DE102004028899B4

DE102004028899B4 - Verwendung einer Kombination zur präventiven und/oder therapeutischen Behandlung von bakteriell bedingten Infektionserkrankungen oder der Sepsis

Info

Publication number: DE102004028899B4
Application number: DE102004028899A
Authority: DE
Inventors: Mario Dr. Menschikowski; Albert Dr. Hagelgans; Gabriele Prof. Dr. Siegert
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2004-06-09
Filing date: 2004-06-09
Publication date: 2009-09-03
Anticipated expiration: 2024-06-10
Also published as: DE102004028899A1; WO2005120475A2; WO2005120475A3

Abstract

Verwendung einer Kombination aus
a. mindestens einem Inhibitor der Rho-Kinase oder von RhoA und
b. mindestens einem Inhibitor der GlykogensynthaseKinase-3β (GSK-3β) und
c. Interferon-γ (IFN-γ)
zur präventiven und/oder therapeutischen Behandlung von bakteriell bedingten Infektionserkrankungen oder der Sepsis.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Inhibitoren bzw. Aktivatoren bestimmter Signalwege zur Steigerung der Synthese der sekretorischen Phospholipase A₂-IIA (sPLA₂-IIA) und/oder zur Steigerung der Sekretion der sPLA₂-IIA in die Blutbahn. Gebiet der Erfindung ist die Medizin, insbesondere die Therapie bakterieller Infektionskrankheiten.
Stand der Technik
Die humane sekretorische Phospholipase A₂-IIA (sPLA₂-IIA) lässt sich in einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen und Gewebe nachweisen, wie Thrombozyten¹, Leukozyten, in der Prostata³ und Plazenta⁴, und auch in Körperflüssigkeiten wie Samenflüssigkeit^5,6 Tränenflüssigkeiten⁷ und Synovialflüssigkeit^8,9 kommt dieses Enzym vor. In anderen Zellen wie Hepatozyten, Endothelzellen und glatten Muskelzellen ließ sich erst nach einer Stimulation mit Interleukin-1β, Interleukin-6, Tumornekrosefaktor-α, und Interferone-γ in vitro eine Expression des Enzyms finden^10,11,12. Die Enzymaktivität im Serum Gesunder ist eher niedrig. Während einer akuten Entzündungserkrankung wie Sepsis und septischer Schock^13,14,15, akute Pankreatitis^16,17, Peritonitis¹⁷ oder Appendicitis¹⁸ kann sie jedoch dramatisch ansteigen. So wurden bei diesen Erkrankungen gegenüber der Norm 100–1000-fach erhöhte Werte beschrieben. Auch bei chronisch rheumatoider Arthritis^19,20 und neoplastischen Erkrankungen²¹ zeigen sich erhöhte Serumspiegel der sPLA₂-IIA. Auf Grund des schnellen Anstieges während einer lokalen oder systemischen Entzündungsreaktion wird die sPLA₂-IIA zu den Akut-Phase-Reaktanten gerechnet²².
Mit großer Intensität wurde deshalb in den letzten Jahren nach Inhibitoren für die sPLA₂-IIA gesucht, um bei schweren Entzündungsreaktionen die Wirkung der sPLA₂-IIA zu blockieren. Die biologisch Funktion der sPLA₂-IIA ist jedoch noch ungenügend aufgeklärt. Neben einer Beteiligung des Enzyms an Prozessen der zellulären Signaltransduktion, Apoptose und/oder „Remodeling” von Zellmembranen wird auch eine Beteiligung des Enzyms an der Körperabwehr gegenüber Bakterien und human-pathogenen Pilzen diskutiert.
Bei Sängertieren lassen sich eine Vielzahl unterschiedlicher Peptide und Polypeptide finden, die in der Lage sind Staphylokokken und andere gram-positive Bakterien abzutöten. Dazu zählt die sekretorische PLA₂ vom Typ IIA, die ein außerordentlich effizientes antibakterielles Agent darstellt. Bereits Ende der siebziger Jahre konnten Elsbach und Mitarbeiter²³ aus Kaninchen-Leukozyten eine PLA₂ isolieren, die in vitro gemeinsam mit einem zweiten Protein, dem bactericidal/permeability-increasing Protein (BPIP), gram-negative Stämme von Escherichia coli und Salmonella typhimurium wirkungsvoll abtöten. Später ließ sich eine antibakterielle Wirkung gegenüber Staphylococcus aureus in Entzündungsexudaten finden, die ebenfalls auf eine PLA₂ zurückzuführen war^24,25. Antibakterielle Eigenschaften gegen gram-positive Bakterien wurden in den folgenden Jahren auch für die humane sPLA₂-IIA nachgewiesen und die hohen Konzentrationen des Enzyms in entzündlichen Exudaten²⁶ und in der Tränenflüssigkeit²⁷ sprechen ebenfalls für die antibakterielle Funktion des Enzyms. Zudem wird das Enzym von Paneth-Zellen des Darms²⁸ und von Makrophagen^29,30 freigesetzt; beides Zellarten, die an der Körperabwehr gegen bakterielle Eindringlinge beteiligt sind. Es wird vermutet, dass die Fähigkeit der sPLA₂-IIA Staphylococcus aureus und andere gram-positive Bakterien zu attackieren, hauptsächlich in der Fähigkeit des Enzyms besteht, an der Bakterienzellwand zu binden, diese zu penetrieren und dadurch die Phospholipide der Zellwand hydrolytisch angreifen zu können^31,32. Die initiale Bindung der sPLA₂-IIA an der Zelloberfläche von S. aureus beruht dabei auf elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der sPLA₂-IIA und der Zelloberfläche. Unter den mehr als 100 strukturell sehr ähnlichen niedrigmolekularen sPLA₂ (14 kDa) ist die sPLA₂-IIA einzigartig in ihrer extrem hohen positiven Nettoladung, die zwischen +12 und +17 liegt. Diese hohe Nettobasizität wird als Grundlage für die wirkungsvolle antibakterielle Aktivität der sPLA₂-IIA gegenüber gram-positiven Bakterien angesehen^33,34,35.
Schließlich konnte die protektive Wirkung der sPLA₂-IIA gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien auch in vivo durch Untersuchungen an transgenen Mäusen belegt werden, die durch eine Überexpression der humanen sPLA₂-IIA charakterisiert sind. So wiesen die transgenen Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren eine signifikant höhere Resistenz gegenüber Staphylococcus areaus auf³⁶. Während der Großteil der transgenen Tiere nach intraperitonealer Injektion von S. aureus nur geringfügig Symptome einer Sepsis aufwiesen und vollzählig am Leben blieben, verstarben bereits nach 24 Stunden 85% der nicht-transgenen Kontrolltiere. Die verstorbenen Tiere zeigten dabei schwere Lungen-, Leber- und Nierenstauungen und wiesen verstärkt hämorrhagische Ergüsse in der Pleura- und Peritonealhöhle auf. Die gleiche Arbeitsgruppe konnte wenig später auch gegenüber gram-negativen E. coli-Bakterien eine höhere Resistenz der sPLA₂-IIA-transgenen Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren nachweisen³⁷.
In den USA erkranken jährlich 750000 Menschen an der Sepsis, wovon 210000 Patienten daran versterben. In den letzten Jahren hat sich das Verständnis der Sepsis geändert. Wurde die Sepsis bisher ausschließlich als eine außer Kontrolle geratenen Entzündungsreaktion auf Grund einer Infektion angesehen und darauf basierend eine anti-entzündliche Prävention und Therapie aufgebaut, z. B. durch Anwendung von Antikörpern gegen unterschiedliche Cytokine bzw. deren Rezeptoren, so zeigen neue Untersuchungen, dass in den erhöhten Cytokinspiegeln nicht nur eine schädigende, sondern auch eine schützende Wirkung gesehen werden kann. Untersuchungen an Versuchstieren mit Peritonitis wiesen nach, dass die Blockierung des TNF-α die Überlebensrate der Tiere verminderte^38,39. Eine Kombinationstherapie gegen TNF-α und IL1-Rezeptor war ebenfalls fatal für ein neuropenisches Modell der Sepsis⁴⁰. Auch in klinischen Studien, in denen TNF-Antagonisten gegeben wurden, war eine erhöhte Mortalität nachweisbar⁴¹. Die Bedeutung der Cytokine, insbesondere die des TNF-α zeigte sich auch bei Patienten mit rheumatoider Arthritis. So wiesen Patienten, die mit TNF-Antagonisten behandelt wurden, verstärkt Zeichen einer Sepsis bzw. infektiöse Komplikationen auf⁴². Woran Patienten mit einer Sepsis letztlich versterben, ist noch ungeklärt. Ein Fehlen der Akut-Phase-Reaktanten bei Patienten mit Sepsis ist jedoch mit einer hohen Mortalität verbunden. Während durch eine Blockierung der proinflammatorischen Cytokine keine durchgreifenden Erfolge bei der Behandlung von Sepsispatienten zu verzeichnen waren, sondern eher noch eine Verschlechterung eintrat, konnte durch die Substitution von rekombinantem aktivierten Protein C (APC), ein Antikoagulant, eine effizientere Behandlung erreicht werden^43,44. So fiel das relative Todesrisiko für Patienten mit Sepsis um 19,4%, das absolute Risiko um 6,1%⁴³. APC inaktiviert die Gerinnungsfaktoren Va und VIIIa und verhindert somit die Bildung des Thrombins⁴⁴. Dass die Effizienz des APC allerdings nicht allein auf die Hemmung des Gerinnungssystems zurückzuführen ist, zeigten Untersuchungen mit zwei weiteren Antikoagulantien, Antithrombin III (ATIII) und Inhibitoren des Gewebsfaktors (TF). Im Gegensatz zum APC führte die Gabe beider Gerinnungshemmer zu keiner verbesserten Heilungsrate der septischen Patienten⁴⁵. Eine Erklärung hierfür könnte darin bestehen, dass diese Inhibitoren im Vergleich zum APC an anderen Stellen des Gerinnungssystems wirken.
Darüber hinaus ließen sich für das APC anti-apoptotische Eigenschaften nachweisen⁴⁶, was für die beiden anderen Inhibitoren bisher nicht der Fall war. Die Apoptose wird als eine wesentliche Ursache für die bei der Sepsis eintretende Immunparalyse angesehen, die häufig mit einer verminderten Anzahl von Lymphozyten und gastrointestinale Epithelialzellen einhergeht. Ähnlich dem APC besitzt auch die sPLA₂-IIA anti-apoptotische Eigenschaften, wie an Hamster-Nierenfibroblasten und an Mastzellen gezeigt werden konnte^47,48. Zudem werden der sPLA₂-IIA ebenfalls anti-koagulatorische Eigenschaften zugeschrieben, indem das Enzym mit dem Gerinnungsfaktor Va um die Bindung am Faktor Xa konkurriert und dadurch die Bildung des Thrombins ähnlich dem APC hemmt^49–56. Neben diesen Eigenschaften und den bereits erwähnten antibakteriellen Wirkungen erscheint deshalb die sPLA₂-IIA als ein geeignetes pharmakologisches Target, um die Prävention und Therapie von systemischen Infektionserkrankungen bis hin zur Sepsis als auch von lokalen und systemischen, arteriellen und venösen Thrombosen zu verbessern.
Auch die akute bakterielle Meningitis ist eine lebensbedrohliche Infektion, an der in Deutschland jährlich ca. 2.000 Menschen erkranken. Ihr Verlauf ist gegenüber einer viralen Meningitis meist schwerer. Die wichtigsten Erreger sind Neisseria meningitidis (Meningokokken), Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken), Listeria monocytogenes, Borrelia burgdorferi, Staphylokokken, Streptokokken (inklusive hämolysierende Streptokokken der Gruppe B) und Escherichia coli.
Aufgabenstellung
Aufgabe der Erfindung ist es Mittel zur Steigerung der Synthese der sekretorischen Phospholipase A₂-IIA (sPLA₂-IIA) und deren vermehrter Sekretion in die Blutbahn anzugeben. Durch die Aktivierung der körpereigenen Abwehr sollen die Behandlungserfolge von bakteriellen Infektionserkrankungen verbessert werden. Insbesondere die Behandlungserfolge der Sepsis sollen mit der Erfindung deutlich erhöht werden.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gemäß Anspruch 1 gelöst durch die Verwendung einer Kombination aus

a. mindestens einem Inhibitor der Rho-Kinase oder von RhoA und
b. mindestens einem Inhibitor der GlykogensynthaseKinase-3β (GSK-3β) und
c. Interferon-γ (IFN-γ)

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 bis 9 angegeben.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Expression von sPLA₂-IIA durch mindestens drei Signalwege negativ reguliert wird, nämlich durch den Rho/Rho-Kinase-Signalweg, den Ras/Raf/MEK/ERK-Signalweg und den Ras/PI3-Kinase/Akt-Signalweg. Werden einer oder mehrere dieser negativ regulierenden Signalwege (Rho/Rho-Kinase Signalweg, Ras/Raf/MEK/ERK-Signalweg, Ras/PI3-Kinase/Akt-Signalweg) inhibiert, kommt es zu einer Steigerung der sPLA₂-IIA-Expression und -Sekretion.
Die Expression und Sekretion von sPLA₂-IIA wird ebenfalls dadurch gesteigert, dass Signalwege, die die aufgeführten negativ regulierenden Signalwege aktivieren, inhibiert werden oder wenn Signalwege, die durch diese negativ regulierenden Signalwege aktiviert werden, inhibiert werden.
Eine Aktivierung von Signalwegen, die die negativ regulierenden Signalwege inhibieren, führt ebenfalls zu einer Steigerung der sPLA₂-IIA-Expression und -Sekretion.
Eine Kombination aus Mitgliedern verschiedener Inhibitorklassen bzw. mit Aktivatoren führt zu einer synergistischen Steigerung der sPLA₂-IIA-Expression und -Sekretion.
Unter bakteriell bedingten Infektionserkrankungen sind Erkrankungen zu verstehen, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien hervorgerufen werden, beispielsweise akute, subakute und chronische, durch Erreger wie Chlamydien, Streptococcus pneumoniae, Mykoplasma pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis und Staphylococcus aureus hervorgerufenen Bronchitis, akute bakterielle Meningitis, akute bakterielle abszedierenden Pyelonephritis, akute durch Staphylococcus aureus verursachte Infektionen der Skelettmuskulatur (Pyomyositiden), chronisch bakterielle Infektionen des Magens und Darms, Endokarditis, Lepra, Tuberkulose und Brucellose. Eine weitere chronisch-infektiöse, durch Chlamydien verursachte Erkrankung stellt möglicherweise auch die Arteriosklerose dar, so dass hier gegebenenfalls das entwickelte Arzneimittel anwendbar ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zusätzlich Acetylcholin und/oder Lysophosphatidylsäure (LPA) eingesetzt.
Interferon-γ wird verstärkt von den körpereigenen T-Lymphozyten gebildet und in die Blutbahn abgegeben, sobald durch die Invasion bakterieller Pathogene das Immunsystem aktiviert wird. Alle getesteten Inhibitoren bzw. Inhibitorkombinationen induzierten mit IFN-γ synergistisch die Synthese der sPLA₂-IIA, daher wird bevorzugt bei Patienten mit schweren Infektionskrankheiten der IFN-γ-Blutspiegel kontrolliert und gegebenenfalls bei fehlendem Nachweis des Cytokins, beispielsweise bei Patienten mit Immunparalyse, gleichzeitig neben den oben aufgeführten Wirkstoffkombinationen rekombinantes IFN-γ gegeben, um eine optimale, synergistische Wirkung hinsichtlich der körpereigenen sPLA₂-IIA-Synthese und Sekretion in die Blutbahn auszulösen.
Auch Lysophosphatidylsäure (LPA) führt gemeinsam mit IFN-γ zu einer signifikanten Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression. Ähnliches trifft auch auf Acetylcholin zu. Die Wirkung beider Wirkstoffe kann in Kombination mit cAMP-erhöhenden Agenzien weiter gesteigert werden. LPA wirkt dabei durch Aktivierung der Proteinkinase C, die widerum die GSK-3β hemmt⁶⁰. Ähnlich wirkt Acetylcholin durch Steigerung des intrazellulären Calciums und Aktivierung der Proteinkinase C.
Bevorzugt werden daher zusätzlich zu den angeführten Wirkstoffkombinationen Acetylcholin und/oder LPA eingesetzt.
Unter dem Rho/Rho-Kinase Signalweg wird dabei der Weg der Signalweiterleitung ausgehend von RhoA zur Rho-Kinase verstanden (1). Inhibitoren des Rho/Rho-Kinase-Signalwegs sind alle Substanzen, die die Signalweiterleitung über diesen Signalweg abschwächen oder unterbinden.
In einer Ausführungsform wird die Signalweiterleitung durch die Inhibition von RhoA unterbrochen, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Toxin B aus Clostridium difficile als RhoA-Inhibitor eingesetzt. Toxin B inhibiert spezifisch Rho-Proteine durch Glykosylierung von Threoninresten.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Rho-Kinase inhibiert, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Rho-Kinase-Inhibitoren Y-27632 und H-1152 verwendet.
Unter dem Ras/Raf/MEK/ERK-Signalweg wird der Weg der Signalweiterleitung ausgehend vom Ras-Protein über das Raf-Protein und über die mitogen activated Protein kinase Kinase MEK zur extracellular signal-regulated kinase ERK verstanden (1). Inhibitoren des Ras/Raf/MEK/ERK-Signalwegs sind alle Substanzen, die die Signalweiterleitung über diesen Signalweg abschwächen oder unterbinden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zusätzlich die MEK inhibiert, in einer besonders bevorzugten Form werden die Inhibitoren PD-98059 und U0126 verwendet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Raf-Kinase inhibiert, in einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Raf Inhibitor ZM336372 verwendet.
Unter dem Ras/PI3-Kinase/Akt-Signalweg wird der Weg der Signalweiterleitung ausgehend vom Ras-Protein über die Protein-Kinase und über Proteinkinase 13 (Akt) verstanden (1). Inhibitoren des Ras/PI3-Kinase/Akt-Signalwegs sind alle Substanzen, die die Signalweiterleitung über diesen Signalweg abschwächen oder unterbinden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zusätzlich die PI3-Kinase inhibiert, in einer besonders bevorzugten Form wird der Inhibitor Wortmannin verwendet.
Unter Signalwegen, die den Rho/Rho-Kinase und/oder den Ras/Raf/MEK/ERK Signalweg und/oder den Ras/PI3-Kinase/Akt-Signalweg aktivieren, werden Signalwege verstanden, die den angeführten Signalwegen vorgeschaltet sind und die das RhoA-Protein des Rho/Rho-Kinase-Signalwegs und/oder das Ras-Protein des Ras/Raf/MEK/ERK-Signalwegs und des Ras/PI3-Kinase/Akt-Signalwegs aktivieren (1).
Ebenfalls dazu zählen Stoffwechselwege, deren Produkte zur posttranslationalen Modifikation von Ras und/oder Rho Verwendung finden, beispielsweise zur posttranslationalen Isoprenylierung, durch die die Zellmigration, die Proliferation und die Differenzierung kontrolliert werden. Durch die Farnesyltransferase wird hierbei ein Farnesyl-Isoprenoid (C15) auf eine Thiolgruppe eines Cysteins am C-Terminus des Ras-Proteins übertragen. Die entsprechende posttranslationale Modifikation des Rho-Proteins mit einem Geranylgeranyl-(C20)-Isoprenoid erfolgt durch die Geranylgeranyl-Transferase. Die verwendeten Isoprenoide stammen aus dem Cholesterinstoffwechsel, der im wesentlichen durch die HMG-CoA-Reduktase reguliert wird.
Inhibitoren dieser Signal- und Stoffwechselwege sind alle Substanzen, die die Signalweiterleitung über diese Signalwege abschwächen oder unterbinden bzw. diese Stoffwechselwege blockieren, beispielsweise Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase, Inhibitoren der Farnesyltransferase und Inhibitoren der Geranylgeranyltransferase.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zusätzlich Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktase verwendet, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die HMG-CoA-Inhibitoren Mevastatin, Lovastatin, Simvastatin, Atorvastatin, Fluvastatin oder Pravastatin verwendet.
Wird Simvastatin zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis bei 5 bis 80 mg am Tag, wird Simvastatin in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw. Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 5 mg am Tag.
Wird Lovastatin zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis bei 10 bis 80 mg am Tag, wird Lovastatin in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw. Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 10 mg am Tag.
Wird Atorvastatin zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis bei 10 bis 80 mg am Tag, wird Atorvastatin in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw. Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 10 mg am Tag.
Wird Fluvastatin zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis bei 20 bis 80 mg am Tag, wird Fluvastatin in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw.
Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 20 mg am Tag.
Wird Pravastatin zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis bei 10 bis 40 mg am Tag, wird Pravastatin in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw. Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 10 mg am Tag.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden zusätzlich Inhibitoren der Farnesyltransferase verwendet, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Farnesyltransferase-Inhibitoren Manumycin A, Cys-Val-2-Nal-Met, FTI-249, FTI-277, FTI-2153, FTI RPR130401, FTI SCH66336, FTI R115777, FTI L-778123 oder FTI BMS-214662 eingesetzt.
Wird FTI SCH66336 zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis bei 400 bis 800 mg am Tag, wird FTI SCH66336 in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw. Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 400 mg am Tag.
Wird FTI R115777 zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis bei 400 bis 800 mg am Tag, wird FTI R115777 in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw. Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 400 mg am Tag.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden zusätzlich Inhibitoren der Geranylgeranyltransferase verwendet, in einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Geranylgeranyltransferase-Inhibitoren GGTI-279, GGTI-286, GGTI-287, GGTI-297, GGTI-298, GGTI-2133 oder GGTI-2147 verwendet.
Unter Signalwegen, die den Rho/Rho-Kinaseweg und/oder den Ras/Raf/MEK/ERK-Signalweg und/oder den Ras/PI3-Kinase/Akt-Signalweg inhibieren, werden Signalwege verstanden, die die Signalweitergabe über den Rho/Rho-Kinaseweg und/oder den Ras/Raf/MEK/ERK-Signalweg und/oder den Ras/PI3-Kinase/Akt-Signalweg abschwächen oder verhindern.
Beispielsweise unterbindet die Proteinkinase A die Signalweitergabe von RhoA zur Rho-Kinase im Rho/Rho-Kinase-Signalweg, indem sie Serin 188 von RhoA phosphoryliert. Dies führt zur Translokation des membranassoziierten RhoA ins Cytosol unabhänging vom Isoprenylierungszustand von RhoA⁵⁷. Dong et al.⁵⁸ zeigten, dass die reduzierte biologische Aktivität des phosporylierten RhoA durch die geschwächte Bindung von RhoA an seine downstream Rho-assoziierte Serin/Threonin-Kinase verursacht wird.
Die Proteinkinase A erniedrigt zudem die Verfügbarkeit von Rafl für das Ras-Protein und inhibiert auf diese Weise ebenfalls den Ras/Raf/MEK/ERK-Signalweg⁵⁹ In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression von sPLA₂-IIA durch die Aktivierung der Proteinkinase A gesteigert, wozu die cAMP-steigernden Agentien Forskolin, Theophyllin, ATP, 8-Bromo-cAMP, Prostacyclin oder β-Adrenorezeptor-Agonisten eingesetzt werden.
Die Proteinkinase A liegt in ihrer inaktiven Form als Tetramer vor, bestehend aus zwei regulatorischen und zwei katalytischen Untereinheiten, wobei das katalytische Zentrum durch die regulatorischen Untereinheiten verdeckt wird. Durch die Bindung von cAMP an spezifische Bindungsstellen auf den regulatorischen Untereinheiten dissoziieren die regulatorischen Untereinheiten ab und die Proteinkinase A liegt in ihrer aktiven Form vor. Die Konzentration von cAMP in der Zelle ist abhängig vom Ausmaß der Neusynthese durch die Adenylatcyclase und des Abbaus durch Phosphodiesterasen.
Forskolin steigert die cAMP-Konzentration durch die Aktivierung der Adenylatcyclase, Theophyllin durch die Inhibition der Phosphodiesterase.
Die Aktivierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren führt über die Aktivierung von G-Proteinen ebenfalls zur Aktivierung der Adenylatcyclase und damit zur Steigerung der cAMP-Konzentration: ATP aktiviert die G-Protein-gekoppelten Purinoceptoren P2X und P2Y, Prostacyclin und Carbacyclin aktivieren die G-Protein-gekoppelten Prostacyclin-Rezeptoren, β-Adrenorezeptor Agonisten, beispielsweise Isoproterenol, aktivieren die G-Protein-gekoppelten β-Adrenorezeptoren.
Wird Forskolin zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis bei 50 bis 100 mg am Tag, wird Forskolin in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw. Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 50 mg am Tag.
Wird Theophyllin zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte orale Dosis bei 200 bis 1200 mg am Tag, wird Theophyllin in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw. Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 200 mg am Tag.
Unter Signalwegen, die durch den Rho/Rho-Kinase und/oder den Ras/Raf/MEK/ERK Signalweg und/oder den Ras/PI3-Kinase/Akt-Signalweg aktiviert werden, werden Signalwege verstanden, die diesen Signalwegen nachgeschaltet sind, beispielsweise der GSK-3-Signalweg, der sowohl von der Rho-Kinase des Rho/Rho-Kinase-Signalweg als auch von der ERK des Ras/Raf/MEK/ERK-Signalwegs aktiviert wird (1).
Inhibitoren dieser Signalwege sind alle Substanzen, die die Signalweiterleitung über diese Signalwege abschwächen oder unterbinden, beispielsweise Inhibitoren der GSK-3β. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Indirubin als Inhibitor der GSK-3β eingesetzt. Wird Indirubin zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis bei 20 bis 100 mg am Tag, wird Indirubin in Kombination mit anderen Inhibitoren bzw. Aktivatoren zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, so liegt die bevorzugte Dosis darunter, eine besonders bevorzugte Dosis liegt bei unter 50 mg am Tag.
Durch die Kombination verschiedener Substanzen, die unterschiedliche Signalwege an verschiedenen Stellen blockieren, ergeben sich synergistische Effekte, die wesentlich geringere Konzentrationen der anzuwendenden Substanzen im Vergleich zu den Einzelsubstanzen erlauben. Durch die niedrigere Konzentration der eingesetzten Substanzen ist auch mit geringeren Nebenwirkung zu rechnen.
Anhand der folgenden Figuren und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert:
Figur (Fig.) 1 zeigt eine Übersicht über die intrazellulären Signalwege, die durch die beschriebenen Inhibitoren bzw. Aktivatoren beeinflusst werden und zu einer Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression führen. Die mit Querbalken versehenen Linien stellen die Hemmung durch pharmakologisch wirksamen Substanzen dar bzw. zeigen eine negative Regulation. Die durchgehenden Linien kennzeichnen bekannte Stoffwechselwege, die durchbrochene Linie stellt einen in der Literatur diskutierten Mechanismus dar. Die mit einem Fragezeichen versehenen Linien kennzeichnen von uns postulierte Mechanismen, die weitere Möglichkeiten für die Regulation der sPLA₂-IIA darstellen.
Tabelle 1 zeigt eine Übersicht der verschiedenen Inhibitor- bzw. Aktivatorsubstanzen, ihrer chemischen Bezeichnung (CAS-Nummer), der durch sie beeinflussten Signalwege, ihrer Funktion und ihrer Bezugsquellen.
Ausführungsbeispiel 1: Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression in HASMC und HepG2-Hepatomzellen durch Atorvastatin und Mevastatin
Zellkultivierungen
Primäre glatte Muskelzellen der humanen Aorta (HASMC) werden von der Firma Promocell (Heidelberg, Germany) bezogen und entsprechend den vorgeschriebenen Bedingungen in Smooth Muscle Cell Growth Medium und 5% fetales Kälberserum, 0.5 ng/ml humanen Epidermal-Growth-Factor, 2 ng/ml humanen Basic-Fibroblast-Growth-Factor, 5 μg/ml Rinderinsulin, 50 μg/ml Gentamycinsulfat und 50 ng/ml Amphotericin B bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Die humane HepG2-Hepatom-Zellline wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA) bezogen und in RPMI-Medium mit 10% fetales Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin unter identischen Bedingungen wie für die HASMC beschrieben kultiviert. Jeden zweiten bis dritten Tag erfolgt ein Mediumwechsel und vor Erreichen der Konfluenz werden die HASMC und HepG2-Zellen mit Hilfe von Trypsin/EDTA passagiert. Für die RNA-Isolierung und Bestimmung der zellulär sezernierten sPLA₂-IIA werden die Zellen in 6-well-Platten bzw. 24-well-Platten in einer Zelldichte von 10⁴ Zellen/cm² eingebracht. Nach zwei Tage wird das Medium der HASMC durch Medium, das 0.5% fetales Kälberserum enthält, ersetzt, um das Zeltwachstum zu synchronisieren. Nach weiteren 48 Stunden wird erneut das Medium durch Smooth Muscle Cell Growth Medium mit 5% fetalem Kälberserum ersetzt. Alle Experimente werden an exponentiell wachsenden subkonfluenten HASMC und konfluenten HepG2-Zellen der Passage 5–8 durchgeführt. Nach Beendigung der Inkubation wird das konditionierte Zellmedium entnommen, bei 800 g für 10 min zentrifugiert, um abgelöste Zellen zu entfernen und bis zur Bestimmung der sPLA₂-IIA bei –80°C konserviert. Die adhärenten Zellen werden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen, in TRI-Reagent (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany) lysiert und bis zur RNA–Isolierung bei –80°C konserviert.
Atorvastatin, Mevastatin, Mevalonsäure, Squaen, Cholesterol und Forskolin wurden in Ethanol, Manumycin A, GGTI-298, GGTI-286, PD98059, U0126, AG-490 und CAPE in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die Endkonzentration der Lösungsmittel in den einzelnen Untersuchungen betrug weniger als 0.3%. Ethanol und DMSO wurden in allen Fällen als Kontrollen mitgeführt. Nach dem Lösen von Mevastatin und D, L-Mevalonsäure-Lakton in Ethanol wurden diese Verbindungen durch Öffnen des Laktonringes in die aktive Form überführt, indem diese in 0.1 N NaOH bei 37°C für 45 min inkubiert wurden⁶³ und nach erfolgter Hydrolyse durch Zusatz von 0.1 N HCl der pH-Wert der Lösungen wieder auf einen Wert von 7,4 eingestellt wurden.
RNA-Extraktion and Reverse-Transkriptase (RT)-PCR-Analysen
Nach Lyse der Zellen in TRI-Reagenz wird die RNA entsprechend der Firmenbeschreibung isoliert. Anschließend erfolgt mit Hilfe des GeneAmp RNA-PCR Kits (Perkin-Elmer) das Umschreiben der isolierten RNA in die cDNA und die Amplifikation in der PCR zur Identifizierung der sPLA₂-IIA-mRNA und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-mRNA. Letztere dient als „house-keeping gene”. Folgende Oligonukleotide dienen als Primer-Paare: 5'-GTGATCATGATCTTTGGCCTACTGCA-3' (SEQ_NO.1) und 5'-TCTCCCTCGTGGGGAGCAACGACT-3' (SEQ_NO.2) für die sPLA₂-IIA (PCR-Produkt mit 411 bp-Länge) und 5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3' (SEQ_3) und 5'-GCAGGAGGCATTGC-TGATGATCTTG-3' (SEQ_4) für die GAPDH (Produktlänge von 439 bp). Für die Sequenz der eingesetzten Oligonukleotide dient die publizierte Nukleotid-Sequenz der humanen plazentaren sPLA₂-IIA cDNA⁶¹ und für die GAPDH-mRNA entsprechend die von Ercolani et al.⁶² publizierte Nukleotidsequenz als Grundlage. Die Primerpaare werden in der PCR in einer Endkonzentration von 0.8 μmol/l eingesetzt. Die Amplifikationsbedingungen sind folgende: 40 Zyklen bei 94°C für 30 sec, 68°C für 30 sec und 72°C für 1 min. Die verwendeten Pufferlösungen und Reagenzien sind in dem GeneAmp Kit (Perkin-Elmer) enthalten. Nach Amplifikation werden die erhaltenen Produkte mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Bestimmung der GAPDH-mRNA dienten in jedem Ansatz als Kontrolle.
Quantitative Bestimmung der sPLA₂-IIA- and GAPDH-mRNA mittels real-time RT-PCR
Die Sequenzen der Primer und molekularen Beacons für die real-time RT-PCR basieren auf der RNA-Sequenz des sPLA₂-IIA-Gens⁶¹ und des GAPDH-Gens⁶². Für die Analyse der sPLA₂-IIA werden als Primer die Oligonukleotide 5'-AATTTGGTGAATTTCCACAG-3' und 5'-AGTCATGAGTGACACAGCAG-3' und für die GAPDH die Oligonukleotide 5'-CAAGCTCATTTCCTGGTATG-3' und 5'-TGAGGGTCTCTCTCTTCCTC-3' verwendet. Die Beacons werden am 5'-Ende mit 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) und am 3'-Ende mit dem Quencher 4-Dimethylaminophenylazobenzoesäure (Dabcyl) markiert. Die Sequenz der Beacons ist 5'-CGCTCGCACTCAGTTATGGCTTCTACGGCTGCCACGCGAGCG-3' für die sPLA₂-IIA und 5'-CGCTCGCACATGGCCTCCAAGGAGTAAGACCCCTGGCGAGCG-3' für die GAPDH. Die Reaktion wird als 1-Schritt-RT-PCR in einem iCycler iQ PCR Detection System (Bio-Rad, Germany) mit Hilfe des QuantiTect^TM-Kits (QIAGEN) in Dreifachbestimmung durchgeführt. Folgende Reagenzienansätze werden eingesetzt: 15 μl 2 × QuantiTect Probe RT-PCR als Master-Mix, jeweils 4 μl of 4 μmol/l Primer-Paare, 2,5 μl 4 μmol/l Beacon, 0,3 μl QuantiTect Probe RT Mix, 1,2 μl of 25 mM MgCl₂-Lösung, 2 μl Template-RNA und 1 μl RNase-freies Wasser. Die reverse Transkription erfolgt bei 60°C für 30 min, gefolgt von einer Denaturierungsphase bei 95°C für 15 min. Daran schließt sich die PCR mit 10 Zyklen bei 95°C für 15 sec, 55°C für 15 sec und 72°C für 20 sec und bis zu 70 Zyklen bei 95°C für 15 sec, 45°C für 30 sec und 72°C für 20 sec an. Die ”real-time”-Messung findet während der Annealing-Phase statt. Ansätze ohne RNA-Template dienen dabei als negative Kontrolle. Die in der PCR erhaltenen Daten werden anschließend mit Hilfe der iCycler iQ Software ausgewertet. Die relative Quantifizierung der sPLA₂-IIA-mRNA erfolgt mittels ΔΔCt Methode mit GAPDH als Referenz-Housekeeping-Gen entsprechend dem ”User Bulletin #2 – Relative Quantitation of Gene Expression – ABI PRISM 7700 Sequence Detection System.”
Quantifizierung der sPLA₂-IIA durch ELISA
Mit Hilfe eines spezifischen Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) wird die zellulär sezernierte sPLA₂-IIA entsprechend der Vorschrift der Firma Caymann Chemical, MI, USA) bis auf wenige kleinere Modifizierungen bestimmt. Dazu zählt der Einsatz weiterer Standardproben mit den Konzentration von 3.9 pg/ml und 7.8 pg/ml und einer verlängerten Inkubation mit dem Ellman's Reagent um die Sensitivität des Assays zu erhöhen. Der zelluläre Proteingehalt als Bezugsgröße wird mittels Bicinchoninic-Acid-Assay (Sigma-Aldrich) bestimmt, in dem Rinderserumalbumin als interner Standard fungiert.
Western-Blot Analyse
Aliquote von konditionierten Zellkulturmedien werden mit 0.2 vol Laemmli-Puffer [25% Glycerol, 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), 5% β-Mercaptoethanol in 60 mM Tris/HCl, pH 6.8] bei 95°C für 5 min vorinkubiert und anschließend die Proteine in 7.5%ic SDS-Polyacrylamid-Gelen elektrophoretisch getrennt. Daran schließt sich der Proteintransfer auf Nitrocellulose-Membranen mittels Semidry-Electroblottings [Transferpuffer: 48 mM Tris, 39 mM Glycin, 0.040% SDS, 20% (v/v) Methanol] an. Nach dem Proteintransfer wird die Nitrocellulose-Membran mit NET-Puffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, pH 7.4, 5 mM EDTA, 0.05% Triton X-100, 5% fettarmes Trockenmild-Pulver) blockiert und mit spezifischen polyklonalen Kaninchen-Anti-sPLA₂-IIA-Antikörpern (1:1000 in NET-Puffer verdünnt, Cayman Chemical (MI, USA)) über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen der Membran mit NET-Puffer erfolgt die Inkubation mit Peroxidase-markierten Anti-Kaninchen-IgG (1:3000 in NET-Puffer verdünnt) für 1 h bei Raumtemperatur und die Visualisierung der sPLA₂-IIA mittels ECL-Systems (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany).
Statistische Auswertungen
Die Ergebnisse stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 3 bis 6-Fachuntersuchungen dar und repräsentieren mindestens 3 unabhängig voneinander durchgeführte Experimente. Die erhaltenen Daten werden mittels ungepaartem Student's t Test statistisch ausgewertet.
2 zeigt die Wirkungen des Atorvastatin (Av) auf die zelluläre sPLA₂-IIA-Sekretion an HASMC nach 48-stündiger Inkubation mit proinflammatorischen Cytokinen (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ; schwarze Balken) in einer Konzentration von 25 ng/ml bzw. nach Inkubation mit proinflammatorischen Cytokinen (25 ng/ml) und gleichzeitigem Zusatz von Atorvastatin in einer Konzentration von 6,5 μmol/l (graue Balken).
Der Zusatz von Cytokinen bzw. Atorvastatin erfolgt hierbei zum Zeitpunkt Null, die Messung der zellulären sPLA₂-IIA-Sekretion erfolgt über ELISA.
Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von Vierfachbestimmungen dar und sind repräsentativ für drei voneinander unabhängig durchgeführten Experimenten. p < 0.05 im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen nach Zusatz der entsprechenden Cytokine, aber ohne Zusatz des Atorvastatins.
Dabei zeigt sich ein starker synergistischer Effekt von Atorvastatin mit IFN-γ hinsichtlich der sPLA₂-IIA-Expression.
In 3 (A bis D) ist die konzentrations- und zeitabhängige Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression in HASMC durch Atorvastin dargestellt. Nach Inkubation der HASMC (Kultivierungsbedingungen s. o.) mit Atorvastatin in unterschiedlichen Konzentrationen (0 bis 20 μmol/l) für 48 h (3A–C) und nach Inkubation der Zellen mit Atorvastatin für unterschiedliche Zeitintervalle (12 bis 72 Stunden, D) in Anwesenheit oder Abwesenheit von IFN-γ (25 ng/ml) wird sowohl auf mRNA-(durch RNA-Extraktrion und Reverse Transkriptase (RT)-PCR-Analyse sowie real-time RT-PCR) als auch auf Proteinebene (mittels ELISA und Western Blot Analyse) die Expression der sPLA₂-IIA bestimmt.
In 3A und B (oben) sind in Form weißer Balken die Ergebnisse der real-time-RT-PCR-Analyse (s. o.) dargestellt als relatives Verhältnis zwischen sPLA₂-IIA-mRNA und GAPDH- mRNA im Vergleich zu den unbehandelten Zellen, wo das Verhältnis von sPLA₂-IIA-mRNA und GAPDH-mRNA gleich 1.0 gesetzt wurde.
In 3A und B (unten) ist der Nachweis der mit Ethidiumbromid-gefärbten Amplifikate der RT-PCR-Analyse (s. o.) in der Agarosegel-Elektrophorese gezeigt (M bezeichnet den 100 bp-Molekulargewichtsstandard).
3C zeigt die sPLA₂-IIA-Proteinfreisetzung in Abhängigkeit von steigender Atorvastatin-Konzentrationen gemeinsam mit IFN-γ.
In 3D ist die Zeitabhängigkeit der sPLA₂-IIA-mRNA-Transkription nach alleiniger und gemeinsamer Inkubation von Atorvastatin und IFN-γ abgebildet.
Die Ergebnisse in 3A und B geben den Mittelwert ± Standardabweichung von Sechsfachbestimmungen und in 3C von Vierfachbestimmungen wieder und repräsentieren die Ergebnisse von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (* p < 0.05 im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen nach Zusatz von IFN-γ, aber ohne Zusatz des Atorvastatin).
Ähnlich dem Atorvastatin wird auch durch Mevastatin eine Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression in HASMC festgestellt (Tabelle 2).
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der sPLA₂-IIA-Expression auf mRNA- und Proteinebene nach Inkubation von HASMC mit Mevastatin und IFN-γ.
Nach 48-stündiger Inkubation mit alleinigem und kombiniertem Zusatz von Mevastatin und IFN-γ wurde die sPLA₂-IIA-mRNA und die ins Medium freigesetzte sPLA₂-IIA bestimmt (Durchführung wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben). Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von Vierfachbestimmungen dar and und sind repräsentativ für drei voneinander unabhängig durchgeführten Experimenten.
* Verhältnis zwischen sPLA₂-IIA/GAPDH-mRNA in Beziehung zu den unbehandelten Kontrollzellen, die mit 1.0 gleichgesetzt wurden. ^† p < 0.005 gegenüber den Kontrollzellen; ^‡ p < 0.001 gegenüber den Kontrollzellen; ^§ p < 0.0005 gegenüber den Kontrollzellen; ^∥ p < 0.0005 gegenüber den Zellen, die mit IFN-γ inkubiert wurden; ^¶ p < 0.001 gegenüber Kontrollzellen; ^# p < 0.005 gegenüber den Zellen, die mit IFN-y inkubiert wurden.
Werden humane HepG2-Hepatomzellen mit Atorvastatin (5 μmol/l) allein und in Kombination mit IFN-y (25 ng/ml) inkubiert, kann ähnlich den HASMC auch an den HepG2-Zellen eine Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression festgestellt werden. Dabei lassen sich mit Hilfe von ELISA-Technik, Western-Blotting und real-time-RT-PCR ebenfalls synergistische Effekte von Atorvastatin und IFN-γ nachweisen (4, A–D).
4 zeigt die Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression nach alleiniger oder kombinierter Inkubation der humanen HepG2-Zellen mit Atorvastatin und IFN-γ für 48 h.
4A zeigt die Ergebnisse der real-time PCR-Analyse: sPLA₂-IIA-mRNA im Verhältnis zur GAPDH-mRNA in Abhängigkeit von Atorvastatin allein und in Kombination mit IFN-y.
In 4B (oben) ist ein Western Blot der von den Zellen sezernierten sPLA₂-IIA unter Verwendung von polyklonalen Anti-sPLA₂-IIA-Antiserum gezeigt, wobei jeweils 30 μg Protein aufgetragen wurden.
4B (unten) zeigt die Quantifizierung der freigesetzten sPLA₂-IIA durch ELISA.
Die Ergebnisse stellen jeweils den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und repräsentieren die Ergebnisse von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (* p < 0.05 im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen).
Ähnliche Ergebnisse werden auch mit Mevastatin an HepG2-Zellen erhalten (Daten sind nicht dargestellt).
Ausführungsbeispiel 2:
Wirkung von Mevalonsäure und Isoprenoiden auf die Statin-vermittelte Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression
Wie 5 zeigt, führt der Zusatz von Mevalonsäure in einer Konzentration von 100 μmol/l zu einer Verminderung der Statin-induzierten Sekretion der sPLA₂-IIA in HASMC. Werden die Zellen gleichzeitig mit Atorvastatin (5 μmol/l) und IFN-γ (25 ng/ml) inkubiert, so führt der Zusatz von Mevalonsäure zu einer Reduktion der sPLA₂-IIA-Freisetzung auf einen Wert, der nach alleiniger Inkubation mit IFN-γ resultiert.
Werden die HASMC mit Farnesylpyrophosphat (FPP) in einer Konzentration von 10 μmol/l, Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) in einer Konzentration von 10 μmol/l, Squalen in einer Konzentration von 25 μmol/l und Cholesterol in einer Konzentration von 50 μmol/l koinkubiert, läßt sich eine verminderte Freisetzung der sPLA₂-IIA durch FPP oder GGPP, nicht aber durch Squalen oder Cholesterol feststellen.
In 5 sind diese Ergebnisse zusammengefaßt. Dabei wird die zelluläre sPLA₂-IIA-Sekretion nach gleichzeitiger Inkubation mit Atorvastatin und IFN-γ ohne Zusatz von Metaboliten gleich 1.0 gesetzt. Die Ergebnisse stellen jeweils den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und repräsentieren die Ergebnisse von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Die Zellkultivierungen und die Bestimmung der sPLA₂-IIA-Freisetzung wird dabei wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben durchgeführt (* p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit Atorvastatin inkubiert wurden; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die gleichzeitig mit Atorvastatin und IFN-γ inkubiert wurden).
Ausführungsbeispiel 3:
Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression durch Inhibitoren der Farnesyltransferase und Geranylgeranyltransferase-I
Erfolgt die Zellkultivierung (s. Ausführungsbeispiel 1) in Gegenwart von Manumycin A, einem Farnesyltransferaseinhibitor, zeigt sich ein signifikanter und konzentrationsabhängiger Anstieg der sPLA₂-IIA-Sekretion nach 24 Stunden Inkubation (s. 6). Wird neben Manumycin A gleichzeitig IFN-y (25 ng/ml) zum Medium zugesetzt, steigt die sPLA₂-IIA-Expression synergistisch an.
Neben der Induktion der sPLA₂-IIA durch Manumycin A läßt sich auch nach Inkubation mit dem GGTase-I Inhibitor GTI-298 eine gesteigerte Sekretion der sPLA₂-IIA feststellen (6). Dabei wirkt GTI-298 ebenfalls synergistisch mit IFN-y (25 ng/ml). Ähnliche Ergebnisse werden mit dem FTase Inhibitor Cys-Val-2-Nal-Met und dem GGTase-I Inhibitor GGTI-286 in HASMC als auch in HepG2-Zellen erzielt (Daten sind hier nicht gezeigt).
In 6 sind die Effekte des Farnesyltransferase-Inhibitors Manumycin A und Geranylgeranyltransferase-Inhibitors GGTI-298 sowohl allein (schwarze Balken) als auch in Kombination mit IFN-γ (25 ng/ml; graue Balken) auf die zelluläre sPLA₂-IIA-Sekretion in HASMC nach 24-stündiger Inkubation gezeigt.
Die Ergebnisse der ELISA-Analyse (Durchführung wie in Ausführungsbeispiel 1) stellen jeweils den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und repräsentieren die Ergebnisse von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (* p < 0.05 im Vergleich zu den Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit den gleichen Konzentration der Inhibitoren, aber ohne IFN-γ inkubiert wurden).
Ausführungsbeispiel 4:
Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression durch Toxin B, Y-27632, H-1152, cAMP-erhöhende Agenzien, PD98059 und U0126
Werden HASMC mit Toxin B (Clostridium difficile Toxin B), Y-27632 bzw. H-1152 (Zellkultivierung wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben) allein und in Kombination mit IFN-γ inkubiert, ist nach 24 h Inkubation ein kontinuierlicher, und im Fall von Y-27632 und H-1152, signifikanter Anstieg der sPLA₂-IIA-Sekretion ins Zellmedium (ELISA-Analyse wie in Ausführungsbeispiel 1) nachweisbar (7).
Gleichzeitig treten synergistische Effekte hinsichtlich der sPLA₂-IIA-Sekretion auf, wenn diese Agenzien mit IFN-γ kombiniert werden.
Ähnliche Ergebnisse lassen sich auch nach Inkubation der Zellen mit cAMP-erhöhenden Agenzien wie 8-bromo-cAMP und Forskolin finden.
In 7 sind diese Effekte zusammengefasst und zeigen die zelluläre sPLA₂-IIA-Sekretion in HASMC nach 24 h Inkubation mit Clostridium difficile toxin B (Toxin B), Y-27632, H-1152, 8-bromo-cAMP (Br-cAMP) und Forskolin ohne (schwarze Balken) und mit (graue Balken) gleichzeitigem Zusatz von IFN-γ (25 ng/ml).
Die Ergebnisse der ELISA-Analyse stellen jeweils den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und repräsentieren die Ergebnisse von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten (* p < 0.05 im Vergleich zu den Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit den gleichen Konzentration der Inhibitoren, aber ohne IFN-γ inkubiert wurden).
Wird die Hemmung der MEK als Komponente des Ras/Raf/MEK/ERK-Signalweges mit Hilfe der Inhibitoren PD98059 und U0126 untersucht, so zeigt sich ein signifikanter Anstieg der sPLA₂-IIA-Sekretion nach alleiniger Inkubation der Zellen mit PD98059 in einer Konzentration von 25–50 μmol/l (8). Dabei lassen sich ebenfalls synergistische Effekte in HASMC mit PD98059 bzw. U0126 und IFN-γ finden. 8 zeigt die Wirkungen der MEK Inhibitoren, PD98059 und U0126, in Ab-(schwarze Balken) und Anwesenheit (graue Balken) von IFN-γ (25 ng/ml) auf die sPLA₂-IIA-Freisetzung in HASMC nach 24 stündiger Inkubation. Die Ergebnisse stellen jeweils den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und repräsentieren die Ergebnisse von drei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten.
Zellkultivierung und Bestimmung der sPLA₂-IIA-Freisetzung erfolgen dabei wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben (* p < 0.05 im Vergleich zu den Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit den gleichen Konzentration der Inhibitoren, aber ohne IFN-γ inkubiert wurden).
Ausführungsbeispiel 5
Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression durch Wortmannin als PI3-Kinase Inhibitor
In 9 ist die Wirkung von Wortmannin in einer Konzentration von 0,5 μmol/l auf die sPLA₂-IIA-Expression an HASMC nach 24-stündiger Inkubation allein und in Kombination mit IFN-γ (25 ng/ml) gezeigt (weiße Balken). Zellkultivierung und Bestimmung der sPLA₂-IIA-Freisetzung erfolgen dabei wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und sind repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführter Experimente (* p < 0.05 im Vergleich zu den Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit den gleichen Konzentration der Inhibitoren, aber ohne IFN-γ inkubiert wurden).
Ausführungsbeispiel 6
Wirkungen von Lysophosphatidylsäure (LPA) allein und in Kombination mit IFN-γ und Br-cAMP auf die sPLA₂-IIA-Expression in HASMC
10 zeigt die Hochregulation der sPLA₂-IIA-Expression (weiße Balken) nach 48-stündiger Inkubation der HASMC mit Lysophosphatidylsäure (LPA, 30 μmol/l)) allein und in Kombination mit IFN-γ (25 ng/ml) und Brom-cAMP (0,5 mmol/l). Zellkultivierung und Bestimmung der sPLA₂-IIA-Freisetzung erfolgen dabei wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und sind repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführter Experimente (* p < 0.05 im Vergleich zu den Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit den gleichen Konzentration der Inhibitoren, aber ohne IFN-γ inkubiert wurden).
Ausführungsbeispiel 7
Wirkungen von Acetylcholin allein und in Kombination mit IFN-γ und Br-cAMP auf die sPLA₂-IIA-Expression in HASMC
11 zeigt die zelluläre sPLA₂-II-Sekretion (weiße Balken) nach 48-stündiger Inkubation der HASMC mit Acetylcholin (10 μmol/l) allein und in Kombination mit IFN-γ (25 ng/ml) und Brom-cAMP (0,5 mmol/l). Zellkultivierung und Bestimmung der sPLA₂-IIA-Freisetzung erfolgen dabei wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und sind repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführter Experimente (* p < 0.05 im Vergleich zu den Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit den gleichen Konzentration der Inhibitoren, aber ohne IFN-γ inkubiert wurden).
Ausführungsbeispiel 8
Zelluläre sPLA₂-IIA-Expression in HASMC nach gemeinsamer Inkubation mit MEK-Inhibitoren, Statinen und IFN-γ
In 12 ist die Hochregulation der sPLA₂-IIA-Sekretion (weiße Balken) in HASMC durch Kombination von PD98059 (MEK-Inhibitor) in einer Konzentration von 50 μmol/l und IFN-γ (25 ng/ml) mit Mevastatin (30 μmol/l) nach 48-stündiger Inkubation gezeigt. Zellkultivierung und Bestimmung der sPLA₂-IIA-Freisetzung erfolgen dabei wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und sind repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführter Experimente (* p < 0.05 im Vergleich zu den Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit den gleichen Konzentration der Inhibitoren, aber ohne IFN-γ inkubiert wurden).
Ausführungsbeispiel 9:
Kombinatorische Wirkung von Rho-Inhibitor, GSK-3β-Inhibitor und IFN-γ auf die sPLA₂-IIA-Sekretion in HASMC
13 zeigt die Induktion der sPLA₂-IIA-Sekretion in HASMC (weiße Balken) durch Inkubation mit Clostridium difficile Toxin B (TcdB) in einer Konzentration von 10 ng/ml und Indirubin (50 nmol/l) allein und in Kombination mit IFN-γ (25 ng/mol) für 48 h. Zellkultivierung und Bestimmung der sPLA₂-IIA-Freisetzung erfolgen dabei wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und sind repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführter Experimente (* p < 0.05 im Vergleich zu den Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit den gleichen Konzentration der Inhibitoren, aber ohne IFN-γ inkubiert wurden).
Ausführungsbeispiel 10:
Blockierung der Toxin B-, PD98059- und Statin-induzierten sPLA₂-IIA-Sekretion durch Inhibierung des Jak/STAT- and NFκB-Signalweges in HASMC
14 zeigt die Blockierung der durch Clostridium difficile Toxin B (TcdB) in einer Konzentration von 10 ng/ml, PD98059 (50 μmol/l) und Mevastatin (5 μmol/l) vermittelten Induktion der sPLA₂-IIA-Freisetzung in HASMC durch den Jak2-Inhibitor AG-490 (50 μmol/l) und den NFκB-Inhibitor CAPE (25 μmol/l) allein und in Kombination mit IFN-γ (25 ng/ml) nach 48-stündiger Inkubation. Die Zellkultivierung und die Bestimmung der sPLA₂-IIA-Freisetzung werden wie in Ausführungsbeispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± Standardabweichung von Dreifachbestimmungen dar und sind repräsentativ für drei unabhängig voneinander durchgeführter Experimente. (* p < 0.05 im Vergleich zu den Kontrollzellen; ** p < 0.05 im Vergleich zu den Zellen, die mit den gleichen Konzentration der Inhibitoren, aber ohne IFN-γ inkubiert wurden).
AG-490 und CAPE blockieren komplett die IFN-γ-abhängige Hochregulation der sPLA₂-IIA. Ähnliche Effekte können mit PDTC und PSI als weitere NFκB-Inhibitoren beobachtet werden (Daten sind hier nicht gezeigt). Außerdem hemmt AG-490 den Effekt von Toxin B und PD98059 auf die sPLA₂-IIA-Sekretion. Ähnliches trifft für CAPE zu. Schließlich kann auch der synergistische Effekt von Mevastatin und IFN-γ durch AG-490 und CAPE komplett inhibiert werden.
Abkürzungsverzeichnis
In der Erfindungsbeschreibung werden folgene Abkürzungen verwendet:

μM:: μMol/l
6-FAM:: 6-Carboxyflourescein
AG-490:: Tyrphostin B42
APC:: aktiviertes Protein C
ATP:: Adenosin-triphosphat
cAMP:: zyklisches Adenosin-monophosphat
Bp:: Basenpaare
BPIP:: bactericidal/permeability-increasing protein
Br-cAMP:: 6-bromo-cAMP
cAMP:: cyclisches Adenosin-3',5'-monophosphat
CAPE:: Caffeic acid phenethyl ester
CAS:: chemical abstract service
Dabcyl:: 4-Dimethylaminophenylazo-Benzoesäure
DNA:: Desoxyribonukleinsäure
E. coli:: Escheichia coli
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA:: enzyme linked immunosorbent assay
ERK:: extracellular signal-regulated kinase
FCS:: fetal calf serum
Fig.:: Figur
FPP:: Farnesylpyrophosphat
FTase:: Farnesyltransferase
FTI:: Farnesyltransferase Inhibitor
GAPDH:: Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase
GGPP:: Geranylgeranylpyrophosphat
GGTase:: Geranylgeranyl Transferase
GGTI:: Geranylgeranyl Transferase-I Inhibitor
GSK-3β:: Glykogensynthasekinase-3β
HASMC:: human aortic smooth muscle cells
HMG-CoA:: 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A
IFN-γ:: Interferon-γ
IgG:: Immunglobulin G
IL-1β:: Interleukin-1β
IL-6:: Interleukin-6
Jak:: Janus Tyrosinkinase
kDa:: Kilodalton
MEK:: mitogen-activated protein kinase Kinase
mM:: mMol/l
mRNA:: messenger RNA
NFκB:: nuclear factor-κB
p:: probability
PBS:: phosphate-buffered saline
PCR:: polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion
PDTC:: Pyrrolidin Dithiocarbamat
PGI2:: Prostacyclin
PI3-Kinase:: Phosphoinositid-3-Kinase
PKA:: Protein Kinase A
PP:: Pyrophosphat
PSI:: Proteasom Inhibitor
RNA:: Ribonukleinsäure
RT:: Reverse Transkriptase
s.:: siehe
S.: aureus: Staphylococcus aureus
S.: typhimurium: Salmonella typhimurium
SDS:: sodium dodecyl sulfate
sPLA₂-IIA:: secretory phospholipase A₂ of type IIA
STAT:: signal transducer and activator of transcription
TcdB:: Clostridium difficile toxin B
TF:: tissue factor
TNF-α:: Tumor Necrosis Factor-α
Toxin B:: Clostridium difficile Toxin B
z. B.:: zum Beispiel

Literaturverzeichnis

1 Mounier C, Vargaftig BB, Franken PA, Verheij HM, Bon C, Touqui L. Platelet secretory phospholipase A2 fails to induce rabbit platelet activation and to release arachidonic acid in contrast with venom phospholipases A2. Biochim Biophys Acta. 1994 Aug 25; 1214(1): 88–96.
2 Inada M, Tojo H, Kawata S, Tarui S, Okamoto M. Preferential distribution of group-II-like phospholipase A2 in mononuclear phagocytic cells in rat spleen and liver. Eur J Biochem. 1991 Apr 23; 197(2): 323–9.
3 Nevalainen T, Haapanen T. Distribution of pancreatic (group I) and synovial-type (group II) phospholipase A₂ in human tissue. Inflammation 1993; 17: 453–464.
4 Andersen S, Sjursen W, Laegreid A, Austgulen R, Johansen B. Immunohistologic detection of non-pancreatic phospholipase A2 (type II) in human placenta and its possible involvement in normal parturition at term. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 1994 Jul; 51(1): 19–26.
5 Takayama K, Hara S, Kudo I, Inoue K. Detection of 14-kDa group II phospholipase A2 in human seminal plasma. Biochem Biophys Res Commun. 1991 Aug 15; 178(3): 1505–11.
6 Nevalainen TJ, Meri K-M, Niemi M. Synovial type (group II) phospholipase A₂ in human seminal plasma. Andrologia 1993; 25: 355–330.
7 Nevalainen TJ, Aho HJ, Peuravuori H. Secretion of group 2 phospholipase A₂ by lacrimal gland. Invest. Ophthalmol. Visc Sci 1994; 32: 417–421.
8 Kramer RM, Hession C, Johansen B, Hayes G, McGray P, Chow EP, Tizard R, Pepinsky RB. Structure and properties of a human non-pancreatic phospholipase A2. J Biol Chem. 1989 Apr 5; 264(10): 5768–75.
9 Pruzanski W, Bogoch B, Katz A, Wloch M, Stefanski B, Grouix B, Sakotic G, Vadas P. Induction of release of secretory nonpancreatic phospholipase A₂ from human articular chondrocytes. J Rheumatol 1995; 22: 2114–2119.
10 Crowl RM, Stoller TJ, Conroy RR, Stoner CR. Induction of phospholipase A₂ gene expression in human hepatoma cells by mediators of the acute-phase response. J Biol Chem 1991; 266: 2647–2651.
11 Kudo I, Murakami M, Hara S, Inoue K. Mammalian non-pancreatic phospholipases A₂. Biochim Biophys Acta 1993; 1170: 217.
12 Murakami M, Kudo I, Inoue K. Secretory phospholipases A₂. J Lipid Mediat Cell Signal 1995; 12: 119–130.
13 Vadas P. Elevated plasma phospholipase A₂ levels: correlation with hemodynamic and pulmonary changes in gram-negative septic shock. J Lab Clin Med 1984; 104: 873–881.
14 Green J-A, Smith GM, Buchta R, Lee R, Ho KY, Rajkovic IA, Scott KF. Circulating phospholipase A₂ activity associated with sepsis and septic shock is indistinguishable from that associated with rheumatoid arthritis. Inflammation 1991; 15: 355–367.
15 Vadas P, Pruzanski W. Induction of group II phospholipase A₂ expression and pathogenesis of the sepsis syndrome. Circ Shock 1993; 39: 160–167.
16 Büchler M, Malfertheiner P. Schädlich H, Nevalainen TJ, Friess H, Beger HG. Role of phospholipase A₂ in human acute pancreatitis. Gastroenterology 1989; 97: 1521–1526.
17 Büchler M, Deller A, Malfertheiner P, Kleine HO, Wiedeck H, Uhl W, Samtner M, Friess H, Nevalainen TJ, Beger HG. Serum phospholipase A₂ in intensive care patients with peritonitis, multiple injury, and necrotizing pancreatitis. Klin Wochenschr 1989; 67: 217–221.
18 Grönroos JM, Forsström JJ, Irjala K, Nevalainen TJ. Phospholipase A₂, C-reactive protein, and white blood cell count in the diagnosis of acute appendicitis. Clin Chem 1994; 40: 1757–1760.
19 Pruzanski W, Vadas P, Stefanski E, Urowitz MB. Phospholipase A₂ activity in sera and synovial fluids in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. J Rheumatol 1985; 12: 211–216.
20 Pruzanski W, Keystone B, Sternby B, Bombardier C, Snow KM, Vadas P. Serum phospholipase A₂ levels correlate with disease activity in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 1988; 15: 1351–1355.
21 Ogawa M. Group II phospholipase A₂ in neoplastic diseases. In Phospholipase A₂. Basic and Clinical Aspects in Inflammatory Diseases. Uhl W, Nevalainen TJ, Büchler MW, editors, Karger, Basel, 1997; pp 200–204.
22 Nevalainen TJ, Grönroos JM. Serum phospholipases A₂ in inflammatory diseases. In Phospholipase A₂. Basic and Clinical Aspects in Inflammatory Diseases. Uhl W, Nevalainen TJ, Büchler MW, editors, Karger, Basel, 1997; 104–107.
23 Elsbach P, Weiss J, Franson RC, Beckerdite-Quagliata S, Schneider A, Harris L. Separation and purification of a potent bactericidal/permeability-increasing protein and a closely associated phospholipase A2 from rabbit polymorphonuclear leukocytes. Observations on their relationship. J Biol Chem. 1979 Nov 10; 254(21): 11000–9.
24 Weinrauch Y, Elsbach P, Madsen LM, Foreman A, Weiss J. The potent anti-Staphylococcus aureus activity of a sterile rabbit inflammatory fluid is due to a 14-kD phospholipase A2. J Clin Invest. 1996 Jan 1; 97(1): 250–7.
25 Weinrauch Y, Abad C, Liang NS, Lowry SF, Weiss J. Mobilization of potent plasma bactericidal activity during systemic bacterial challenge. Role of group IIA phospholipase A2. J Clin Invest. 1998 Aug 1; 102(3): 633–8.
26 Vadas P, Browning J, Edelson J, Pruzanski W. Extracellular phospholipase A2 expression and inflammation: the relationship with associated disease states. J Lipid Mediat. 1993 Aug; 8(1): 1–30.
27 Qu XD, Lehrer RI. Secretory phospholipase A2 is the principal bactericide for staphylococci and other gram-positive bacteria in human tears. Infect Immun. 1998 Jun; 66(6): 2791–7.
28 Nevalainen TJ, Haapanen TJ. Distribution of pancreatic (group I) and synovial-type (group II) phospholipases A2 in human tissues. Inflammation. 1993 Aug; 17(4): 453–64.
29 Vadas P, Browning J, Edelson J, Pruzanski W. Extracellular phospholipase A2 expression and inflammation: the relationship with associated disease states. J Lipid Mediat. 1993 Aug; 8(1): 1–30.
30 Murakami M, Nakatani Y, Atsumi G, Inoue K, Kudo I. Regulatory functions of phospholipase A2. Crit Rev Immunol. 1997; 17(3-4): 225–83.
31 Buckland AG, Wilton DC. The antibacterial properties of secreted phospholipases A(2). Biochim Biophys Acta. 2000 Oct 31; 1488(1-2): 71–82.
32 Foreman-Wykert AK, Weinrauch Y, Elsbach P. Weiss J. Cell-wall determinants of the bactericidal action of group IIA phospholipase A2 against Gram-positive bacteria. J Clin Invest. 1999 Mar; 103(5): 715–21.
33 Weiss J, Inada M, Elsbach P, Crowl RM. Structural determinants of the action against Escherichia coli of a human inflammatory fluid phospholipase A2 in concert with polymorphonuclear leukocytes. J Biol Chem. 1994 Oct 21; 269(42): 26331–7.
34 Buckland AG, Heeley EL, Wilton DC. Bacterial cell membrane hydrolysis by secreted phospholipases A(2): a major physiological role of human group IIa sPLA(2) involving both bacterial cell wall penetration and interfacial catalysis. Biochim Biophys Acta. 2000 Apr 12; 1484(2-3): 195–206.
35 Koduri RS, Gronroos JO, Laie VJ, Le Calvez C, Lambeau G, Nevalainen TJ, Gelb M. H. Bactericidal properties of human and murine groups I, II, V, X, and XII secreted phospholipases A(2), J Biol Chem. 2002 Feb 22; 277(8): 5849–57.
36 Laie VJ, Grass DS, Nevalainen TJ. Protection by group II phospholipase A2 against Staphylococcus aureus. J Immunol. 1999 Jun 15; 162(12): 7402–8.
37 Laie VJ, Grass DS, Nevalainen TJ. Resistance of transgenic mice expressing human group II phospholipase A2 to Escherichia coli infection. Infect Immun. 2000 Jan; 68(1): 87–92.
38 Eskandari MX, Bolgos G, Miller C, Nguyen DT, DeForge LE, Remick DG. Antitumor necrosis factor antibody therapy fails to prevent lethality after cecal ligation and puncture or endotoxemia. J Immunol. 1992 May 1; 148(9): 2724–30.
39 Echtenacher B, Weigl K, Lehn N, Mannel DN. Tumor necrosis factor-dependent adhesions as a major protective mechanism early in septic peritonitis in mice. Infect Immun. 2001 Jun; 69(6): 3550–5.
40 Opal SM, Cross AS, Jhung JW, Young LD, Palardy JE, Parejo NA, Donsqky C. Potential hazards of combination immunotherapy in the treatment of experimental septic shock. J Infect Dis. 1996 Jun; 173(6): 1415–21.
41 Fisher CJ Jr, Agosti JM, Opal SM, Lowry SF, Balk RA, Sadoff JC, Abraham E, Schein RM, Benjamin E. Treatment of septic shock with the tumor necrosis factor receptor:Fc fusion protein. The Soluble TNF Receptor Sepsis Study Group. N Engl J Med. 1996 Jun 27; 334(26): 1697–702.
42 Keane J, Gershon S, Wise RP, Mirabile-Levens B, Kasznica J, Schwieterman WD, Siegel JN, Braun MM. Tuberculosis associated with infliximab, a tumor necrosis factor alpha-neutralizing agent. N Engl J Med. 2001 Oct 11; 345(15): 1098–104.
43 Bernard GR, Vincent JL, Laterre PF, LaRosa SP; Dhainaut JF, Lopez-Rodriguez A, Steingrub JS, Garber GE, Helterbrand JD, Ely EW, Fisher CJ Jr; Recombinant human protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis (PROWESS) study group. Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis. N Engl J Med. 2001 Mar 8; 344(10): 699–709.
44 Matthay MA. Severe sepsis--a new treatment with both anticoagulant and antiinflammatory properties. N Engl J Med. 2001 Mar 8; 344(10): 759–62.
45 Warren BL, Eid A, Singer P, Pillay SS, Carl P, Novak I, Chalupa P, Atherstone A, Penes I, Kubler A, Knaub S, Keinecke HO, Heinrichs H, Schindel F, Juers M, Bone RC, Opal SM; KyberSept Trial Study Group. Caring for the critically ill patient. Highdose antithrombin III in severe sepsis: a randomized controlled trial. JAMA. 2001 Oct 17; 286(15): 1869–78.
46 Joyce DE, Gelbert L, Ciaccia A, DeHoff B, Grinnell BW. Gene expression profile of antithrombotic protein c defines new mechanisms modulating inflammation and apoptosis. J Biol Chem. 2001 Apr 6; 276(14): 11199–203.
47 Zhang Y, Lemasters J, Herman B. Secretory group IIA phospholipase A(2) generates anti-apoptotic survival signals in kidney fibroblasts. J Biol Chem. 1999 Sep 24; 274(39): 27726–33.
48 Fonteh AN, Marion CR, Barham BJ, Edens MB, Atsumi G, Samet JM, High KP, Chilton FH. Enhancement of mast cell survival: a novel function of some secretory phospholipase A(2) isotypes. J Immunol. 2001 Oct 15; 167(8): 4161–71.
49 Mounier C, Franken PA, Verheij HM, Bon C. The anticoagulant effect of the human secretory phospholipase A₂ on blood plasma and on a cell-free system is due to a phospholipid-independent mechanism of action involving the inhibition of factor Va. Eur J Biochem 1996; 237: 778–785.
50 Mounier CM, Hackeng TM, Schaeffer F, Faure G, Bon C, Griffin JH. Inhibition of prothrombinase by human secretory phospholipase A₂ involves binding to factor Xa. J Biol Chem. 1998; 273: 23764–23772.
51 Billy D, Speijer H, Zwaal RF, Hack EC, Hermens WT. Anticoagulant and membranedegrading effects of secretory (non-pancreatic) phospholipase A₂ are inhibited in plasma. Thromb Haemost 2002; 87: 978–984.
52 Cirino G, Cicala C, Sorrentino L, Browning JL. Human recombinant non pancreatic secreted platelet phospholipase A2 has anticoagulant activity in vitro on human plasma. Thromb Res. 1993; 70: 337–342.
53 Inada M, Crowl RM, Bekkers AC, Verheij H, Weiss J. Determinants of the inhibitory action of purified 14-kDa phospholipases A2 on cell-free prothrombinase complex. J Biol Chem. 1994; 269: 26338–26343.
54 Mounier CM, Luchetta P, Lecut C, Koduri RS, Faure G, Lambeau G, Valentin B, Singer A, Ghomashchi F, Beguin S, Gelb MH, Bon C. Basic residues of human group IIA phospholipase A2 are important for binding to factor Xa and prothrombinase inhibition comparison with other mammalian secreted phospholipases A2. Eur J Biochem. 2000; 267: 4960–4969.
55 Stefansson S, Kini RM, Evans HJ. The basic phospholipase A2 from Naja nigricollis venom inhibits the prothrombinase complex by a novel nonenzymatic mechanism. Biochemistry. 1990; 29: 7742–7746.
56 Kerns RT, Kini RM, Stefansson S, Evans HJ. Targeting of venom phospholipases: the strongly anticoagulant phospholipase A(2) from Naja nigricollis venom binds to coagulation factor Xa to inhibit the prothrombinase complex. Arch Biochem Biophys. 1999; 369: 107–113.
57 Lang P, Gesbert F, Delespine-Carmagnat M, Stancou R, Pouchelet M, Bertoglio J. Protein kinase A phosphhorylation of RhoA mediates the morphological and functional effects of cyclic cAMP in cytotoxic lymphocytes. EMBO J. 1996; 15: 510–519.
58 Dong JM, LeungT, Manser E, Lim L. cAMP-induced morphological changes are counteracted by the activated RhoA small GTPase and the Rho kinase ROKalpha. J Biol Chem. 1998; 273: 22554–22562.
59 Ciullo I, Diez-Roux G, Di Domenico M, Migliaccio A, Avvedimento EV. cAMP signaling selectively influences Ras effectros pathways. Oncogene. 2001 20: 1186–92.
60 Fang X, Yu S, Tanyi JL, Lu Y, Woodgett JR, Mills GB. Convergence of multiple signaling cascades at glycogen synthase kinase 3: Edg receptor-mediated phosphorylation and inactivation by lysophosphatidic acid through a protein kinase C-dependent intracellular pathway. Mol Cell Biol. 2002 Apr; 22(7): 2099–110.
61 Crowl R, Stoner C, Stoller T, Pan YC, Conroy R. Isolation and characterization of cDNA clones from human placenta coding for phospholipase A₂, Adv Exp Med Biol. 1990; 279: 173–184.
62 Ercolani L, Florence B, Denaro M, Alexander M. Isolation and complete sequence of a functional human glyceraldehyde-3-Phosphate dehydrogenase gene. J Biol Chem 1988; 263: 15335–41
63 Gerson RJ, MacDonald JS, Alberts AW, Kornbrust DJ, Majka JA, Stubbs RJ, Bokelman DL. Animal safety and toxicology of simvastatin and related hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors. Am J Med 1989; 87: 28S–38S

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verwendung einer Kombination aus a. mindestens einem Inhibitor der Rho-Kinase oder von RhoA und b. mindestens einem Inhibitor der GlykogensynthaseKinase-3β (GSK-3β) und c. Interferon-γ (IFN-γ) zur präventiven und/oder therapeutischen Behandlung von bakteriell bedingten Infektionserkrankungen oder der Sepsis.
Verwendung einer Kombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor der Glykogensynthasekinase-3β 5-Iodo-Indirubin-3'-monoxim (Indirubin) ist.
Verwendung einer Kombination nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor der Rho-Kinase (R)-(+)-trans-N-(4-Pyridyl)-4-(1-aminoethyl)cyclohexanecarboxamid (Y-27632) oder (S)-(+)-2-Methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonyl]homopiperazin (H1152) oder dass der Inhibitor von RhoA Toxin B (TcdB) ist.
Verwendung einer Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination zusätzlich mindestens einen Inhibitor der mitogen-activated Protein kinase Kinase (MEK) und/oder mindestens einen Inhibitor der 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase) enthält.
Verwendung einer Kombination nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor der MEK 2'-Amino-3'-methoxyflavon (PD98059) oder 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2-aminophenylthio)butadien (U0126) ist.
Verwendung einer Kombination nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor der HMG-CoA-Reduktase Mevastatin, Lovastatin, Simvastatin, Atorvastatin, Fluvastatin oder Pravastatin ist.
Verwendung einer Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination zusätzlich mindestens einen Aktivator der Proteinkinase A (PKA) ausgewählt aus Forskolin (7β-Acetoxy-8,13-epoxy-6β-hydroxy-labd-14-en-11-on), Theophyllin, ATP oder 8-Brom-cAMP enthält.
Verwendung einer Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination zusätzlich Acetylcholin und/oder Lysophosphatidylsäure (LPA) enthält.
Verwendung einer Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination zusätzlich mindestens einen Inhibitor der Farnesyltransferase und/oder mindestens einen Inhibitor der Geranylgeranyltransferase und/oder mindestens einen Inhibitor der PI3-Kinase (Phosphatidylinositol-3-Kinase) enthält.