DE102004044556A1

DE102004044556A1 - Behandlung viraler Infektionen durch selektive Zerstörung virusinfizierter Zellen mit Stresskinase-Inhibitoren

Info

Publication number: DE102004044556A1
Application number: DE102004044556A
Authority: DE
Inventors: Karl Dr. Ziegelbauer; Holger Dr. Zimmermann; Olaf Dr. Weber
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2004-09-15
Filing date: 2004-09-15
Publication date: 2006-03-30

Abstract

Bei vielen viralen Infektionen kann eine Beseitigung der Infektionsherde mit den derzeit verfügbaren antiviralen Mitteln nich erfolgen, das Viren effiziente Strategien zum Überleben im Wirtsorganismus entwickelt haben, der Angriffspunkt der derzeit verfügbaren antiviralen Mittel jedoch das sich vermehrende Virus oder der Infektionsprozess ist. Daher sollte eine Möglichkeit gefunden werden, virusinfizierte Zellen selektiv zu zerstören. Es konnte experimentell gezeigt werden, dass Inhibitoren der Serin/Threonin-Kinase "Stress" antivirale Effekte haben, die vermutlich über selektive Apoptose in virusinfizierten Zellen ausgelöst werden.

Description

Bei vielen viralen Infektionen kann eine Beseitigung der Infektionsherde (infizierte Zellen) mit den derzeit verfügbaren antiviralen Mitteln nicht erfolgen, da Viren verschiedene effiziente Strategien zum Überleben im Wirtsorganismus, z.B. Latenz oder Integration in das Wirtszellgenom, entwickelt haben, der Angriffspunkt der derzeit verfügbaren antiviralen Mittel in der Regel jedoch das sich vermehrende Virus oder der Infektionsprozess ist.

Serin/Threonin Protein Kinasen sind in zelluläre Signalwege eingebunden, die u.a. die Genexpression und die Zellproliferation regulieren (Su & Karin, Curr. Opinion Immunol. 1996, 8. 402; Kolch Biochem. J. 2000, 351. 289). Einige Serin/Threonin Protein Kinasen, cyklinabhängige Kinasen (cdk), regulieren Übergangsschritte im Zellzyklus (Meyerson et al. EMBO J. 1992, 11. 2909). Aktiv sind diese Kinasen, wenn sie spezifisch an bestimmte Proteine, die zur Familie Cycline gehören, gebunden sind.

Viren können nur in Zellen replizieren. Es konnte experimentell gezeigt werden, dass die Inhibition von Proteinkinasen über einen Eingriff in den Lebenszyklus der Zelle vielversprechende antivirale Effekte zeigen kann (Schang Antimicrob Chemother. 2002, 50. 779).

Die selektive Beseitigung infizierter Zellen über eine Nutzung zellulärer Stressmechanismen stellt zur Zeit nicht den Gegenstand antiviraler Therapien dar. Es sollte eine Möglichkeit gefunden werden, virusinfizierte Zellen selektiv zu zerstören und damit einerseits die Infektion zu beenden und andererseits mit der Therapie möglichst nebenwirkungsarm zu sein.

Viren bringen bei der Infektion von Zellen ihre Nukleinsäuren mit. Aufgrund der Struktur dieser Nukleinsäuren, die sich von der eukaryotischer Zellen unterscheiden, wird ein so genanntes DNA damaging Signal ausgelöst (Raj et al. 2001 Nature, 142. 914). Die Zelle reagiert mit einer Stressantwort, d.h. Mechanismen der Zellzykluskontrolle und DNA-Repair-Mechanismen. Durch Störung dieser Stressantwort wird die Zelle in Apoptose getrieben. Bestandteil der erwähnten Stressantwort sind verschiedene Kinasen, u.a. Serin/Threonin Kinasen.

Die Inhibition der Serin/Threonin Kinase „Stress" (1) führt in Zellen zur Apoptose.

Es konnte durch die Verwendung einer DNA-schädigenden Substanz (Adriamycin) gezeigt werden, dass Zellen, in denen ein DNA-damaging Signal ausgelöst wurde, signifikant sensitiver gegenüber einer Inhibition von „Stress" mittels eines spezifischen „Stress" Inhibitors „A" sind als nicht gestresste Zellen (2). Die Struktur von „A" ist in 5a dargestellt.

Es konnte gezeigt werden, dass die Expression der Serin/Threonin Kinase „Stress" bei Exposition von Zellen mit DNA-schädigendem UV-Licht, DNA-interkalierenden Substanzen oder mit einem viralen Vektor induziert wird (unveröffentlicht).

Verbindung „B" (Struktur in 5b), ein weiterer spezifischer Inhibitor von „Stress", zeigte antivirale Effekte in NHDF Zellen, die mit humanem Zytomegalievirus infiziert worden waren (3).

In Abhängigkeit der eingesetzten Viruskonzentration konnte ein Selektivitätsindex von bis zu ca. 300 zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen erarbeitet werden (4).

Im Vergleich weist der relativ unspezifische Kinase-Inhibitor „C" (5c) auch bei nicht infizierten Zellen deutlich zytopathische Effekte auf. Der Selektivitätsindex beträgt ca. 1.

Somit wurde überraschenderweise festgestellt, dass Inhibitoren von „Stress" antivirale Effekte haben, die vermutlich über die selektive Auslösung von Apoptose in virusinfizierten Zellen ausgelöst werden.

Die Sequenz 1 zeigt die Aminosäuresequenz der Serin/Threoninkinase „Stress". Das Enzym wurde unter US 10/410764 und unter WO 01/81589 publiziert. Desweiteren wurde eine Patentanmeldung der Firma Sugen unter der Nummer PCT/US01/02337 veröffentlicht, bei der eine ähnliche Kinase (1 Aminosäure verändert) erwähnt wird.

Beschreibung der Abbildungen:

1: Werden mit humanem Zytomegalievirus infizierte humane Zellen mit dem „Stress" Inhibitor „B" behandelt, so lassen sich antivirale Effekte beobachten. Die Dichte des Zellrasens nimmt mit steigender Substanzkonzentration zu. In vergleichbaren Konzentrationen wirkt die Substanz auf nicht infizierten Zellen nicht zytostatisch.

2a: Verbindung „A" (N-(6-Quinolinyl)-N-[2-(6-quinolinylamino)-5-(trifluoromethyl)-4-pyrimidinylamine) WO 03/030909 (Veröffentlichungsdatum: 17. April 2003)

2b: Verbindung „B" (5-Bromo-N-(6-Quinolinyl)-N-[2-(6-quinolinylamino)-4-pyrimidinylamine) WO 03/030909 (Veröffentlichungsdatum: 17. April 2003)

2c: Verbindung „C" (N-[5-Bromo-2-(1H-indazol-5-ylamino)-4-pyrimidinyl]-N-(1H-indazol-5-yl)amine). WO 03/030909 (Veröffentlichungsdatum: 17. April 2003)

Beispiele
Beispiel 1: Kombinationstherapie Adriamycin und Inhibitor „A"
H460 Lungenkrebszellen (ATCC Nr. HTB-177) wurden unter Standardbedingungen kultiviert (DMEM, 10% FBS, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamin, 100 U/mL Penicillin, 100 ☐ g/mL Streptomycin bei 37°C in 5% CO2 in einem Feuchtinkubator) Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsin aus den Kulturflaschen gelöst und in einer Dichte von ca. 3000 Zellen/Well in insgesamt 100 ☐ L o.g. Mediums/Well in einer 96-Well Platte ausgesät. 24 Stunden nach Aussaat wurde Adriamycin (Doxorubicin HCL Injection USP, Ben Venue Laboratories, Inc. Bedford, USA) in den beschriebenen Konzentrationen zugesetzt (2). Nachdem Inhibitor "A" in verschiedenen Konzentrationen zugegeben wurde, erfolgte die Auswertung der Zellzahl mittels eines kommerziell erhältlichen MTS Assays (Promgega CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay) 72 Stunden später entsprechend den mitgelieferten Arbeitsanweisungen des Herstellers. Inhibitor "A" wurde in 100% DMSO gelöst und eine l0mM Stocklösung hergestellt. Diese Lösung wurde weiter verdünnt bis eine 40μM Arbeitslösung in 0.4% DMSO hergestellt war.
Tabelle 1

Behandlung von H460 Zellen mit suboptimalen Konzentrationen von Adriamycin (1 nM) führt nicht zu zytopathischen Effekten. Während der „Stress" Kinase-Inhibitor „A" bei Exposition von H460 Zellen einen IC₅₀ von ca. 1 μM aufweist, wird bei Vorbehandlung (Schädigung der DNA und Induktion einer Repair-Antwort) ein IC₅₀ von ca. 60 nM beobachtet.

H460	IC50 [M]
keine Vorinkubation, "A" allein	1.27E-06
24 Stunden Inkubation mit 1 nM Adriamycin (kein "A")	inaktiv
24 Stunden Vorinkubation mit 1 nM Adriamycin + "A"	5.89E-08
4 Tage Inkubation mit 1 nM Adriamycin (kein "A")	inactive
4 Tage Vorinkubation mit 1 nM Adriamycin + "A"	5.94E-07
24 Stunden Inkubation mit 10 nM Adriamycin (kein "A")	40% Inh
24 Stunden Vorinkubation mit 10 nM Adriamycin + "A"	< 1.65E-08
4 Tage Inkubation mit 10 nM Adriamycin (kein "A")	40% Inh
4 Tage Vorinkubation mit 10 nM Adriamycin + "A"	< 1.65E-08
24 Stunden Inkubation mit 100 nM Adriamycin (kein "A")	100% Inh
24 Stunden Vorinkubation mit 100 nM Adriamycin + "A"	< 1.65E-08
4 Tage Inkubation mit 100 nM Adriamycin (kein "A")	100% Inh
4 Tage Vorinkubation mit 100 nM Adriamycin + "A"	< 1.65E-08
24 Stunden Inkubation mit 1 μM Adriamycin (kein "A")	100% Inh
24 Stunden Vorinkubation mit 1 μM Adriamycin + "A"	< 1.65E-08
4 Tage Inkubation mit 1 μM Adriamycin (kein "A")	100% Inh
4 Tage Vorinkubation mit 1 μM Adriamycin + "A"	< 1.65E-08

Beispiel 2: Anti-HCMV- (Anti-Humanes Cytomegalo-Virus) Zytopathogenitätstests
Die Testverbindungen werden als 50 millimolare (mM) Lösungen in Dimethysulfoxid (DMSO) eingesetzt. Nach der Zugabe von jeweils 2 μl der 50, 5, 0.5 und 0.05 mM DMSO-Stammlösungen zu je 98 μl Zellkulturmedium in der Reihe 2 A-H in Doppelbestimmung werden 1:2-Verdünnungen mit je 50 μl Medium bis zur Reihe 11 der 96-Well-Platte durchgeführt. Die Wells in den Reihen 1 und 12 enthalten je 50 μl Medium. In die Wells werden dann je 150 μl einer Suspension von 1 × 10⁴ Zellen (humane Vorhautfibroblasten [NHDF]) pipettiert (Reihe 1 = Zellkontrolle) bzw. in die Reihen 2–12 ein Gemisch von HCMV-infizierten und nichtinfizierten NHDF-Zellen (M.O.I. = 0.001 – 0.002), d.h. 1–2 infizierte Zellen auf 1000 nicht-infizierte Zellen. Die Reihe 12 (ohne Substanz) dient als Viruskontrolle. Die End-Testkonzentrationen liegen bei 250 – 0.0005 μM. Die Platten werden 6 Tage bei 37°C/5% CO2 inkubiert, d.h. bis in den Viruskontrollen alle Zellen infiziert sind (100% cytopathogener Effekt [CPE]). Die Wells werden dann durch Zugabe eines Gemisches von Formalin und Giemsa's Farbstoff fixiert und gefärbt (30 Minuten), mit aqua bidest. gewaschen und im Trockenschrank bei 50°C getrocknet. Danach werden die Platten mit einem Overhead-Mikroskop (Plaque Multiplier der Firma Technomara) visuell ausgewertet.
Die folgenden Daten können von den Testplatten ermittelt werden:
CC50 (NHDF) = Substanzkonzentration in μM, bei der im Vergleich zur unbehandelten Zellkontrolle keine sichtbaren cytostatischen Effekte auf die Zellen erkennbar sind;
EC50 (HCMV) = Substanzkonzentration in μM, die den CPE (cytopathischen Effekt) um 50% im Vergleich zur unbehandelten Viruskontrolle hemmt;
SI (Selektivitätsindex) = CC50 (NHDF)/EC50 (HCMV).
Die Tabelle 2 zeigt die Selektivität von infizierten Zellen vs. nicht infizierten Zellen wird durch spezifische Inhibition von „Stress" vermittelt. HCMV (+) = infizierte und nicht infizierte Zellen im Verhältnis 1:900 eingesetzt; HCMV (–) = nur nicht infizierte Zellen eingesetzt; CC50 = Konzentration (μM) bei der das Zellwachstum 50% eingeschränkt ist; EC50 = Konzentration (μM) bei der die Virusvermehrung zu 50% unterbunden ist; SI = Selektivitäts-Index (Quotient aus CC50 und EC50). Tabelle 2

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verwendung von Kinase-Inhibitoren, welche in zelluläre Stressreaktionen involviert sind zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung viraler Infektionen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die virale Infektion durch HCMV verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kinase Inhibitoren Serin/Threonin Kinase-Inhibitoren sind.
Verwendung nach den Ansprüchen 1–3, wobei die Kinase eine Aminosäuresequenz wie in 1 aufweist.
Verwendung nach den Ansprüchen 1–3, wobei die Kinase eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 80 % Identität zu der Sequenz in 1 besitzt.
Ein Serin/Threonin Kinase Inhibitor zur Behandlung viraler Infektionen gemäss den Methoden der Ansprüche 1–5.
Verwendung eines Serin/Threonin Kinase Inhibitors gemäss Anspruch 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung viraler Infektionen.