen, so dass in die Symmetrieebene des Übertragungssystems z.B. eine Pupillenbiende eingesetzt werden kann, mit Hilfe derer sich die numerische Apertur steuern lässt. Der Strahlengang kann in diesem Bereich auch in einem gewissen Bereich verlängert werden, so dass die Unterbringung weiterer optischer Elemente möglich wird. Auch lässt sich so eine strukturierte Beleuchtung ohne eine separate Pupillenabbildung erzeugen. Die zugängliche Pupille erleichtert auch die Erzeugung eines Übersichtsbildes mit einer Objektebene, die beispielsweise parallel zur Oberfläche eines Deckglases liegen kann. Durch die Telezentrie der Teilsysteme wird erreicht, dass die Übertragung auch in einem weiten Bereich außerhalb der Fokusebene ohne nennenswerte Abbildungsfehler korrekt erfolgt.

Objektebene und Zwischenbildebene erfüllen die Scheimpflugbedingung, so dass ein Winkel ß', den die Normale der Zwischenbildebene mit der optischen Achse des Übertragungssystems einschließt, durch einen Winkel ß, den die Normale der Objektebene mit der optischen Achse des Übertragungssystems einschließt, sowie durch die Brechzahlen der beiden Medien und die Vergrößerung eindeutig vorgegeben ist. Allgemein gilt ri

tm '=—M tmß

n

Wenn, wie bevorzugt, die beiden Medien die gleichen Brechzahlen η', n oder zumindest nahezu gleiche Brechzahlen aufweisen und eine Vergrößerung von 1 bei einer Abbildung im Maßstab 1 :1 gewählt wird, sind die beiden Winkel folglich gleich oder nahezu gleich, was den Aufbau des optischen Abbildungssystems relativ zum optischen Übertragungssystem erleichtert. Auch bei nahezu gleichen Brechzahlen können die Winkel als in guter Näherung gleich angesetzt werden.

Bei der erfindungsgemäßen Lösung sind nicht nur die Teilsysteme der Übertragungsoptik symmetrisch aufgebaut, sondern auch die Brechzahlen eventuell verwendeter Immersionsmedien und von Medien, in denen Probe bzw. Zwischenbild lokalisiert sind, sind nahezu gleich. Sofern Deckgläser verwendet werden, sind diese bevorzugt sowohl im Objektbereich als auch im Zwi- schenbildbereich identisch aufgebaut, d.h. aus dem gleichen Material und von identischer Dicke. Es ist auch möglich, Deckgläser aus verschiedenen Materialien zu verwenden, wenn ihre Brechzahlen nahezu gleich sind. Das Zwischenbild liegt daher in einem zweiten Medium, welches eines zum ersten Medium nahezu identischen Brechungsindex aufweist. Nicht zuletzt durch diese Maßnahme kann durch diesen symmetrischen Aufbau das Auftreten von Abberationen wie Koma und lateraler Farbauslöschung vermieden werden, da sich diese nicht symmetrischen Aberrationen beider Teilsysteme gegenseitig kompensieren. Das Übertragungssystem im Zusammenspiel mit den Medien ermöglicht in einem vorgegebenen Volumenbereich eine sowohl in der Tiefe als auch in der lateralen Ausdehnung maßstabsgetreue Abbildung im Verhältnis 1 : 1 , eine objekttreue Volumenabbildung, die in der lateralen Ausdehnung senkrecht zur optischen Achse komafrei und in der Tiefe öffnungsfehlerfrei ist, so dass auch eine zur optischen Achse schief liegende Objektebene maßstabsgetreu und ohne die genannten Fehler in die Zwischenbildebene abgebildet wird.

Während die vorangehend beschriebene Vorrichtung generell für die Abbildung schiefer Objektebenen geeignet ist und aufgrund ihrer kompakten Bauweise dort einfach einsetzbar ist, so liegt ihr besonderer Vorteil darin, dass sie im Zusammenhang mit der SPIM-Technik verwendet werden kann, bei welcher Detektionsrichtung und Beleuchtungsrichtung einen von Null verschiedenen Winkel einschließen und die Beleuchtung in der Beleuchtungsrichtung mit einem Lichtblatt erfolgt. Zu diesem Zweck weist die Vorrichtung bevorzugt Mittel zur Einkopplung von Beleuchtungslicht zur Beleuchtung der Probe mit einem Lichtblatt auf, wobei die Lichtblattebene im wesentlichen in der Objektebene und in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung liegt.

Eine erste Möglichkeit zur Ausgestaltung der Mittel zur Einkopplung von Beleuchtungslicht liegt darin, eine Beleuchtungseinrichtung vorzusehen, welche das Beleuchtungslicht über das zweite Medium in der Zwischenbildebene in den Strahiengang einkoppelt, wobei die Beleuchtung der Zwischenbildebene mit einem Lichtblatt in dieser Ebene erfolgt. Dies erfordert allerdings eine genaue bautechnische Anpassung der Beleuchtungsoptik und des optischen Abbildungssystems, welches auf die Zwischenbildebene fokussiert ist, da sich beide auf der gleichen Seite der Übertragungsoptik befinden, was die Verwendung hoher numerischer Aperturen erschwert. Der Vorteil bei dieser Anordnung gegenüber einer Einkopplung von Beleuchtungslicht direkt am Probenort liegt jedoch gerade darin, dass die Beleuchtung nicht am Probenort erfolgt, was insgesamt eine einfachere Bauweise ermöglicht und die Einsatzmöglichkeiten erweitert, da auf eine spezielle Konfiguration der Probenkammer keine Rücksicht genommen werden muss.

Aufgrund der symmetrischen Bauweise bezüglich einer Pupillenebene lässt sich in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Vorrichtung auch eine andere Möglichkeit der Einkopplung des Beleuchtungslichts realisieren, bei der sich die Beleuchtungsoptik und das optische Abbildungssystem zur Detektion räumlich nicht gegenseitig stören. Bei dieser Ausgestaltung umfassen die Mittel zur Einkopplung von Beleuchtungslicht einen in einer Pupillenebene zwischen den beiden Teilsystemen angeordneten Strahlteiler. Diese Ausgestaltung ist insbesondere dann besonders gut einsetzbar, wenn sich die Wellenlängen des Beleuchtungslichtes von denen, die detektiert werden sollen, unterscheiden, was z.B. bei fluoreszenzmikroskopischen Anwendungen regelmäßig der Fall ist. Anstelle von Strahlteilern können auch andere optische Elemente verwendet werden, sofern sie das eingekoppelte Licht in Richtung der Probe umlenken und das von der Probe kommende Licht in dem entsprechenden Bereich der Vorrichtung ungehindert durchlassen. Das Beieuchtungslicht wird dabei nur in den Teil des optischen Übertragungssystems eingekoppelt, der unter einem anderen Winkel auf die Probe fällt, als ihn das von der Probe kommende zu delektierende Licht einnimmt. Der Winkeibereich, in dem das Beleuchtungslicht eingestrahlt wird_» unterscheidet sich also von dem Winkelbereich, unter dem das zu detektierende Licht von der Probe abgestrahlt wird, jeweils hinsichtlich der optischen Achse. Dies trifft für alle Ausgestaltungen zu.

Zur Erzielung möglichst hoher numerischer Aperturen ist es vorteilhaft, wenn das optische Übertragungssystem mit dem ersten und zweiten Medium in Kontakt steht, so dass erstes und zweites Medium auch als Immersionsmittel wirken. Als erstes Medium kann beispielsweise Wasser verwendet werden. Diese Wahl ist grundsätzlich auch für das zweite Medium möglich, jedoch insofern mit Nachteilen behaftet, da dann auch das optische Abbildungssystem zur De- tektion und gegebenenfalls auch die Beleuchtungseinrichtung entsprechend als Immersionsoptiken ausgestaltet werden müssen. Vorteilhaft verwendet man daher für das zweite Medium anstelle von Wasser ein amorphes Fluoropolymer, beispielsweise CYTOP^®' welches einen Brechungsindex aufweist, der im wesentlichen dem von Wasser entspricht. Bei einer Wellenlänge von λ_ύ = 578,56 nm beträgt die Brechzahl von Wasser 1 ,33 und die des genannten Fluoropoly- mers 1 ,34, was im Sinne der Erfindung als nahezu gleich angesehen wird. Auch als erstes Medium kann CYTOP^® verwendet werden. Das Fluoropolymer kann auch anstelle eines Deckglases verwendet werden, falls ein solches vorgesehen ist, so dass aufgrund der nahezu identischen Brechzahlen eine Auslegung des Übertragungssystems mit höheren Toleranzen möglich wird.

Eine andere Ausgestaltung sieht die Verwendung von Probenträgern auf beiden Seiten des Übertragungssystems vor. Wird objektseitig eine Probenkammer verwendet, so reicht zwi- schenbildseitig die Verwendung einer Platte aus dem gleichen Material oder aus einem Material mit einem nahezu gleichen Brechungsindex und von gleicher Dicke wie die entsprechende Probenkammerwand aus um die optische Symmetrie zu erhalten. Immersionsmittel müssen dann nicht verwendet werden, können aber selbstverständlich eingesetzt werden, wobei dann auf beiden Seite des Übertragungssystems bevorzugt das gleiche Immersionsmittel eingesetzt wird, beispielsweise Wasser oder Öl.

Als erstes Medium können beispielsweise alle zur lang- oder kurzfristigen Aufbewahrung von organischen proben geeignete Materialien, beispielsweise Wasser, wässrige Lösungen oder Gele, verwendet werden, mit Ausnahme von Luft.

Für die Realisierung der katadioptrischen Baugruppe gibt es verschiedene Möglichkeiten. Um eine kompakte Bauweise zu realisieren ist es jedoch vorteilhaft, wenn die katadioptrische Baugruppe folgende optische Elemente umfasst: (i) eine plankonvexe Linse oder Linsengruppe mit einer konvexen Fläche und einer planen Fläche, weiche der Objektebene bzw. Zwischenbildebene zugewandt und zur Innenseite verspiegelt ist, und (ii) ein der konvexen Fläche der Linse oder Linsengruppe gegenüber angeordnetes Spiegelelement mit einer konkav geformten Spiegelfläche, welche von der plankonvexen Linse oder Linsengruppe kommendes Licht reflektiert. Sowohl bei der plankonvexen Linse oder Linsengruppe als auch bei den Spiegelelement ist ein Bereich, der die optische Achse einschließt, jeweils von der Verspiegelung ausgenommen, so dass Licht in diesem Bereichen durch die Spiegel hindurchtreten und übertragen werden kann.

Die katadioptrische Baugruppe kann beispielsweise eine einzelne plankonvexe Linse aufweisen oder aber eine Linsengruppe aus zwei oder mehr miteinander verkitteten Linsen. Die konvexe Fläche der plankonvexen Linse oder Linsengruppe kann asphärisch geformt sein, das Spiegelelement kann auch als Manginspiegel ausgestaltet sein. Solche Ausführungen sind beispielhaft in den Unteransprüchen aufgeführt und werden auch anhand der folgenden Zeichnungen beschrieben.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten sowie auch die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alieinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale zeigen, beispielhalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:

Fsg.1 den prinzipiellen Aufbau einer Vorrichtung zur Abbildung einer Probe mit einem optischen

Übertragungssystem und einem optischen Abbildungssystem,

Fig.2 ein optisches Übertragungssystem mit einer anderen Ausgestaltung für die Einkopplung des Beleuchiungslichts,

Fig.3 eine erste spezielle Ausgestaltung des optischen Übertragungssystems,

Fig.4 eine zweite spezielle Ausgestaltung des optischen Übertragungssystems,

Fig.5 eine dritte spezielle Ausgestaltung des optischen Übertragungssystems, und

Fig.6 eine vierte spezielle Ausgestaltung des optischen Übertragungssystems.

In Fig.1 ist zunächst der grundlegende Aufbau einer Vorrichtung zur Abbildung einer Probe 1 , die in einer Objektebene 2 in einem ersten Medium 3 angeordnet ist, dargestellt. Bei dem ersten Medium 3 kann es sich beispielsweise um Wasser oder eine wässrige Lösung handeln. Die Vorrichtung umfasst ein optisches Übertragungssystem 4, welches die Probe 1 in der Objektebene 2 in ein Zwischenbild 5 in einer Zwischenbildebene 6 abbildet. Die Objektebene 2 und die Zwischenbildebene 6 schließen mit einer optischen Achse des optischen Übertragungssystems 4 jeweils einen von 90° verschiedenen Winkel ein, beide Winkel sind bevorzugt gleich. Das optische Übertragungssystem 4 besteht aus zwei Teilsystemen, einem objekiseitigen Teilsystem 4a und einem zwischenbildseitigen Teilsystem 4b, jeweils mit mehreren Linsen, und ist symmeirisch bezüglich einer Symmetrieebene 7 aufgebaut, so dass die Abbildung mit einem Maßstab von 1 :1 erfolgt. Objektebene 2, Zwischenbildebene 6 und die Symmetrieebene 7, die auch als Objektivebene bezeichnet werden kann, schneiden sich in einer Geraden, so dass die Scheimpflugbedingung erfüllt ist. Dabei ist der Aufbau des optischen Übertragungssystems bezüglich einer Pupillenebene symmetrisch, die Symmetrieebene 7 korrespondiert also zu einer Pupillenebene. In dieser Pupilienebene ist in dem in Fig.1 gezeigten Aufbau eine optionale, vorteilhaft ansteuerbare Pupillenblende 8 angeordnet. Um einen kompakten Aufbau zu erreichen und die Abbildungsfehler möglichst gering zu halten, umfasst die der Probe 1 bzw. dem Zwischenbild 5 am nächsten angeordnete Linsengruppe der Teilsysteme 4a und 4b jeweils mindestens eine katadioptrische Baugruppe. Um zu gewährleisten, dass die Abbildung tatsächlich mit einem Maßstab von 1 :1 erfolgt, und um mögliche Abbildungsfehler weitestgehend zu eliminieren ist das Übertragungssystem 4 so aufgebaut, dass bei der Abbildung der Probe 1 das Zwischenbild 5 in einem zweiten Medium 9 liegt, wobei das zweite Medium einen zum ersten Medium 3 nahezu identischen Brechungsindex aufweist. Ist beispielsweise das erste Medium 3 Wasser und ist das Übertragungssystem 4 als Immersionssystem ausgestaltet, so dass es beispielsweise direkt in die Probenkammer mit Wasser eintaucht, so ist auch das zweite Teilsystem 4b als Immersionssystem ausgestaltet, das Zwischenbild 5 liegt dann in dem zweiten Medium 9, welches einen zum Wasser nahezu identischen Brechungsindex aufweist, wobei das zweite Medium 9 selbstverständlich mit dem ersten Medium 3 auch identisch sein kann. Anstelle von Wasser lässt sich jedoch auch CYTOP^® als zweites Medium verwenden, was den Aufbau erleichtert, da es sich nicht um ein flüssiges Material handelt. Auch andere, im Vergleich zu Wasser festere Medien jedoch mit nahezu gleichen Brechzahlen lassen sich hier verwenden. Natürlich ist es auch möglich, die Probe 1 in einer wässrigen Lösung auf einem Probenträger 10 zu platzieren, wie dies hier für das probenseitige Teilsystem 4a des optischen Übertragungssystems 4 gezeigt ist. Entsprechend ist auf der Zwischenbildseite des Übertragungssystems 4 ebenfalls ein Probenträger 10 angeordnet bzw. ein entsprechendes optisches, meist planparalleles Element aus dem gleichen Material und von gleicher Dicke wie der Probenträger 0. Auch hier kann das Übertragungssystem 4 als immersionssystem ausgestaltet sein, eine Immersionsflüssigkeit befindet sich dann jeweils zwischen der äußeren Linse des katadioptrischen Systems und dem Probenträger 10. In diesem Fall kann beispielsweise auch Öl als Immersionsflüssigkeit verwendet werden, was sich jedoch als erstes Medium 3 nicht besonders eignet, da Öl nicht zur Aufbewahrung insbesondere lebender Proben verwendet werden kann.

Auf die Zwischenbildebene 6 ist ein optisches Abbildungssystem 11 gerichtet mit einem Objektiv 12, dessen optische Achse senkrecht auf der Zwischenbildebene 6 steht und welches auf die Zwischenbildebene 6 fokussiert ist. Auf diese Weise kann insgesamt die Objektebene 2 unverzerrt auf einen Detektor 13 abgebildet werden. Bei dem Detektor 13 kann es sich beispielsweise um den CCD- oder CMOS-Chip einer Kamera handeln, auch die Beobachtung durch ein Okular oder auf einem Bildschirm ist selbstverständlich denkbar. Beide Teilsysteme 4a und 4b sind telezentrische Systeme und bei dem Übertragungssystem 4 als Gesamtsystem handelt es sich um ein afokales System, damit das Zwischenbild in einem großen Bereich, auf den nicht fokussiert wird, ohne Fehler abgebildet wird. Dies ist notwendig, da die Objektebene 2 zur optischen Achse gekippt ist, so dass eigentlich ein Bereich aus dem Volumen auf den Detektor 3 abgebildet wird.

Die Verwendung katadioptrischer Baugruppen für die Teilsysteme 4a, 4b bietet darüber hinaus den Vorteil, dass die Pupille, die den Bereich zwischen den beiden Teilsystemen 4a und 4b bildet, leicht zugänglich ist. Auf diese Weise können zusätzliche optische Elemente, wie die bereits genannte Pupillenblende 8 in den Strahlengang eingebracht werden.

Die vorangehend beschriebene Vorrichtung lässt sich besonders gut im Zusammenhang mit der SPI -Technik einsetzen, da sie mehrere Möglichkeiten bietet, das Beleuchtungslicht zur Beleuchtung der Probe 1 mit einem Lichtblatt, wie es bei diesem Verfahren notwendig ist, in den Strahlengang des Übertragungssystems 4 einzukoppeln, wobei die Lichiblattebene im wesentlichen in der Objektebene und in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung liegt. Grundsätzlich ist auch die Kombination mit einem klassischem SPIM-Aufbau möglich, bei dem die Beleuchtung durch ein gesondertes Beleuchtungsobjektiv im Bereich der Probe bzw. Probenkammer erfolgt.

Eine der Möglichkeit zur Einkoppiung von Beleuchtungslicht 14 in das Übertragungssystem 4 ist ebenfalls in Fig.1 dargestellt, es handelt sich dabei jedoch nur um eine von mehreren Möglichkeiten, so ist beispielsweise auch die Kombination mit einer klassischen, gesonderten Beleuchtungsoptik, die über ein eigenes Beleuchtungsobjektiv verfügt, möglich. Die in Fig.1 dargestellten Mittel zur Einkoppiung von Beleuchtungslicht 14 umfassen einen in einer Pupillenebene zwischen den beiden Teilsystemen 4a und 4b angeordneten Strahlteüer 5. Die Anordnung des Strahlteilers 15 in der Pupillenebene ist ohne weiteres möglich, da der Strahlengang an dieser Stelle zwischen den beiden Teilsystemen 4a und 4b in einem gewissen Umfang verlängert werden kann, so dass der Strahlteiler 15 ohne Probleme in der Pupillenebene angeordnet werden kann, in Fig.1 ist der Strahiteiler 15 in der Symmetrieebene 7 angeordnet, dies ist nicht unbedingt notwendig, er kann auch direkt einem der beiden Teilsysteme 4a oder 4b zugeordnet sein. Der Strahlteüer 15 muss dabei so ausgestaltet sein, dass er zu delektierendes Licht hindurch- lässt, was für Fluoreszenzmikroskopieanwendungen allerdings unproblematisch ist, da sich hier die Wellenlängen von Beleuchtungslicht 14 und zu detektierendem Licht unterscheiden. In Fig.1 ist zu erkennen, dass für den Beleuchtungsstrahlengang der linke Teil des Teilsystems 4a verwendet wird, während für die Detektion der rechte Teil des Teilsystems 4a verwendet wird. Aufgrund dieser räumlichen Aufteilung von Detektions- und Beleuchtungsstrahlengang, die notwendig zur Realisierung einer SPIM-Beobachtung mit einem einzigen optischen System im Bereich der Probe ist, kann anstelle des die gesamte Pupillenebene einnehmenden Strahlteilers 15 auch ein halb so großes Element verwendet werden, welches den rechten Bereich freilässt. Auf diese Weise können geringe Lichtverluste, die an dem Strahlteiler 15 auftreten können, vermieden werden, was bei schwach ausgeprägten Fluoreszenzsignalen von Vorteil sein kann.

Eine weitere Möglichkeit zur Einkopplung von Beleuchtungslicht 14 in den Strahlengang des Übertragungssystems 4 ist in Fig.2 dargestellt. Dabei wurde auf Darstellung des vollständigen Übertragungssystems 4 verzichtet, vielmehr wird nur das zwischenbildseitige Teilsystem 4b als Skizze dargestellt, die gezeigten optischen Elemente dienen nur der Verdeutlichung des prinzipiellen Strahlungsverlaufs. Die hier gezeigte Beleuchtungseinrichtung 16 ist auf der Seite des Zwischenbildes 5 angeordnet, sie ist dazu ausgelegt, das Beleuchtungslicht 14 über das zweite Medium 9 in der Zwischenbildebene 6 in den Strahlengang einzubringen, wobei die Beleuchtung der Zwischenbildebene 6 bereits mit einem Lichtblatt in dieser Ebene erfolgt. Dieses Lichtblatt wird dann entsprechend in die Objektebene 2 übertragen, da das Übertragungssystem 4 in beiden Richtungen funktioniert.

Bei dem in Fig.2 gezeigten zwischenbildseitigen Teilsystem 4b steht dieses in direktem Kontakt mit dem zweiten Medium 9, welches somit als Immersionsmittel wirkt. Das erste Medium 3 steht mit dem entsprechenden optischen Element des objektseitigen Teilsystems 4a in direktem Kontakt und wirkt dort als Immersionsmittel. Bei diesem Aufbau wird also auf eine spezielle Pro- benhalterung verzichtet. Handelt es sich bei dem ersten Medium 3 beispielsweise um Wasser, so kann das Übertragungssystem von oben in die entsprechende Probenkammer eingebracht werden. Über spezielle Anschlüsse an den Probenkammern ist auch eine Anbringung von der Seite oder von unten möglich. Wenn als erstes Medium 3 beispielsweise Wasser verwendet wird, so kann auch als zweites Medium 9 Wasser verwendet werden. Besonders vorteilhaft ist jedoch die Verwendung nicht eines flüssigen Mediums, sondern eines festen oder amorphen Mediums, beispielsweise eines amorphen Fluoropolymers, wie es von der Firma BELLEX International Corporation unter dem Produktnamen CYTOP^® angeboten wird. Aufgrund seiner Konsistenz muss dieses Material nicht gesondert in einem Gefäß aufbewahrt werden, was für die Ankopplung des optischen Abbildungssystems 11 und gegebenenfalls auch der in Fig. 2 gezeigten Beleuchtungseinrichtung 16 einen großen Vorteil darstellt, da ansonsten auch das optische Abbildungssystem 11 und die Beleuchtungseinrichtung 16 als Immersionssysteme ausgestaltet werden müssten, was aber selbstverständlich möglich ist.

Selbstverständlich kann auch das erste Medium 3 und das zweite Medium 9 jeweils durch einen Probenträger 10 bzw. Deckgias oder ein entsprechendes Element auf der Zwischenbildseite ersetzt werden. In diesem Fall muss das Übertragungssystem 4 nicht zwingend als Immersionssystem ausgestaltet sein, zur Erzielung einer hohen numerischen Apertur ist die Ausgestaltung als Immersionssystem jedoch von Vorteil. Bei der in Fig.2 gezeigten Vorrichtung kann das Übertragungssysiem 4 beispielsweise eine numerische Apertur von 1 ,31 , das optische Abbildungssystem 11 eine numerische Apertur von 1 ,0 und die Beleuchtungseinrichtung 16 eine numerische Apertur von 0,5 aufweisen. Für das optische Abbildungssystem 11 ist hier, da es nur der Abbildung dient und nicht der Beleuchtung, keine extrem hohe numerische Apertur mehr notwendig, was das optische Design hinsichtlich der Auswahl und Zusammenstellung von Komponenten für eine gut korrigierte Abbildung erleichtert.

Die katadioptrische Baugruppe kann auf verschiedenen Weisen ausgestaltet sein, in Abhängigkeit von der Ausgestaltung dieser Baugruppe werden die übrigen Elemente des Übertragungssystems 4 gestaltet. Zur Verkürzung der räumlichen Längsausdehnung des Übertragungssystems 4 entlang der optischen Achse umfasst die katadioptrische Baugruppe beispielsweise eine plankonvexe Linse oder Linsengruppe und ein Spiegelelement. Die plankonvexe Linse oder Linsengruppe weist eine plane Fläche auf, weiche der Objektebene 2 bzw. Zwischenbildebene 6 zugewandt und zur Innenseite verspiegelt ist. Dabei ist ein Bereich, der die optische Achse einschließt, zum Durchtritt von Licht von der Verspiegelung ausgenommen. Der Bereich muss dabei so groß sein, dass genügend Licht entlang der Detektionsrichtung durch diesen unver- spiegelten Bereich in das Übertragungssystem 4 eintreten kann und außerdem Beleuchtungslicht in einem Winkel von bevorzugt 90° gegenüber der Detektionsrichtung zur optimalen Beleuchtung mit einem Lichtblatt. Gegenüber der planen Fläche ist eine konvexe Fläche angeordnet, das Spiegelelement wiederum ist dieser konvexen Fläche der Linse oder Linsengruppe gegenüber angeordnet. Die Spiegelfläche dieses Spiegelelements ist konkav geformt, sie reflektiert von der plankonvexen Linse oder Linsengruppe kommendes Licht. Auch bei dem Spiegelelement ist ein Bereich, der die optische Achse einschließt zum Durchtritt von Licht von der Verspiegelung ausgenommen. Dabei ist der Strahlengang so konzipiert, dass Licht durch den unverspiegelten Bereich unter einem Winkel, der im Bereich der Detektionsrichtung liegt, eintritt, zunächst durch die plankonvexe Linse hindurchläuft, an der konvexen Fläche austritt, und an der Spiegelfläche des Spiegelelements zurückreflektiert wird auf die plankonvexe Linse. Nach abermaligen Eintritt durch die konvexe Fläche der plankonvexen Linse wird der Strahl an der verspiegelten, planen Fläche reflektiert in Richtung des Bereiches des Spiegelelements, der zum Durchtritt von Licht von der Verspiegelung ausgenommen ist. Dieser Bereich kann als Öffnung ausgebildet sein, in diese Öffnung kann auch schon eine entsprechende Linse oder Linsengruppe eingesetzt sein.

Unter Verwendung dieser beiden Elemente, der plankonvexen Linse/Linsengruppe und dem Spiegelelement, kann das Übertragungssystem 4 auf verschiedene Weisen realisiert werden.

Beispielsweise kann ein jedes der Teilsysteme 4a und 4b die in folgender Tabelle 1 aufgeführten Systemdaten aufweisen. Linse Fläche Radius [mm] Dicke [mm] / Luftabstand [mm] n_d Vd

L1 1 plan 17,56 1 ,52 64,1

2 -59,77 7,22

S2 3 -29,95 1 ,00

L3 4 784,92 3,35 1 ,59 64,27

5 -21 ,53 2,56

L4 6 -8,81 4,39 1 ,65 33,85

7 -8,21 3,76

L5 8 189,42 3,50 1 ,52 64,17

9 -15,81 0,50

L6 10 21 ,29 4,00 1 ,52 64,1 7

11 -65,47

Tabelle 1

Dabei weist jedes des Teilsysteme Linsen L1 , L3, L4, L5 und L6 sowie ein Spiegelelement S2 auf, die Flächen 1 und 3 sind verspiegelt. Die Brechzahl n_d und die Abbesche Zahl v_d beziehen sich auf eine Wellenlänge von λ_ά = 578,56 nm. Ein Übertragungssystem mit diesen Systemdaten ist beispielhaft in Fig.3 dargestellt. Die katadioptrische Baugruppe besteht hier also aus der Linse L1 und dem Spiegelelement S2. Der Arbeitsabstand beträgt in diesem Fall 0,5 mm, als erstes und zweites Medium wird bevorzugt ein Materia! verwendet, welches einen Brechungsindex n_d = 1 ,33 und eine Abbesche Zahl v_d = 55,74 aufweist, beispielsweise Wasser oder ein Fluoropolymer wie CYTOP®, welches einen Brechungsindex von 1 ,34 aufweist. Das in Tabelle 1 beschriebene System ist auch und insbesondere für den Einsatz in immersionsumgebungen geeignet.

Ein anderes Beispiel für eine Realisierung des Übertragungssystems 4 ist in Fig.4 dargestellt. Jedes der beiden Teilsysteme 4a und 4b des dort dargestellten Übertragungssystems 4 weist folgende Systemdaten auf:

Linse Fläche Radius [mm] Dicke [mm] / Luftabstand [mm] 1d v_d

L1 1 plan 7,22 1 ,64 42,41

L2 2 122,40 8,53 1 ,46 67,87

L3 3 -130,00 6,16 1 ,82 46,62

4 -74,26 10,49

S4 5 -38,74 0,10

L5 6 -16,21 1 ,00 1 ,44 94,93 L6 7 6,19 3,28 1 ,64 42,41

8 -85,87 10,80

L7 9 -174,59 3,04 1 ,74 32,26

10 -14,94 0,10

L8 11 42,60 3,40 1 ,61 56,65

L9 12 -46,09 8,71 1 ,88 40,76

L10 13 17,72 7,67 1 ,82 46,62

14 -37,45

Tabelle 2

Jedes der Teilsysteme 4a und 4b weist hier also Linsen L1 , L2, L3, L5, L6, L7, L8, L9, L10 auf und ein Spiegelelement S4. Die Linsen L , L2 und L3 sind miteinander verkittet, ebenso sind die Linsen L8, L9 und L10 miteinander verkittet, Sie bilden jeweils Linsengruppen. Bei jedem der Teilsysteme sind die Flächen 1 und 5 verspiegelt, gekennzeichnet in Fig.4 wie auch in Fig.3 durch die angedeutet Schraffur. Diese Ausgestaltung lässt sich insbesondere mit einem Deckglas mit dem Brechungsindex n_d = 1 ,52 und einer Abbeschen Zahl v_d = 59,48 verwenden, wobei das Deckglas dann bevorzugt eine Dicke von 0,17 mm hat. Als erstes und zweites Medium werden jeweils wieder bevorzugt Wasser verwendet, wobei der Arbeitsabstand von der Objektebene - ohne das Deckglas - bei 0,4 mm liegt, d.h. die Dicke der Wasserschicht beträgt 0,4 mm. Auch ein Fluoropolymer kann verwendet werden, beispielsweise anstelle des Wassers als zweitem Medium auf der Zwischenbildseite.

In einer weiteren Ausgestaltung des Übertragungssystems 4 ist die konvexe Fläche der plankonvexen Linse oder Linsengruppe asphärisch geformt, bei einer Linsengruppe ist dabei die dem Objekt am entferntesten liegende Fläche gemeint. Ein Beispiel für ein solches Übertragungssystem 4 ist in Fig.5 dargestellt. Es weist die folgenden Systemdaten aus Tabelle 3 auf.

Linse Fläche Radius [mm] Dicke [mm] / Luftabstand [mm] n_d v_d

L1 1 plan 16,60 1 ,52 64,17

2 -51 ,89 6,85

S2 3 -27,43 0,00

L3 4 -95, 19 1 ,00 1 ,52 64,1 7

5 13,07 1 ,00

L4 6 -23,51 6,17 1 ,69 31 ,18

7 -6,94 0,10

L5 8 26,32 5,00 1 ,69 31 ,18 L6 9 15,23 8,00 1 ,52 64,17

10 -14,45

Tabelle 3

Dabei ist die konvexe Fläche 2 der plankonvexen Linse asphärisch geformt. Die asphärisch geformte Fläche, hier eine rotationssymmetrische Kegelschnittasphäre, wird dabei durch die Beziehung

beschrieben. K ist die konische Konstante, und N sind natürliche Zahlen und c₂,- die Koeffizienten eines Polynoms in h. R bezeichnet den Radius einer gedachten Kegelschnittfläche am Scheitelpunkt dieser Fläche, d.h. den Abstand des Scheitelpunkts zum nächstgelegenen Brennpunkt. Dabei Siegen sowohl der Scheitelpunkt als auch die Brennpunkte der Kegelschnittfläche auf der optischen Achse. Die Koeffizienten, die konische Konstante K und der Radius R werden iterativ bestimmt. Der Radius der Fläche 2 in Tabelle 3 bezeichnet den sphärischen Grundradius in der nächsten Umgebung der optischen Achse, d.h. für kleine h, und korrespondiert zu p.

Bei dem in Fig.5 gezeigten Beispiel bilden außerdem die Linsen L5 und L6 eine Linsengruppe, sie sind miteinander verkittet. Auch diese Ausgestaltung lässt sich insbesondere mit einem Deckglas mit dem Brechungsindex n_d = 1 ,52 und einer Abbeschen Zahl v_d = 59,48 verwenden, wobei das Deckglas dann bevorzugt eine Dicke von 0,17 mm hat. Als erstes und zweites Medium werden jeweils wieder bevorzugt Wasser verwendet, wobei der Arbeitsabstand, d.h. die Dicke der Wasserschicht, 0,4 mm beträgt. Für diese und die in Tabelle 3 aufgeführten Parameter ergeben sich beispielsweise, wenn man als konische Konstante K = 0 wählt und eine übliche Linsenhöhe von ca. 30 mm vorgibt, die folgenden Koeffizienten des Polynoms in h bis i = 8: c_A = -8,9311 - 10^-7, c₆ = ~1 ,4858- 10^{^} , c₈ = -2,1550- 10^~11 , c₁₀ = - , 1551 - 10^~13 c₁₂ = -3,6392- 10^""16, c = -5,7753- 10^~19 und c₁₆ = -3,6408- 10~²². Auch Fluoropolymere kommen als Deckglas und/oder Medien in Frage.

In einer weiteren Ausgestaltung des Übertragungssystems kann das Spiegelelement auch als Manginspiegel ausgestaltet sein. Ein Beispiel dafür ist in Fig.6 gezeigt, es weist die folgenden Systemdaten aus Tabelle 4 auf: Linse Fläche Radius [mm] Dicke [mm] / Luftabstand [mm] rid

L1 1 plan 15,98 1 ,52 64,17

2 -62,72 6,23

L2 3 -32,45 3,50 1 ,52 64,17

4 -3 ,64 0,53

L3 5 -10,68 1 ,00 1 ,52 64,17

6 -1 ,90 0,10

L4 7 -3,44 7,31 1 ,69 31 ,18

8 -19,46 0,54

L5 9 56,66 3,92 1 ,69 31 ,18

10 -39,96 0, 10

L6 11 24,67 4,00 1 ,52 64,17

12 -14,04

Tabelle 4

Jedes der Teilsysteme 4a, 4b weist also Linsen L1 , L2, L3, L4, L5 und L6 auf. Die Linse L2 ist als Manginspiegel ausgestaltet, d.h. die eine Seite dieser Linse ist - bis auf den Bereich um die optische Achse - verspiegelt. Auch diese Ausgestaltung lässt sich insbesondere mit einem Deckglas mit dem Brechungsindex n_d = ,52 und einer Abbeschen Zahi v_d = 59,48 verwenden, wobei das Deckglas dann bevorzugt eine Dicke von 0, 17 mm hat. Als erstes und zweites Medium werden jeweils wieder bevorzugt Wasser oder ein Fluoropolymer verwendet, wobei der Arbeitsabstand, d.h. die Dicke der Wasserschicht, 0,4 mm beträgt. Das Fluoropolymer kann auch anstelle eines Deckglases eingesetzt werden.

Die vorangehend beschriebenen optischen Übertragungssysteme erlauben aufgrund der Verwendung katadioptrischer Elemente eine starke Verkürzung des Aufbaus einer Vorrichtung zur Abbildung einer Probe, insbesondere im Zusammenhang mit SPIM-Anwendungen. Da das Zwischenbild und das tatsächliche Objekt in Medien mit annähernd gleicher Brechzahl liegen, wird der defokussierte Volum enbereich nahezu ohne optische Fehler abgebildet, so dass auch schräge Objektebenen, die in einem großen Bereich außerhalb des Fokus liegen, korrekt abgebildet werden können. Bezugszeichenliste

1 Probe

2 Objektebene

3 erstes Medium

4 optisches Übertragungssystem

4,a, 4b Teiisystem

5 Zwischenbild

6 Zwischenbildebene

7 Symmetrieebene

8 Pupiilenblende

9 zweites Medium

10 Probenträger

11 optisches Abbildungssystem

12 Objektiv

13 Detektor

14 Beleuchtungslicht

15 Strahlteiler

16 Beleuchtungseinrichtung

L1 - L10 Linsen

S2, S4 Spiegeleiement

Claims

Patentansprüche

Vorrichtung zur Abbildung einer in einem ersten Medium (3) in einer Objektebene (2) angeordneten Probe (1 ), umfassend

ein optisches Ü bertrag ungssystem (4), welches die Probe (1 ) Objektebene (2) in ein Zwischenbild (5) in einer Zwischenbildebene (6) abbildet,

wobei die Objektebene (2) und die Zwischenbildebene (6) mit einer optischen Achse des Übertragungssystems (4) einen von 90° verschiedenen Winkel einschließen und das optische Übertragungssystem (4) aus zwei Teilsystemen (4a, 4b) mit mehreren Linsen symmetrisch bzgl. einer Symmetrieebene (7) aufgebaut ist, so dass die Abbildung durch das optische Übertragungssystem (4) mit einem Maßstab von 1 :1 erfolgt,

ein optisches Abbildungssystem (11 ) mit einem Objektiv (12), dessen optische Achse senkrecht auf der Zwischenbildebene (6) steht und welches auf die Zwischenbildebene (6) fokussiert ist, so dass die Objektebene (2) unverzerrt auf einen Detektor ( 3) abbildbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass

das beide Teilsysteme (4a, 4b) telezentrisch und das optische Übertragungssystem (4) bezüglich einer Pupillenebene symmetrisch aufgebaut ist,

die Objektebene (2) und die Zwischenbildebene (6) die Scheimpflugbedingung erfüllen, das Zwischenbild (5) in einem zweiten Medium (9), welches einen zum ersten Medium (3) nahezu identischen Brechungsindex aufweist, liegt, und

die der Probe (1 ) bzw. dem Zwischenbild (5) am nächsten angeordnete Linsengruppe der Teilsysteme (4a, 4b) mindestens eine katadioptrische Baugruppe umfasst.

Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie Mittel zur Einkopplung von Beleuchtungsltcht (14) zur Beleuchtung der Probe (1 ) mit einem Lichtblau aufweist, wobei die Lichtblattebene im wesentlichen in der Objektebene

(2) und in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung liegt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Einkopplung von Beleuchtungslicht (14) einen in einer Pupillenebene zwischen den beiden Teilsystemen (4a, 4b) angeordneten Strahiteiler (15) umfassen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Einkopplung von Beleuchtungslicht (14) eine Beleuchtungseinrichtung ( 6) umfassen, welche das Beleuchtungslicht (14) über das zweite Medium (9) in der Zwischenbildebene (6) in den Strahlengang einkoppelt, wobei die Beleuchtung der Zwischenbildebene (6) mit einem Lichtblatt in dieser Ebene erfolgt.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Übertragungssystem (4) mit dem ersten (3) und dem zweiten Medium (9) in Kontakt steht, so dass erstes (3) und zweites Medium (9) als Immersionsmittel wirken.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als erstes Medium (3) Wasser und als zweites Medium (9) ein amorphes Fluoropotymer verwendet wird.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die kata- dioptrische Baugruppe folgende optischen Elemente umfasst:

eine plankonvexe Linse oder Linsengruppe mit einer planen Fläche, weiche der Objektebene (2) bzw. Zwischenbildebene (6) zugewandt und zur Innenseite verspiegelt ist, wobei ein Bereich, der die optische Achse einschließt, zum Durchtritt von Licht von der Ver- spiegelung ausgenommen ist, und mit einer konvexen Fläche,

ein der konvexen Fläche der Linse oder Linsengruppe gegenüber angeordnetes Spiegelelement mit einer konkav geformten Spiegelfläche, welche von der plankonvexen Linse oder Linsengruppe kommendes Licht reflektiert, wobei ein Bereich, der die optische Achse einschließt, zum Durchtritt von Licht von der Verspiegelung ausgenommen ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein jedes der Teilsysteme (4a, 4b) folgende Systemdaten mit Linsen L1 , L3, L4, L5, L6 und einem Spiegelelement S2 aufweist, wobei die Flächen 1 und 3 verspiegelt sind, mit n_d der Brechzahl und v_d der Abbeschen Zahl bei einer Weilenlänge _ü = 587,56 nm:

Dicke [mm] /

Linse Fläche Radius [mm] n_d v_d

Luftabstand [mm]

L1 1 plan 17,56 1 ,52 64,17

2 -59,77 7,22

S2 3 -29,95 1 ,00 L3 4 784,92 3,35 1 ,59 64,27

5 -21 ,53 2,56

L4 6 -8,81 4,39 1 ,65 33,85

7 -8,21 3,76

L5 8 189,42 3,50 1 ,52 64, 7

9 -15,81 0,50

L6 10 21 ,29 4,00 1 ,52 64,17

1 1 -65,47

9. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein jedes der optischen Teilsystem (4a, 4b) folgende Systemdaten aufweist, mit Linsen L , L2, L3, L5, L6, L7, L8, L9, L10 und einem Spiegelelement S4, wobei die Linsen L1 , L2 und L3 miteinander und die Linsen L8, L9, L10 miteinander verkittet sind und Linsengruppen bilden, und wobei die Flächen 1 und 5 verspiegeli sind, mit n_d der Brechzahl und v_d der Abbeschen Zahl bei einer Wellenlänge λ = 587,56 nm:

10. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die konvexe Fläche der plankonvexen Linse oder Linsengruppe asphärisch geformt ist.

1 1 . Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein jedes der optischen Teilsysteme {4a, 4b) folgende Systemdaten aufweist, mit Linsen L , L2, L3, L4, L5, L6, und einem Spiegelelement S2, wobei die Linsen L5 und L6 eine Linsengruppe bilden und miteinander verkittet sind, mit n_d der Brechzahl und v_d der Abbeschen Zahl bei einer Wellenlänge k_ä = 587,56 nm, wobei die Fläche 2 asphärisch geformt ist:

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Spiegelelement als Manginspiegel ausgestaltet ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein jedes der optischen Teilsysteme (4a, 4b) folgende Systemdaten aufweist, mit Linsen L1 , L2, L3, L4, L5, L6, wobei die Linse L2 der Manginspiegel ist und wobei die wobei die Flächen 1 und 4 verspiegelt sind, mit n_d der Brechzahl und v_d der Abbeschen Zahl bei einer Wellenlänge k<j = 587,56 nm :

Dicke [mm] / Luftab¬

Linse Fläche Radius [mm] v_d stand [mm]

L1 1 plan 15,98 1 ,52 64,17

2 -62, 72 6,23

L2 3 -32,45 3,50 1 ,52 64,17

4 -31 ,64 0,53

L3 5 -10,68 1 ,00 1 ,52 64, 17

6 -1 ,90 0,10

L4 7 -3,44 7,31 1 ,69 31 ,18

8 -19,46 0,54

L5 9 56,66 3,92 1 ,69 31 , 18

10 -39,96 0,10

L6 11 24,67 4,00 1 ,52 64, 17

12 -14,04