CN115029438A - Rarres2基因在乳腺癌脑转移诊疗中的应用 - Google Patents

Rarres2基因在乳腺癌脑转移诊疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RARRES2基因在乳腺癌脑转移诊疗中的应用。我们首先通过挖掘GEO、MET500等公共数据库来比较人乳腺癌原发肿瘤与脑转移瘤之间的基因表达差异，筛选比对得到RARRES2基因，并对比了RARRES2基因在乳腺癌骨转移、肺转移和肝转移中的表达。其次对乳腺癌患者脑转移瘤进行了单细胞转录组测序。结果显示，RARRES2在乳腺癌脑转移的表达水平显著低于原发肿瘤，但RARRES2在乳腺癌骨、肺和肝转移中的表达与原发肿瘤没有显著差异，提示其与乳腺癌脑转移特异相关。通过构建RARRES2过表达和敲降人乳腺癌脑转移细胞(MDA‑MB‑231)系，发现RARRES2过表达显著抑制该细胞增殖和侵袭。通过构建荧光素酶标记的RARRES2过表达乳腺癌脑转移小鼠模型，发现RARRES2过表达可显著抑制乳腺癌细胞在脑中的增殖。

Description

RARRES2基因在乳腺癌脑转移诊疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及RARRES2基因在乳腺癌脑转移的诊断和治疗中的应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。根据国家癌症中心发布的最新版2016年中国恶性肿瘤流行情况分析，乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤首位，死亡率居第4位，严重危害女性健康。在转移性乳腺癌患者中，颅脑是常见的转移部位之一，整体发生率约14％。其中人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)阳性乳腺癌脑转移发生率可高达35～50％，而三阴性乳腺癌脑转移发生率也可达到46％。乳腺癌脑转移相比其他部位转移来说，患者生存期更短，预后更差，1年内死亡率高达80％。由于其机制尚不明确，且缺乏有效的针对性治疗手段，是当前乳腺癌治疗领域的难题，因此亟待阐明脑转移的机制以提供新的干预策略。
RARRES2(retinoic acid receptor responder 2)视黄酸受体反应蛋白2，也被称为TIG2或chemerin，是一个多功能细胞因子，通过激活趋化因子样受体1(CMKLR1)调节脂肪生成、代谢和炎症，可以作为CMKLR2的配体，也可与C-C趋化因子受体样2(CCRL2)结合，但其亲和力低于与CMKLR1或CMKLR2的亲和力。RARRES2同时可作为促进炎性反应脂肪因子，导致促进炎性和促糖尿病性脂肪因子分泌增加。近年来，由于其受体CMKLR1被发现在多种肿瘤细胞表面表达，RARRES2在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到关注。RARRES2在乳腺癌、黑色素瘤、***癌组织中，与癌旁组织相比常表现为敲降。既往研究发现，在黑色素瘤的肿瘤微环境中外源性过表达RARRES2可显著抑制肿瘤生长，在非小细胞肺癌和肝细胞肝癌中也观察到类似现象。同时，RARRES2在急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌等肿瘤中，也被发现具有潜在的诊断和预后价值。
发明内容
为了解决现有的临床瓶颈和技术存在的问题，我们首先通过利用基因表达综合数据库(gene Expression Omnibus，GEO)MET500等公共数据库，分析和比较人乳腺癌原发肿瘤与乳腺癌脑转移、乳腺癌骨转移、乳腺癌肺转移和乳腺癌肝转移之间的基因表达差异，其次对乳腺癌患者脑转移肿瘤组织进行了单细胞转录组测序，分析和比较结果显示，RARRES2在乳腺癌脑转移的表达水平显著低于在乳腺癌原发肿瘤中的表达水平、而RARRES2在乳腺癌骨转移、乳腺癌肺转移和乳腺癌肝转移中的表达水平与乳腺癌原发肿瘤中没有显著差异，提示RARRES2与乳腺癌脑转移特异相关。通过构建过表达和敲降RARRES2的人乳腺癌脑转移潜能细胞株(MDA-MB-231)，发现RARRES2过表达显著抑制MDA-MB-231细胞增殖和侵袭。通过构建荧光素酶标记的RARRES2过表达乳腺癌脑转移瘤小鼠模型，发现RARRES2过表达可显著抑制乳腺癌脑转移瘤在脑中的增殖。
本发明的目的在于提供一种用于乳腺癌脑转移诊断或治疗的产品，所述产品包括用于检测生物标志物表达水平的试剂，所述生物标志物是RARRES2。
本发明采用了如下技术方案：
本发明一方面提供了检测RARRES2基因的试剂在制备诊断肿瘤的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括特异性识别RARRES2基因的寡核苷酸探针、特异性扩增RARRES2基因的引物或特异性结合RARRES2基因编码的蛋白的结合剂。
“检测表达”是指确定内在基因的RNA转录物或其表达产物的量或存在。检测本发明公开的内在基因表达，即基因表达概况分析的方法包括基于多核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法、免疫组化方法、和基于蛋白质组学的方法。这些方法通常检测本文所述的内在基因的表达产物(例如mRNA)。在优选的实施方案中，使用基于PCR的方法，例如逆转录PCR(RT-PCR)和基于阵列的方法例如微阵列。“微阵列”指可杂交阵列元件，例如，多核苷酸探针，在基质上的有序排列。术语“探针”指能与特别预期的靶生物分子，例如由内在基因编码的或相应于内在基因的核苷酸转录物或蛋白选择性结合的分子。探针可以由本领域技术人员合成，或者可以来自于合适的生物制备物。可以特异性地设计探针以对其进行标记。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白、抗体、和有机分子。
针对RARRES2基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述肿瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌。
进一步，所述肿瘤为乳腺癌脑转移瘤。
本发明另一方面提供了一种诊断肿瘤的产品，其特征在于，所述产品包括能够检测RARRES2表达水平的芯片、试剂盒或核酸膜条。
进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测RARRES2基因转录水平的针对RARRES2基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括RARRES2蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测RARRES2基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测RARRES2蛋白表达水平的试剂、或芯片。
特异性结合RARRES2基因编码的蛋白的结合剂例如蛋白质RARRES2的受体、结合蛋白质RARRES2的凝集素、针对蛋白质RARRES2的抗体、针对蛋白质RARRES2的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。特异性结合剂的具体例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。
进一步，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测RARRES2基因或蛋白表达水平的试剂。
本发明另一方面提供了RARRES2在构建预测乳腺癌脑转移瘤的计算模型中的应用。
RARRES2在构建预测肿瘤的计算模型中的应用，正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。特别的，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。
优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于乳腺癌脑转移的风险或与有助于评估乳腺癌脑转移患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有乳腺癌脑转移风险的个体、具有乳腺癌脑转移的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估乳腺癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。
本发明另一方面提供了RARRES2在制备***的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括RARRES2的促进剂；
进一步，所述促进剂特异性促进RARRES2的表达水平；
进一步，所述促进剂为RARRES2过表达的载体或RARRES2蛋白；
进一步，所述肿瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌。
进一步，所述药物组合物抑制肿瘤细胞的生长和增殖、抑制肿瘤细胞的迁移。
所述促进剂是指任何可增加RARRES2蛋白的活性、提高RARRES2基因或蛋白的稳定性、上调RARRES2蛋白的表达、增加RARRES2蛋白有效作用时间、或促进RARRES2基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调RARRES2有用的物质，从而可用于预防或***。例如所述的促进剂包括核酸促进剂，蛋白促进剂。所述促进剂包括但不限于增加表达RARRES2的载体、RARRES2蛋白或其活性肽。
分子生物学领域的技术人员已知许多合适的载体，其选择取决于所期望的功能。载体的非限制性实例包括质粒、黏粒、病毒、噬菌体和其他常规用于例如遗传工程的载体。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建各种质粒和载体。
作为本发明的一种可选方式，载体是病毒。病毒载体用于引入编码靶标特异性多肽的非内源性核酸序列。病毒载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。病毒载体还可以包括编码转导标记的核酸序列。
适合与本发明的组合物一起使用的病毒载体包括已鉴定用于人类基因治疗应用的那些。合适的病毒载体包括基于RNA病毒的载体，例如逆转录病毒来源的载体，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)来源的载体，并且包括更复杂的逆转录病毒来源的载体，例如慢病毒来源的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。
病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，细小病毒(如腺相关病毒)，冠状病毒，负链RNA病毒(如正粘病毒(如流感病毒)，弹状病毒(如狂犬病和水疱性口炎病毒)，副粘病毒(如，麻疹和仙台病毒)，正链RNA病毒(例如小核糖核酸病毒和甲型病毒)以及双链DNA病毒，包括腺病毒，疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒和巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘，鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括但不限于诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、***瘤病毒、肝炎病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的例子包括禽类白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒和泡沫病毒。
作为本发明的一种可选方式，载体是表达载体。根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主中的复制和表达，并因此保证由此编码的本发明的METTL7A在选择的宿主中的表达。
载体的非限制性实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体***、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)、pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。适合于巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的质粒载体的非限制性实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(全部为Invitrogen)。适合于在爪蟾属(Xenopus)胚胎、斑马鱼胚胎以及各种各样的哺乳动物和禽类细胞中表达蛋白质的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。
本发明另一方面提供了一种***的药物组合物，所述药物组合物包括RARRES2的促进剂。
进一步，所述促进剂特异性促进RARRES2的表达水平；
进一步，所述促进剂为RARRES2过表达的载体或RARRES2蛋白；
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体；
进一步，所述肿瘤选自乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌。
进一步，所述肿瘤为乳腺癌脑转移瘤。
本发明另一方面提供了RARRES2在筛选***的候选药物中的应用；
进一步，筛选***的候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有RARRES2基因或其编码的蛋白的培养体系；检测所述体系中RARRES2基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进RARRES2基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是***的候选药物。
进一步，所述肿瘤选自乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌。
进一步，所述肿瘤为乳腺癌脑转移瘤。
本发明另一方面提供了一种筛选***的候选药物的方法，用待筛选物质处理表达或含有RARRES2基因或其编码的蛋白的培养体系；检测所述体系中RARRES2基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进RARRES2基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是***的候选药物；
进一步，所述肿瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌。
进一步，所述肿瘤为乳腺癌脑转移瘤。
本发明中的术语“敲降”等同于“低表达”，两者同义，可以相互替换。
附图说明
图1显示生物信息学数据分析结果图；
A是通过分析GSE12237得出的人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231亲代细胞和MDA-MB-231BrM中的基因表达差异图；
B是通过分析GSE19184得出的MDA-MB-231异种移植到小鼠脂肪垫和小鼠脑内的基因表达差异图；
C是通过分析MET500得出的人类乳腺癌脑转移瘤和原发性乳腺癌肿瘤之间基因表达差异图；
D是通过分析GSE12237、GSE19184和MET500得出的乳腺癌脑转移差异表达基因的交叉重叠分析图；
E是通过分析MetMap得出的RARRES2在预注射乳腺癌亲代细胞和乳腺癌脑转移中的表达量差异图；
F是通过分析GSE14020得出的RARRES2在乳腺癌骨转移、乳腺癌脑转移、乳腺癌肺转移中的表达量差异图；
G是通过分析GSE62598得出的RARRES2在原发性乳腺癌、乳腺癌肺转移、乳腺癌脑转移、乳腺癌肝转移中的表达量差异图；
H是通过分析GSE10534得出的RARRES2在配对的原发性乳腺癌和乳腺癌脑转移患者中的表达量差异图；
图2显示乳腺癌患者脑转移肿瘤组织的单细胞转录测序结果图；
A是通过乳腺癌患者脑转移肿瘤组织的单细胞转录测序，获得13簇特定类型细胞实验数据图；
B是每个簇中细胞标记物的表达热图；
C是RARRES2在原发性乳腺癌和乳腺癌脑转移中的单细胞转录组表达量差异图；
图3显示敲降和过表达RARRES2的MDA-MB-231细胞系的增殖和侵袭能力结果图及过表达RARRES2的小鼠脑转移荧光成像图；
A是敲降RARRES2的MDA-MB-231细胞增殖能力变化图；
B是敲降RARRES2的MDA-MB-231细胞侵袭能力统计图；
C是敲降RARRES2的MDA-MB-231细胞侵袭能力实验图；
D是过表达RARRES2的MDA-MB-231细胞增殖能力变化图；
E是过表达RARRES2的MDA-MB-231细胞侵袭能力统计图；
F是过表达RARRES2的MDA-MB-231细胞侵袭能力实验图；
G是过表达RARRES2的小鼠脑部肿瘤与对照组小鼠脑部肿瘤荧光差异统计图
H是过表达RARRES2的小鼠脑部肿瘤与对照组小鼠脑部肿瘤荧光成像实验图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1乳腺癌脑转移中RARRES2表达降低
1、生物信息学数据分析
通过分析基因表达综合数据集(GEO)，分别比较人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231亲代细胞与MDA-MB-231BrM(脑转移衍生物)(GSE12237)(图1A)和移植到小鼠脂肪垫和脑(GSE19184)的MDA-MB-231细胞之间(图1B)的基因表达水平差异，筛选出DLC1、RARRES2、CASK、PUDP、CYP1B1、KDM6A、LSS、CTSB、ADAM12、COL18A1、BMP4、GNG11、CLDN4、RBM47、LITAF、UBA1、CEMIP、CSF1、CTSD共19个基因在MDA-MB-231BrM和小鼠脑转移瘤中下调。我们使用MET500数据集(图1C)进一步分析了人类乳腺癌脑转移瘤和原发性乳腺癌肿瘤之间差异表达基因，对重叠基因与上述19个基因表达量进行了比较，比较结果显示，在GSE12237、GSE19184和MET500三个数据集中，与原发性乳腺肿瘤相比，乳腺癌脑转移瘤中RARRES2的表达水平均显著降低(图1D)。我们使用MetMap分析了预注射乳腺癌亲代细胞与乳腺癌脑转移(BCBM)之间的RARRES2表达水平差异，分析结果显示，与预注射乳腺癌亲代细胞相比，BCBM中的RARRES2表达水平显著下调(图1E)。我们使用GSE14020数据集比较了RARRES2在乳腺癌骨转移、乳腺癌脑转移、乳腺癌肺转移中的表达量水平差异，比较结果显示，脑中的RARRES2表达水平明显低于骨骼和肺中(图1F)。我们使用GSE62598数据集比较了RARRES2在原发性乳腺癌、乳腺癌肺转移、乳腺癌脑转移、乳腺癌肝转移中的表达水平差异，比较结果显示，与原发性乳腺肿瘤相比，肝、骨和肺转移瘤中RARRES2的表达没有降低(图1G)，表明其功能依赖于微环境。我们进一步使用了GSE100534数据集分析了在一个独立患者群体中配对的原发性乳腺肿瘤和乳腺癌脑转移病灶之间的RARRES2表达水平差异，分析结果显示，与原发性乳腺肿瘤相比，乳腺癌脑转移(BCBM)中RARRES2表达水平也显著降低(图1H)。
实施例2基于乳腺癌脑转移瘤的单细胞转录组测序及分析
1、病例介绍
病例是患有乳腺癌的48岁中国女性，该病例记录在临床试验IMpassion 131(NCT03125902)中。该病例随机接受阿替利珠单抗和紫杉醇治疗，经过第一次和第二次治疗后，检查结果显示乳腺癌已经出现了肺和脑转移，随即患者结束了治疗。一周后，她开始出现头痛、呕吐和视力模糊的症状，脑部MRI显示左枕叶有一个3.1厘米的转移性肿块，左侧脑室受压，切除部分肿块后症状缓解。切除的肿块用于scRNA-seq(单细胞RNA测序)。
2、肿瘤样本采集和处理
脑转移病灶的肿瘤样本放置在RNAlater(QIAGEN)一种RNA储存液中。取储存的肿瘤样本置于RPMI-1640培养基(Gibco)中，在37℃条件下，使用MACS肿瘤分离试剂盒(Miltenyi Biotec)酶解肿瘤样本60分钟。在含有酶解后的肿瘤样本的RPMI-1640培养基(Invitrogen)中加入10％的FBS，使用40μm的细胞过滤器(BD)过滤，获得均匀的细胞悬浮液。将悬浮细胞通过细胞过滤器(BD)，并在400g下离心10分钟，弃上清去除红细胞。用1xPBS(Invitrogen)洗涤两次后，将细胞颗粒重新悬浮在分选缓冲液中(PBS补充1％FBS)。
3、单细胞RNA-seq文库构建和测序
试剂盒为从10x Genomics购买的Chromium Next GEM Single cell 5'Kit v2。根据使用说明书，用含有0.04％牛血清白蛋白(BSA)的PBS清洗单细胞一次，使乳腺癌脑转移瘤单细胞重新悬浮在含有0.04％BSA的PBS中。使用Rigel S2细胞计数器(Countstar)测定细胞数量，测定的最终浓度为500-1200个/μl。取含有10000个细胞的细胞悬浮液，生成纳升级凝胶珠状乳剂(GEMs)。使用C1000Touch Thermal Cycler(Bio-Rad)对GEMs进行反转录，程序是53℃，45分钟；85℃，5分钟；4℃保持。程序结束后，将DynaBeads和SPRIselect试剂(Thermo Fisher Scientific)加入到反转录产物中，进一步分离和纯化cDNA，获得纯化后的cDNA。进一步PCR扩增，合成双链cDNA；纯化cDNA，去除可能的游离的核苷酸，酶，缓冲剂；cDNA末端修复，并纯化；将双链cDNA的3’端转换成腺苷酸；将接头连接到双链cDNA的两端；继续纯化，连接了接头经过末端修复的ds cDNA；使用PCR扩增来富集文库，使用来自接头的序列作为引物，扩增已经存在的序列；纯化；文库制备完成；对文库进行验证和质量控制：用Illumina HiSeq X-Ten测序仪对单细胞RNA文库进行测序，测序结果为150bp配对末端读数。
4、结果
我们总共筛选了该乳腺癌患者的脑转移瘤5540个细胞，对其进行单细胞转录组测序和结果分析，每个细胞中平均筛选3772个基因用于下游分析。根据每个细胞簇中涉及的细胞标记物和癌症相关信号通路，将13个簇确定为特定的细胞类型，用不同的颜色去标记不同的簇(图2A)。根据细胞簇的差异转录特征，制作了特征表达热图(图2B)。分析了GSE118389数据集中乳腺癌原发灶的单细胞转录组测序数据与该乳腺癌患者的脑转移瘤单细胞转录组测序数据之间的RARRES2表达水平差异，在数据经过标准化处理后，分析结果显示，与原发灶乳腺肿瘤单细胞转录组测序结果相比，乳腺癌脑转移瘤中RARRES2表达水平显著下调(p<0.001，图2C)。
实施例3 RARRES2缺失促进体外和体内脑转移形成
1、细胞培养和动物
从国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室购买人乳腺癌脑转移潜能细胞系MDA-MB-231、小鼠乳腺癌细胞系4T1-luci和293TN。在MDA-MB-231和293TN中加入10％胎牛血清(HyClone)和DMEM(BIOROC，中国)，置于37℃的CO2标准培养箱中培养。在4T1-luci中加入10％胎牛血清(HyClone)，置于RPMI-1640培养基中培养。从北京维生河实验动物技术有限公司(中国北京)购买BALB/c雌性小鼠，正常饮食和进水的前提下，以12小时的光/暗循环饲养。
2、构建荧光素酶标记的RARRES2过表达脑乳腺瘤小鼠模型
根据Ozawa T,James CD.Establishing intracranial brain tumor xenograftswith subsequent analysis of tumor growth and response to therapy usingbioluminescence imaging.J Vis Exp.2010(41)提供的技术方案，挑选具有3.0×104个细胞的小鼠进行4T1-luci颅内注射。对已经颅内4T1-luci的小鼠，腹腔注射底物D-荧光素(150mg/kg)，使用IVIS LUMINA XRMS(Perkinlemer)监测肿瘤细胞的生长，观察小鼠生物发光肿瘤成像。
3、质粒和shRNA敲低
将全长人类和小鼠RARRES2基因(NM_002889，NM_027852)分别克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-PURO载体中，生成RARRES2过表达质粒。shRNA1和shRNA2分别克隆到PLKO1-TRC质粒中。shRNA1和shRNA2序列表见表1。
表1 shRNA序列表
Figure BDA0003650947920000121
4、稳定细胞系的建立
pLKO1和pCDH分别与包装载体psPAX2和pMD2共转染293TN细胞，48小时和72小时后获得慢病毒，使用4μg/ml的聚凝胺进行慢病毒转导肿瘤细胞48小时，完成转导后，加入嘌呤霉素筛选和获得稳定的RARRES2敲降MDA-MB-231细胞系和RARRES2过表达MDA-MB-231细胞系。
5、体外侵袭实验
1)transwell板上室操作步骤：加1.0×105MDA-MB-231细胞悬浮液到无血清培养基，加0.5％基质凝胶层(3422，康宁，美国)到transwell板的上室中，加含有细胞的无血清培养基到含凝胶的transwell板的上室中。
2)transwell板下室操作步骤：取含有20％胎牛血清的600μl DMEM培养基注入24孔板的下室。
3)transwell板置于37℃的CO2标准培养箱中，培养24h。
4)取出transwell板，PBS淋洗2遍，用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，在24孔板内100％甲醛固定15min，0.5％结晶紫溶液染色15min。
5)倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数10个视野，取平均值，统计分析。使用ImageJ软件计算穿过膜的细胞所占的相对面积。所有上述分析重复三次。
6、统计学分析
使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示。学生t检验用于评估统计显著性。实验组之间均值差异的显著性在图表上表示为：ns，不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
7、结果
我们利用shRNA(short hairpin RNA)干扰技术，设计了shRNA1和shRNA2序列，构建了RARRES2敲降MDA-MB-231细胞系。通过比较MDA-MB-231细胞系正常细胞系与RARRES2敲降MDA-MB-231细胞系，发现RARRES2敲降后显著促进细胞增殖和侵袭性(图3A、3B、3C)。通过比较MDA-MB-231细胞系正常细胞系与RARRES2过表达MDA-MB-231细胞系，发现RARRES2过表达后显著抑制细胞增殖和侵袭性(图3D、3E、3F)。通过构建荧光素酶标记的RARRES2过表达乳腺癌脑转移小鼠模型，发现RARRES2过表达可显著抑制乳腺癌脑转移瘤在脑中的增殖(图3G，3H)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> RARRES2基因在乳腺癌脑转移诊疗中的应用
<141> 2022-05-18
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcccttccca gctggaatat tctcgagaat attccagctg ggaagggctt tttt 54
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcttctactt ccctggacag tctcgagact gtccagggaa gtagaagctt tttt 54

Claims (10)

1.检测RARRES2基因的试剂在制备诊断肿瘤的产品中的应用；
优选地，所述试剂包括特异性识别RARRES2基因的寡核苷酸探针、特异性扩增RARRES2基因的引物或特异性结合RARRES2基因编码的蛋白的结合剂；
优选地，所述肿瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌；
优选地，所述肿瘤为乳腺癌脑转移瘤。
2.一种诊断肿瘤的产品，其特征在于，所述产品包括能够检测RARRES2表达水平的芯片、试剂盒或核酸膜条；
优选地，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测RARRES2基因转录水平的针对RARRES2基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括RARRES2蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测RARRES2基因转录水平的试剂、或核酸膜条，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测RARRES2蛋白表达水平的试剂、或核酸膜条。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测RARRES2基因或蛋白表达水平的试剂。
4.RARRES2在构建预测乳腺癌脑转移瘤的计算模型中的应用。
5.RARRES2在制备***的药物组合物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述药物组合物包括RARRES2的促进剂；
优选地，所述促进剂特异性促进RARRES2的表达水平；
优选地，所述促进剂为RARRES2过表达的载体或RARRES2蛋白。
7.根据权利要求5所述的应用，所述肿瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌；
优选地，所述药物组合物抑制肿瘤细胞的生长和增殖、抑制肿瘤细胞的迁移。
8.一种***的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括RARRES2的促进剂；
优选地，所述促进剂特异性促进RARRES2的表达水平；
优选地，所述促进剂为RARRES2过表达的载体或RARRES2蛋白；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体；
优选地，所述肿瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌；
优选地，所述肿瘤为乳腺癌脑转移瘤。
9.RARRES2在筛选***的候选药物中的应用；
优选地，筛选***的候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有RARRES2基因或其编码的蛋白的培养体系；检测所述体系中RARRES2基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进RARRES2基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是***的候选药物；
优选地，所述肿瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌；
优选地，所述肿瘤为乳腺癌脑转移瘤。
10.一种筛选***的候选药物的方法，其特征在于，用待筛选物质处理表达或含有RARRES2基因或其编码的蛋白的培养体系；检测所述体系中RARRES2基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进RARRES2基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是***的候选药物；
优选地，所述肿瘤包括乳腺癌、黑色素瘤、***癌、急性淋巴细胞白血病、肾上腺皮质癌；
优选地，所述肿瘤为乳腺癌脑转移瘤。
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