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Stand der Technik und dessen Nachteile
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Die Erfindung betrifft ein Laser-Scanning-Mikroskop (LSM), das mit mehreren Spots gleichzeitig eine Probe abrastert und so eine verkürzte Bildaufnahmezeit ermöglicht.
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Ein derartiges Mikroskop ist beispielsweise in
US 6028306 beschrieben.
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Eine Einrichtung zur Mehrstahlerzeugung wurde beispielsweise in
DE19904592 A1 beschrieben.
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Zum allgemeinen Aufbau konfokaler LSM wird zusätzlich auf J. Pawley,„Handbook of biological confocal microscopy", Springer (2006) verwiesen. In einem LSM werden vor allem fluoreszierende Proben durch mindestens einen Laserspot oder eine Linie zum Leuchten angeregt, wobei der Spot oder die Linie über die Probe gerastert wird. Die von der Probe stammende Fluoreszenz wird auf eine konfokale Blende abgebildet, welche Licht aus nicht fokalen Ebenen der Probe effektiv ausblendet. Durch die Blende transmittiertes Licht wird mit einem Photodetektor registriert und per Computer mittels der Ortsinformation aus der Laserpositionierung zu einem kontrastreichen Fluoreszenzbild der jeweiligen Fokalebene zusammengesetzt. Durch Änderung der Fokalebene können dreidimensionale Bildstapel erzeugt werden.
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Dem Scanvorgang inhärent ist eine relativ große Dauer bzgl. der Bildaufnahme. Der aus
US 6028306 bekannte Ansatz, die konfokale Bildaufnahmerate zu beschleunigen, ist das simultane Rastern der Probe mit mehreren Anregungsstrahlen in kleinen Regionen.
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In diesem Fall ist die konfokale Filterung ein kritischer Parameter, insbesondere bezüglich der Variabilität der Pinholegrößen.
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Viele vorgeschlagene Lösungen geben einfach feste Pinholegrößen vor, was jedoch nachteilig ist, wenn durch die Applikation, d. h. kundenseitig, eine große Anzahl von möglichen Objektiven verlangt wird, da die Größe des Fluoreszenzspots in der Pinholeebene von der Größe der Objektivpupille abhängt.
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Zudem liegt dann der Pinholeabstand fest, was insbesondere hohe Justier- und Stabilitätsanforderungen an die jeweiligen Strahlengänge stellt oder eine Variabilität des betrachteten Scanfeldes gar nicht mehr zulässt. Weiterhin ist auch bei einem gewünschten Umschalten von einer multifokalen Arbeitsweise und dem konventionellen LSM-Betrieb die maximale Größe eines Pinholes immer durch den Abstand, in diesem Fall schaltbarer, Pinholes begrenzt.
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Problemstellung
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In einem konfokalen Laserscanningmikroskop (LSM) mit multifokaler Anregung der Probe soll vollständige Konfokalität hergestellt werden, wobei Justierungstoleranzen der individuellen Strahlengänge bzw. der Relativpositionen der Konfokalblenden zueinander nicht in deutlichen Helligkeitsunterschieden resultieren sollen.
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Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der unabhängigen Patentansprüche gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
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Problemlösung
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Die hier vorgeschlagene erfinderische Lösung der Problemstellung betrifft ein multifokales LSM dessen Foki auf einer Linie angeordnet sind und deren Anzahl (ca. 4–8) nicht allzu groß ist, um den Fertigungsaufwand im Rahmen zu halten. Vom Aufwand abgesehen ist dem Grad der Parallelisierung (der Anzahl der Anregungsstrahlen) aber kein prinzipielles Limit gesetzt. Die vorgeschlagene Lösung des Problems nutzt vorteilhaft aus, dass die Fluoreszenzspots in der Pinholeebene ortsfest liegen und linear angeordnet sind. Es werden erfindungsgemäß nun zwei Pinholeebenen erzeugt, die also zueinander optisch konjugiert sind, in denen jeweils eine veränderliche Blonde, vorzugsweise eine Spaltblende angeordnet wird. Diese beiden Spaltblenden sind in ihrer Ausrichtung parallel zueinander oder auch senkrecht zueinander, wenn ein Periskop zur Aufrechterhaltung der Orientierung zwischen ihnen angeordnet ist. Eine einfache Drehung der Spotreihe, wie sie zum Beispiel in einem einfachen Periskop mit zwei Spiegeln realisiert wird, würde jedoch darin resultieren, dass beide Spalten auf die jeweils gleiche Raumrichtung einwirken und die Konfokalität in dieser Richtung quasi doppelt bestimmen.
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Aus diesem Grund wird erfindungsgemäß in Detektionsrichtung hinter der ersten Spaltblende eine optische Anordnung implementiert, welche die geometrische Orientierung der individuellen Punktbilder in Bezug auf die Orientierung des Gesamtbildes (Punktbildkette) um 90° dreht.
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Dies kann auf zwei verschiedene Arten erfolgen:
- 1. Individuelle Drehung der Punktbilder mittels eines Arrays von vorzugsweise miniaturisierten bildfelddrehenden Prismen.
- 2. Umordnung der Punktbilder der gesamten Spotreihe mittels periskopischer Spiegelanordnungen, ohne die Bildorientierung zu modifizieren. Nach der Bildumordnung erfolgt die (möglichst beugungsbegrenzte) Abbildung in eine zweite Pinholeebene, in der wiederum eine veränderliche Spaltblende angeordnet ist.
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Auf diese Weise erfolgt in zwei orthogonalen Bildrichtungen eine vollständig konfokale Filterung, wobei auch Pinholefertigungs-toleranzen keine Auswirkungen auf die Bildqualität haben. Zudem ist in geringen Grenzen eine Modifikation der Spotabstände ohne Verringerung der konfokalen Filterung zulässig und damit eine geringe Variabilität der Scanfeldgröße möglich, indem beispielsweise der Abstand der drehenden Prismen mit verändert wird.
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Das segmentierte bilddrehende Mittel muss dabei in einer Position des Strahlenganges angeordnet werden, wo jeder Teilstrahl individuell behandelbar ist.
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Beschreibung der Abbildungen
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Fig. 1:
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Die Abbildung in 1a zeigt eine Anordnung aus 4 um 45° gedrehten Dove-Prismen DP, unten in Frontansicht und oben Draufsicht von oben. Diese Prismen sind jeweils in eine Nut in einem Auflagekörper VB (schraffiert) gelagert, um ihre gleichmäßige Orientierung zu gewährleisten, Höhenversätze auszuschließen und die Prismen auf Stoß anordnen zu können.
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Ein Dove-Prisma ist ein gestutztes, rechtwinkliges Prisma. Es handelt sich um eine Art Reflexionsprisma, bei dem eintretendes Licht nach dem Durchlaufen der ersten geneigten Fläche eine totale interne Reflexion erfährt; danach reflektiert es entlang der längeren Unterfläche und tritt an der zweiten geneigten Fläche wieder aus. Das Austrittsbild steht auf dem Kopf, ist aber nicht lateral versetzt.
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Ein Dove-Prisma zeigt die Eigenschaft, dass es, die Abbildung um den zweifachen Prismendrehungswinkels rotiert. Dove-Prismen sind äußerst nützlich als Bildrotatoren in Bereichen wie der Astronomie, der Interferometrie und zur Struktur- und Bildmustererkennung.
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Im oberen Teil in 1 ist jeweils der Strahlengang gestrichelt dargestellt. Die Pfeilorientierungen deuten die Orientierungsänderung des betreffenden Punktbildes beispielhaft an.
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Durch die Dove-Prismen und ihre 45 Grad Lagerung erfahren die vier Einzelstrahlen und Punktbilder eine Drehung um jeweils 90 Grad.
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Diese Anordnung würde somit in der oben beschriebenen Weise die konfokale Filterung in einem 4-fach Multifokal-LSM in den zwei Spaltblendenebenen (siehe die weiteren Abbildungen) ermöglichen.
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Anstelle der Dove-Prismen sind ebenso Abbe-König-Prismen oder andere bildfelddrehende (prismatische oder nichtprismatische) Elemente verwendbar. Jedoch verlangen Dove-Prismen nach dem geringsten Bauraum und sind monolithisch fertigbar.
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Eine Vereinfachung in Bezug auf die Fertigung dieser Struktur ergibt sich auch, wenn anstatt der Dove-Prismen entsprechend dimensionierte 90°-Prismen verwendet werden wie in 1b dargestellt.
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Diese können dann auf einer der beiden Hypotenusenkanten um 45° geneigt werden und an den Dreiecksflächen (Stirnseiten) miteinander verkittet werden. Die Prismen werden dann von den Kathetenflächen her beleuchtet, brechen das Licht zur Hypotenuse hin, wo es reflektiert wird und an der gegenüberliegenden Kathetenfläche das Prisma verlässt, wobei die Bildinformation jedes einzelnen Strahlbündels ebenfalls wie in 1a) um 90° gedreht wurde.
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Fig. 2:
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Die Abbildung in 2 zeigt die Anordnung der vorgeschlagenen erfindungsgemäßen Komponente im Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskops (LSM).
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Von einer nicht dargestellten Beleuchtungsquelle, vorzugsweise einem Laser emittiertes Licht (1) wird mittels eines Strahlteilers (3) auf einen Strahlengang zur Fluoreszenzanregung durch Reflektion an 3 aufgefädelt, wobei hier zu Gunsten der Übersichtlichkeit nur der Achsstrahl gezeigt ist, da die Erzeugung mehrerer Teilstrahlen an sich nicht Gegenstand der Erfindung ist (Siehe Darstellung des Standes der Technik oben).
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Die Beleuchtung 1 gelangt auf Scanspiegel (4x, 4y), die die Laserspots über die Probe (6) rastern, deren Fokusse durch das Mikroskopobjektiv (5) erzeugt werden. Ein Scanner (x) bewegt die Laserspots senkrecht zu ihrer Verbindungsachse über die Probe, der andere (y) verschiebt die Spots entlang ihrer Längsachse um eine weitere Abtastung in X Richtung zu realisieren.
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Aus diesen Foki emittiertes Fluoreszenzlicht (2) und weiteres Probenlicht wird durch das Objektiv (5) in entsprechende Teilstrahlen kollimiert, welche durch die Scanspiegel (4x, 4y) gescannt, d. h. auf ortsfeste Strahlen gelenkt werden.
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Das Fluoreszenzlicht durchläuft den Strahlteiler (3) in Transmission und wird mittels zweier Pinholeoptiken (7) in zwei Zwischenbilder abgebildet. In diesen Zwischenbildern ist jeweils eine variabel in ihrer Öffnung verstellbare Spaltblende (8) positioniert.
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In einem Teilabschnitt des Strahlenganges, in dem auf alle Teilstrahlen individuell zugegriffen werden kann, werden mittels der erfindungsgemäßen Anordnung (9) die Bildorientierungen der Einzelpunktbilder relativ zu der Orientierung des Gesamtbildes um 90° gedreht. Schließlich wird die Fluoreszenz (2) mittels eines Detektorarrays (10) elektronisch registriert.
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Die veränderlichen Spaltblenden 8 können hierbei in ihrer Spaltlängsausdehnung parallel orientiert sein, wenn die einzelnen Punktbilder separat in ihrer Orientierung gedreht werden, wie in 1 dargestellt, sie können aber auch zueinander senkrecht orientiert angeordnet sein, wenn die Reihe der Punktbilder zusammen in ihrer Orientierung gedreht wird, wie in den weiteren Ausführungen noch beschrieben wird.
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Fig. 3a, b:
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Die Abbildung in 3 zeigt eine monolithisch erzeugbare erfindungsgemäße Anordnung 9 wobei die Bilddrehung jedes einzelnen Teilstrahls einzeln aufgrund von drei 90° Reflexionen erfolgt. Die dazu notwendigen Mikrospiegel MS1-3 werden dazu in einen Glasblock G gefräst, geätzt oder per Laserablation eingebracht. Eine hochverspiegelnde Beschichtung ist nicht von nöten, da der Einfallswinkel von 45° auf die Mikrospiegelflächen bereits in BK7 für Totalreflexion ausreichend ist. 3a zeigt dabei die Anordnung mit vier bilddrehenden Segmenten in einem Glasblock G in Draufsicht mit einem ausschnittsweise vergrößerten Einzelelement.
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In 3b ist schematisch und nicht maßstabsgetreu eine Anordnung aus drei Mikrospiegeln, wie in 3a enthalten, im Detail dargestellt.
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Die Mikrospiegel MS1-3 sind jeweils in einen 45 Grad Winkel zur Einfallsnormale angeordnet, aber unterschiedlich in ihrer Lage zueinander orientiert.
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Der einfallende Strahl Se wird an MS1 nach obenabgelenkt, erfährt an MS 2 eine seitliche Ablenkung und wird an MS3 als ausgehender Strahl Sa parallel zur Einfallsrichtung von S3 abgelenkt.
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Die Abbildung in 3c zeigt den Strahlengang von der Spaltblendenebene ausgehend durch ein bilddrehendes Segment MS1-3 hindurch für den Achsstrahl und die beiden Randstrahlen, die gerade noch durch das Segment hindurch propagieren. Die Maßstabverhältnisse entsprächen einer Positionierung des segmentierten Bilddrehers 2 mm hinter der ersten Spaltblende mit einer für LSM typischen numerischen Apertur der Pinholeoptik und einer Begrenzung des korrespondierenden Pinholedurchmessers auf 200 μm. Das entspricht einer hinreichend weiten Öffnung und stellt sicher, dass alle Teilstrahlen separat manipulierbar sind. Des Weiteren illustriert der Strahlengang die bilddrehende Wirkung der Anordnung auf einen einzelnen Teilstrahl. Auf der einlaufenden Seite der Anordnung liegen die Randstrahlen nebeneinander in der Papierebene und werden durch die ersten beiden Reflexionen übereinander gelegt. Die dritte Reflexion ändert an der relativen Orientierung der Teilstrahlen innerhalb eines Spotbündels nichts mehr, ordnet die Spotbündel aber wieder nebeneinander auf einer Linie an. Dabei werden die optischen Achsen der Spotbündel um etwa einen halben Spotabstand gegeneinander versetzt. Der Spotabstand bleibt aber erhalten da jedes der Spotbündel, von denen nur eines dargestellt ist, um den gleichen Betrag versetzt ist.
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Bei einer Änderung des Spotabstandes könnte beispielsweise das Element 9 nach 3 durch ein anderes vorgefertigtes mit geringerem Abstand zwischen den Einzelelementen MS1-3 ersetzt werden.
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Fig. 4:
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Die Abbildung in 4 zeigt schematisch den Strahlengang durch die gesamte Anordnung zur konfokalen Filterung des von der Probe ausgesandten Fluoreszenzlichtes (2). Dieses wird zunächst durch die erste Linse der Pinholeoptik (7a) auf die erste Spaltblende (8a) abgebildet. Die zweite Linse (7b) bildet die beiden Spaltblenden (8a) und (8b) aufeinander ab, wobei aber die durch die erfindungsgemäße Anordnung (9) erzeugten Strahlversätze und zusätzlichen Glaswege in fachmännisch bekannter Weise berücksichtigt werden. Die Linse (7b) ist beispielsweise als ein System aus zwei Fourierlinsen implementierbar, welche zunächst (die erste Linse) nach einen kollimierten Strahlengang erzeugen und dann (die zweite Linse) auf (8b) abbilden. in 4 ist jedoch schematisch eine Einzellinse 7b dargestellt. Die dritte Linse (7c) kollimiert das Fluoreszenzlicht wieder, welches danach in Richtung Detektor und ggf. Detektionsoptik weiter geleitet wird.
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Fig. 5:
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Die Abbildung 5 zeigt skizziert das Prinzip der Umordnung der Spots innerhalb eines linearen Spotarrays, wie sie vorteilhaft beispielsweise durch die Anordnung mehrerer periskopischer Spiegelstufen erreicht werden kann. Hier erfolgt eine Neupositionierung der Spots, ohne dass deren Bildorientierung verändert wird. Die Bildorientierung wird durch die Pfeilrichtung angezeigt. Die Neupositionierung erfolgt mittels einer 90°-Drehung der Orientierungsachse des Spotarrays. In diesem Fall würden die Spaltblenden 8a, 8b zueinander um 90 Grad orientiert stehen.
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Fig. 6:
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Diese Abbildung zeigt erfindungsgemäße Anordnungen P1-7 mit rhomboiden Prismen,
die jeweils an dunkel gezeichneten reflektierenden Flächen zwei 90°-Umlenkungen ausführen und so einen periskopischen Strahlversatz in jeden Teilstrahlengang einführen.
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Im dargestellten Ausführungsbeispiel werden zunächst die Teilstrahlen aus der ursprünglichen Ebene, schematisch als E1 dargestellt, die durch Strahlrichtung und Orientierungsrichtung des Spotarrays definiert ist, mittels einer ersten Periskopprismenstufe P1, P4, P6 in die neuen vertikalen Zielebenen abgelenkt.
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Wie hier dargestellt werden nur S1, S3 und S4 seitlich versetzt, S2 behält seine Lage, es ist jedoch ohne Einschränkung auch denkbar, S1-S4 seitlich zu versetzen. Die zweite Periskopprismenstufe P2, P3 P4, P5, P6 ordnet die Spots durch jeweils seitliche Versetzung in einer senkrecht zur Ausgangsebene E1 orientierten Ebene E2 neu übereinander an. Hierbei wird S2 nur seitlich versetzt.
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Die Erfindung ist nicht an die dargestellten Ausführungsformen gebunden. Insbesondere kann neben der dargestellten Teilstrahlenanordnung in einer Ebene auch eine Teilstrahlenmatrix oder ein Teilstrahlenarray realisiert werden, beispielsweise durch mehrere Anordnungen wie in 1 dargestellt übereinander und ein entsprechend angeordnetes Blendenarray (Pinholearray) in den beiden beschriebenen Raumrichtungen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 6028306 [0002, 0005]
- DE 19904592 A1 [0003]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- J. Pawley,„Handbook of biological confocal microscopy”, Springer (2006) [0004]
