DE102004017956B4

DE102004017956B4 - Verfahren zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe

Info

Publication number: DE102004017956B4
Application number: DE102004017956.5A
Authority: DE
Inventors: Frank Schreiber
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2004-04-14
Filing date: 2004-04-14
Publication date: 2022-07-07
Anticipated expiration: 2024-04-15
Also published as: DE102004017956A1; US20050230610A1; US7394063B2

Abstract

Verfahren zur Untersuchung einer Lebensdauer angeregter Zustände von Probenfarbstoffen in einer Probe (27) unter Verwendung eines Mikroskops mit mindestens einer Lichtquelle, die einen Halbleiterlaser (3), der gepulstes Anregungslicht (11) emittiert, und zumindest einen weiteren Halbleiterlaser (5), der weiteres gepulstes Anregungslicht (11) emittiert, beinhaltet, und mit mindestens einem Detektor, der von der Probe (27) ausgehendes Detektionslicht empfängt, wobei der Halbleiterlaser (3) und der zumindest eine weitere Halbleiterlaser (5) aufeinander synchronisiert sind, mit den Schritten:
Anregen der Probenfarbstoffe mit Anregungslicht (11) des Halbleiterlasers (3) und des zumindest einen weiteren Halbleiterlasers (5) und
Einstellen der Puls-Repetitionsrate auf die spezifischen Lebensdauereigenschaften der Probenfarbstoffe in der Probe (27).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein konfokales Rastermikroskop zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe mit mindestens einer Lichtquelle, die Anregungslicht erzeugt, und mit mindestens einem Detektor, der von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt.
Durch die Untersuchung der Lebensdauer der angeregten Zustände einer Probe bzw. eines Fluorophors lassen sich wichtige Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Probe ziehen. Insbesondere wenn mehrere Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden, kann mit Hilfe der Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) eine Identifikation und eine Unterscheidung der Fluorophore ermöglicht werden.
Aus EP 0 681 695 B1 ist eine Vorrichtung zur quantitativen Abbildung von mehreren Fluorophoren bekannt. Die Vorrichtung beinhaltet ein Mittel zum Führen von zwei Abtaststrahlen kontinuierlicher elektromagnetischer Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge. Die Intensität jedes Strahls ist mit verschiedenen Modulationsfrequenzen sinusförmig moduliert. Die modulierte Detektionsstrahlung wird mit Hilfe von Lock-in-Technik den jeweiligen Anregungswellenlängen zugeordnet.
Aus DE 101 44 435 A1 ist ein Verfahren und eine Anordnung zur Erzeugung von zeit- und ortsaufgelösten sowie zeit- und wellenlängenaufgelösten Fluoreszenzbildern bekannt. Die Anordnung basiert auf der gepulsten Fluoreszenzanregung mit einem Femto- oder Pikosekundenlaser, wobei die Detektion zeit- und ortskorreliert in einer Einzelphotonenzählung erfolgt.
Aus den Veröffentlichungen WESTPHAL, V. [et al.]: Laser-diode-stimulated emission depletion microscopy. In: Appl. Phys. Lett. 82, 3125 (2003) und KLAR, Thomas A. [et al.]: Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission. In: Proceedings of the National Academy of Sciences, 97 (15), 18.7.2000;8206 - 8210, und der DE 102 35 914 A1 sind STED-Mikroskopieverfahren bekannt, bei welchen Lichtpulse zur Anregung einer Fluoreszenzprobe mit Lichtpulsen zur stimulierten Abregung der Fluoreszenzprobe synchronisiert sind.
In der Rastermikroskopie (Scanmikroskopie) wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so daß ein Spiegel in xund der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen.
Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.
Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
In der konfokalen Scanmikroskopie kann im Falle der Zweiphotonenanregung (oder Mehrphotonenanregung) auf eine Detektionsblende verzichtet werden, da die Anregungswahrscheinlichkeit vom Quadrat der Photonendichte und damit vom Quadrat der Beleuchtungslichtintensität abhängt, die naturgemäß im Fokus viel höher ist als in den Nachbarregionen. Das zu detektierende Fluoreszenzlicht stammt daher mit großer Wahrscheinlichkeit zum aller größten Teil aus der Fokusregion, was eine weitere Differenzierung von Fluoreszenzphotonen aus dem Fokusbereich von Fluoreszenzphotonen aus den Nachbarbereichen mit einer Blendenanordnung überflüssig macht.
In diesem Fall kann eine Non-Descan-Detektion erfolgen, bei der das Detektionslicht nicht (wie bei der Descan-Anordnung) über die Strahlablenkeinrichtung und durch den Strahlteiler zur Beleuchtungslichteinkopplung zum Detektor gelangt, sondern direkt nach dem Objektiv mit Hilfe eines dichroitischen Strahlteilers ausgelenkt und detektiert wird. Anordnungen dieser Art sind beispielsweise aus der Veröffentlichung von David. W. Piston et al. „Two-photon-excitation fluorescence imaging of three dimensional calcium-ion activity“, Applied Optics, Vol. 33, No. 4, Feb 1996, und aus Piston et al: „Time-Resolved Fluorescence Imaging and Background Rejection by Two-Photon Excitation in Laser Scanning Microscopy“, SPIE Vol. 1640 bekannt.
Lifetime Imaging auf der Basis der zeitkorrelierten Einzelphotonenmessung wird üblicherweise mit Infrarotpulslasern mit ca. 80 MHz Repetitionsrate in Multiphotonenanregung (meist Zweiphotonenanregung) realisiert. Diese gepulsten Infrarotlaser (meist modenverkoppelte Titansaphirlaser) sind sehr teuer und sehr aufwendig. Die Pulsrepetitionsrate dieser Laser hängt direkt von der Resonatorlänge ab und lässt sich daher nicht variieren. Insbesondere bei Fluoreszenzfarbstoffen mit längerer Lebensdauer steigt die Wahrscheinlichkeit, dass angeregte Fluorophore bis zum Eintreffen des nächsten Anregungspulses nicht wieder in den Grundzustand gelangt sind. Da in diesen Fällen der nächste Anregungspuls als Zeitbasis dient, führt dies zu falschen Messergebnissen. Ein weiterer Nachteil der bekannten Anordnungen auf der Basis von gepulsten Titansaphirlasern beruht darauf, das die Titansaphirlaser bauartbedingt Anregungslicht im Bereich von etwa 800 nm (ca. 720-980nm) emittieren, so dass nur spezifische auf diese Wellenlänge abgestimmte Farbstoffe untersucht und verwendet werden können.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Mikroskop zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe bzw. eines Fluorophors anzugeben, das einerseits eine zeiteffiziente auf die jeweiligen Fluorophore bzw. Proben anpassbare Messung ermöglicht und das es erlaubt, beliebige Probenfarbstoffe mit beliebigen Anregungsspektren zu verwenden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Ein Mikroskop beinhaltet eine Lichtquelle, die einen Halbleiterlaser, der gepulstes Anregungslicht emittiert, und zumindest einen weiteren Halbleiterlaser. Der Halbleiterlaser und der zumindest eine weitere Halbleiterlaser sind aufeinander synchronisiert. Eine Einstellvorrichtung ist zur Einstellung der Puls-Repetitionsrate auf die spezifischen Lebensdauereigenschaften der Probe vorgesehen.
Die Erfindung hat den Vorteil, dass die Pulsrepetitionsrate des Halbleiterlasers beispielsweise durch eine wenig aufwendige Steuerung des elektrischen Pumpstromes auf die Lebensdauer der zu untersuchenden Probenfarbstoffe eingestellt werden kann. Hierdurch wird vorteilhafterweise die Zahl an Detektionsphotonen optimiert, was letztlich zu einem wesentlich genaueren Untersuchungsergebnis bezüglich der Fluoreszenzlebensdauer führt. Ein anderer Vorteil des erfindungsgemäßen Mikroskops beruht darauf, dass die Detektion sowohl in Descan- als auch in Non-Descan-Detektionsanordnung erfolgen kann.
Durch die Möglichkeit der Anpassung der Repetitionsrate des Lasers an die Lebensdauer der Fluoreszenzfarbstoffe kann der Effekt, dass angeregte Fluorophore bis zum Eintreffen des nächsten Anregungspulses nicht wieder in den Grundzustand gelangt sind, wirkungsvoll vermieden werden
Insbesondere bei Fluoreszenzfarbstoffen mit kurzer Lebensdauer wird keine Messzeit ungenutzt verschenkt. Der Effekt, dass Fluorophore nach der Anregung mit einem Lichtpuls längst wieder im Grundzustand angelangt sind bevor der nächste Lichtpuls eintrifft, kann erfindungsgemäß wirkungsvoll vermieden werden.
Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass Halbleiterlaser beliebiger Ausgangswellenlänge verwendbar sind, so dass keine Einschränkung bezüglich der Verwendung von Probenfarbstoffen mit Anregungsspektren im nahen Infrarotbereich (bzw. im UV-Bereich bei Zweiphotonenanregung) mehr besteht.
Alle diese Vorteile werden erreicht, ohne auf das Prinzip der zeitkorrelierten Einzelphotonenmessung zugunsten der weniger genauen sinusförmigen Anregungsmodulation verzichten zu müssen.
Die Anregung der Probe umfasst in einer bevorzugten Ausgestaltungsvariante einen Einphotonenübergang, wobei die Detektion bei dieser Variante in Descan-Anordnung hinter dem Detektionspinhole erfolgt.
In einer anderen Ausgestaltungsform erfolgt die Anregung der Probe über einen Mehrphotonenübergang, beispielsweise einen Zweiphotonenübergang. In dieser Variante ist es besonders vorteilhaft, die Detektion in Non-Descan-Anordnung vorzunehmen, da auf diesem Detektionsweg weniger Licht verloren geht, als auf dem Lichtweg der Descan-Detektion. Dennoch ist es - zur Anpassung an spezielle Experimentierbedingungen - möglich, auch bei Mehrphotonenanregung in Descan-Detektion zu detektieren.
Die Lichtquelle beinhaltet zumindest einen weiteren Halbleiterlaser. So können Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Anregungsspektren gleichzeitig oder sequenziell angeregt werden. Bei mehreren Probenfarbstoffen mit unterschiedlichen Lebensdauern in der Probe können die Repetitionsraten in dieser Variante gezielt auf die einzelnen Farbstoffe angepasst werden. Vorzugsweise wird in dieser Variante ein mehrkanaliger Detektor verwendet. Es ist jedoch auch möglich, die Probenfarbstoffe sequenziell mit dem Halbleiterlaser und dem weiteren Halbleiterlaser anzuregen und darauf angepasst eine sequenzielle Detektion in einem einzigen Kanal vorzunehmen. Diese Variante gewährleistet auf einfache und effiziente Weise eine Unterscheidbarkeit der verwendeten Farbstoffe.
Der Halbleiterlaser und der zumindest andere weitere Halbleiterlaser sind aufeinander synchronisiert. Eine Synchronisierung kann dabei ganz unterschiedlich erfolgen. Zum einen könnten die Laserpulse jeweils gleichzeitig auf die Probe eingestrahlt werden. Auch eine sequentielle Einstellung ist denkbar, dass etwa die Pulse des ersten Halbleiterlasers immer um eine vorher festgelegte Zeiteinheit (z.B. 3ns) dem Laserpuls des zweiten Halbleiterlasers vorweglaufen. Unterschiedliche Taktung ist ebenfalls denkbar, wobei auf jeden 3. Laserpuls des ersten Halbleiterlasers ein Laserpuls des zweiten Halbleiterlasers eingestrahlt wird, usw.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsvariante ist eine Steuerungsvorrichtung vorgesehen, die den Halbleiterlaser und/oder den weiteren Halbleiterlaser betreibenden Pumpstrom steuert. Die Halbleiterlaser können über eine elektronische Schnittstelle entweder direkt an den PC oder an die Versorgungseinheit (Supply Unit) des Rastermikroskops angeschlossen werden. Das hat den Vorteil, dass die Laser direkt über die Benutzersoftware des Rastermikroskops angetrieben werden können.
Neben dem Halbleiterlaser und/oder dem zumindest anderen Halbleiterlaser können natürlich auch herkömmliche gepulste Laserquellen verwendet werden. Das Spektrum dieser Lichtquellen ist besonders groß und reicht über modengekoppelte Farbstoff- oder Festkörperlaser (TiSa- oder Nd-Laser), frequenzvervielfachte modengekoppelte Strahlquellen, OPO's usw.
Die Steuerungsvorrichtung erzeugt in einer bevorzugten Ausgestaltungsvariante synchron mit den Pulsen des Anregungslichts und/oder des weiteren Anregungslichts elektrische Detektionsstartsignale, die eine zeitkorrelierte Erfassung der Detektionsphotonen ermöglichen.
Vorzugsweise ist die Repetitionsrate des Halbleiterlasers und/oder die Repetitionsrate des weiteren Halbleiterlasers kontinuierlich einstellbar. In einer anderen Variante ist die Repetitionsrate des Halbleiterlasers und oder die Repetitionsrate des weiteren Halbleiterlasers schrittweise einstellbar. Vorzugsweise um die einstellbaren Repetitionsraten bei 40 Megaherz und oder 20 Megaherz und oder 10 Megaherz und oder 5 Megaherz. Mit diesen Einstellmöglichkeiten lässt sich das Mikroskop die Lebensdauern der gängigsten Fluorophore anpassen.
Das Mikroskop ist als Rastermikroskop, und zwar als konfokales Rastermikroskop ausgebildet. Die Detektion mit einem konfokalen Rastermikroskop in Descan-Detektion hat den Vorteil der Unempfindlichkeit gegenüber dem Umgebungslicht, das bei Non-Descan-Detektion das Messergebnis erheblich verfälschen kann. Vorteilhafterweise kann das erfindungsgemäße Mikroskop bei FRET-Untersuchungen (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) verwendet werden. Bei der FRET-Anregung wird Anregungsenergie strahlungslos von einem Donor auf einen Akzeptor übertragen. Wenn sich in der Nähe eines Donors ein Akzeptor befindet, ändert sich die Lebensdauer des Donors, was mit Hilfe des erfindungsgemäßen Mikroskops effizient und genau messbar ist.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:

1 ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
2 ein weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop.

1 zeigt ein erfindungsgemäßes konfokales Rastermikroskop mit einer Lichtquelle 1, die einen Halbleiterlaser 3 und einen weiteren Halbleiterlaser 5 beinhaltet. Der Pumpstrom der Halbleiterlaser 3, 5 wird von einer Steuerungsvorrichtung 7 gesteuert. Das gepulste Ausgangslicht des Halbleiterlasers 3 und des weiteren Halbleiterlasers 5 wird mit Hilfe eines dichroitischen Strahlvereinigers 9 zu einem Anregungslichtstrahlenbündel 11 vereinigt und auf die Beleuchtungslochblende 13 gelenkt. Das von der Beleuchtungslochblende 13 ausgehende Beleuchtungslichtstrahlenbündel wird mit Hilfe des Hauptstrahlteilers 15 zu einer Strahlablenkeinrichtung 17, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 19 beinhaltet, gelenkt. Die Strahlablenkeinrichtung 17 führt das Beleuchtungslichtstrahlenbündel 11 durch die Scanoptik 21, die Tubusoptik 23 sowie durch das Mikroskopobjektiv 25 hindurch über bzw. durch die Probe 27. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 29 (gestrichelt gezeichnet) gelangt auf demselben Lichtweg, nämlich durch das Mikroskopobjektiv 25, die Tubusoptik 23 sowie durch die Scanoptik 21 und über die Strahlablenkeinrichtung 17 zurück zum Hauptstrahlteiler 15, passiert diesen und die nachfolgende Detektionslochblende 31 und gelangt zu einem Multibanddetektor 37. Mit Hilfe eines Prismas 33 wird das Detektionslicht zunächst räumlich spektral aufgespaltet. Das räumlich spektral aufgespaltene Detektionslicht wird mit Hilfe der Feldlinse 35 zu einer Fokuslinie fokussiert. Im Bereich der Fokuslinie ist eine Spaltblendenanordnung, die eine erste Spaltblende 39 und eine zweite Spaltblende 41 beinhaltet, angeordnet.
Die Vorderseiten der Spaltblenden 39, 41 sind reflektierend ausgeführt. Das von den Spaltblenden 39, 41 durchgelassene Licht gelangt über einen ersten Detektionskanal zu einem ersten Detektor 43. Das von der Spaltblende 41 ausgeblendete Detektionslicht wird von der reflektierend beschichteten Seite der zweiten Spaltblende 41 reflektiert und gelangt über einen zweiten Detektionskanal zu einem zweiten Detektor 45. Der erste Detektor 43 und der zweite Detektor 45 detektieren in unterschiedlichen Detektionsbereichen. Die Steuerungsvorrichtung 7 erzeugt synchron mit den elektrischen Ansteuerpulsen für den ersten und den zweiten Halbleiterlaser 3, 5 elektrische Detektionsstartsignale, die an eine Verarbeitungseinheit 47 übergeben werden. Die Detektoren 43, 45 erzeugen elektrische zur Anzahl der eintreffenden Detektionsphotonen proportionale Signale, die an die Verarbeitungseinheit 47 übergeben werden. In der Verarbeitungseinheit 47, die als PC 49 ausgeführt ist, erfolgt die Auswertung der Messsignale. Die Ergebnisse werden auf einem Monitor 51 graphisch dargestellt. Mit Hilfe des PC's 49 und den an ihn angeschlossenen Einstellelementen, wie Computermaus 53, Panelbox 55 und Tastatur 57 kann der Benutzer die Pulsrepetitionsrate des ersten Halbleiterlasers 3 sowie des zweiten Halbleiterlasers 5 probenspezifisch einstellen. Die Einstellung erfolgt vorzugsweise so, dass nicht mehr als 1 Detektionsphoton pro Anregungslichtpuls erzeugt wird. Vorzugsweise wird die Einstellung derart vorgenommen, dass sich eine Detektionsrate von etwa 1 Detektionsphoton pro 10 Anregungspulse ergibt.
2 zeigt eine andere Ausgestaltungsvariante eines erfindungsgemäßen Mikroskops. Das Mikroskop weist einen ersten Halbleiterlaser 3 und einen weiteren Halbleiterlaser 5, der als UV-Laser 59 ausgebildet ist, auf. Das von dem ersten Halbleiterlaser 3 emittierte Beleuchtungslicht 61 gelangt auf eine erste Beleuchtungslochblende 63 und wird nach Passieren der Beleuchtungslochblende 63 von dem dichroitischen Strahlteiler 65 zu der Strahlablenkeinrichtung 17, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 19 beinhaltet, gelenkt. Das von dem weiteren Halbleiterlaser 5 emittierte zweite Beleuchtungslicht 67 gelangt zu einer zweiten Beleuchtungslochblende 69 und anschließend zu einem zweiten dichroitischen Strahlteiler 71, der das zweite Beleuchtungslicht 67 ebenfalls zu der Strahlablenkeinrichtung 17 führt. Die Strahlablenkeinrichtung 17 lenkt das erste und zweite Beleuchtungslicht 61, 67 durch die nicht gezeigte Scanoptik, die nicht gezeigte Tubusoptik und das nicht gezeigte Objektiv über bzw. durch die Probe 27. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 29 gelangt über die Strahlablenkeinrichtung 17 durch die dichroitischen Strahlteiler 65, 71 zu der Detektionslochblende 73, passiert diese und das nachfolgende Filterrad 75 und gelangt anschließend zu einem weiteren dichroitischen Strahlteiler 77, der das Detektionslicht 29 auf einen ersten Detektionskanal 79 und einen zweiten Detektionskanal 81 aufteilt. Im ersten Detektionskanal 79 ist ein erster Detektionsfilter 83 angeordnet, der verhindert, dass Störlicht (beispielsweise im Detektionslicht noch vorhandenes Anregungslicht) zu dem ersten Detektor 85 gelangt. Ebenso ist im zweiten Detektionskanal 81 ein zweiter Detektionsfilter 84 vorgesehen, der Störlicht von dem zweiten Detektor 87 fernhält. Zwischen der Detektionslochblende 73 und dem weiteren dichroitischen Strahlteiler 77 kann ein Umlenkelement 89 in den Strahlengang eingebracht werden, um das Detektionslicht 29 auf einen Multibanddetektor 91 zur Erzeugung eines Abbildes der Probe zu lenken. Der erste Detektor 85 und der zweite Detektor 87 erzeugen elektrische zur Anzahl der eintreffenden Detektionsphotonen proportionale Signale, die an eine Verarbeitungseinheit 47 übergeben werden. Die Verarbeitungseinheit 47 ist als PC 49 ausgeführt und beinhaltet vorzugsweise eine SPC 730/830-Einsteckkarte 50 der Fa. Becker+Hickl. Auf einem Monitor 51 wird das Ergebnis der FLIM-Untersuchung graphisch dargestellt.
Bezugszeichenliste

1: Lichtquelle
3: Halbleiterlaser
5: weiterer Halbleiterlaser
7: Steuerungsvorrichtung
9: Strahlvereiniger
11: Anregungslichtstrahlenbündel
13: Beleuchtungslochblende
15: Hauptstrahlteiler
17: Strahlablenkeinrichtung
19: Scanspiegel
21: Scanoptik
23: Tubusoptik
25: Mikroskopobjektiv
27: Probe
29: Detektionslicht
31: Detektionslochblende
33: Prisma
35: Feldlinse
37: Multibanddetektor
39: erste Spaltblende
41: zweite Spaltblende
43: erster Detektor
45: zweiter Detektor
47: Verarbeitungseinheit
49: PC
50: Einsteckkarte
51: Monitor
53: Computermaus
55: Panelbox
57: Tastatur
59: UV-Laser
61: Beleuchtungslicht
63: Beleuchtungslochblende
65: dichroitischer Strahlteiler
67: Beleuchtungslicht
69: Beleuchtungslochblende
71: Strahlteiler
73: Detektionslochblende
75: Filterrad
77: Strahlteiler
79: erster Detektionskanal
81: zweiter Detektionskanal
83: erster Detektionsfilter
84: zweiter Detektionsfilter
85: Detektor
87: zweiter Detektor
89: Umlenkelement
91: Multibanddetektor

Claims

Verfahren zur Untersuchung einer Lebensdauer angeregter Zustände von Probenfarbstoffen in einer Probe (27) unter Verwendung eines Mikroskops mit mindestens einer Lichtquelle, die einen Halbleiterlaser (3), der gepulstes Anregungslicht (11) emittiert, und zumindest einen weiteren Halbleiterlaser (5), der weiteres gepulstes Anregungslicht (11) emittiert, beinhaltet, und mit mindestens einem Detektor, der von der Probe (27) ausgehendes Detektionslicht empfängt, wobei der Halbleiterlaser (3) und der zumindest eine weitere Halbleiterlaser (5) aufeinander synchronisiert sind, mit den Schritten: Anregen der Probenfarbstoffe mit Anregungslicht (11) des Halbleiterlasers (3) und des zumindest einen weiteren Halbleiterlasers (5) und Einstellen der Puls-Repetitionsrate auf die spezifischen Lebensdauereigenschaften der Probenfarbstoffe in der Probe (27).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop ein konfokales Rastermikroskop ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung in der Probe (27) einen Einphotonenübergang umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung in der Probe (27) einen Mehrphotonenübergang umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der den Halbleiterlaser (3) und/oder den weiteren Halbleiterlaser (5) betreibende Strom durch eine Steuerungsvorrichtung (49) gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerungsvorrichtung (49) synchron mit den Pulsen des Anregungslichts (11) und/oder des weiteren Anregungslichts elektrische Detektions-Startsignale erzeugt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Halbleiterlaser (3) und der Detektor (43) aufeinander synchronisiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Repetitionsrate des Halbleiterlasers (3) und/oder die Repetitionsrate des weiteren Halbleiterlasers (5) kontinuierlich einstellbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Repetitionsrate des Halbleiterlasers (3) und/oder die Repetitionsrate des weiteren Halbleiterlasers (5) schrittweise einstellbar ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Repetitionsrate des Halbleiterlasers (3) und/oder die Repetitionsrate des weiteren Halbleiterlasers (5) schrittweise auf 40 MHz, 20 MHz, 10 MHz und 5MHz einstellbar ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (43) einen Detektionskanal aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (43) mehrere Detektionskanäle aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (43) einen Non-Descan-Detektor beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (43) einen Descan-Detektor beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, gekennzeichnet durch FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)-Untersuchungen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine zeitkorrelierte Erfassung der Detektionsphotonen ermöglicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserpulse des Halbleiterlasers und des weiteren Halbleiterlasers jeweils gleichzeitig auf die Probe eingestrahlt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenfarbstoffe sequenziell mit dem Halbleiterlaser und dem weiteren Halbleiterlaser angeregt und darauf angepasst eine sequenzielle Detektion in einem einzigen Kanal vorgenommen wird.