Rastermikroskop und Verfahren zur rastermikroskopischen Untersuchung einer Probe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur rastermikroskopischen Untersuchung einer Probe.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Rastermikroskop mit einer Lichtquelle zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahles, mit zumindest einem Objektiv, das den Beleuchtungslichtstrahl auf und/oder in eine Probe fokussiert, mit einer Strahlablenkvorrichtung, die den Fokus des Beleuchtungslichtstrahles über und/oder durch die Probe führt, und mit einer Detektionseiπrichtuπg, die von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt.
In der Rastermikroskopie (Scaπmikroskopie) wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x- und der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der
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Position des Abtaststrahles gemessen.
Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
Im Allgemeinen werden die zu untersuchenden Proben mit einer Markierung, meist einem Fluoreszenzfarbstoff, der optisch anregbar ist, versehen. Bei diesen Farbstoffen kann es sich beispielsweise auch um GFP (Green- Fluorescence-Protein) oder CFP (Cyan-Fluorescence-Protein) handeln.
Bei vielen Experimenten und Untersuchungen von biologischen Proben ist es notwendig, neben der mikroskopischen Beobachtung der Probe auch eine Manipulation an der Probe vorzunehmen. Aus der Offenlegungsschrift US 2002/0196535 A1 ist ein konfokales Rastermikroskop bekannt, mit dem zumindest ein Bereich einer Probe (region of interest; ROI) sowohl manipuliert als auch beobachtet werden kann. Die Manipulation und die zur Beobachtung notwendige Abtastung des Bereichs erfolgt sequenziell, beispielsweise kann die Manipulation beim Hinlauf in einer Zeile erfolgen, während beim Rücklauf
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der interessierende Bereich und gegebenenfalls das umgebene Gebiet zur Beobachtung abgetastet wird.
Aus DE 100 43 986 A1 ist ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe mittels eines konfokalen Scanmikroskops, bei dem zunächst ein Voransichtsbild der Probe aufgenommen wird und anschließend ein oder mehrere interessierende Bereiche markiert werden können. Jedem Bereich werden spezifische Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl- Leistungen zugeordnet, um anschließend die Probe in den markierten Bereichen gemäß der Zuordnung zu manipulieren. Für einige -Experimente ist es wünschenswert, die Probe gleichzeitig beobachten und manipulieren zu können. Ein Laserscanningmikroskop, das eine simultane Abrasterung und Manipulation einer Probe erlaubt, ist aus US 6,094,300 bekannt. Das Laserscanningmikroskop beinhaltet zwei voneinander unabhängige Strahlablenkeinrichtungen, wobei eine der Strahlablenkeinrichtungen den Manipulationslichtstrahl über bzw. durch die Probe führt, während die andere Strahlablenkeinrichtung den Beobachtungs- Beleuchtungslichtstrahl über bzw. durch die Probe lenkt. Das Laserscanningmikroskop hat den Nachteil, dass die von den Strahlablenkeinrichtungen kommenden Lichtstrahlen, nämlich der Manipulationslichtstrahl und der Abtast-Beleuchtungslichtstrahl vor dem Eintritt in das Objektiv mit einem Strahlvereiniger auf einen gemeinsamen Strahlengang vereinigt werden müssen. Ein ganz besonderer Nachteil des nötigen Strahlvereinigers liegt darin, dass die von ihm hervorgerufenen Interferenzstreifen im Abbild sich während des Abtastvorganges auf Grund des wechselnden Einfallswinkels des bewegten Strahles verändern und damit nicht kompensierbar oder bei der Bildbearbeitung herausrechenbar sind. Außerdem ruft der Strahlvereiniger einen Strahlversatz hervor und führt zu erheblichen Lichtverlusten.
Aus DE 100 39 520 A1 ist ebenfalls ein konfokales Rastermikroskop mit der Möglichkeit zur simultanen Manipulation und Objektdetektion bekannt. Auch bei diesem Rastermikroskop sind zwei Strahlablenkeinrichtungen - eine für den Manipulationslichtstrahl, eine für den Beleuchtungslichtstrahl -
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vorgesehen. In einer besonderen Ausgestaltungsvariante dieses Rastermikroskops erfolgt die Einkopplung des Manipulationslichtstrahls in den Strahlengang des Beleuchtungslichtstrahls durch den dem Beleuchtungslichtstrahl zugeordneten Ablenkspiegel hindurch. Der Ablenkspiegel ist dabei für Licht der Wellenlänge des Maπipulationslichtstrahls transparent und für Licht der Wellenlänge des Beleuchtungslichtstrahls reflektierend ausgebildet.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Rastermikroskop anzugeben, das sowohl die Manipulation einer Probe in zumindest einem auswählbaren Bereich als auch die vorzugsweise simultane Beobachtung der Probe ermöglicht, wobei auf eine dem Manipulationslicht zugeordnete Strahlablenkeinrichtung und die damit verbundenen Nachteile (insbesondere Bildartefakte) verzichtet wird.
Diese Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Mittel zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters vorgesehen ist und dass Abbildungsmittel das Manipulationsbeleuchtungsmuster auf und/oder in die Probe abbilden.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren anzugeben, das sowohl eine Manipulation einer Probe in zumindest einem Bereich als auch eine vorzugsweise simultane Beobachtung der Probe ermöglicht, wobei die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile, nämlich Bildartefakte und Lichtleistungsverlust weitgehend vermieden sein sollen.
Diese weitere Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist: • Fokussieren eines Beleuchtungslichtstrahles einer Lichtquelle, mit zumindest einem Objektiv, auf und/oder in eine Probe, • Führen des Fokus des Beleuchtungslichtstrahles mit einer Strahlablenkvorrichtung über und/oder durch die Probe,
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Erzeugen eines Manipulationsbeleuchtungsmusters mit einem Mittel zur Erzeugung eines Manipulatioπsbeleuchtungsmusters, Abbilden des Manipulationsbeleuchtungsmusters auf und/oder in die Probe und Detektieren von von der Probe ausgehendem Detektionslicht mit einer Detektionseinrichtung.
Die Erfindung hat den Vorteil, dass neben der dem Beleuchtungslichtstrahl zugeordneten Strahlablenkeinrichtung keine weitere Maπipulations- Strahlablenkeinrichtung erforderlich ist; da das Muster individuell auf die zu manipulierenden Bereiche einstellbar ist.
Vorzugsweise empfängt die Detektionseinrichtung von einzelnen Rasterpunkten der Probe ausgehendes Detektionslicht, wobei mehrere der Rasterpunkte mit dem Licht des Manipulationsbeleuchtungsmusters beaufschlagt sind. Bei schnellem Abscannen der Probe wird der Beleuchtuπgslichtstrahl kontinuierlich über die Probe geführt. Rasterpunkte sind in diesem Fall die Stücke der Abtastbahn, die der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls in vorgebbareπ Zeitintervallen überstreicht.
In einer besonders bevorzugten Variante ist vorgesehen, zunächst ein Voransichtsbild der Probe bzw. eines Teils der Probe aufzunehmen und aus diesem Voransichtsbild einen oder mehrere Manipulationsbereiche auszuwählen und beispielsweise mit dem Mauszeiger eines PCs durch Umranden zu markieren. Ein Rechnersystem (z.B. PC) errechnet aus diesen Eingaben das abzubildende Manipulationsbeleuchtungsmuster und steuert nun das Mittel zur Erzeugung eines Beleuchtungsmanipulationsmusters.
Während der Beleuchtung der Probe mit dem
Manipulationsbeleuchtungsmuster ist es möglich, simultan konfokal Abbilder der Probe aufzunehmen .
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Vorzugsweise beinhaltet das Mittel zur Erzeugung eines Maπipulatioπsbeleuchtuπgsmusters zumindest einen Laser. EΞs ist jedoch auch möglich, andere Lichtquellen, wie beispielsweise Lampen, Bogenlampen, Hochdrucklampen oder LEDs zu verwenden. In einer besonderen Ausgestaltungsform beinhaltet das Mittel zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters ein Laserarray, vorzugsweise ein Diodenlaserarray, wobei die einzelnen Laser des Arrays einzeln ansteuerbar sind. Vorzugsweise ist die Ausgangsleistung jedes einzelnen Lasers individuell einstellbar und an die jeweiligen Anforderungen des zu manipulierenden Probenbereichs anpassbar.
In einer anderen Variante beinhaltet das Mittel zur Erzeugung eines Beleuchtungsmanipulationsmusters ein LCD-Element, um ähnlich wie bei einem Beamer ein Manipulationsbeleuchtungsmuster zu projizieren. In einer ganz anderen Variante ist zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters ein Array von vorzugsweise einzeln steuerbaren Mikrospiegeln (DMD) vorgesehen.
In einer weiteren Ausgestaltungsform beinhaltet das Mittel zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters eine abbildbare Maske, die beispielsweise als Lochscheibe oder als Schlitzscheibe oder als Musterscheibe ausgestaltet sein kann.
In einer bevorzugten Variante weist das Mittel zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters ein adressierbares Faserbündel . auf. Vorzugsweise werden hierbei Mikrooptiken zur Einkopplung des Manipulationslichts in die einzelnen Fasern des Faserbündels verwendet. Ein Ende des Faserbündels wird vorzugsweise direkt in der Zwischenbildebene des Rastermikroskops angeordnet und kann dort positioniert werden. Hierbei kann das Ende des Faserbündels gebogen oder angeschrägt sein, so dass das Manipulationslicht beim Austreten aus den Austrittsflächen des Faserbündels in die Zwischenbildebeπe durch Lichtbrechung abgelenkt und auf den Strahlengang des Rastermikroskops gelenkt wird. Diese Ausgestaltung hat den besonderen Vorteil, dass rückreflektiertes
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Manipulationslicht nicht zur Strahlablenkeinrichtung gelangt und somit auch nicht zum Detektor des Rastermikroskops.
Das Manipulationsbeleuchtungsmuster wird in einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsform in eine Zwischenbildebene des Rastermikroskops abgebildet.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante gehört das Objektiv zu den das Manipulatioπsbeleuchtungsmuster abbildenden Abbildungsmitteln, so dass das Beleuchtungslicht durch das Objektiv hindurch geführt wird. In einer anderen Variante ist vorgesehen, das Manipulationsbeleuchtungslicht durch den Kondensor hindurch abzubilden, wobei in diesem Fall der Kondensor das Abbildungsmittel oder einen Teil der Abbildungsmittel bildet. Es ist auch möglich, beispielsweise in einer 4-Pi-Anordnung das
Manipulationsbeleuchtungsmuster sowohl durch das Objektiv als auch durch den Kondensor hindurch, abzubilden. Vorzugsweise ist ein Einkoppelmittel vorgesehen, das den Beleuchtungslichtstrahl reflektiert und von dem Mittel zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters ausgehendes Licht zumindest teilweise passieren lässt. Diese Variante hat den ganz besonderen Vorteil, dass keine sich zeitlich ändernden Interferenzmuster auftreten, da der durch das Einkoppelmittel, das beispielsweise als dichroitischer Strahlteiler ausgebildet sein kann, tretende Manipulationsbeleuchtungslicht sich entlang eines ortsfesten unbewegten Strahlengangs ausbreitet, während der beim Scannen sich bewegende Beleuchtungslichtstrahl von dem Einkoppelmittel lediglich reflektiert wird und daher keine Interferenzprobleme aufgrund von Vielfachreflexionen hervorruft. Vorzugsweise ist das Einkoppelmittel austauschbar. Hierzu können beispielsweise mehrere Einkoppelmittel auf einem Revolver oder auf einem Schiebeschlitten vorjustiert angeordnet sein, um auf einfache Weise in den Strahlengaπg des Rastermikroskops eingebracht werden zu können. Vorteilhafterweise sind hierbei Anschlagelemente bzw. Rastungen vorgesehen, die für eine korrekte Positionierung der Einkoppelmittel sorgen.
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In einer anderen Variante lässt das Einkoppelmittel den Beleuchtuπgslichtstrahl zumindest teilweise passieren und reflektiert von dem Mittel zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters ausgehendes Licht. Auch bei dieser Variante kann das Einkoppelmittel als Strahlteiler, beispielsweise als dichroitischer Strahlteiler oder auch als Neutralstrahlteiler ausgebildet sein.
In einer anderen Variante beinhaltet das Einkoppelmittel einen Spiegel, der beispielsweise als Halbspiegel oder als Streifenspiegel ausgebildet sein kann und der derart angeordnet ist, dass von dem Mittel zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters ausgehendes Licht von dem Spiegel in den Strahlengang des Rastermikroskops reflektiert wird, während das Beleuchtungslicht zumindest teilweise an dem Spiegel vorbei zum Objektiv gelangt.
In einer anderen Variante beinhaltet das Einkoppelmittel ein Umlenkprisma. Außerdem kann das Einkoppelmittel vorzugsweise einen Filter oder einen Kantenfilter beinhalten.
In einer anderen Variante des Rastermikroskops beinhaltet das Einkoppelmittel photoπische Kristalle, vorzugsweise solche, mit denen gezielt einzelne Lichtkomponenten, wie in kleinen Kapillaren gelenkt werden können. Vorteilhafterweise ist in einer besonderen Ausgestaltungsvariante die Manipulationszone nicht auf die Konfokalebene beschränkt, sondern auch eine Manipulation, beispielsweise ein Bleichen in den Ebenen oberhalb und unterhalb der Konfokalebene, ermöglicht. In diesem Fall ist es vorteilhaft, den Fokus des Manipulationsbeleuchtungslichts "säulenartig" in die Probe abzubilden. Bei einem Punktbleichen z.B. ist dies unter anderem durch das nicht vollständige Ausleuchten der Objektivpupille erreichbar.
In einer anderen Variante sind das Manipulatioπsbeleuchtungsmuster und der Fokus des Beleuchtungslichtstrahls in dieselbe Ebene abgebildet bzw. fokussiert. Zur Veränderung der Größe des abgebildeten
Manipulationsbeleuchtungsmusters kann die Abbildungsoptik als Zoomoptik
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ausgestaltet sein. Eine Veränderung des Manipulationsbeleuchtungsmusters (z.B. Verbreiterung) ist durch zusätzliche Optik ebenfalls denkbar.
Das Manipulationsbeleuchtungsmuster kann für Manipulationen unterschiedlichster Art verwendet werden, beispielsweise kann ein Ausbleichen der Probe und/oder eine optische Anregung und/oder eine stimulierte Emission ausgelöst werden. Es ist ebenso denkbar, gebundene Farbstoffe mit Hilfe des Manipulationsbeleuchtungsmusters freizusetzen (Ca2+, Glutamat,..., caged compound release) oder eine Photoaktivierung von Verbindungen (PA-GFP) zu induzieren. Es ist auch denkbar, das Manipulationsbeleuchtungsmuster als optische Pinzette oder zum Zerteilen/Schneiden der Probe einzusetzen.
Das Einkoppelmittel ist vorzugsweise in einer Zwischenbildebene des Rastermikroskops angeordnet. Im Falle des Halbspiegels derart, dass Teile in einer Hälfte der Probe gezielt manipuliert werden. Der besondere Vorteil dieser Ausgestaltungsvariante besteht darin, dass in der anderen Hälfte des Bildes der Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang des Rastermikroskops völlig ungestört ist. Das Bild wird nicht durch störende optische Komponenten beeinträchtigt, was insbesondere bei der Benutzung eines AOBS (Acousto- Optical-Beam-Splitter) als Hauptstrahlteiler von besonderem Vorteil ist. Obwohl bei dieser Variante nicht das gesamte Bildfeld abgetastet wird, können aus der Beobachtung des Randbereichs zur manipulierten Zone, in der beispielsweise ein Bleichvorgang hervorgerufen wird, wichtige Informationen über das Erholungsverhalten der gebleichten Moleküle gewonnen werden. Das Einkoppelmittel kann auch als Polarisationsstrahlteilerwürfel ausgestaltet sein. Ein Polarisationsstrahlteiler hat insbesondere den Vorteil, dass zum einen die Beleuchtungslichtleistung mit einer zusätzlichen drehbaren λ/2- Platte variabel einstellbar ist und die Hälfte des Fluoreszenzlichtes den Polarisationsstrahlteiler passieren kann, um detektiert zu werden. Bei Verwendung von Manipulationslicht einer einzigen Wellenlänge kann das Einkoppelmittel vorteilhafterweise aus einem Kantenfilter bestehen. Der durch
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den Kantenfilter erzeugte Strahlversatz kann durch Rückrechnung und Bildkorrektur korrigiert werden, wodurch es möglich ist, das gesamte Bildfeld auszuwerten. Außerdem werden Rückreflexe des Manipulationslichts ausgeblendet. Diese gelangen somit vorteilhafterweise nicht zum Detektor des Rastermikroskops.
Die kondensorseitige Einkoppluπg des Manipulationslichts hat den Vorteil, dass das Abtastbildfeld nicht eingeschränkt ist. Es sollte jedoch eine Justiermöglichkeit vorhanden sein, um die Fokusebene des Beleuchtungslichtstrahls und des Manipulationsbeleuchtungsmusters zur Deckung zu bringen oder, falls gewünscht, lediglich überlappen zu lassen.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigt:
Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop.
Fig. 2 zeigt eine andere Ausgestaltungsvariante eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops.
Fig. 3 zeigt eine weitere Ausgestaltungsform eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops.
Fig. 4 zeigt eine weitere Variante eines erfindungsgemäßen Rasterm ikroskops. Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop 1 , das ein Abbildungsmodul 3 und ein modular angekoppeltes Mittel 37 zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters beinhaltet. Das Abbildungsmodul 3 beinhaltet eine Lichtquelle 5, die einen Beleuchtungslichtstrahl 7 emittiert. Der Beleuchtungslichtstrahl 7 wird von dem Hauptstrahlteiler 9 zu einer Strahlablenkeinrichtung 11 , die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 13 beinhaltet, reflektiert. Die Strahlablenkeinrichtung 11 führt den Beleuchtungslichtstrahl 7 durch die Scanoptik 15, die Tubusoptik 17 sowie durch das Mikroskopobjektiv 19 hindurch über bzw. durch die Probe 21. Das von der Probe 21 ausgehende Detektionslicht 23 gelangt auf demselben Lichtweg, nämlich durch das Mikroskopobjektiv 19, die Tubusoptik 17, die
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Scanoptik 15 sowie über die Strahlablenkeinrichtung 11 zurück zum Hauptstrahlteiler 9, passiert diesen und die nachfolgende Detektionslochblende 25 und gelangt schließlich zu einem Detektor 29, der als Photomultiplier 27 ausgestaltet ist. Der Detektor 29 erzeugt elektrische zur Leistung des Detektionslichts 23 proportionale Detektionssignale, die an eine Verarbeitungseinheit 31 übergeben werden. In der Verarbeitungseinheit 31 werden die Detektionssignale den entsprechenden Positionssignalen zugeordnet und anschließend an einen PC 33 übergeben, auf dessen Bildschirm 35 ein Bild der Probe dargestellt wird. Das Mittel 37 zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters ist über einem Bajonettanschluss 51 an das Abbildungsmodul angekoppelt. Das Mittel 37 zur Erzeugung eines Manipulatioπsbeleuchtuπgsmusters beinhaltet einen Laser 39, dessen Manipulationslicht 41 über die Optik 47 zum LCD-Element 43 gelangt. Das LCD-Element 43 wird von dem PC 33 gesteuert und erzeugt das Manipulationsbeleuchtungsmuster, das über die Optiken 49, 55 in die Zwischenbildebene des Rastermikroskops abgebildet wird. Das Manipulationsbeleuchtungsmuster wird von einem Einkoppelmittel 57, das als Prisma 53 ausgebildet und in der Zwischenbildebene angeordnet ist, zur Tubusoptik 17 umgelenkt, die gemeinsam mit dem Mikroskopobjektiv 19 das Manipulationsbeleuchtungsmuster auf bzw. in die Probe 21 abbildet. Das Einkoppelmittel 57 ist derart verschiebbar angeordnet, das der im Strahlengang des Rastermikroskops wirksame Teil variierbar ist.
Fig. 2 zeigt eine Variante des erfindungsgemäßen Rastermikroskops, bei dem das Mittel 37 zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters ein Laserdiodenarray 59 von einzeln schaltbaren Laserdioden umfasst. Das von dem Laserdiodenarray ausgehende Manipulationslicht 41 wird von einer Mikrooptik 61 auf ein Lichtleitfaserbündel 63 abgebildet. Zur Auskopplung des Manipulatioπslichts 41 aus dem Lichtleitfaserbündel 63 ist eine weitere Mikrooptik 65 vorgesehen, die das Manipulationsbeleuchtungsmuster in die Zwischenbildebene des Rastermikroskops abbildet. In der Zwischenbildebene ist ein Einkoppelmittel 57 vorgesehen, das in dieser Variante als dichroitischer Strahlteiler 67 ausgebildet ist. Das Manipulationsbeleuchtungsmuster, das von
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der Tubusoptik 17 und dem Mikroskopobjektiv 19 in die Probe 21 abgebildet wird, kann durch Schalten der Einzeldiodeπ des Laserdiodenarrays 59 variiert werden. Hierdurch ist jede einzelne Faser des Faserbündels de-facto einzeln adressierbar. Fig. 3 zeigt eine weitere Variante eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops mit einem adressierbareπ Lichtleitfaserbüπdel 63. In dieser Variante ist die abgeschrägte Endfläche 69 des Lichtleitfaserbündels 63 direkt in der Zwischenbildebene angeordnet. Das aus dem Lichtleitfaserbündel 63 austretende Manipulationslicht wird durch Lichtbrechung abgelenkt und auf den Strahlengang des Rastermikroskops gelenkt. In dieser Variante bilden die Tubusoptik 17 und das Mikroskopobjektiv 19 die Endfläche 69 des Lichtleitfaserbündels 63 in die Probe 21 ab. Das Ende des Lichtleitfaserbüπdels 63 kann in der Zwischeπbildebene gezielt positioniert werden, wie durch den Doppelpfeil angedeutet. Die Positionierung wird von der Verarbeitungseinheit 31 und dem PC 33 gesteuert.
Fig. 3 a zeigt eine Detailansicht des Endes des Lichtleitfaserbündels 63. Je nach Beschaltung des Laserdiodenarrays 59 tritt Maπipulatioπslicht aus den Einzelfasern des Lichtleitfaserbündels 63 aus, wobei die Leistung des durch die Einzelfasern des Lichtleitfaserbündels 63 laufenden Polarisationslichts 41 vom PC 33 steuerbar ist.
Fig. 4 zeigt eine andere Ausgestaltungsform eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops 1. Das Rastermikroskop 1 beinhaltet eine Lichtquelle 5, die einen Beleuchtungslichtstrahl 7 emittiert, der über einen akustooptischen Filter 71 (AOTF; acousto optical tunable filter) zu dem Hauptstrahlteiler 9 gelenkt wird. Die Lichtquelle 5 ist als Mehrlinienlaser 73 ausgeführt. Mit Hilfe des akustooptischen Filters 71 kann eingestellt werden, welcher spektrale Anteil des Beleuchtungslichts 7 über den Hauptstrahlteiler zur Strahlablenkeinrichtung 11 und über die nicht gezeigte Scan- und Tubusoptik sowie durch das Mikroskopobjektiv 19 zur Probe 21 gelangen soll. Die spektralen Anteile, die nicht auf den Strahlengang des Rastermikroskops gelenkt werden, gelangen in eine Strahlfalle 75. Die Ansteuerung des aktustooptischeπ Filters 71 erfolgt über einen Hochfrequenzsender 77, der
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von einer Verarbeitungseinhe'it 31 geregelt ist. Das Rastermikroskop 1 weist ein Mittel 37 zur Erzeugung eines Manipuiatioπsbeleuc tungsmusters auf, das einen Laser 39 beinhaltet, der Manipulationslicht 41 emittiert. Aus dem Manipulationslicht 41 werden mit einem weiteren akustooptischen Filter 79 diejenigen spektralen Anteile selektiert, die zur Manipulation der Probe 21 abgebildet werden sollen. Alle übrigen spektralen Anteile gelangen in eine weitere Lichtfalle 81. Die Ansteuerung des weiteren akustooptischen Filters 79 erfolgt über einen weiteren Hochfrequenzsender 83. Das Mittel 37 zur Erzeugung eines Manipulationsbeleuchtungsmusters beinhaltet ein steuerbares Mikrospiegelarray 85. Die Erzeugung des
Manipulationsbeleuchtungsmusters erfolgt durch Ansteuerung der Einzelspiegel des Mikrospiegelarrays 85. Das
Manipulationsbeleuchtungsmuster wird mit Abbildungsmitteln 87, die eine Feldlinse 89 und einen Kondensor 91 beinhalten, in die Probe abgebildet. Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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Bezugszeichenliste:
I Rastermikroskop 3 Abbildungsmodul 5 Lichtquelle 7 Beleuchtungslichtstrahl
9 Hauptstrahlteiler
I I Strahlableπkeiπrichtuπg 13 Scanspiegel
15 Scanoptik 17 Tubusoptik
19 Mikroskopobjektiv
21 Probe
23 Detektionslicht
25 Detektionslochblende 27 Photomultiplier
29 Detektor
31 Verarbeitungseinheit
33 PC
35 Bildschirm 37 Mittel zur Erzeugung eines Manipulatioπsbeleuchtuπgsmusters
39 Laser
41 Manipulationslicht
43 LCD-Element
45 47 Optik
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Optik
Bajonettanschluss
Prisma
Optik
Einkoppelmittel
Laserdiodenarray
Mikrooptik
Lichtleitf aserbü ndel
Mikrooptik
Strahlteiler
Endfläche aktustooptischer Filter
Mehrlinienlaser
Strahlfalle
Hochfrequenzsender weiterer aktustooptischer Filter weitere Lichtfalle weiterer Hochfrequenzsender
Mikrospiegelarray
Abbildungsmitteln
Feldlinse
Kondensor