CN105477000A - 用于减缓细胞衰老的包含rho激酶抑制剂的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种用于减缓细胞衰老的包含Rho激酶抑制剂的组合物，和在哺乳动物中治疗细胞衰老相关症状的方法。

Description

用于减缓细胞衰老的包含RHO激酶抑制剂的组合物及其用途
相关申请
本申请要求2014年10月6日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请No.10-2014-0134481的权益，其完整公开内容通过提述并入本文。
发明领域
本公开涉及用于减缓细胞衰老的组合物、减少哺乳动物中细胞衰老的方法、和治疗哺乳动物中细胞衰老相关症状的方法。
发明背景
衰老可定义为细胞***的永久停止。已在细胞水平观察到复制性衰老或细胞衰老作为老化模型。当持续培养细胞时，细胞***多次，但老化的细胞不再能***。衰老细胞对程序性细胞死亡有抗性，且一些衰老细胞保持不***状态达几年。
Rho激酶是属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。包括ROCK1和ROCK2在内的Rho有关的蛋白激酶(即ROCK)在哺乳动物、斑马鱼、爪蟾(Xenopus)等中发现。人ROCK1具有150kDa的分子量，而且是小GTPaseRhoA的主要下游效应物。哺乳动物ROCK包括激酶域、卷曲螺旋区、和血小板-白细胞激酶C底物同源(Pleckstrinhomology,PH)结构域，当RhoA-GTP不存在时血小板-白细胞激酶C底物同源结构域通过自身抑制性分子内折叠降低ROCK的激酶活性。
由于ROCK在与细胞衰老有关的细胞过程中所起的作用，仍然需要开发用Rho激酶抑制剂减缓(reducing)细胞衰老的组合物和方法。
发明概述
提供一种用于在哺乳动物中治疗与细胞中的脂褐素积累有关的症状的组合物，所述组合物包含Rho激酶抑制剂作为活性成分。所述细胞可以是具有脂褐素积累的皮肤组织细胞、肌肉组织细胞或神经组织细胞。优选地，所述哺乳动物是人。
在一个方面，所述与脂褐素积累有关的症状是神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、年龄相关的黄斑变性、心脏的褐色萎缩、肢端肥大症、去神经萎缩、脂质肌病、慢性阻塞性肺病(COPD)、或其组合。
提供一种用于在体外或在哺乳动物中减少细胞中脂褐素积累的组合物，所述组合物包含Rho激酶抑制剂作为活性成分。
提供一种用于刺激人细胞的增殖的组合物，所述组合物包含Rho激酶抑制剂作为活性成分。在一个实施方案中，所述人细胞是成纤维细胞、肌细胞或神经细胞。在一个方面，所述组合物用于治疗皮肤皱纹、降低的修复伤口的能力、肌肉衰减症(sarcopenia)、哈-格二氏早老性综合征(Hutchinson-Gilfordprogeriasyndrome)、或其组合。提供一种减少哺乳动物中细胞衰老的方法，包括通过对所述哺乳动物施用有效量的Rho激酶抑制剂来减缓细胞衰老。
提供一种治疗哺乳动物中的与细胞衰老有关的症状的方法，其中所述方法包括通过对所述哺乳动物施用有效量的Rho激酶抑制剂来治疗与细胞衰老有关的症状。
提供一种治疗哺乳动物中的胞内脂褐素积累相关症状的方法，其中所述方法包括通过对所述哺乳动物施用有效量的Rho激酶抑制剂来治疗脂褐素积累相关病症。
提供一种刺激人细胞增殖的方法，包括：将所述人细胞暴露于有效量的Rho激酶抑制剂以刺激所述人细胞，其中所述人细胞是成纤维细胞、肌细胞或神经细胞。特别地，所述暴露包括将有效量的Rho激酶抑制剂施用给人体部位，其中所述部位是皮肤组织、肌肉组织或神经组织。
所述Rho激酶抑制剂可以局部施用至包含具有脂褐素积累的细胞的皮肤组织、肌肉组织或神经组织。在一个实施方案中，所述Rho激酶抑制剂的施用通过将Rho激酶抑制剂局部施用至包含具有脂褐素积累的细胞的组织来进行。
本申请的方法可用于治疗皮肤皱纹、降低的修复伤口的能力、肌肉衰减症、哈-格二氏早老性综合征、或其组合。
附图简述
这些和/或其他方面从对例示性实施方案连同所附附图的下列描述来看将变得明显且更容易领会的。
图1，该示例图显示了暴露于多种浓度的Rho激酶抑制剂Y-27632、Fasudil和SR3677的细胞的细胞集落形成；
图2，该系列图绘出了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)情况下培养的衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)的相对细胞数对时间；
图3是显微镜图像，其例示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)情况下培养的衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)的细胞形状；
图4是细胞在各种细胞生长阶段的百分比的图，其例示了Rho激酶抑制剂Y-27632和Fasudil对衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)的细胞周期的影响；
图5是显微镜图像的图，其例示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下在含琼脂培养基中培养衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)的结果；
图6至8是例示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)的衰老有关的(SA)-β-半乳糖苷酶活性(图6A、7A和8A的a和b)的显微镜图像的图，和例示具有衰老有关的(SA)-β-半乳糖苷酶活性的细胞的百分比的图(图6B、7B和8B)；
图9，该组图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成纤维细胞(37次细胞传代后)中脂褐素的量；
图10，该组图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成纤维细胞(37次细胞传代后)中的反应性氧种类；
图11，该组图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成纤维细胞(37次细胞传代后)的线粒体膜电位；
图12，该图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成纤维细胞(38次细胞传代后)中的DNA损伤程度，通过指示DNA损伤程度的DNA彗星测定法(DNAcometassay)测量；
图13是显微镜图像的图，其例示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成肌细胞(11次细胞传代后)中的细胞形状变化；
图14，该组图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成肌细胞(11次细胞传代后)中的脂褐素量；
图15，该组图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成肌细胞(11次细胞传代后)中的反应性氧种类；
图16，该组图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成肌细胞(11次细胞传代后)中的线粒体膜电位；
图17是显微镜图像的图，其例示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(progericfibroblasts)(17次传代后)中的细胞形状变化；
图18，该组图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(17次传代后)中的脂褐素量；
图19，该组图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(17次传代后)中的反应性氧种类；
图20，该组图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(17次传代后)的线粒体膜电位；
图21，该图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(17次传代后)中的DNA损伤程度，通过指示DNA损伤程度的DNA彗星测定法测量；和
图22是例示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(17次传代后)的SA-β-半乳糖苷酶活性的显微镜图像的图(图22A的a-e)，和例示具有SA-β-半乳糖苷酶活性的细胞的百分比的图(图22B)。
图23显示了在应用Y-27632或作为对照的DMSO后年老小鼠的时间匹配的伤口大小和伤口外观。
图24代表免疫组织化学实验结果，其显示Y-27632处理在年老小鼠(19个月龄)的伤口愈合中起着重要作用。
图25代表以下实验结果，其显示伤口重塑组织的横截面面积中胶原沉积的厚度揭示了在老年小鼠中用Y-27632处理的伤口相比于用DMSO处理的伤口中更密集和更厚的胶原。
图26代表了显示年老小鼠中用Y-27632处理的伤口相比于用DMSO处理的伤口中表皮中的PCNA+细胞的实验结果。
发明详述
现将对例示性的实施方案进行详细提述，其例子例示在附图中，其中相似的参照编号从头到尾指相似的要素。在此方面，目前的例示性实施方案可能具有不同形式且不应理解为受限于本文中陈述的说明。因此，下文仅通过参照附图描述了例示性实施方案以解释各方面。如本文中使用的，术语“和/或”包括一个/种或多个/种所列关联项的任意和所有组合。表述如“至少一个/种”在置于一组要素之前修饰整组要素而不修饰该组的单个要素。另外的方面部分将在下面的说明书中陈述，而部分从说明书将是明显的，或者可通过实践呈现的例示性实施方案得知。
提供可用于减缓细胞衰老的组合物，其中所述组合物包含Rho激酶抑制剂作为活性成分。
Rho激酶，也称为“Rho-有关的蛋白质激酶(ROCK)”，是属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。在哺乳动物、斑马鱼、爪蟾等中发现ROCK(例如ROCK1和ROCK2)。人ROCK1具有150kDa的分子量且是小GTPaseRhoA的主要下游效应物。哺乳动物ROCK包含激酶域、卷曲螺旋区、和血小板-白细胞激酶C底物同源(Pleckstrinhomology,PH)结构域，当RhoA-GTP不存在时血小板-白细胞激酶C底物同源结构域通过自抑制性分子内折叠降低ROCK的激酶活性。
Rho激酶抑制剂可以是(1R,4R)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷羧酰胺((1R,4R)-4-((R)-1-aminoethyl)-N-(pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide)(Y-27632)、N-[2-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基]-2,3-二氢-1,4-苯并二噁英-2-羧酰胺](N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamide])(SR3677)、5-(1,4-二氮杂环庚烷-1-磺酰)异喹啉(5-(1,4-diazepane-1-sulfonyl)isoquinoline)(Fasudil)、其任何药学可接受的盐、其立体异构体、或组合。
减少细胞衰老包括延迟或预防细胞的衰老，和/或将衰老细胞逆转成更幼的细胞状态(例如类似于衰老前细胞的状态的细胞状态)。减缓细胞衰老可以包括增强细胞增殖的能力、减少脂褐素的积累、降低β-半乳糖苷酶的活性、减少线粒体反应性氧种类的数目、增加线粒体膜电位、和/或减少细胞周期G0和/或G1阶段的持续时间。衰老的细胞可以是肌细胞，包括成肌细胞、成纤维细胞、来自患有哈-格二氏早老综合征(Hutchinson-Gilfordprogeriasyndrome)的受试者的细胞、或神经细胞。
组合物可用于治疗细胞衰老相关的症状(即细胞衰老的症状)。细胞衰老相关的症状的例子包括皮肤皱纹、降低的修复伤口的能力、肌肉衰减症(sarcopenia)、哈-格二氏早老综合征、或其任意组合。细胞衰老相关的症状可以是脂褐素积累相关的症状(即脂褐素积累的症状)。脂褐素积累相关的症状的例子包括神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronalceroidlipofuscinoses,NCL)、年龄相关的黄斑变性、神经原纤维性缠结(neurofibrillarytangles)、心脏的褐色萎缩(Brownatrophyoftheheart)、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis(ALS))、肢端肥大症(acromegaly)、去神经萎缩(denervationatrophy)、脂质肌病(lipidmyopathy)和慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)。细胞衰老相关的症状也可以是由受损的线粒体所致的疾病，如线粒体反应性氧种类的增加、线粒体膜电位的降低、或其任意组合。还有，细胞衰老相关的症状可以由细胞中增加的β-半乳糖苷酶活性导致。
Rho激酶抑制剂可以为药学可接受的盐的形式。药学可接受的盐可以是通常用于药物组合物领域(例如细胞衰老相关疾病领域)的酸加成盐，例如源自无机酸如盐酸、溴酸、硫酸、氨基磺酸(sulfamicacid)、磷酸或硝酸的盐，或源自有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、柠檬酸、马来酸、丙二酸、甲磺酸、酒石酸、苹果酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、2-乙酰氧基苯甲酸(2-acetoxybenzoicacid)、富马酸、甲苯磺酸、草酸、或三氟乙酸的盐。盐还包括源自金属如锂、钠、钾、镁或钙的盐。酸加成盐或金属盐可以使用本领域中已知的任何方法制备。
Rho激酶抑制剂可以为溶剂合物的形式。“溶剂合物”指由一种或多种溶质分子即Rho激酶抑制剂或其药学可接受盐和一种或多种溶剂分子形成的复合物或聚集物。溶剂合物可以是由溶质分子和水、甲醇、乙醇、异丙醇或乙酸形成的复合物或聚集物。
Rho激酶抑制剂还可以为立体异构体的形式。立体异构体包括所有异构体如对映异构体(enantiomer)和非对映异构体(diastereomer)。Rho激酶抑制剂可以为立体异构体纯的形式或至少一种立体异构体的混合物，例如外消旋混合物。可使用本领域中已知的任意方法来分离具体的立体异构体。
在组合物中，细胞可以是哺乳动物(包括人)的细胞。哺乳动物可以患有细胞衰老相关的疾病。
组合物还可以包含药学可接受的载体。在组合物中，“药学可接受的载体”指与活性成分组合以协助该活性成分的应用的物质，一般为惰性物质。载体可以包括常规的药学可接受的赋形剂、添加剂或稀释剂。例如，载体可以包括选自下组的至少一种：填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、滑润剂、芳香剂(flavoringagent)、稠化剂、着色剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂和等张剂。
组合物可以包含治疗有效量的Rho激酶抑制剂或其药学可接受的盐或溶剂合物。在组合物中，“治疗有效量”指足以在需要治疗的受试者中引起期望的治疗效果的量(例如细胞增殖的增加或脂褐素积累的降低)。术语“治疗上”指在受试者(例如哺乳动物，如人)中治疗疾病或医学症状如细胞衰老相关的疾病，且包括：(a)预防疾病或医学症状的发作，即对患者的预防性治疗；(b)缓解疾病或医学症状，即消除患者中的疾病或医学症状或从其恢复；(c)抑制疾病或医学症状，即延迟或停止受试者中疾病或医学症状的进展；或(d)减轻受试者中的疾病或医学症状。“有效量”可以由本领域普通技术人员选择。“有效量”可以是约0.01mg至约10,000mg、约0.1mg至约1,000mg、约1mg至约100mg、约0.01mg至约1,000mg、约0.01mg至约100mg、约0.01mg至约10mg、或约0.01mg至约1mg的量。
组合物可以口服施用或胃肠外经由静脉内、腹膜内、皮下、直肠施用，或局部施用。如此，组合物可以配制为多种剂型，如片剂、胶囊剂、水性液体配制剂、或悬浮剂。一般地，可向片剂添加赋形剂如乳糖和玉米淀粉和滑润剂如硬脂酸镁以用于口服施用。在用于口服施用的胶囊剂中，乳糖和/或干玉米淀粉可以用作稀释剂。当使用用于口服施用的水性悬浮剂时，活性成分可以与乳化剂和/或悬浮液联合。若需要，可将甜味剂和/或芳香剂进一步添加到制剂中。在神经内、肌内、腹膜内、皮下和静脉内施用的情况中，制备活性成分的无菌溶液，调整溶液的pH，并将溶液缓冲。在静脉内施用的情况中，可以调整溶质的总浓度以允许制剂具有等张性。组合物可以是水性液体配制剂，包含药学可接受的载体如具有pH7.4的盐水。溶液可以经由局部推注引入肌内或神经内血流中。
如本文中使用的，短语“细胞衰老”、“细胞的衰老”和“细胞性衰老”指相比于参照细胞(例如同一细胞类型的已知未衰老的细胞)，该细胞具有降低的增殖能力、脂褐素累积的增加、β-半乳糖苷酶活性的增加、线粒体反应性氧种类的增加、线粒体膜电位的降低、和/或细胞G0和/或G1期持续时间的增加，或导致这些特征的过程或状况。如本文中使用的，短语“年轻细胞”和“未衰老细胞”指与参照细胞(例如同一类型的已知衰老的细胞)相比时，该细胞存在增加的增殖能力、脂褐素累积的降低、β-半乳糖苷酶活性的降低、线粒体反应性氧种类的降低、线粒体膜电位的增加、和/或细胞G0和/或G1期持续时间的降低。术语“参照细胞”指来自年龄为18至25、18至23或18至20的正常且健康的人的细胞，例如成纤维细胞。参照细胞可以是成纤维细胞、肌细胞或神经细胞。
如本文中使用的，术语“传代”指通过将生长在已有细胞培养物中的一种或多种细胞转移到新细胞培养基来进行细胞传代培养。
组合物可以与用于治疗细胞衰老相关疾病的一种或多种其他治疗剂组合。另外，组合物可以仅包含Rho激酶抑制剂或其药学可接受的盐或溶剂合物，而不包含用于治疗细胞衰老相关疾病的另一种活性成分。
组合物可以包含浓度为约5μM至20μM的Y-27632。优选地，Y-27632的浓度为约5μM。或者，所述组合物可以包含浓度为约3μM至7μM的FASUDIL。优选地，FASUDIL的浓度为约5μM。或者，所述组合物可以包含浓度为约0.1μM至1μM的SR3677。优选地，SR3677的浓度为约0.5μM。
提供一种在哺乳动物中减少细胞衰老的方法，其通过对所述哺乳动物施用有效量的Rho激酶抑制剂。
在该方法中，“Rho激酶抑制剂”、“减少细胞衰老”和“哺乳动物”如上文所述。“有效量”指在对具有衰老细胞的受试者施用时足以减少细胞衰老的量(例如细胞增殖增加或脂褐素的累积降低)。施用Rho激酶抑制剂包括施用包含Rho激酶抑制剂或其药学可接受的盐或溶剂合物的组合物。
提供一种治疗细胞衰老相关的症状的方法，其通过对所述哺乳动物施用有效量的Rho激酶抑制剂。
依照另一个例示性实施方案的一个方面，提供一种用于在哺乳动物中治疗与脂褐素积累有关的症状的方法，其中所述方法包括：对哺乳动物施用有效量的Rho激酶抑制剂来治疗与脂褐素积累有关的症状。
在该方法中，“Rho激酶抑制剂”、“衰老相关的症状”和“哺乳动物”如上文所述。“有效量”指在对具有细胞衰老相关的症状的受试者施用时足以治疗细胞衰老相关的症状的量(例如细胞增殖增加或脂褐素的累积降低)。有效量还指在对具有脂褐素积累的受试者施用时“足以减少脂褐素积累的量”。脂褐素的积累可以是脂褐素在细胞如成纤维细胞、肌肉细胞如成肌细胞、或神经细胞内的积累。施用Rho激酶抑制剂包括施用包含Rho激酶抑制剂或其药学可接受的盐或溶剂合物的组合物。
在本文中描述的方法中，所述方法可以进一步包括鉴定具有细胞衰老的哺乳动物。鉴定步骤可以包括测量脂褐素积累的水平、β-半乳糖苷酶的活性、线粒体反应性氧种类(ROS)的数目、线粒体膜电位、和细胞周期G0和/或G1阶段的持续时间。测量可使用本领域中已知的方法进行。例如，脂褐素积累的水平可通过测量细胞的源自脂褐素的自发荧光能力来测量。具体地，可用488nm波长照射培养的细胞，然后用自520nm波长发出的辐射测量。β-半乳糖苷酶的活性水平可通过使用发色底物如X-gal发色底物并在与含有β-半乳糖苷酶的样品反应后检测来自发色底物的光来测量。线粒体反应性氧种类(ROS)的数目水平可以通过以下来测量，使用线粒体超氧化物指示物如0.2μMMitoSOXTMRed线粒体超氧化物指示物进行活细胞成像(Invitrogen,M36008)，然后在与线粒体反应性氧种类反应后检测自该指示物发射的光。可以通过监测DNA含量来实现细胞周期分析，例如G0和/或G1期、S期和G2/M期的时段。G0/G1期细胞是二倍体(2N)且表达四倍体G2/M期细胞(4N)的DNA含量的一半。S期细胞含有在G1和G2状态之间的不同量的DNA。
在本文描述的方法中，可由本领域普通技术人员根据患者的病理状况来选择施用路径。施用可以是口服、胃肠外或局部施用。施用可以是局部施用至包含衰老细胞的组织。施用可以局部施用至皮肤组织、肌肉组织或神经组织。
在所述方法中，剂量可根据多种因素而变化，诸如如上文所述的患者的病理状况、施用路径和医师的决定。可以基于通过体外实验或动物模型实验获得的剂量-反应曲线来估测有效剂量。依照一个例示性实施方案包含在组合物中的Rho激酶抑制剂的比率和浓度可根据化学特性、施用路径、治疗有效剂量等来确定。对受试者施用的剂量的范围可以为约10μg/kg至约10g/kg每天、约100μg/kg至约1g/kg每天、约1000μg/kg至约0.1g/kg每天、约10μg/kg至约1g/kg每天、约10μg/kg至约0.1g/kg每天、约10μg/kg至约0.01g/kg每天、约1μg/kg至约1g/kg每天、或约0.1mg/kg至约500mg/kg每天，作为有效剂量。剂量可以按照受试者的年龄、重量、敏感性或症状来调整。
所述方法还可以包括对细胞测量细胞的倍增时间、细胞中脂褐素的量、细胞中的β-半乳糖苷酶活性、细胞中线粒体ROS的数目、线粒体膜电位、和细胞周期的G0和/或G1期的时段。该方法可以进一步包括将测量所得数据与对照细胞的数据相比较，其中所述对照细胞是参照细胞。参照细胞可以是同一细胞类型的已知未衰老细胞。术语“参照细胞”指细胞，例如源自年龄为18至25、18至23或18至20岁的正常健康的人的成纤维细胞。参照细胞可以是成纤维细胞、肌肉细胞如成肌细胞、或神经细胞。该方法还可以包括当对于细胞观察到相比于参照细胞增加的细胞倍增时间、细胞中增加的脂褐素积累、细胞中增加的β-半乳糖苷酶活性、细胞中增加的线粒体ROS数目、降低的线粒体膜电位、和增加的细胞周期的G0和/或G1期时段时，确定所述细胞是衰老细胞。该方法还可以包括当观察到相比于参照细胞增加的细胞中脂褐素量时，确定所述细胞具有脂褐素积累。
在上文描述的方法中，可对确定具有包含衰老细胞的衰老组织的哺乳动物进行施用步骤。
提供一种在哺乳动物中治疗胞内脂褐素积累相关的症状的方法，其中所述方法包括通过对所述哺乳动物施用有效量的Rho激酶抑制剂来治疗脂褐素积累相关的症状。
在该方法中，“Rho激酶抑制剂”、“衰老相关的症状”和“哺乳动物”如上文所述。“有效量”指在对具有细胞衰老相关的症状的受试者施用时足以治疗细胞衰老相关的症状的量(例如细胞增殖增加或脂褐素的累积降低)。施用Rho激酶抑制剂包括施用包含Rho激酶抑制剂或其药学可接受的盐或溶剂合物的组合物。
包含Rho激酶抑制剂或其药学可接受的盐或溶剂合物的组合物可用于减少细胞衰老。
依照在另一个例示性实施方案中减少哺乳动物中细胞衰老的方法，可以有效减少细胞衰老且可以有效治疗细胞衰老相关的症状。
依照另一个方面的在哺乳动物中治疗与脂褐素积累有关的症状的方法可用于治疗哺乳动物中与脂褐素积累有关的症状。
将参照以下实施例更详细地描述本发明的实施方案。这些实施例仅用于例示性目的且不意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1：Y-27632、Fasudil和SR3677对衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)增殖的作用
在补充有10％胎牛血清(FBS)和100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素(两种抗生素购自Gibro-BRL和GrandIsland,NY)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中在5％CO2培养箱中于37℃培养成纤维细胞细胞系。所述成纤维细胞细胞系(M11株)自一个11岁龄男孩的***获得。当细胞在板中约85％汇合时启动传代培养。早期传代培养以1:4的分流比(splitratio)实施，后面的传代培养则以1:2的分流比实施。当细胞倍增时间为14天时，细胞被视为衰老的成纤维细胞(传代35至37)。
为了确定Rho激酶抑制剂Y-27632(Selleckchem,S1049,50mg2HCl盐形式)、FASUDIL(Selleckchem,S1573,500mgHCl盐形式)和SR3677(Synkinase,SYN1083,10mg)的最佳浓度，将该衰老的成纤维细胞(37次细胞传代后)以2,000个细胞/孔的浓度接种于6孔板的每个孔上，并将孔用1μM、5μM、10μM、20μM和30μM的Y-27632，1μM、5μM、10μM、20μM和30μM的FASUDIL，和0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM和1μM的SR3677处理。另外，以相同的方式制备阴性对照组，只不过使用的是二甲亚砜(DMSO)。每4天用补充有Y-27632、FASUDIL或SR3677的新鲜培养基改变培养基，并在4周后用0.05％结晶紫对集落染色。
图1显示了根据Rho激酶抑制剂Y-27632、Fasudil和SR3677的浓度鉴定细胞增殖和细菌集落形成的实验结果。
图1的A显示了根据Y-27632的浓度鉴定细胞增殖和细菌集落形成的实验结果。在图1的“A”中，Y-27632在5μM、10μM和20μM的浓度时对于细胞增殖和细菌集落形成具有最大的治疗效果。然而，由于在30μM的浓度的毒性作用，Y-27632降低细胞增殖和细胞集落形成。选择最低的5μM并在以下实验中作为5μM、10μM和20μM浓度中具有对细胞增殖和细胞集落形成的治疗效果的浓度使用。在图1的A中，在阴性对照组中使用0.05(v/v)％的DMSO。
图1的“B”显示了根据FASUDIL的浓度鉴定细胞增殖和细菌集落形成的实验结果。在图1的B中，FASUDIL在5μM的浓度时对于细胞增殖和细菌集落形成具有最大的治疗效果。然而，由于在10μM,20μM和30μM的浓度的毒性作用，FASUDIL降低细胞增殖和细胞集落形成。选择5μM并在以下实验中作为具有对细胞增殖和细胞集落形成的治疗效果的浓度使用。在图1的B中，在阴性对照组中使用0.05(v/v)％的DMSO。
图1的“C”显示了根据SR3677的浓度鉴定细胞增殖和细菌集落形成的实验结果。在图1的C中，SR3677在0.5μM的浓度时对于细胞增殖和细菌集落形成具有最大的治疗效果。然而，由于在1uM的浓度的毒性作用，SR3677降低细胞增殖和细胞集落形成。选择0.5μM并在以下实验中作为具有对细胞增殖和细胞集落形成的治疗效果的浓度使用。在图1的C中，在阴性对照组中使用0.05(v/v)％的DMSO。
为了定量测量Y-27632、Fasudil和SR3677分别在最佳浓度5μM,5μM和0.5μM时诱导的细胞增殖程度，将细胞以2,000细胞/孔的浓度在96孔板的每个孔上接种。然后，对其添加5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677，并在相同条件下培养细胞。另外，以相同的方式制备阴性对照组，只不过使用的是DMSO而不是ROCK抑制剂。在第4、8、12和16天时使用血球计对细胞数计数以测量在96孔板上接种的细胞数的变化。
图2显示了当在存在Y-27632、FASUDIL和SR3677的情况下培养衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)时细胞数目的图。参见图2，对细胞添加5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677，并在5％CO2培养箱中于37℃培养细胞。每4天对细胞添加分别补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基。在图2中，从12个重复测定数据(n＝12)。如图2中例示的，当在存在这些Rho激酶抑制剂的情况下培养16天时，细胞数目相比于阴性对照组(DMSO)的显著增加。在图2中，*指示统计学显著的(p<0.05)。在图2中，在阴性对照组中向培养基添加0.05(v/v)％的DMSO。
另外，在与上文所述相同的培养基中和相同条件下在存在0.05(v/v)％的DMSO和Y-27632(5μM)情况下培养衰老的成纤维细胞(37次细胞传代后)后，使用显微镜来观察细胞的形状。图3是显微镜图像，其例示了在存在Y-27632的情况下培养4周的衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)的细胞形状。如图3中例示的，在存在Y-27632(b)的情况下培养的细胞数目大于对照组的(DMSO,a)，且在存在Y-27632(b)的情况下培养的细胞具有一般见于年轻细胞中的纺锤形状(比例尺20μm)。
在分别补充有5μM的Y-27632(A),5μM的FASUDIL(B)和0.5μM的SR3677(C)的培养基中在5％CO2培养箱中于37℃培养衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)达4周。每4天用分别补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基来交换培养基。使用MuseTMCellCycle试剂盒(MERCKMillipore,MCH100106)依照制造商手册来测量细胞周期。使用MuseTMCellAnalyzer(MERCKMillipore)对细胞照射具有488nm波长的光并测量520nm处的光发射。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。以相同的方式制备对照组，只不过对其添加0.05(v/v)％的DMSO。
图4是展现Y-27632和FASUDIL对衰老成纤维细胞(37次细胞传代后)的细胞周期的影响的图。如图4中例示的，与对照组相比时在存在Y-27632和FASUDIL的情况下G0/G1期的细胞数目低于在S和G2/M期的细胞数目。原因是在存在Y-27632和FASUDIL的情况下，细胞周期进入实现细胞增殖的S和G2/M期，由此增强细胞增殖的能力。
另外，实施软琼脂测定法来鉴定通过培养增殖的细胞是否涉及异常增殖如癌细胞增殖。首先，将补充有10％FBS的DMEM与1.6％琼脂以1:1的比率混合以制备浓度为0.8％的琼脂溶液，并将琼脂溶液添加至6孔板。将2,500个细胞添加至分别补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的培养基，并将细胞和培养基的混合物与0.8％琼脂溶液混合至琼脂浓度为0.4％。然后，将最终混合物涂布到施加在孔板上的0.8％琼脂溶液上。细胞在5％CO2培养箱中在37℃培养4周。每4天向其添加分别补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的培养基以防止琼脂干燥。作为对照组，使用人胚胎肾293T细胞系(CRL-11268TM)。另外，以相同的方式制备阴性对照组，只不过使用0.05(v/v)％的DMSO。
图5是例示在存在Rho激酶抑制剂的情况下在含琼脂培养基中培养成纤维细胞(37次细胞传代后)的结果的图。如图5中例示的，尽管作为癌细胞的293T细胞形成集落，但其他细胞并未形成集落。在图5的“a”中，选择一部分(由虚线矩形标示出)，并在a1中放大用于对集落的更近距检查。在图5的a1中，选择一部分(由虚线矩形标示出)，并在a2中放大用于对集落的近距的多的检查(比例尺20μm)。在图5中，成纤维细胞37指传代培养37代的成纤维细胞。
实施例2：Y-27632、Fasudil和SR3677对衰老的成纤维细胞(37次细胞传代后)恢复为年轻细胞的作用
鉴定Rho激酶抑制剂对衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)表达的影响，其通过用β-半乳糖苷酶染色试剂盒(CellSignalingTechnology,#9860,Beverly,MA)处理增殖的细胞。按照制造商方案将具有pH6.0的生色底物(X-gal)在37℃过夜温育。
图6A,6B,7A,7B,8A和8B是例示了在存在Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成纤维细胞(37次细胞传代后)的SA-β-半乳糖苷酶活性(a和b)的图，和例示了具有该活性的细胞的百分数的图(图6B,7B和8B)。在图6A中，a,a1和a2显示使用DMSO的阴性对照组，而b,b1和b2显示用5μMY-27632处理的细胞。在“a”中，选择一部分(由虚线矩形标示出)，并在a1中放大以对染色细胞进行更近距检查。在a1中，选择一部分(由虚线矩形标示出)，并在a2中放大以对集落进行更近距检查(比例尺20μm)。
如图6B,7B和8B中例示的，在存在Rho激酶抑制剂的情况下，其中表达β-半乳糖苷酶的细胞数目相比于对照组(用0.05(v/v)％的DMSO处理)显著降低。在图6B,7B和8B中，*指示统计学显著的(p<0.05)。
另外，测量培养的细胞中累积的脂褐素量。将衰老的细胞(37次细胞传代后)在存在5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的情况下在5％CO2培养箱中于37℃培养4周。每4天用补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基来交换培养基。由于脂褐素具有自发荧光特征，通过使用FACSCaliber(BecktonDickinson)对细胞照射具有488nm波长的光并测量520nm处的光发射。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。图9展现了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5uM),Fasudil(5uM)和SR3677(0.5uM)的情况下培养的成纤维细胞(37次细胞传代后)中脂褐素的量。如图9中例示的，在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下，细胞中的脂褐素量相比于对照组显著降低。在图9中，*指示统计学显著的(p<0.05)。
另外，通过测量本领域中公知的反应性氧种类(ROS)和线粒体膜电位来鉴定线粒体的损伤。使用0.2μMMitoSOX(Invitrogen,M3608)依照制造商手册来测量ROS。使用FACSCaliber(BecktonDickinson)对细胞照射具有520nm波长的光并测量580nm处的光发射。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。如图10中例示的，相比于对照组，在存在Y-27632、FASUDIL和SR3677的情况下，ROS在细胞中显著降低。在图10中，*指示统计学显著的(p<0.05)。
使用用于流式细胞术的MitoProbeTMJC-1测定试剂盒(Lifetechnologies,T3168)依照制造商手册来测量线粒体膜电位。JC-1以电位依赖性方式在线粒体中积累，且该积累通过从绿色(约529nm)至红色(约590nm)的荧光发射迁移鉴定。因此，通过红/绿荧光比的降低来鉴定线粒体去极化。通过使用FACSCaliber(BecktonDickinson)在488nm处激发，和使用流式细胞器通过使用530/30nm和585/42nm带通滤光片(bandpassfilter)来测量线粒体膜电位(Themitochondrialmembranepotentialsweremeasuredbyexcitationat488nmusingaFACSCaliber(BecktonDickinson)andusingaflowcytometerbyusing530/30nmand585/42nmbandpassfilters)。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。图11的图显示线粒体的作用电位。如图11中例示的，线粒体的作用电位在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下相比于对照组显著增加。在图11中，*指示统计学显著的(p<0.05)。在图11中，垂直轴是线粒体膜电位。“MMP”指线粒体膜电位。
参照图10和11，确认在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下线粒体活性得到增强。
通过DNA彗星测定法鉴定由Rho激酶抑制剂所致的衰老细胞中DNA损伤的恢复程度。该方法通过检测被紫外线(UV)辐射切割的DNA级份(fraction)来进行。该方法基于凝胶电泳。在凝胶电泳期间，受损的DNA比正常DNA迁移得更远，形成类似彗星尾巴的尾部。然后，将载玻片用SYBRGreen染色，并使用荧光显微镜测量DNA级份的尾部的长度来鉴定DNA损伤的程度。
图12的图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成纤维细胞(38次细胞传代后)中DNA损伤的程度，其通过指示DNA损伤程度的DNA彗星测定法来测量。在图12中，将衰老细胞(38次细胞传代后)在补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的培养基中在5％CO2培养箱中于37℃培养4周。每4天用补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基来交换培养基。还有，以与上文所述相同的方式制备阴性对照组，只不过一个阴性对照组制备为无处理而另一个用0.05(v/v)％的DMSO处理。将已经历17次传代且具有4至5天的细胞倍增时间的细胞用作年轻细胞。如图12中例示的，尾矩(TailMoment)在年轻细胞中更短，而尾矩在阴性对照组的衰老细胞中增加。如此，确认了DNA损伤程度在衰老细胞中增加。在彗星测定法中，尾矩定义为尾部的长度乘以尾部中含有的总DNA分数。亦即，尾矩是在凝胶电泳期间迁移的尾部的长度。当尾部的长度减少时，DNA损伤的程度降低。然而，当与对照组相比时，DNA损伤在存在Y-27632、FASUDIL和SR3677的情况下培养的细胞中有相当大地恢复，且该细胞恢复为年轻细胞。在图12中，**指示统计学显著的(p<0.01)。在图12中，“成纤维细胞p17”和“成纤维细胞p38”分别指传代培养17代的成纤维细胞和传代培养38代的成纤维细胞。
实施例3：Y-27632、Fasudil和SR3677对衰老的成肌细胞恢复的作用
将成肌细胞细胞系(人骨骼肌成肌细胞，LonzaCC-2580LOT:0000387550)在包含SkGMTM-2SingleQuotsTMKit(LonzaCC-3244)的SkBMTM-2BasalMedia(LonzaCC-3246)中在包被有I型胶原(GreinerBioOne,658950)的板上在5％CO2培养箱中于37℃培养。当细胞在板中约85％汇合时启动传代培养。早期传代培养以1:4的分流比实施，后面的传代培养则以1:2的分流比实施。当细胞倍增时间为14天时，细胞被视为衰老的成肌细胞(细胞传代数10至12)。
将衰老的细胞以2,000个细胞/孔的浓度接种于包被有I型胶原(GreinerBioOne,657950)的6孔板的每个孔上。在存在5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的情况下在5％CO2培养箱中于37℃培养衰老的成肌细胞(11代)达4周。每4天用补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基来交换培养基。以相同的方式制备阴性对照组，只不过使用0.05(v/v)％的DMSO。
图13的图例示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成肌细胞(11代)中的细胞形状变化。
图13例示了在存在5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的情况下培养的细胞的显微镜图像。在图13的“a”中，选择一部分并通过由虚线矩形标示出，在a1中放大该选择部分以对培养的细胞进行更近距检查。在图13的a1中，选择一部分(由虚线矩形标示出)，在a2中放大以对培养的细胞进行更近距检查(比例尺20μm)。如图13中例示的，在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下培养的细胞数目大于对照组(DMSO)的，且在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下培养的细胞具有一般见于年轻细胞中的纺锤形状(比例尺20μm)。
另外，测量培养的细胞中累积的脂褐素量。将衰老的成肌细胞(11代细胞)在存在5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的情况下在5％CO2培养箱中于37℃培养4周。每4天用补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基来交换培养基。由于脂褐素具有自发荧光特征，通过使用FACSCaliber(BecktonDickinson)对细胞照射具有488nm波长的光并测量520nm处的光发射。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。图14的图展现了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5uM),Fasudil(5uM)和SR3677(0.5uM)的情况下培养的成肌细胞(11代细胞)中脂褐素的量。如图14中例示的，在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下培养的细胞中的脂褐素量相比于对照组显著降低。在图14中，*指示统计学显著的(p<0.05)。
另外，通过测量本领域中公知的反应性氧种类(ROS)和线粒体膜电位来鉴定线粒体的损伤。
使用0.2μMMitoSOX(Invitrogen,M3608)依照制造商手册来测量ROS。使用FACSCaliber(BecktonDickinson)对细胞照射具有520nm波长的光并测量580nm处的光发射。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。
图15展现了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的成肌细胞(11代细胞)中的反应性氧种类。如图15中例示的，相比于对照组，ROS在存在Y-27632、FASUDIL和SR3677的情况下培养的细胞中显著降低。在图15中，*指示统计学显著的(p<0.05)。
使用用于流式细胞术的MitoProbeTMJC-1测定试剂盒(Lifetechnologies,T3168)依照制造商手册来测量线粒体膜电位。JC-1以电位依赖性方式在线粒体中积累，且该积累通过从绿色(约529nm)至红色(约590nm)的荧光发射迁移鉴定。因此，通过红/绿荧光比的降低来鉴定线粒体去极化。通过使用FACSCaliber(BecktonDickinson)在488nm处激发，和使用流式细胞器通过使用530/30nm和585/42nm带通滤光片来测量线粒体膜电位。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。
图16的图显示线粒体的作用电位。如图16中例示的，线粒体的作用电位在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下相比于对照组显著增加。在图16中，*指示统计学显著的(p<0.05)。参照图15和16，确认了线粒体的活性在存在Y-27632、FASUDIL和SR3677的情况下得到增强。
实施例4：Y-27632、Fasudil和SR3677对衰老的早老性细胞恢复的作用
在补充有10％胎牛血清(FBS)和100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素(两种抗生素购自Gibro-BRL和GrandIsland,NY)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中在5％CO2培养箱中于37℃培养早老性成纤维细胞(哈-格二氏早老性综合征皮肤成纤维细胞，CoriellCellRepositories，AG03198B)。当细胞在板中约85％汇合时启动传代培养。早期传代培养以1:4的分流比实施，后面的传代培养则以1:2的分流比实施。当细胞倍增时间为14天时，细胞被视为衰老的早老性成纤维细胞(progeriafibroblast)(细胞传代数16至17)。
将衰老的早老性成纤维细胞(细胞传代数17)以2,000个细胞/孔的浓度在6孔板的每个孔上接种，并在存在5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的情况下在5％CO2培养箱中于37℃培养4周。每4天用补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基来交换培养基。另外，以相同的方式制备阴性对照组，只不过使用0.05(v/v)％的DMSO。
图17的图例示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(17代)中的细胞形状变化。在图17和图22中，“早老性成纤维细胞p17”和“早老性成纤维细胞p11”分别指传代培养进行17次细胞传代的早老性成纤维细胞和传代培养进行11次细胞传代的早老性成纤维细胞。
图17例示了在存在5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的情况下培养的细胞的显微镜图像。在图17的“a”中，选择一部分(由虚线矩形标示出)，在a1中放大该选择部分以对培养的细胞进行更近距检查。在图17的a1中，选择a1的一部分(由虚线矩形标示出)，在a2中放大以对培养的细胞进行近得多的检查(比例尺20μm)。如图17中例示的，在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下培养的细胞数目大于对照组(DMSO)的，且在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下培养的细胞具有一般见于年轻细胞中的纺锤形状(比例尺20μm)。
另外，测量培养的细胞中累积的脂褐素量。将衰老的早老性成纤维细胞(17代)在存在5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的情况下在5％CO2培养箱中于37℃培养4周。每4天用补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基来交换培养基。由于脂褐素具有自发荧光特征，通过使用FACSCaliber(BecktonDickinson)对细胞照射具有488nm波长的光并测量520nm处的光发射。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。图18的图展现了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5uM),Fasudil(5uM)和SR3677(0.5uM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(17代)中脂褐素的量。如图18中例示的，在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下培养的细胞中的脂褐素量相比于对照组显著降低。在图18中，*指示统计学显著的(p<0.05)。
另外，通过测量本领域中公知的反应性氧种类(ROS)和线粒体膜电位来鉴定线粒体的损伤。使用0.2μMMitoSOX(Invitrogen,M3608)依照制造商手册来测量ROS。使用FACSCaliber(BecktonDickinson)对细胞照射具有520nm波长的光并测量580nm处的光发射。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。图19的图展现了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(细胞传代数17)中的反应性氧种类。如图19中例示的，相比于对照组，ROS在存在Y-27632、FASUDIL和SR3677的情况下培养的细胞中显著降低。在图19中，*指示统计学显著的(p<0.05)。
使用用于流式细胞术的MitoProbeTMJC-1测定试剂盒(Lifetechnologies,T3168)依照制造商手册来测量线粒体膜电位。JC-1以电位依赖性方式在线粒体中积累，且该积累通过从绿色(约529nm)至红色(约590nm)的荧光发射迁移鉴定。因此，通过红/绿荧光比的降低来鉴定线粒体去极化。通过使用FACSCaliber(BecktonDickinson)在488nm处激发，和使用流式细胞器通过使用530/30nm和585/42nm带通滤光片来测量线粒体膜电位。使用CellQuest3.2软件(BecktonDickinson)分析结果。图20显示线粒体的作用电位。如图20中例示的，线粒体的作用电位在存在Y-27632、Fasudil和SR3677的情况下相比于对照组显著增加。在图20中，*指示统计学显著的(p<0.05)。参照图19和20，确认了线粒体的活性在存在Y-27632、FASUDIL和SR3677的情况下得到增强。
通过DNA彗星测定法鉴定由Rho激酶抑制剂所致的衰老的早老性成纤维细胞中DNA损伤的恢复程度。该方法通过检测被紫外线(UV)辐射切割的DNA级份来进行。该方法基于凝胶电泳。在凝胶电泳期间，受损的DNA比正常DNA迁移得更远，形成类似彗星尾巴的尾部。然后，将载玻片用SYBRGreen染色，并使用荧光显微镜测量DNA级份的尾部的长度来鉴定DNA损伤的程度。
图21的图显示了在存在Rho激酶抑制剂Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的早老性成纤维细胞(细胞传代数17)中DNA损伤的程度，其通过指示DNA损伤程度的DNA彗星测定法来测量。在图21中，将衰老的早老性细胞(细胞传代数17)在补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的培养基中在5％CO2培养箱中于37℃培养4周。每4天用补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基来交换培养基。将具有6至7天的细胞倍增时间的细胞用作年轻细胞。以相同的方式制备阴性对照组，只不过使用DMSO。如图21中例示的，尾矩在年轻细胞中更短，而尾矩在阴性对照组的衰老细胞中增加。如此，确认了DNA损伤程度在衰老细胞中增加。然而，确认了当与对照组(DMSO)相比时，DNA损伤在存在Y-27632、FASUDIL和SR3677的情况下培养的细胞中有相当大地降低。在图21中，*指示统计学显著的(p<0.05)。
鉴定Rho激酶抑制剂对衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)表达的影响，其通过用β-半乳糖苷酶染色试剂盒(CellSignalingTechnology,#9860,Beverly,MA)处理增殖的细胞。按照制造商方案将具有pH6.0的生色底物(X-gal)在37℃过夜温育。
图22A和22B是例示了在存在Y-27632(5μM)、Fasudil(5μM)和SR3677(0.5μM)的情况下培养的细胞的SA-β-半乳糖苷酶活性(a,b,c,d和e)的图，和展现了具有该SA-β-半乳糖苷酶活性的细胞的百分数的图(图22B)。在图22A中，将衰老的早老性成纤维细胞(细胞传代数17)在存在5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的情况下在5％CO2培养箱中于37℃培养4周。每4天用补充有5μM的Y-27632、5μM的FASUDIL和0.5μM的SR3677的新培养基来交换培养基。将已经历11代细胞且具有6至7天的细胞倍增时间的细胞用作年轻细胞。另外，以相同的方式制备阴性对照组，只不过使用DMSO。在图22A的“a”中，选择一部分(由虚线矩形标示出)，并在a1中放大以对染色细胞进行更近距检查。在图22A的a1中，选择一部分(由虚线矩形标示出)，并在a2中放大以对染色细胞进行近距得多的检查(比例尺20μm)。如图22B中例示的，尽管存在其中表达β-半乳糖苷酶的少数年轻细胞，但其中表达β-半乳糖苷酶的细胞数目在阴性对照组(DMSO)中显著增加。在存在Rho激酶抑制剂的情况下，其中表达β-半乳糖苷酶的细胞数目相比于阴性对照组(DMSO)显著降低。在图22B中，*指示统计学显著的(p<0.05)。
实施例5：ROCK抑制对年老小鼠中伤口愈合的体内作用
(5.1)材料和方法
伤口愈合测定法、免疫组织化学和三色染色
为了进一步测试ROCK抑制剂是否能促进年老(19月龄)雄性小鼠(C57BL/6J小鼠)中的皮肤伤口愈合，在小鼠的背部皮肤上创建4个全厚度钻取活组织检查伤口(直径8mm)(4个伤口位点/小鼠，5只小鼠/组)，每天对伤口施用0.5mL在30％Pluronic凝胶中的10μMY-27632(PluronicF-127Sigma,P2443-1KG)，然后用Telfa纱布(KendallHealthCare,Mansfield,MA,USA)敷盖伤口。DMSO被用作对照。所有动物研究均由SKKU医学院的国际动物保护和使用委员会(InternationalAnimalCareandUseCommitteeofSKKUSchoolofMedicine)(SUSM)审查和批准。SUSM是国际实验动物评估和认可委员会(AssociationforAssessmentandAccreditationofLaboratoryAnimalCareinternational)认可的机构，且遵循实验室动物研究所指南(InstituteforLaboratoryAnimalResearchguide)。对伤口照相10天。在5μm石蜡包埋的切片上实施免疫组织化学分析，如先前描述的(Lin等,2004.DevelopmentalBiology270,474-486)。用于免疫组织化学的一抗是小鼠抗-α-平滑肌肌动蛋白(Sigma,F3777-2ML,1:500)，和小鼠抗-PCNA(SantaCruzBiotechnology,SC-56,1:500)。用于免疫组织化学的二抗是EnVisionTMDetectionSystem(DAKO,K5007)。依照制造商用法说明(PolysciencesInc.,WarringtonPA,USA)实施Masson的三色染色。
(5.2)Y-27632处理在伤口愈合中起着重要作用
伤口愈合的衰老(aging)依赖性损伤通过降低运动性和导致慢性疼痛不利地影响生活质量。对Y-27632在年老小鼠中的伤口愈合效果知之甚少。本发明人检查了Y-27632对年老小鼠(19月龄)中伤口愈合的效果。对时间匹配的DMSO处理对Y-27632处理伤口的肉眼分析显示伤口愈合过程相比于对照在早期时间点(第3天)显著加速(图23:**P<0.01)。图23显示在施用Y-27632或作为对照的DMSO后年老小鼠的时间匹配的伤口大小和伤口外观。依照图23，在第10天，伤口愈合在用Y-27632处理的伤口中近乎完全，而用DMSO处理的伤口仍显示残余疤痂。
实施免疫组织化学分析来研究伤口愈合过程的根本性机制。将伤口区域的切片用针对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的抗体标记，该α-平滑肌肌动蛋白是在纤维化期间表达的收缩性成肌纤维细胞的标志物。α-SMA免疫反应性在对照动物的肉芽组织中较高，而在用Y-27632处理的组中，信号在真皮中弥散且与胶原纤维的外观相关；强表皮信号与成肌纤维细胞迁移到表皮区域中相关(图24)。
图24代表免疫组织化学实验结果，其显示Y-27632处理在年老小鼠(19月龄)的伤口愈合中起着重要作用。对伤口组织切片还进行Masson的三色染色以评估重塑组织的横截面区域中的胶原沉积。该染色在DMSO处理组的肉芽组织中是弥散的；然而在用Y-27632处理的小鼠中，染色在真皮区域较强且与伤口愈合的成熟/重塑阶段相关(图24)。
相对于DMSO处理，通过Y-27632增加胶原厚度(图25；**P<0.01)。另外，尽管用DMSO处理的伤口显示在肉芽组织中的选择性增殖，如由增殖细胞核抗原(PCNA)免疫标记测定的，但在用Y-27632处理的伤口的表皮的上基部区域(suprabasalarea)观察到增殖(图24)，在Y-27632处理组的表皮中比对照组具有更高的PCNA阳性细胞数目(图26；**P<0.01)。
图25代表以下实验结果，其显示伤口重塑组织的横截面面积中的胶原沉积的厚度揭示在年老小鼠的用Y-27632处理的伤口中相比于用DMSO处理的伤口中更密集和更厚的胶原。
图26代表以下实验结果，其显示年老小鼠的用Y-27632处理的伤口相比于用DMSO处理的伤口的表皮中的PCNA+细胞。
应理解本文中描述的例示性实施方案应仅视为描述性意义而不是用于限制目的。对每个例示性实施方案内的特征或方面的描述应通常视为可用于其他例示性实施方案中的其他类似的特征或方面。
尽管已参照附图描述了一个或多个例示性实施方案，但本领域普通技术人员将理解可在其中进行形式和细节的多种变化而不背离本发明的精神和范围，如由所附权利要求限定的。
本文中引用的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请和专利均通过提述并入本文，其程度如同每个参考文献均分别且特定地指示为通过提述纳入且在本文中完整列出的。
除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，术语“一个/一种”和“该”和“至少一个/一种”及类似指代物在描述本发明的背景中(尤其在所附权利要求的背景中)的使用应理解为涵盖单数和复数。除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，前有一列的一个或多个项的术语“至少一个/一种”的使用(例如“A和B中的至少一个/一种”)应理解为意指选自所列项的一项(A或B)，或两项或更多所列项的任意组合(A和B)。除非另外记载，术语“包含/包括”、“具有”和“含有”应理解为开放端术语(即意指“包括但不限于”)。除非另外指示，本文中值的范围的记载仅意图作为分别提述落入该范围内的每个单独值的速记方法，且每个单独的值均纳入说明书中，如其在本文中分别记载的。除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，本文中描述的所有方法可以任何适宜的次序进行。除非另外主张，本文中提供的任何和所有例子或例示性语言(例如“如”)的使用仅意图更好地说明本发明，而不对本发明的范围施加限制。说明书的任何语言均不应理解为指示任何未主张的要素为对本发明实践必要的。
在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明最佳的模式。在阅读前述说明后，那些优选实施方案的变体对于本领域普通技术人员可能是明显的。发明人预期熟练的技术人员如适宜地采用这类变体，且发明人意图本发明以本文中具体描述的以外的方式实践。因此，本发明包括所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物，如适用法律所允许的。而且，除非本文中另外指示或与上下文清楚地冲突，上述要素在其所有可能变体中的任意组合均涵盖在本发明中。

Claims (19)

1.一种用于在哺乳动物中治疗与细胞中的脂褐素积累有关的症状的组合物，所述组合物包含Rho激酶抑制剂作为活性成分。
2.权利要求1的组合物，其中所述细胞是具有脂褐素积累的皮肤组织细胞、肌肉组织细胞或神经组织细胞。
3.权利要求2的组合物，其中所述哺乳动物是人。
4.权利要求2的组合物，其中所述Rho激酶抑制剂是(1R,4R)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷羧酰胺(Y-27632)、N-[2-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基]-2,3-二氢-1,4-苯并二噁英-2-羧酰胺](SR3677)、5-(1,4-二氮杂环庚烷-1-磺酰)异喹啉(Fasudil)、其药学可接受的盐、其立体异构体、或其组合。
5.权利要求2的组合物，其中所述与脂褐素积累有关的症状是神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、年龄相关的黄斑变性、心脏的褐色萎缩、肢端肥大症、去神经萎缩、脂质肌病、慢性阻塞性肺病(COPD)、或其组合。
6.一种用于在体外或在哺乳动物中减少细胞中脂褐素积累的组合物，所述组合物包含Rho激酶抑制剂作为活性成分。
7.一种用于刺激人细胞的增殖的组合物，所述组合物包含Rho激酶抑制剂作为活性成分。
8.权利要求7的组合物，其中所述人细胞是成纤维细胞、肌细胞或神经细胞。
9.权利要求7的组合物，其中所述组合物用于治疗皮肤皱纹、降低的修复伤口的能力、肌肉衰减症(sarcopenia)、哈-格二氏早老性综合征(Hutchinson-Gilfordprogeriasyndrome)、或其组合。
10.一种用于在体外或在哺乳动物中减少细胞中脂褐素积累的方法，所述方法包括在体外或在哺乳动物中对细胞施用有效量的Rho激酶抑制剂以减少脂褐素积累。
11.一种在哺乳动物中治疗与细胞中脂褐素积累有关的症状的方法，所述方法包括通过对所述哺乳动物施用有效量的Rho激酶抑制剂来治疗与脂褐素积累有关的症状。
12.权利要求11的方法，其中施用所述Rho激酶抑制剂通过将Rho激酶抑制剂局部施用至包含具有脂褐素积累的细胞的组织来进行。
13.权利要求11的方法，其中将所述Rho激酶抑制剂局部施用至包含具有脂褐素积累的细胞的皮肤组织、肌肉组织或神经组织。
14.权利要求11的方法，其中所述哺乳动物是人。
15.权利要求10或11的方法，其中所述Rho激酶抑制剂是(1R,4R)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷羧酰胺(Y-27632)、N-[2-[2-(二甲基氨基)乙氧基]-4-(1H-吡唑-4-基)苯基]-2,3-二氢-1,4-苯并二噁英-2-羧酰胺](SR3677)、5-(1,4-二氮杂环庚烷-1-磺酰)异喹啉(Fasudil)、其药学可接受的盐、其立体异构体、或其组合。
16.权利要求10或11的方法，其中所述与脂褐素积累有关的症状是神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、年龄相关的黄斑变性、心脏的褐色萎缩、肢端肥大症、去神经萎缩、脂质肌病、慢性阻塞性肺病(COPD)、或其组合。
17.一种刺激人细胞增殖的方法，包括：
将所述人细胞暴露于有效量的Rho激酶抑制剂以刺激所述人细胞，其中所述人细胞是成纤维细胞、肌细胞或神经细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述暴露包括将有效量的Rho激酶抑制剂施用给人体部位，其中所述部位是皮肤组织、肌肉组织或神经组织。
19.权利要求17的方法，其中所述方法用于治疗皮肤皱纹、降低的修复伤口的能力、肌肉衰减症、哈-格二氏早老性综合征、或其组合。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160049435A (ko) 2014-10-27 2016-05-09 삼성전자주식회사 Atm 저해제를 포함하는 세포의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도
EP3112466A1 (en) 2015-07-01 2017-01-04 Samsung Electronics Co., Ltd. Composition for reducing cellular senescence level including activity inhibitor inhibiting dcun1d3 activity or expression inhibitor inhibiting expression of dcun1d3-encoding gene and use thereof
KR20210082186A (ko) * 2018-10-19 2021-07-02 오하이오 스테이트 이노베이션 파운데이션 폐 염증 요법을 위한 나노담체
KR20220147278A (ko) 2021-04-27 2022-11-03 (주)아모레퍼시픽 리포푸신 축적 억제 또는 리포푸신 제거용 조성물
WO2023182856A1 (ko) * 2022-03-24 2023-09-28 서울대학교산학협력단 로-키나제 억제제를 포함하는 켈로이드 등 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093773A1 (en) * 2012-12-14 2014-06-19 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and assays relating to macrophage differentiation
WO2014160409A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rbp4 antagonists for the treatment of age-related macular degeneration and stargardt disease

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10153605A1 (de) 2001-11-02 2003-05-28 Morphochem Ag Komb Chemie Verwendung von Inhibitoren der Rho-Kinasen zur Stimulation des Nervenwachstums, zur Inhibition der Narbengewebsbildung und/oder Reduktion eines Sekundärschadens
US20040028716A1 (en) 2002-06-14 2004-02-12 Marks Andrew R. Use of Y-27632 as an agent to prevent restenosis after coronary artery angioplasty/stent implantation
US7838531B2 (en) 2002-10-18 2010-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Farnesyltransferase inhibitors for treatment of laminopathies, cellular aging and atherosclerosis
US7803559B1 (en) 2003-08-08 2010-09-28 The Regents Of The University Of Ca Protein aggregation regulators
US20090169585A1 (en) 2003-10-23 2009-07-02 Resveratrol Partners, Llc Resveratrol-Containing Compositions And Their Use In Modulating Gene Product Concentration Or Activity
JP2005206485A (ja) 2004-01-21 2005-08-04 Asahi Kasei Pharma Kk イソキノリンスルホンアミド誘導体を含有する医薬
US20050222130A1 (en) 2004-04-02 2005-10-06 L'oreal Inhibitors of RhoA kinase production/activation for relaxing the features of and/or for decontracting the skin
JP2006327942A (ja) 2005-05-23 2006-12-07 Chiba Univ 軸索再生剤
WO2007002528A1 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Yale University Anti-aging micrornas
UY29774A1 (es) 2005-08-31 2007-03-30 Kudos Pharm Ltd Inhibidor de atm
BRPI0504199B8 (pt) 2005-09-08 2021-05-25 Ana Marisa Chudzinski Tavassi composições farmacêuticas baseadas em lopap e usos das ditas composições
EP2111863B1 (en) 2005-10-26 2012-03-28 Asahi Kasei Pharma Corporation Fasudil in combination with bosentan for the treament of pulmonary arterial hypertension
CN101089000B (zh) * 2006-06-16 2011-01-05 北京大学 螺环哌嗪季铵盐类化合物及其制备方法和应用
WO2008019395A2 (en) * 2006-08-10 2008-02-14 Translational Genomics Research Institute Compounds for improving learning and memory
US20090142839A1 (en) 2007-05-04 2009-06-04 Shiloh Laboratories, Inc. Inducing Premature Senescence to Stabilize Stem Cell Feeder Layer Cells
WO2009035673A1 (en) * 2007-09-12 2009-03-19 Trustees Of Columbia University In The City Of Newyork Compositions and methods for treating macular degeneration
FR2927809B1 (fr) 2008-02-26 2011-01-14 Tri Inov Nouvelle utilisation de n-acetyl-taurinate de zinc.
EP2317849A4 (en) 2008-06-26 2011-11-02 Inspire Pharmaceuticals Inc PROCESS FOR THE TREATMENT OF LUNG DISEASES WITH RHO KINASE INHIBITOR COMPOUNDS
EP2364698A2 (en) 2008-07-25 2011-09-14 SNU R&DB Foundation Composition for control of aging and / or extension of life, containing dapsone as active ingredient
US8637310B2 (en) 2008-12-05 2014-01-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of a rock inhibitor to sustain primary human keratinocytes in a proliferative state
WO2010135004A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Enzymatic degradation of a2e and other bisretinoid compounds of rpe lipofuscin
US20120010196A1 (en) 2010-04-02 2012-01-12 Qin Quingyu Methods of treating neurodegenerative disorders and diseases
WO2011149012A1 (ja) 2010-05-27 2011-12-01 参天製薬株式会社 イソキノリンスルホニル誘導体を有効成分として含有する網脈絡膜変性疾患の予防または治療剤、網脈絡膜変性疾患の予防または治療方法、イソキノリンスルホニル誘導体またはその医薬的に許容される塩、ならびにその使用
US20120058088A1 (en) 2010-06-28 2012-03-08 Resveratrol Partners, Llc Resveratrol-Containing Compositions And Methods Of Use
WO2012024611A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Natural Alternatives International, Inc. Methods of treating sarcopenia and frailty
US9279106B2 (en) 2010-11-12 2016-03-08 Georgetown University Immortalization of epithelial cells and methods of use
KR101293637B1 (ko) 2011-01-14 2013-08-13 서울대학교병원 줄기세포의 부유배양용 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093773A1 (en) * 2012-12-14 2014-06-19 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and assays relating to macrophage differentiation
WO2014160409A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rbp4 antagonists for the treatment of age-related macular degeneration and stargardt disease

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MELISSA BOWERMAN等: "Fasudil improves survival and promotes skeletal muscle development in a mouse model of spinal muscular atrophy", 《BMC MEDICINE》 *

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Publication number Publication date
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