DE10106835A1

DE10106835A1 - Signaltransduktionsproteine 15B3, 15B3-1 und 15B3-2 und zugrundeliegende DNA-Sequenzen

Info

Publication number: DE10106835A1
Application number: DE10106835A
Authority: DE
Inventors: Armin Schneider; Achim Fischer; Bettina Klausner; Moritz Rossner; Birgitta Kammandel; Rebecca Widenmeyer; Bernhard Goetz; Gisela Eisenhardt; Stephanie Jomana Naim; Dieter Newrzella
Original assignee: BASF Lynx Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2001-02-14
Filing date: 2001-02-14
Publication date: 2002-09-05
Also published as: WO2002064776A3; AU2002250943A1; WO2002064776A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, Expressionsvektoren, die erfindungsgemäße DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen, Genprodukte der vorgenannten DNA-Sequenzen, die für Signaltransduktionsproteine codieren, sowie weitere Derivate der vorgenannten Erfindungsgegenstände. Weiterhin offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. den von diesen DNA-Sequenzen exprimierten Signaltransduktionsprotein als Arzneimittel und nicht therapeutische Verwendungen erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen bzw. Genprodukte.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft (i) DNA-Sequenzen, (ii) Expressionsvektoren, die erfindungsgemäße DNA-Sequenzen ent halten, (iv) Wirtszellen, die erfindungsgemäße Expressions vektoren aufweisen, (v) Genprodukte, die durch erfindungsge mäße Sequenzen codiert werden, (vi) hinsichtlich erfindungs gemäßer Sequenzen veränderte transgene Tiere, (vii) gegen er findungsgemäße Genprodukte gerichtete Antikörper, (viii) Ver fahren zur Expression bzw. Isolierung von erfindungsgemäßen Genprodukten, (ix) die Verwendung von erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen bzw. Genprodukten als Arzneimittel, (x) pharmazeu tisch wirksame Verbindungen und Verfahren zu deren Herstel lung sowie Verwendungen derartiger erfindungsgemäßer Verbin dungen und (xi) nicht-therapeutische Verwendungen erfindungs gemäßer DNA-Sequenzen bzw. Genprodukte.

Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß die Pathophysi ologie des Schlaganfalls, daß der Ras/Erk Signaltransdukti onsweg einen großen Einfluß auf NMDA Rezeptor/NOS Aktivierung und die neuronale ischämische Prekonditionierung hat. Die Proteine der Ras/Erk-Kaskade stellen pharmakologische targets dar, da aufgrund definierter biochemischer Funktionen spezi fische Inhibitoren gefunden werden können.

Der Schlaganfall stellt die dritthäufigste Todesursache und die Hauptursache für Behinderungen in den westlichen Indust rienationen dar. Jedes Jahr erleiden in Deutschland un gefähr 250 000 Menschen einen Schlaganfall, ein Drittel stirbt innerhalb des ersten Monats daran, 60% behalten Be hinderungen zurück. Bislang gibt es keine wirksame Therapie für die Mehrzahl dieser Patienten. Die Mehrzahl aller Schlaganfälle in den westlichen Ländern beruht auf Störun gen des cerebralen Blutflusses durch Thrombosen oder Embo lien. Aus diesem Grund beruhen viele der bisherigen Therapiekonzepte auf der Thrombolyse (bspw. mittels Strep tokinase, rtPA, Ancrod). Aus dem Stand der Technik ist al lerdings nunmehr auch bekannt, daß bei der Mehrzahl der Schlaganfälle eine spontane Reperfusion auftritt. Neuere Ar beiten bei Nagetieren lassen auch vermuten, dass der Schaden durch die Reperfusion in einem gewissen Zeitfenster eher grö ßer wird.

Die klinische Wirksamkeit ist für die Thrombolyse teilweise erbracht, hat jedoch nicht zu einer Therapie geführt, die bei der Mehrzahl der Schlaganfälle eingesetzt werden kann. Neuere Forschungsentwicklungen stellen daher auf die Entwicklung neuer Medikamente ab, die direkt das Zelltodpro gramm in Neuronen beeinflussen.

Um neuartige Konzepte für die Behandlung der cerebralen Ischämie, deren ausgeprägteste Form der Schlaganfall dar stellt, zu entwickeln, werden in neueren Modellsystemen der cerebralen Ischämie Veränderungen der Genexpressi on registriert, die in funktionellem Zusammenhang mit dem Ausmaß der Hirnschädigung stehen. Das beste verfügbare Tiermodell ist das sog. Fadenmodell in Nagetieren ("fila ment model"), bei dem ein beschichteter Nylonfaden die Ab zweigung der A. cerebri media verschließt. Durch Zurückzie hen des Fadens wird eine Wiederdurchblutung des Infarktge bietes möglich. Aus der Analyse des Transkriptoms zu unter schiedlichen postischämischen Zeitpunkten können neue the rapeutische Targets identifiziert werden, die neue Behand lungswege für die Akuttherapie erschliessen. Einzelne Genpro dukte, die einer Regulation während des Präkonditionierens unterliegen, konnten bereits identifiziert werden (z. B. IL- 1ra, TIMP-1, hsp-72). Bislang ist jedoch eine protektive Wir kung der identifizierten Proteine nicht eindeutig nachgewie sen worden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere Prote ine und deren zugrundeliegenden Nukleotidsequenzen zu identi fizieren, die protektive Wirkung haben, insbesondere eine gewisse Resistenz gegenüber dem Schlaganfall vermitteln, wie auch solche, die eine Ausweitung des ischämischen Schadens bedingen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Er findung ist es, auf der Basis identifizierter Proteine Ver fahren zur Verfügung zu stellen, die es erlauben, Pharmaka zu entwickeln, die in die entsprechende Pathophysiologie thera peutisch eingreifen können. Damit ist auch das Bereitstellen von entsprechenden Pharmaka eine Aufgabe der vorliegenden Er findung.

Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch die Ge genstände der Ansprüche 1, 5, 6, 8, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 23, 26 und 27. Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den je weiligen Unteransprüchen beschrieben.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Nuklein säure-Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die einen Se quenzbereich enthalten, der für ein Polypeptid mit einer Ami nosäuresequenz von AS 312 bis AS 711 (15B3), AS 180 bis AS 579 (15B3-1) oder AS 306 bis AS 705 (15B3-2) (Numerierung ge mäß Fig. 4) codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele. Insbesondere sind alle Nuk leinsäure-Sequenzen mitumfaßt, die mit den erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren, einschließlich der jeweils im Dop pelstrang komplementären Sequenzen (Anspruch 1).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden DNA- Sequenzen offenbart, deren Genprodukt für ein Polypeptid co diert, wie in einer der Fig. 9, 11 oder 13 für die Sequen zen 15B3, 15B3-1 bzw. 15B3-2 wiedergegeben, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Allele oder Fragmente ei ner solchen DNA-Sequenz und auch infunktioneller Derivate, Allele, Analoga oder Fragmente (bspw. DN-Varianten), die die physiologische Funktion, bspw. apoptotische Signalkaskade, inhibieren können (Anspruch 2). Auch mit diesen erfindungsge mäßen DNA-Sequenzen hybridisierende DNA-Sequenzen (ein schließlich der Sequenzen des komplementären DNA-Stranges) sind mitoffenbart. Die Herstellung derartiger Derivate, Ana loga, Fragmente oder Allele geschieht durch Standardverfahren (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manu al, Cold Spring Harbor, NY). Hierbei werden bei den DNA- Sequenzen gemäß Fig. 8, 10 oder 12 ein oder mehrere Co don(s) insertiert, deletiert oder substituiert, um nach Transkription und Translation ein Polypeptid zu erhalten, das einen Unterschied in bezug auf mindestens eine Aminosäure ge genüber den nativen in den Fig. 9, 11 oder 13 dargestell ten Sequenzen aufweist.

Zum Erfindungsgegenstand der vorliegenden Anmeldung gehören auch DNA-Teilsequenzen der in den Fig. 8, 10 oder 12 dar gestellten Sequenzen. Diese Teilsequenzen enthalten typi scherweise mindestens 60, stärker bevorzugt mindestens 150 und noch stärker bevorzugt mindestens 250 Nukleotide umfas sende Fragmente der in den Fig. 8, 10 oder 12 dargestell ten Nukleotidsequenzen. Insbesondere codieren bevorzugte Teilsequenzen für Polypeptide, die von AS 312 (15B3), 180 (15B3-1) bzw. 306 (15B3-2) mindestens 20 AS in Richtung N- Terminus verlaufen und ggf. sich bis zum N-Terminus erstre cken können (Numerierung gemäß Fig. 4). Weiterhin kann die für mindestens 20 AS codierende Teilsequenz aber auch an ei nem von den vorgenannten Punkten weiter proximal oder distal liegenden Codons beginnen. Ganz besonders bevorzugt sind Teilsequenzen, die für mindestens eine LRR codieren, vorzugs weise mindestens 2 und stärker bevorzugt mindestens 5 (LRRs sind in Fig. 4 durch unterlegte Pfeile gekennzeichnet). Ins besondere bevorzugt sind solche Nukleotidteilsequenzen, die für mindestens eine der in Fig. 4 markierten LRRs codieren bzw. Nukleotidsequenzen, die mindestens eine der in Fig. 4 indizierten LRRs enthalten. Mitoffenbart sind alle Derivate, Analoga oder Allele der vorgenannten offenbarten Teilsequen zen. Auch die sich aus diesen erfindungsgemäßen DNA- Teilsequenzen ergebenden AS-Sequenzen sind als solche oder als Bestandteil in größeren rekombinanten Proteinen mitoffen bart. Zum Rahmen der vorliegenden Erfindung gehören auch alle nativen Spleißvarianten der erfindungsgemäßen Sequenzen.

Weiterhin bevorzugt sind Nukleinsäure-Sequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, die für ein Protein codieren, das mindestens 60% Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens 80% und noch stärker bevorzugt mindestens 95%, mit den in den Fig. 9, 11 oder 13 dargestellten Sequenzen hat. Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen gemäß Fig. 8, 10 oder 12 oder deren funktionelle oder in funktionelle Äquivalente, wie z. B. Allelvariantenn oder Iso formen, erhältlich. Unter Allelvarianten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Varianten verstanden, die 60 bis 100% Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 70 bis 100%, ganz besonders bevorzugt 90 bis 100% aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen oder infunktionel len Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substituti on von Nukleotiden aus der in den Fig. 8, 10 oder 12 dar gestellten Sequenzen erhältlich sind, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften erhalten bleibt.

Homologe oder sequenzverwandte DNA-Sequenzen können aus allen Säugerspezies, einschließlich Mensch, nach gängigen Verfahren durch Homologie-Screening durch Hybridisierung mit einer Pro be der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon isoliert werden. Unter funktionellen Äquivalenten sind auch Homologe der in den Fig. 8, 10 oder 12 dargestellten Sequenzen, beispielsweise ihre Homologen aus anderen Mamma lia, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der co dierenden und nicht-codierenden DNA-Sequenz zu verstehen. Solche funktionellen Äquivalente lassen sich ausgehend von den in den Fig. 8, 10 oder 12 dargestellten DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Vertebraten wie Mammalia, isolieren. Damit sind erfindungsge mäß alle mit den Sequenzen gemäß Fig. 8, 10 oder 12 hybri disierenden Sequenzen mitumfaßt. Diese DNA-Sequenzen hybridi sieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligo nukleotide der konservierten Bereiche, die auf dem Fachmann bekannte Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäu ren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden.

Je nach der verwendeten Nukleinsäure-Sequenz (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) bzw. je nachdem, welche Nukleinsäureart (DNA oder RNA) für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA- Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA: RNA-Hybriden gleicher Länge. Unter Standardbedingungen sind beispielswei se, je nach Nukleinsäure, Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwi schen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natrium citrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Forma mid, wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid, zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbe dingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA: RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbe dingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und ei nem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise bei Sambrook et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), beschrieben und lassen sich nach dem Fach mann bekannten Formeln, beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausübel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nu cleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Zu Äquivalenten von erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen gehören auch Derivate der in den Fig. 8, 10 oder 12 darge stellten Sequenzen, wie beispielsweise Promotorvarianten. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen gemeinsam oder einzeln vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehre re Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deleti on(en) verändert sein, wobei Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren erhalten bleiben kann oder, je nach Bedarf, verändert werden kann. So können die Promotoren durch Verän derung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder kom plett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden. Unter Derivaten sind erfindungsgemäß auch Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Be reich -1 bis -1000 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verän dert, bevorzugt erhöht, wird.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die vorzugsweise am 3'-Ende verändert wurden. Als solche "Tags" sind in der Literatur z. B. Hexa-Histidin-Anker be kannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990: 60-89 und Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Proto cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). und/oder mindestens eine Signalsequenz zum Transport des translatierten Proteins, bspw. in eine bestimmte Zellorganel le oder in den extrazellulären Raum.

Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekon strukt oder eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, bspw. gemäß Fig. 8, 10 oder 12 bzw. deren Derivate, Varianten, Homolo ge oder insbesondere Fragmente auch in therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Form exprimiert werden. Zur Generie rung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme oder O ligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide kodieren, die bspw. einer einfacheren Reinigung dienen.

Bevorzugt sind weiterhin DNA-Sequenzen, die eine der in Fig. 8, 10 oder 12 angegebenen (c)DNA-Sequenzen enthalten (An spruch 4).

Weiterhin werden erfindungsgemäß vorzugsweise alle DNA- Sequenzen mitoffenbart, die für ein Protein codieren, das im wesentlichen der Aminosäuresequenz der Proteine 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 gemäß Fig. 9, 11 oder 13 entspricht. Diese DNA-Sequenzen erhalten nur eine geringe Zahl an Veränderungen gegenüber der in den vorgenannten Figuren angegebenen Sequen zen, bspw. kann es sich um Isoformen handeln. Die Zahl der Sequenzveränderungen wird typischerweise nicht größer als 10 sein. Derartige im wesentlichen mit den für die Proteine 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 codierenden DNA-Sequenzen entspre chenden DNA-Sequenzen, die gleichfalls für ein biologisch ak tives Protein codieren, können durch allgemein bekannte Muta genese-Verfahren erhalten und die biologische Aktivität der durch die Mutanten codierten Proteine durch Screening- Verfahren, bspw. Bindungsstudien oder die Fähigkeit zur Aus prägung der biologischen Funktion, bspw. im Zusammenhang mit der Apoptose, identifiziert werden. Zu den entsprechenden Mu tagenese-Verfahren gehören die "site-directed"-Mutagenese, die die automatisch durchgeführte Synthese eines Primers mit mindestens einer Basenveränderung vorsieht. Nach der Polymer sierungsreaktion wird der Heteroduplex-Vektor in einen geeig netes Zellsystem transferiert (z. B. E.coli) und entsprechend transformierte Klone isoliert.

Darüber hinaus kommen alle dem Fachmann geläufigen Methoden für die Herstellung, Modifikation und/oder Detektion von er findungsgemäßen DNA-Sequenzen, die in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden können in Betracht (PCR (Innis et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications) oder chemische Synthese). Durch entsprechende PCR-Primer können bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz eingeführt werden, wie z. B. Restriktionsschnittstellen, Ter minationscodons. Hierdurch können erfindungsgemäße Sequenzen für den Transfer in Klonierungsvektoren entsprechend entwor fen werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Expressionsvektoren oder ein rekombinantes Nukleinsäurekon strukt, das eine, wie oben beschrieben, erfindungsgemäße Nuk leinsäuresequenz, typischerweise eine DNA-Sequenz enthält (Anspruch 5). Vorteilhafterweise werden hierbei die erfin dungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einem gene tischen Regulationselement, wie bspw. Transkriptions- und Translationssignalen, funktionell verknüpft. Diese Verknüp fung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer nativen Ex pressionsrate oder auch zu einer Erhöhung bzw. Erniedrigung der nativen Genexpression führen. Mit den solchermaßen herge stellten Expressionsvektoren können anschließend Wirtsorganismen bzw. Wirtszellen transformiert werden, z. B. Zellkultu ren aus Säugetierzellen.

Bei dem erfindungsgemäßen Expressionsvektor wird (werden) ty pischerweise das (die) native(n) Regulationselement(e) einge setzt werden, d. h. die bspw. Promotor und/oder Enhancer- Region des Gens für das Protein 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2, bspw. aus Säugetieren, insbesondere entsprechende humane Re gulationssequenzen. Ggf. können diese nativen 15B3-, 15B3-1 oder 15B3-2-Regulationssequenzen auch genetisch verändert sein, um eine veränderte Expressionsintensität hervorzurufen. Zusätzlich zu diesen nativen 15B3-, 15B3-1- oder 15B3-2- Regulationssequenzen oder anstelle dieser nativen 15B3-, 15B3-1- oder 15B3-2-Regulationssequenzen können für andere Ge ne native Regulationselemente erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet (5'- oder 3'- Regulationssequenzen) sein und gegebenenfalls auch genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation unter der Kontrolle der 15B3-, 15B3-1- oder 15B3-2- Regulationssequenzen ausgeschaltet ist und die Expression der Gene - je nach Wunsch - hierdurch erhöht oder erniedrigt wer den kann.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, l-PR- oder im l-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren wie amy und SPO2, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie CaM-KinaseII, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, beta-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin Hydroxylase, Kainat-Rezeptor-Untereinheit 1, Glutamat- Rezeptor-Untereinheit B enthalten. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die bspw. oben genannten für einen erfindungsgemäße Expressions vektor verwendet werden.

Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteil haft verwendet werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese quenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirts organismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion expri miert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression posi tiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstär kung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptions signale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation mög lich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Als Regulationssequenzen werden alle dem Fachmann geläufigen Elemente bezeichnet, die auf der Transkriptions- und/oder Translationsebene die Expression der erfindungsgemäßen Se quenzen beeinflussen können. Insbesondere sind dabei neben Promotorsequenzen sog. "Enhancer"-Sequenzen hervorzuheben, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA- Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken können. Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die sog. "Locus Control Regions", "Silencer" oder jeweilige Teilse quenzen davon genannt. Diese Sequenzen können vorteilhaft für eine gewebespezifische Expression verwendet werden. Auch sog. Terminatorsequenzen werden vorteilhafterweise in einem erfin dungsgemäßen Expressionsvektor vorhanden sein und erfindungs gemäß unter den Terminus "Regulationssequenz" subsumiert.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verknüpfung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit einem Promotor, wobei der Promotor typisch 5' "upstream" von einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz zu liegen kommt. Wei tere Regulationssignale, wie bspw. 3'-gelegene Terminatoren, Polyadenylierungssignale oder Enhancer, können funktionell in dem Expressionsvektor enthalten sein. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, insbesondere für die Sequenzen gemäß Fig. 8, 10 oder 12 bzw. für die entspre chenden Proteine, in einer oder mehreren Kopien in einem Gen konstrukt nach dieser Erfindung enthalten sein, oder ggf. auch auf getrennten Genkonstrukten lokalisiert sein.

Unter den Begriff "Expressionsvektor" fallen sowohl rekombi nante Nukleinsäurekonstrukte bzw. Genkonstrukte, wie zuvor beschrieben, als auch komplette Vektorkonstrukte, die neben erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und etwaigen Regulationsse quenzen typischerweise auch weitere Elemente enthalten. Diese Vektorkonstrukte oder Vektoren werden zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus verwendet. Vorteilhafterweise wird mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz, bspw. das 15B3- Gen oder eine Teilsequenz des 15B3-Gens, in einen wirtsspezi fischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im ausgesuchten Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fach mann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vec tors" (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New Y ork-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Sindbisvirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkulä re DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirts organismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in Mammalia wird typischerweise lineare DNA verwendet.

Die Expression erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkription sebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale, wie Promotoren und Enhancer, verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem bei spielsweise die Stabilität der mRNA verbessert oder die Able seeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird. Zur Er höhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen o der homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Ge nexpression verstärken.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit den für interagierende oder für potentiell interagierende Proteine kodierenden Sequenzen in einen einzelnen Vektor klo niert werden und anschließend in vitro in einer Wirtszelle oder in vivo in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Al ternativ kann auch jede der potentiell interagierenden Nuk leinsäuresequenzen und die für 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 ko dierenden Sequenzen in je einen einzelnen Vektor gebracht und diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Me thoden, wie bspw. Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun verbracht werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann mindes tens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene und/oder Gene, die für ein fluoreszierendes Protein kodieren, insbesondere GFP) in einem erfindungsgemäßen Expressionsvek tor, insbesondere einem kompletten Vektorkonstrukt, enthalten sein.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Wirtszellen, die mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz und/oder einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, insbeson dere einem Vektorkonstrukt transformiert sind (Anspruch 6). Als Wirtszellen sind prinzipiell alle Zellen geeignet, die eine Expression erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen allein oder im Verbund mit weiteren Sequenzen, insbesondere Regulations sequenzen, gestatten. Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro- oder eukaryontischer Natur in Betracht, beispielsweise Bakte rien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen. Bevor zugte Wirtszellen sind Bakterien, wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikro organismen, wie Aspergillus oder Saccharomyces cerevisiae o der die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39, (1997)).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Expres sion von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen Zellen aus multizel lulären Organismen gewählt. Dies geschieht auch vor dem Hin tergrund einer möglicherweise erforderlichen Glykosylierung (N- und/oder O-gekoppelt) der codierten Proteine. Diese Funk tion kann in höheren Eukaryotenzellen - im Vergleich zu Prokaryotenzellen - in geeigneter Weise ausgeführt werden. Im Prin zip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, beispielsweise Affen, Ratten, Hamstern oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien be kannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung werden die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryonennierenzelli nie), (Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1997)), BHK (Ba byhamsternierenzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien), (Urlaub und Chasin, P. N. A. S. (USA) 77: 4216, (1980)), HeLa (humane Cervixkarzinomzellen) und weitere - insbesondere für den Laboreinsatz etablierte - Zellinien, wie bspw. HEK293-, Sf9- oder COS-Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane Zellen, insbesondere Zellen des Immunsystems oder adulte Stammzellen, bspw. Stammzellen des Blut bildenden Systems (aus dem Knochenmark) (Anspruch 7). Humane erfindungsgemäße trans formierte Zellen, insbesondere autologe Zellen des Patienten, eignen sich nach (vor allem ex vivo) Transformation mit er findungsgemäßen DNA-Sequenzen oder erfindungsgemäßen Expres sionsvektoren, ganz besonders als Arzneimittel für bspw. gentherapeutische Zwecke, also nach Durchführung einer Zell entnahme, ggf. ex vivo Expansion, Transformation, Selektion und abschließender Retransplantation.

Die Kombination aus einer Wirtszelle und einem zu den Wirts zellen passenden erfindungsgemäßen Expressionsvektor, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen l, Mu oder an dere temperänte Phagen oder Transposons, und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen, bilden eine erfin dungsgemäße Wirtszelle, die als Expressionssystem dienen kann. Bevorzugte erfindungsgemäße Expressionssysteme auf der Basis erfindungsgemäßer Wirtszellen sind beispielsweise die Kombination aus Säugetierzellen, wie bspw. CHO-Zellen, und Vektoren, wie bspw. pcDNA3neo-Vektor, oder bspw. HEK293- Zellen und CMV-Vektor, die für Säugetierzellen besonders ge eignet sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die Gen produkte der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen (Anspruch 8). Un ter Genprodukten versteht man im Sinne dieser Erfindung sowohl Primärtranskripte, also RNA, vorzugsweise mRNA, als auch Pro teine bzw. Polypeptide, insbesondere in aufgereinigter Form (Anspruch 9). Diese Proteine weisen erfindungsgemäß mindestens eine LRR-Sequenz, vorzugsweise mindestens 5, stärker bevorzugt mindestens 8 und am stärksten bevorzugt 10 oder sogar mehr als 10 LRR-Sequenzen auf und regulieren oder transportieren insbe sondere apoptotische oder nekrotische, ggf. auch inflammatori sche Signale oder Signale, die das Zellwachstum oder die Zell plastizität betreffen. Typischerweise sind sie an der Signaltransduktion über die Ras-Kaskade unmittelbar oder mit telbar beteiligt. Bevorzugt ist ein aufgereinigtes Genprodukt dann, wenn es mindestens eine der in Fig. 4 angegebenen (und auch in den Fig. 9, 11 und 13 enthaltenen Aminosäurese quenzen (für eine LRR-Domäne), oder ein funktionshomologes oder die Funktion inhibierendes (infunktionelles) Allel, Fragment, Analoges oder Derivat dieser Sequenz enthält (An spruch 10) oder typischerweise aus einer solchen Aminosäure sequenz besteht. Funktionshomologie wird im Sinne der vorlie genden Erfindung so definiert, daß mindestens noch eine der wesentlichen funktionellen Eigenschaften der gemäß Fig. 9, 11 oder 13 dargestellten Proteine 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 erhalten bleibt. Typischerweise werden funktionshomologe er findungsgemäße Proteine insbesondere eine charakteristische, bspw. mindestens 60%ige, vorzugsweise mindestens 80%ige Se quenzidentität in den als Leucin reichen Regionen (LRRs) be zeichneten Sequenzabschnitten, die Protein- Interaktionsdomänen darstellen und typischerweise 20-28 Ami nosäuren mit einer spezifischen Kernkonsensus-Sequenz von Leucinen und Asparaginen (LXXLXLXXN) aufweisen. Typischerwei se wird ein erfindungsgemäßes funktionshomologes Allel, Deri vat oder Analogon der in den Fig. 9, 11 oder 13 offenbar ten Aminosäure-Sequenzen mindestens vier, vorzugsweise min destens 6 und noch stärker bevorzugt mindestens 8 LRRs mit den vorgenannten Konsensus-Sequenzen aufweisen.

Unter einem Derivat werden dabei insbesondere solche AS- Sequenzen verstanden, die durch Modifikationen ihrer Seiten ketten verändert sind. Bspw. durch Konjugation eines Antikör pers, Enzyms oder Rezeptors an eine erfindungsgemäße AS- Sequenz. Derivate können aber auch die Kopplung eines Zuckers oder Fett(säure)-restes oder einer Phosphatgruppe oder jeder beliebigen Modifikation einer Seitenkette, insbesondere einer freien OH-Gruppe oder NH2-Gruppe oder am N- oder C-Terminus. Darüber hinaus schließt der Begriff "Derivat" auch Fusions proteine ein, bei denen also eine erfindungsgemäße Aminosäu resequenz an beliebige Oligo- oder Polypeptide gekoppelt ist.

Als "Analoge" werden Sequenzen bezeichnet, die sich durch mindestens eine AS-Veränderung gegenüber der nativen Sequenz auszeichnen (Insertion, Substitution). Im Rahmen der vorlie genden Erfindung sind solche konservativen Substitutionen be vorzugt, bei denen der physikochemische Charakter (Raumerfül lung, Basizität, Hydrophobizität etc.) der ausgetauschten AS erhalten bleibt (polare AS, lange aliphatische Kette, kurze aliphatische Kette, negativ oder positiv geladene AS, AS mit aromatischer Gruppe). Die Substitutionen können biologisch funktionelle, tw. Funktionelle oder biologisch infunktionelle Sequenzen ergeben. Beispielsweise können Argininreste gegen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparaginsäurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht werden. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Rei henfolge vertauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden. Die solchermaßen gegenüber den in Fig. 9, 11 oder 13 veränderten Proteine besitzen typischerweise wenigstens 60%, bevorzugt wenigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens 90% Sequenzidentität zu den Sequenzen in den vorgenannten Figuren, berechnet nach dem Algorithmus von Altschul et al. (J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990. Das isolierte Protein und seine funktionellen Varianten lassen sich vorteilhafter weise aus dem Gehirn von Mammalia wie Homo sapiens, Rattus norvegicus oder Mus musculus isolieren. Auch Homologe aus an deren Mammalia sind unter funktionellen Varianten zu verste hen.

Bevorzugt sind erfindungsgemäß Analoge dann, wenn die Sekun därstruktur, wie sie in der nativen Sequenz auftritt, auch bei ihnen erhalten bleibt. Neben konservative Substitutionen können auch weniger konservative AS-Variationen erfindungsge mäß in die native Sequenz eingeführt werden. Dabei behalten sie typischerweise ihre biologische Funktion, insbesondere als Transduktor eines apoptotischen oder nekrotischen, zellproliferativen, wachstumsindizierenden oder regenerativen Signals, bei. Der Effekt einer Substitution oder Deletion kann ohne weiteres durch entsprechende Untersuchungen, bspw. Bindungsassays oder zytotoxische Tests, überprüft werden.

Gleichwohl werden erfindungsgemäß aber auch Sequenzen einbe zogen, die einen sogenannten dominant-negativen Effekt her vorrufen, d. h. auf Grund ihre veränderten Primärsequenz zwar noch Bindungsaktivität an eine in der Kaskade stromaufwärts gelegene Sequenz aufweisen, das Signal aber nicht stromabwärts weitergeben können. Derartige Analoge fungieren daher als Inhibitoren der biologischen Funktion, insbesondere als Inhibitoren der Apoptose, des Zellwachstums, der Zellprolife ration, der Zellplastizität oder der Zellregeneration. Derar tige Analoge werden durch gentechnische Maßnahmen herge stellt, und zwar typischerweise durch die sog. "site- directed"-Mutagenese einer DNA-Sequenz, die für ein erfin dunsgemäßes Protein (typischerweise 15B3, 15B3-1 oder 15B3- 2), codiert. Hierdurch wird die dem Analogen zugrundliegende DNA-Sequenz hergestellt, die schließlich das Protein in einer rekombinanten Zellkultur exprimieren kann (Sambrook et al., 1989, s. o.). Auch alle Derivate der vorbeschriebenen Analoge werden mitoffenbart, genauso wie die den vorbeschriebenen AS- Sequenzen zugrundeliegenden DNA-Sequenzen.

Weiterhin gehören auch Fragmente einer nativen erfindungsge mäßen AS-Sequenz zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Fragmente zeichnen sich durch Deletionen aus (N- oder C- terminal oder auch intrasequentiell). Sie können einen domi nant-negativen oder dominant-positiven Effekt haben.

Zu den erfindungsgemäßen Genprodukten (Proteinen) gehören aber auch all jene Genprodukte (Proteine), die sich erfindungsgemäß von DNA-Derivaten, DNA-Fragmenten oder DNA-Allelen der in den Fig. 8, 10 oder 12 angegebenen DNA-Sequenzen nach Transkription und Translation ableiten.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Proteine chemisch modifiziert sein. So etwa kann eine Schutzgruppe am N-Terminus vorliegen. Es können Glykosylgruppen an Hydroxyl- oder Ami nogruppen angefügt sein, Lipide können kovalent mit dem erfin dungsgemäßen Protein verbunden sein, ebenso Phosphate oder A cetylgruppen und ähnliches. Auch beliebige chemische Substanzen, Verbindungen oder Gruppen können auf einem beliebigen Syntheseweg an das erfindungsgemäße Protein gebunden sein. Auch zusätzliche Aminosäuren, z. B. in Form einzelner Aminosäu ren oder in Form von Peptiden oder in Form von Proteindomänen und ähnliches, können mit dem N- und/oder C-Terminus eines er findungsgemäßen Proteins, insbesondere aber auch an den N- o der C-Terminus einer Leucin reichen Domäne, fusioniert sein, ggf. aber auch in die Sequenz der erfindungsgemäßen Leucin reichen Domäne integriert sein.

Insbesondere sind hier sogenannte Signal- oder "Leader"- Sequenzen am N-Terminus der Aminosäuresequenz eines erfin dungsgemäßen Proteins bevorzugt, die das Peptid cotranslatio nal oder posttranslational in eine bestimmte Zellorganelle o der in den extrazellulären Raum (bzw. das Kulturmedium) füh ren. Am N- oder am C-Terminus können auch Aminosäuresequenzen vorliegen, die als Antigen die Bindung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz an Antikörper erlauben. Zu nennen ist hier insbesondere das Flag-Peptid, dessen Sequenz im Einbuchstaben code der Aminosäuren lautet: DYKDDDDK. Oder auch ein His-Tag mit mindestens 3, vorzugsweise mindestens 6 Histidin-Resten. Diese Sequenzen haben stark antigene Eigenschaften und erlaubt somit eine schnelle Überprüfung und leichte Reinigung des re kombinanten Proteins. Monoklonale Antikörper, die das Flag- Peptid binden, sind von der Firma Eastman Kodak Co., Scienti fic Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut erhält lich.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner mindestens 20, stärker bevorzugt mindestens 30 und noch stärker bevor zugt mindestens 50 Aminosäuren umfassende Teilabschnitte der in den Fig. 9, 11 oder 13 offenbarten Sequenzen. Derartige Teilsequenzen können nach dem Fachmann geläufigen Verfahren bspw. chemisch synthetisiert werden und können vorzugsweise als Antigene für die Produktion von Antikörpern eingesetzt werden. Vorzugsweise wird es sich bei diesen Teilabschnitten um solche Regionen der in den Fig. 9, 11 oder 13 offenbar ten Sequenzen handeln, die im räumlichen Modell der Proteine zumindest teilweise die Proteinoberfläche ausmachen.

Transgene Tiere stellen einen weiteren Gegenstand der vorlie genden Erfindung dar (Anspruch 11). Bei erfindungsgemäßen transgenen Tieren handelt es sich um Tiere, die genetisch da hingehend verändert sind, daß sie eine im Vergleich zum Nor maltier veränderte Menge eines erfindungsgemäßen Genprodukts in mindestens einem Gewebe exprimieren bzw. enthalten. Hier bei sind erfindungsgemäß auch solche Tiere eingeschlossen, die die nativ vorhandene erfindungsgemäße DNA-Sequenz (a) auf der genetischen Ebene entweder tw. oder vollständig nicht mehr aufweisen oder (b) zwar auf der genetischen Ebene erfin dungsgemäße Sequenzen aufweisen, diese jedoch nicht transkri bieren und/oder translatieren können und daher das Genprodukt nicht mehr enthalten. Darüber hinaus kann (können) bei einem transgenen Tier die native 15B3-Sequenz(en), 15B3-1- oder 15B3-2-Sequenzen) (ob vorhanden oder nicht vorhanden) um mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz ergänzt bzw. durch mindestens eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz substitu iert sein. Insbesondere kann es sich bei der (den) substitu ierten und/oder ergänzten Sequenz(en) um erfindungsgemäße Se quenzen handeln, die nicht nativer Natur sind.

Die Herstellung von in bezug auf erfindungsgemäße Sequenzen transgenen und "knock-out" Tieren, insbesondere Mäusen, Rat ten Schweinen, Fruchtfliegen oder Zebrafischen, erfolgt auf dem Fachmann geläufige Weise. Hierzu wird z. B. eine 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 cDNA Sequenz oder native oder nicht-native Variante in transgenen Mäusen exprimiert, z. B. unter einem NSE-Promotor in Neuronen, unter einem MBP-Promotor in Oligo dendrozyten etc. Die genetisch veränderten Tiere können da nach in unterschiedlichen Krankheitsmodellen untersucht wer den (z. B. experimentell herbeigeführtem Schlaganfall, MCAO). Die Herstellung von "knock-out" Tieren kann zudem Hinweise auf die Auswirkungen von Inhibitoren auf den Gesamtorganismen liefern, da ein "knock out Modell" insoweit der Inhibition erfindungsgemäßer nativer Sequenzen entspricht.

Sämtliche multizellulären Organismen können erfindungsgemäß transgen ausgestaltet sein, insbesondere Säugetiere, bspw. Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder oder Schweine. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar. Bei den transgenen Organis men kann es sich auch um sogenannte "Knock-Out"-Tiere han deln. Dabei können die transgenen Tiere eine funktionelle o der nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäure konstrukt allein oder in Kombination mit einer funktionellen oder nicht funktionellen Sequenz, die für 15B3 Proteine ko diert, enthalten.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung der oben be schriebenen transgenen Tiere sind transgene Tiere, in deren Keimzellen oder der Gesamtheit oder einem Teil der somati schen Zellen oder in deren Keimzellen oder der Gesamtheit o der einem Teil der somatischen Zellen die native(n) 15B3- Nukleotidsequenz(en) durch gentechnische Verfahren verändert oder durch Einfügen von DNA-Elementen unterbrochen wurden. Eine weitere Möglichkeit des Einsatzes einer erfindungsgemä ßen Nukleotidsequenz oder Teilen davon ist die Erzeugung transgener oder knock-out- oder konditioneller oder regionenspezifischer knock-out Tiere oder spezifischer Mutationen bei gentechnisch veränderten Tieren (Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York und Torres et al., (eds.) 1997, Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford).

Über transgene Überexpression oder genetische Mutation (Null mutation oder spezifische Deletionen, Insertionen oder Verän derungen) durch homologe Rekombination in embryonalen Stamm zellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wertvolle weitere Informationen über die (Patho-)Physiologie der erfindungsge mäßen Sequenzen liefern. Solchermaßen hergestellte Tiermodel le können essentielle Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika darstellen, die die biologische Funktion von Proteinen gemäß Fig. 9, 11 oder 13 für neurale, vaskuläre oder andere Prozesse beeinflussen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der ein Epitop auf einem erfindungsgemäßen Gen produkt, insbesondere einem erfindungsgemäßen Protein gemäß Fig. 9, 11 oder 13 oder Derivaten, Fragmenten oder Isofor men oder Allelen, erkennt (Anspruch 12), aber auch gegen z. B. erfindungsgemäße mRNA gerichtet sein kann. Der Begriff "Anti körper" umfaßt i. S. der vorliegenden Erfindung sowohl po lyklonale Antikörper als auch monoklonale Antikörper (An spruch 13), chimärische Antikörper, anti-idiotypische Anti körper (gerichtet gegen erfindungsgemäße Antikörper), die al le in gebundener oder löslicher Form vorliegen und ggf. durch "Label" markiert sein können, sowie auch Fragmente der vorge nannten Antikörper. Neben den Fragmenten von erfindungsgemä ßen Antikörpern in Alleinstellung können erfindungsgemäße An tikörper auch in rekombinanter Form als Fusionsproteine mit anderen (Protein)-Bestandteilen auftreten. Fragmente als sol che oder Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern als Be standteile von Fusionsproteinen werden typischerweise durch die Methoden enzymatischer Spaltung, der Protein-Synthese o der die dem Fachmann geläufigen Rekombinationsmethoden herge stellt. Als Antikörper werden nach der vorliegenden Erfindung also sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisier te oder rekombinante Antikörper oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper bezeich net.

Bei den polyklonalen Antikörpern handelt es sich um heteroge ne Mischungen von Antikörpermolekülen, die aus Seren von Tie ren hergestellt werden, die mit einem Antigen immunisiert worden sind. Zum Gegenstand der Erfindung gehören aber auch polyklonale monospezifische Antikörper, die nach Aufreinigung der Antikörper (bspw. über eine Säule, die mit Peptiden eines spezifischen Epitops beladen sind) erhalten werden. Ein mo noklonaler Antikörper enthält eine im wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch gegen Antigene ge richtet sind, wobei die Antikörper im wesentlichen gleiche Epitop-Bindungsstellen aufweisen. Monoklonale Antikörper kön nen durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren erhal ten werden (z. B. Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-397, (1975); US-Patent 4,376,110; Ausubel et al., Harlow und Lane "Antikörper": Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Labora tory (1988); Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Die in den vorgenannten Literaturstellen enthaltene Beschreibung wird als Bestandteil der vorliegenden Erfindung in die Offen barung der vorliegenden Erfindung einbezogen.

Auch lassen sich gentechnisch manipulierte erfindungsgemäße Antikörper nach Verfahren, wie in den vorgenannten Druck schriften beschrieben herstellen. Kurz gesagt, werden dazu Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopro panol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die syntheti sierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch "site directed mutagenesis", Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu- Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakte rien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisi ae. Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Prote ine können sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Therapeutika bei Erkrankungen eignen, bei denen 15B3 von pathophysiologischer Bedeutung ist.

Erfindungsgemäße Antikörper können einer der folgenden Im munglobulinklassen angehören: IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und ggf. einer Unterklasse der vorgenannten Klassen, wie die Sub klassen des IgG oder deren Mischungen zu verstehen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgG1/k oder IgG2b/k. Ein Hybridom-Zellklon, der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung von großen Titern an monoklonalen Antikörpern erfolgt vorzugsweise in vivo oder in situ.

Bei den erfindungsgemäßen chimärischen Antikörpern handelt es sich um Moleküle, die verschiedene Bestandteile enthalten, wobei diese sich aus verschiedenen Tierarten ableiten (z. B. Antikörper, die eine variable Region, die aus einem Mäuse monoklonalen Antikörper abgeleitet ist, und eine konstante Region eines humanen Immunglobulins aufweisen). Chimärische Antikörper werden vorzugsweise eingesetzt, um einerseits die Immunogenizität bei der Anwendung zu reduzieren und anderer seits die Ausbeuten bei der Produktion zu erhöhen, z. B. erge ben murine monoklonale Antikörper höhere Ausbeuten aus Hybri dom-Zellinien, führen aber auch zu einer höheren Immunogeni zität beim Menschen, so daß human/murine chimärische Antikör per vorzugsweise eingesetzt werden. Chimärische Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus dem Stand der Technik bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312, 643-646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171496; Morrion et al., EP-A-173494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) und Harlow und Lane, Antikörper: A Laborato ry Manual, wie oben zitiert. Diese Zitatstellen werden als zur Offenbarung gehörig in die vorliegende Erfindung einbezo gen.

Ganz besonders bevorzugt wird ein solcher erfindungsgemäßer Antikörper gegen einen Leucin reichen Sequenzabschnitt auf einem Protein gemäß Fig. 9, 11 oder 13 als Epitop gerich tet sein (Anspruch 14).

Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper ist ein Antikörper, der eine Determinante, die im allgemeinen mit der Antigenbindungsstelle eines erfindungsgemäßen Antikörpers as soziiert ist, erkennt. Ein anti-idiotypischer Antikörper kann durch die Immunisierung eines Tieres der gleichen Art und des gleichen genetischen Typs (z. B. eines Mäusestamms) als Aus gangspunkt für einen monoklonalen Antikörper, gegen welchen ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper gerichtet ist, hergestellt werden. Das immunisierte Tier wird die idio typischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers durch die Produktion eines Antikörpers, der gegen die idiotypischen Determinanten gerichtet ist (nämlich ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper), erkennen (U. S. 4,699,880). Ein erfindungsgemäßer anti-idiotypischer Antikörper kann auch als Immunogen eingesetzt werden, um eine Immunantwort in ei nem weiteren Tier hervorzurufen und um dort zur Produktion eines sog. anti-anti-idiotypischen Antikörpers zu führen. Der anti-anti-idiotypische Antikörper kann, muß aber nicht, be züglich seiner Epitop-Konstruktion identisch mit dem originä ren monoklonalen Antikörper sein, der die anti-idiotypische Reaktion hervorgerufen hat. Auf diese Weise können durch die Verwendung von gegen idiotypische Determinanten eines mo noklonalen Antikörpers gerichtete Antikörper andere Klone, die Antikörper von identischer Spezifität exprimieren, iden tifiziert werden.

Monoklonale Antikörper, die gegen erfindungsgemäße Proteine, Analoge, Fragmente oder Derivate dieser erfindungsgemäßen Proteine gerichtet sind, können eingesetzt werden, um die Bindung von anti-idiotypischen Antikörpern in entsprechenden Tieren, wie z. B. der BALB/c Maus, zu induzieren. Zellen aus der Milz einer solchen immunisierten Maus können verwendet werden, um anti-idiotypische Hybridom-Zellinien, die anti- idiotypische monoklonale Antikörper sekretieren, zu produzie ren. Weiterhin können anti-idiotypische monoklonale Antikör per auch an einen Träger gekoppelt werden (KLH, "keyhole lim pet hemocyanin") und dann verwendet werden, um weitere BALB/c-Mäuse zu immunisieren. Die Sera dieser Mäuse enthalten dann anti-anti-idiotypische Antikörper, die die Bindungsei genschaften der originären monoklonalen Antikörper haben und spezifisch für ein Epitop des erfindungsgemäßen Proteins oder eines Fragments oder Derivats von demselben sind. Die anti- idiotypischen monoklonalen Antikörper haben auf diese Weise ihre eigenen idiotypischen Epitope oder "Idiotope", die strukturell mit dem zu untersuchenden Epitop ähnlich sind.

Die Bezeichnung "Antikörper" soll sowohl intakte Moleküle als auch Fragmente derselben einschließen. Als Fragmente seien alle verkürzten oder veränderten Antikörperfragmente mit ei ner oder zwei dem Antigen-komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den Antikörper entsprechenden von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder Einzelstrangfragmente, ge nannt. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Fab- oder F(ab')2. Fab- und F(ab')2-Fragmente entbehren ei nes Fc-Fragments, wie etwa in einem intakten Antikörper vorhanden, so daß sie im Blutkreislauf schneller transportiert werden können und vergleichsweise weniger nicht-spezifische Gewebsbindung als intakte Antikörper aufweisen. Hierbei wird hervorgehoben, daß Fab- und F(ab')2- Fragmente von erfindungsgemäßen Antikörpern bei der Detektion und Quantifizierung von erfindungsgemäßen Proteinen erfindungsgemäßen Proteinen eingesetzt werden können. Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung hergestellt, indem Enzyme, wie z. B. Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')2- Fragmenten) verwendet werden, oder durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene er halten werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Mischungen von Antikörpern im Sinne der vorliegenden Erfindung. Neben den Antikörpern können auch Mischungen von Antikörpern für alle gemäß der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren oder Verwendungen eingesetzt werden. Sowohl gereinigte Frak tionen monoklonaler Antikörper, polyklonale Antikörper oder Mischungen monoklonaler Antikörper kommen als Arzneimittel zum Einsatz und finden Verwendung bei der Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von cerebralen Ischämien (z. B. Schlaganfall), degenerativen Erkrankungen, insbesondere neu rodegenerativen Erkrankungen, und neurologischen Erkrankun gen, wie z. B. Epilepsie, wie auch Tumorerkrankungen.

Erfindungsgemäße Antikörper, einschließlich der Fragmente von diesen Antikörpern, bzw. deren Mischungen können zur quanti tativen oder qualitativen Detektion von erfindungsgemäßem Genprodukt, insbesondere Proteinen gemäß Fig. 9, 11 oder 13 oder deren Fragmente oder Derivate, in einer Probe einge setzt werden oder auch zur Detektion von Zellen, die erfin dungsgemäße Proteine exprimieren und ggf. sekretieren. Inso weit wird die Verwendung erfindungsgemäßer Antikörper als Di agnostika offenbart. So kann etwa über erfindungsgemäße Anti körper die Menge an erfindungsgemäßem Genprodukt und u. U. de ren Aktivität (z. B. spezifische Phosphorylierungen) der Pro teine gemäß Fig. 9, 11 oder 13 bestimmt werden. Die Detektion kann mit Hilfe von Immunofluoreszenz-Verfahren erreicht werden, die Fluoreszenz-markierte Antikörper in Kombination mit Lichtmikroskopie, Flußzytometrie oder fluorometrischer Detektion durchgeführt werden.

Erfindungsgemäße Antikörper im Sinne der Erfindung (dies schließt Fragmente dieser Antikörper ein oder auch Mischungen von Antikörpern) eignen sich für histologische Untersuchun gen, wie z. B. im Rahmen der Immunofluoreszenz oder Immunoe lektromikroskopie, für die in situ Detektion eines erfin dungsgemäßen Proteins. Die in situ Detektion kann dadurch er folgen, daß eine histologische Probe von einem Patienten ge nommen wird und markierte erfindungsgemäße Antikörper zu ei ner solchen Probe hinzugegeben werden. Der Antikörper (oder ein Fragment dieses Antikörpers) wird in markierter Form auf die biologische Probe aufgetragen. Auf diese Weise ist es nicht nur möglich, die Anwesenheit von erfindungsgemäßem Pro tein in der Probe zu bestimmen, sondern auch die Verteilung des erfindungsgemäßen Proteins in dem untersuchten Gewebe. Bei der biologischen Probe kann es sich um eine biologische Flüssigkeit, ein Gewebeextrakt, geerntete Zellen, wie z. B. Immunzellen oder Herzmuskel- oder Leberzellen, oder allgemein um Zellen, die in einer Gewebekultur inkubiert worden sind, handeln. Die Detektion des markierten Antikörpers kann je nach Art der Markierung durch im Stand der Technik bekannte Verfahren (z. B. durch Fluoreszenzverfahren) erfolgen. Die biologische Probe kann aber auch auf einem Festphasenträger, wie z. B. Nitrocellulose oder ein anderes Trägermaterial, aufgetragen werden, so daß die Zellen, Zellteile oder lösli chen Proteine immobilisiert werden. Der Träger kann dann mit einem geeigneten Puffer ein- oder mehrfach gewaschen werden, wobei nachfolgend mit einem detektierbar markierten Antikör per nach der vorliegenden Erfindung behandelt wird. Der Festphasenträger kann dann mit dem Puffer ein zweites Mal gewa schen werden, um nicht gebundenen Antikörper zu beseitigen. Die Menge an gebundener Markierung auf dem Festphasenträger kann dann mit einem herkömmlichen Verfahren bestimmt werden.

Als Träger eignen sich insbesondere Glas, Polystyrol, Po lypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon-Amylasen, natürliche oder modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide und Magnetit. Der Träger kann entweder bedingt löslichen oder unlöslichen Charakters sein, um die Bedingungen nach Maßgabe der vorlie genden Erfindung zu erfüllen. Das Trägermaterial kann belie bige Formen einnehmen, z. B. in Form von Kügelchen ("beads"), oder zylindrisch oder sphärisch sein, wobei Polystyrol- Kügelchen als Träger bevorzugt sind.

Eine detektierbare Antikörpermarkierung kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann der Antikörper an ein En zym gebunden werden, wobei das Enzym schließlich in einem Im munoassay (EIA) eingesetzt werden kann. Das Enzym kann dann später mit einem entsprechenden Substrat reagieren, so daß eine chemische Verbindung entsteht, die auf eine dem Fachmann geläufige Art und Weise detektiert und ggf. quantifiziert werden kann, z. B. durch Spektrophotometrie, Fluorometrie o der andere optische Verfahren. Bei dem Enzym kann es sich um Malat-Dehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid Isomerase, Hefe-Alkohol-Dehydrogenase, alpha-Glycerophosphat dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich- Peroxidase, alkalische Phosphatase, Aspariginase, Glucoseoxi dase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase oder Acetyl cholinesterase handeln. Die Detektion wird dann über ein chromogenes Substrat, das spezifisch für das für die Markie rung eingesetzte Enzym ist, ermöglicht und kann schließlich z. B. über Sichtvergleich des durch die Enzymreaktion umge setzten Substrats im Vergleich zu Kontrollstandards erfolgen.

Weiterhin kann die Detektion durch andere Immunoassays si chergestellt werden, z. B. durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente (also durch einen Radi oimmunoassay (RIA; Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T. et al. North Holland Publishing Company, New York (1978). Das radioaktive Isotop kann dabei durch die Verwendung von Szintillationszählern oder durch Au toradigraphie detektiert und quantifiziert werden.

Fluoreszierende Verbindungen können gleichfalls zur Markie rung eingesetzt werden, beispielsweise Verbindungen wie Fluo rescinisothiocyanat, Rhodamin, Phyoerythrin, Phycocyanin, Al lophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin. Auch fluores zensemittierende Metalle, wie z. B. ¹⁵²E oder andere Metalle aus der Lanthanid-Gruppe, können eingesetzt werden. Diese Me talle werden an den Antikörper über Chelatgruppen, wie z. B. Diethylentriaminpentaessigsäure (ETPA) oder EDTA angekoppelt. Weiterhin kann der erfindungsgemäße Antikörper über eine mit Hilfe von Chemilumineszenz wirkende Verbindung angekoppelt werden. Die Gegenwart des Chemilumineszenz-markierten Anti körpers wird dann über die Lumineszenz, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht, detektiert. Beispiele für der artige Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, Acridiniu mester, Imidazol, Acridiniumsalz oder Oxalatester. Gleicher maßen können auch biolumineszente Verbindungen zum Einsatz kommen. Biolumineszenz ist eine Unterart der Chemilumines zenz, die bei biologischen Systemen vorgefunden wird, wobei ein katalytisches Protein die Effizienz der chemilumineszen ten Reaktion verstärkt. Die Detektion des biolumineszenten Proteins erfolgt wiederum über die Lumineszenz, wobei als biolumineszente Verbindung beispielsweise Luciferin, Luciferase oder Aequorin in Betracht kommen.

Ein erfindungsgemäßer Antikörper kann für die Verwendung in einem immunometrischen Assay, auch bekannt als "two-site" o der "sandwich" Assay, zur Anwendung gelangen. Typische immu nometrische Assay-Systeme schließen sog. "Vorwärts"-Assays ein, die sich dadurch auszeichnen, daß erfindungsgemäße Anti körper an ein Festphasensystem gebunden sind und daß der An tikörper mit der Probe, die untersucht wird, auf diese Weise in Kontakt gebracht wird. Derart wird das Antigen aus der Probe durch die Bildung eines binären Festphasen-Antikörper- Antigen-Komplexes aus der Probe isoliert. Nach einer geeigne ten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen, um den verbleibenden Rest der flüssigen Probe zu beseitigen, ein schließlich des ggf. nicht gebundenen Antigens, und daraufhin mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die eine unbekannte Menge an markiertem Detektionsantikörper enthält. Der mar kierte Antikörper dient hierbei als sog. Reporter-Molekül. Nach einer zweiten Inkubationszeit, die es den markierten An tikörper erlaubt, mit dem an die Festphase gebundenen Antigen zu assoziieren, wird der Festphasenträger erneut gewaschen, um markierte Antikörper, die nicht reagiert haben, zu besei tigen.

In einer alternativen Assay-Form kann auch ein sog. "sand wich"-Assay zum Einsatz kommen. Hierbei kann ein einziger In kubationsschritt ausreichen, wenn der an die Festphase gebun dene Antikörper und der markierte Antikörper beide gleichzei tig auf die zu testende Probe aufgebracht werden. Nach Abschluß der Inkubation wird der Festphasenträger gewaschen, um Rückstände der flüssigen Probe und der nicht-assoziierten markierten Antikörper zu beseitigen. Die Anwesenheit von markiertem Antikörper auf dem Festphasenträger wird genau so be stimmt, wie bei den konventionellen "Vorwärts"-Sandwich- Assay. Bei dem sog. reversen Assay wird schrittweise zunächst eine Lösung des markierten Antikörpers zur Flüssigprobe hin zugefügt, gefolgt von der Beimischung von nicht-markiertem Antikörper, gebunden an einen Festphasenträger, nach Ablauf einer geeigneten Inkubationszeit. Nach einem zweiten Inkuba tionsschritt wird der Festphasenträger in herkömmlicher Weise gewaschen, um ihn von Probenüberresten und von markiertem An tikörper, der nicht reagiert hat, zu befreien. Die Bestimmung des markierten Antikörpers, der mit dem Festphasenträger rea giert hat, wird dann, so wie oben beschrieben, durchgeführt.

Nach der vorliegenden Erfindung werden weiterhin Verfahren zur Expression von erfindungsgemäßen Genprodukten, insbesondere also von Polypeptiden gemäß Fig. 9, 11 oder 13, einschließ lich aller Derivate, Analoge und Fragmente, offenbart, wobei hierfür Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressions vektor transformiert werden (Anspruch 15). Dieses Verfahren zur Expression von Genprodukten, die auf einer erfindungsgemä ßen DNA-Sequenz beruhen, dient nicht dazu, das entsprechende Genprodukt zu konzentrieren und aufzureinigen, sondern viel mehr dazu, den Zellstoffwechsel durch das Einführen der erfin dungsgemäßen DNA-Sequenzen über die Expression des dazugehöri gen Genprodukts zu beeinflussen. Hier ist insbesondere an die Verwendung der mit Hilfe von Expressionsvektoren transformier ten Wirtszellen als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zum Zwecke der Behandlung von Er krankungen, bspw. von Tumorerkrankungen, neurologischen Er krankungen, neurodegenerativen Erkrankungen (bspw. Multipler Sklerose, Morbus Parkinson), cerebralen Ischämien (z. B. Schlaganfall). Allgemein werden erfindungsgemäße Wirtszellen bei Erkrankungen zur Verfügung gestellt, denen eine Fehlregulation der Apoptose, der Nekrose, der Zellproliferation, des Zellwachstums oder der Zellplastizität zugrunde liegt. Die derart erfindungsgemäß ex vivo transformierten autologen oder allogenen Wirtszellen können dann Patienten transplantiert werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung von Genprodukten mit mindestens einer mit der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz von 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 zumindest über eine Teilsequenz von mindes tens 20, vorzugsweise mindestens 30 AS homologen Teilsequenz, wobei die Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Expressions vektor transformiert und dann unter geeigneten, die Expression fördernden Bedingungen kultiviert werden, so daß das Genpro dukt schließlich aus der Kultur aufgereinigt werden kann (An spruch 16). Das erfindungsgemäße Genprodukt der erfindungsge mäßen DNA-Sequenz kann dabei, abhängig von dem Expressionssys tem, aus einem Kulturmedium oder aus Zellextrakten isoliert werden. Der Fachmann kann ohne weiteres erkennen, daß die je weiligen Isolierungsmethoden und das Verfahren bei der Aufrei nigung des von einer erfindungsgemäßen DNA kodierten, rekombi nanten Proteins stark vom Typ der Wirtszelle oder auch von dem Umstand, ob das Protein in das Medium sekretiert wird, ab hängt. Zum Beispiel können Expressionssysteme eingesetzt wer den, die zur Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle führen. Das Kulturmedium muß in diesem Fall durch kommerziell erhältliche Proteinkonzentrationsfilter, z. B. Ami con oder Millipore Pelicon, aufkonzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann ein Reinigungsschritt erfolgen, z. B. ein Gelfiltrationsschritt oder eine Reinigung mit Hilfe von säulenchromatographische Methoden. Alternativ kann aber auch ein Anionenaustauscher eingesetzt werden, der eine Matrix mit DEAE aufweist.

Als Matrix dienen dabei alle aus der Proteinreinigung bekannten Materialien, z. B. Acrylamid oder Agarose oder Dextran oder ähnliches. Es kann aber auch ein Kationenaustauscher eingesetzt werden, der dann typischerweise Carboxymethyl-Gruppen enthält. Zur weiteren Reinigung eines durch eine erfindungsgemäße DNA codierten Polypeptids können dann HPLC-Schritte dienen. Es kann sich um einen oder mehrere Schritte handeln. Insbesondere wird die "Reversed-Phase"- Methode eingesetzt. Diese Schritte dienen zum Erhalt eines im wesentlichen homogenen rekombinanten Proteins einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.

Neben bakteriellen Zellkulturen zur Isolierung des Genprodukts können auch transformierte Hefezellen eingesetzt werden. In diesem Fall kann das translatiette Protein sekretiert werden, so daß die Proteinreinigung vereinfacht wird. Sekretiertes re kombinantes Protein aus einer Hefewirtszelle kann durch Metho den erhalten werden, wie sie bei Urdal et al. (J. Chromato. 296: 171 (1994)) offenbart sind und Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden erfindung sind.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen, insbesondere erfin dungsgemäße DNA-Sequenzen, und/oder erfindungsgemäße Genpro dukte können als Arzneimittel bzw. zur Herstellung eines Arz neimittels Verwendung finden (Anspruch 17). Diese können als solche verabreicht werden (bspw. bukkal, intravenös, oral, parenteral, nasal, subkutan) oder in Kombination mit weiteren Wirk-, Hilfs- oder arzneimitteltypischen Zusatzstoffen. Er findungsgemäße Nukleinsäure kann als nackte Nukleinsäure, insbesondere intravenös, injiziert werden oder aber mit Hilfe von Vektoren dem Patienten verabreicht werden. Bei diesen Vektoren kann es sich um Plasmide als solche handeln, aber auch um virale Vektoren, insbesondere retrovirale oder adeno virale Vektoren, oder auch um Liposomen, die nackte erfin dungsgemäße DNA oder ein Plasmid, das erfindungsgemäße DNA enthält, aufweisen können.

Die Verwendung von erfindungsgemäßen Sequenzen, insbesondere der Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen von 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 bzw. deren Varianten, sowie erfindungsgemäßer Protein heteromere sowie davon abgeleiteter erfindungsgemäßer Reagen zien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide) kommt somit für die Herstellung eines Arzneimittels zu therapeutischen Zwe cken, d. h. zur Behandlung von Erkrankungen, in Betracht. Ganz besonders bevorzugt ist dabei der therapeutische Einsatz zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Be handlung von Erkrankungen oder pathophysiologischen Zustän den, die bspw. auf fehlgesteuerter Regulation der Homöostase von Zelltod- und Proliferationsereignissen beruhen (Anspruch 18). Durch die erfindungsgemäße Verwendung können Zelltodpro zesse, z. B. Kaskaden, die zur Apoptose führen, oder Prozesse, die zur Nekrose führen, in allen Zelltypen, die 158B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 und oder eine native Variante hiervon expri mieren, insbesondere in neuralen Zellen, beeinflusst werden, bspw. durch Modulation von Zell-Zell-Interaktionen.

Die nativen erfindungsgemäßen Proteine 15B3, 15B3-1 und 15B3- 2 sind erfindungsgemäß unter anderem Bestandteil des ras- MAPK-Signaltransduktionswegs, typischerweise als Modulator desselben, dessen Fehlsteuerung für eine Vielzahl von Erkran kungen ursächlich ist. Insofern finden sich die vorgenannten erfindungsgemäßen Proteine insbesondere als Komponenten bei den folgenden zellulären Prozessen wieder und hat zelluläre Funktionen bei: Signaltransduktion, Zelldifferenzierung, Wachstum, Plastizität, Regeneration. Entsprechend kann durch Infunktionalität eines erfindungsgemäßen Proteins, bspw. 15B3, oder durch infunktionelle Expression oder durch Überex pression desselben ein pathophysiologischer Zustand ausgelöst werden, der mit einer Fehlsteuerung bspw. der Zeildifferen zierung, des Zellwachstums, der Zellplastizität oder der Zellregeneration einhergeht. Je nach molekularem Mechanismus der pathophysiologischen Störung kann zu therapeutischen Zwe cken die Gabe funktionellen erfindungsgemäßen Proteins oder zumindest eine höhere Expression desselben oder aber eine In hibition des zellulär überexprimierten oder des exprimierten infunktionellen Proteins erwünscht sein. Ganz besonders be vorzugt ist die Verwendung von 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 im Zusammenhang mit deren Funktion beim neuronalen Zelltod, Excitation und Neurogenese. Insbesondere geht die Pathophysi ologie der cerebralen Ischämie mit einer erhöhten Transkrip tion von erfindungsgemäßem 15B3 einher, weswegen dessen Verwendung zur Behandlung dieser Pathophysiologie ganz besonders bevorzugt ist. Aus diesen erfindungsgemäßen Erkenntnissen ergibt sich die Verwendung erfindungsgemäßer Sequenzen (Nukleotid- und Aminosäuresequenzen) sowie entsprechender Derivate (bspw. Peptide, Oligos oder Antikörper) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen und neurologischen Erkrankungen, insbesondere ischämische Zustände (Schlaganfall), multipler Sklerose, neurodegenerative Erkran kungen, wie bspw. Morbus Parkinson, Amyotrophe Lateralsklero se, heredodegenerative Ataxien, Neuropathien, Morbus Hunting ton, Epilepsien und Morbus Alzheimer, viralen Infektionser krankungen, bspw. Hepatitis-Infektionen (Anspruch 19).

Im Zusammenhang mit der therapeutischen Anwendung erfindungs gemäßer Sequenzen steht ein weiterer Gegenstand der vorlie genden Erfindung, nämlich die Verwendung einer erfindungsge mäßen Nukleinsäuresequenz oder Proteinsequenz, insbesondere der Nukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz von Protein 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 oder einer Variante - wie oben definiert - hiervon, insbesondere eines Fragments, zur Gentherapie bei Säugetieren, z. B. beim Menschen bzw. auch derartige genthera peutische Verfahren. Gentherapie umfaßt dabei alle Therapie formen, die entweder erfindungsgemäße Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in den Körper oder Teile davon, bspw. einzelne Gewebe, einbringen, oder die Expression von erfin dungsgemäßer Sequenzen beeinflussen. Dazu können alle dem Fachmann geläufigen Modifikationen im Rahmen der Gentherapie verwendet werden, bspw. Oligonukleotide, z. B. antisense- oder Hybrid-RNA-DNA Oligonukleotide, mit beliebigen Modifikatio nen, die erfindungsgemäße Sequenzen enthalten, benutzt wer den. Ebenfalls können virale Konstrukte, enthaltend eine er findungsgemäße Sequenzen (dies schließt alle Varianten, wie Fragmente, Isoformen, Allele, Derivate ein) benutzt werden. Auch entsprechende erfindungsgemäße nackte DNA-Sequenzen, kommen im Rahmen der Gentherapie in betracht. Ebenso können Nukleinsäurestücke mit enzymatischer Aktivität (z. B. Ribozy me) für gentherapeutische Zwecke benutzt werden.

Neben den therapeutischen Anwendungen kommen auch diagnosti sche Verwendungen erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Poly peptide, erfindungsgemäßer Proteinheteromere sowie davon ab geleiteter erfindungsgemäßer Reagenzien (Oligonukleotide, An tikörper, Peptide) in Betracht, bspw. zur Diagnose von menschlichen Erkrankungen oder von genetischen Prädispositio nen, bspw. auch im Rahmen von Schwangerschaftsuntersuchungen. Bei diesen Erkrankungen oder Prädispositionen handelt es sich insbesondere um die oben im Zusammenhang mit therapeutischen Anwendungen genannten. Diese diagnostischen Verfahren können als in vivo, typischerweise jedoch ex vivo Verfahren ausges taltet sein. Ex vivo wir eine typische Anwendung eines diagnostischen erfindungsgemäßen Verfahrens zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer erfindungsgemäßen Nuk leinsäure in einer biologischen Probe dienen. Ein solches Verfahren umfasst vorzugsweise die folgenden Schritte: (a) Inkubation einer biologischen Probe mit einer bekannten Menge an erfindungsgemäßer Nukleinsäure oder einer bekannten Menge an Oligonukleotiden, die als Primer für eine Amplifikation der erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet sind, (b) Nach weis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure durch spezifische Hybridisierung oder PCR-Amplifikation, (c) Vergleich der Men ge an hybridisierender Nukleinsäure oder an durch PCR Ampli fikation gewonnener Nukleinsäure mit einem Mengenstandard.

Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum qualitati ven und/oder quantitativen Nachweis eines erfindungsgemäßen Proteinheteromers oder eines erfindungsgemäßen Proteins in einer biologischen Probe, das folgende Schritte umfaßt: (a) Inkubation einer biologischen Probe mit einem Antikörper, der spezifisch gegen das Proteinheteromer oder gegen das erfin dungsgemäße Protein/Polypeptid gerichtet ist, (b) Nachweis des Antikörper/Antigenkomplexes, (c) Vergleich der Mengen des Antikörper/Antigenkomplexes mit einem Mengenstandard. Als Standard wird üblicherweise eine biologische Probe aus einem gesunden Organismus entnommen. Insbesondere zu diagnostischen Zwecken kann hierbei die Eigenschaft des 15B3-, 15B3-1- und/oder 15B3-2-Gens benutzt werden, daß nach charakteristi schen pathophysiologischen Stimuli, wie z. B. cerebralen I schämien, die mRNA-Menge von 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 in Zellen sich verändert, z. B. sich erhöht. Auf diese Art kann erfindungsgemäß z. B. eine Verlaufsbeurteilung (Prognose) von mit Veränderungen von Expressionsraten erfindungsgemäßer Proteine einhergehender Krankheiten (wie z. B. des Schlagan falls), die Beurteilung von Therapieerfolgen, die Graduierung einer Krankheit vorgenommen werden. Schließlich kann mit er findungsgemäßen Verfahren ein Monitoring der Behandlung oben angegebener Erkrankungen durchgeführt werden.

Erfindungsgemäße Sequenzen können in Verfahren zur Bestimmung von Polymorphismen derselben z. B. bei Menschen verwendet wer den. Auf diese ermittelte Polymorphismen erfindungsgemäßer Sequenzen unterfallen nicht nur der Offenbarung der vorlie genden Erfindung, sondern können auch prognostische Marker für die Diagnose bzw. für die Diagnose einer Prädisposition von Erkrankungen, die im Zusammenhang mit einer durch infunk tionale Expression erfindungsgemäßer Sequenzen, durch Expres sion infunktionaler erfindungsgemäßer Sequenzen und/oder oder deren Überexpression dienen. Darüber hinaus ist erlauben er findunsgemäße Sequenzen die Erforschung humaner Erbkrankhei ten, und zwar sowohl monogener als auch polygener Erkrankun gen.

Neben therapeutischen und/oder diagnostischen Verwendungszwe cken im Bereich der Human- und/oder Tiermedizin kommt auch die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren oder Polypep tide zum wissenschaftlichen Einsatz in Betracht. Insbesondere erlauben die erfindungsgemäßen Sequenzen auf dem Fachmann be kannte Weise, bspw. über cDNA-Bibliotheken verwandte Sequen zen bei ein- oder mehrzelligen Organismen zu identifizieren oder aber im humanen Genom verwandte Sequenzen zu lokalisie ren. Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, insbesondere die Sequenzen von 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2, können also dazu verwendet werden, Gene für mRNAs, die für diese Nuklein säuren oder deren funktionellen Äquivalente, Homologe oder Derivate kodieren, im bspw. murinen und im menschlichen Genom mit gängigen Methoden durch Homologiescreening zu isolieren, zu kartieren und mit Markern für humane Erbkrankheiten zu korrelieren. Dies ermöglicht die Identifizierung des Gens als Ursache für bestimmte Erbkrankheiten, was ihre Diagnose er heblich vereinfacht und neue Therapieansätze ermöglicht.

Mit Hilfe erfindungsgemäßer Nukleinsäuren lassen sich damit Erbkrankheiten diagnostizieren, weswegen sie als Marker Ver wendung finden. Bspw. wird sich eine Korrelation des chromo somalen Locus des Protein 15B3 beim Menschen (Chromosom 9) zu bestimmten erblichen Erkrankungen ergeben, wobei hieraus ein erfindungsgemäßes Diagnoseverfahren für erbliche Erkrankungen erwachsen wird. Gleiches gilt für die erfindungsgemäßen Pro teine.

Insbesondere wird erfindungsgemäß für die wissenschaftliche Anwendung ein Testsystem offenbart, das auf erfindungsgemäßen Aminosäure- und/oder Nukleotid-Sequenzen beruht. In diesem Zusammenhang können die cDNA, die genomische DNA, die regula torischen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequen zen, als auch das Polypeptid, sowie Teilfragmente davon in rekombinanter oder nicht-rekombinanter Form zur Ausarbeitung eines Testsystems verwendet werden. Ein solches erfindungsge mäßes Testsystem ist insbesondere geeignet, die Aktivität des Promotors oder des Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz zu messen. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einfache Meß methoden (kolorimetrische, luminometrische, auf Fluoreszenz beruhende oder radioaktive), die die schnelle Messung einer Vielzahl von Testsubstanzen erlauben (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum-Verlag, Heidelberg). Die be schriebenen Testsysteme erlauben das Durchsuchen von chemi schen Bibliotheken nach Substanzen, die hemmende oder akti vierende Wirkungen auf erfindungsgemäße Proteine haben. Die Identifizierung solcher Substanzen stellt den ersten Schritt auf dem Weg zur Identifizierung neuartiger Medikamente dar, die spezifisch auf die 15B3-, 15B3-1- oder 15B3-2-assoziierte Signaltransduktion wirken. Insbesondere sind einfache Test systeme denkbar, die die Aktivität der LLR-domäne vom 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 benutzen.

Eine Inhibition der biologischen Aktivität von erfindungsge mäßem Protein, insbesondere von Proteinen gemäß Fig. 9, 11 oder 13, typischerweise der biologischen Aktivität im Zusam menhang mit der Apoptose, wie sie bspw. beim Schlaganfall, dem septischen Schock, GvHD, degenerativen Erkrankungen, ins besondere neurodegenerativen Erkrankungen, akuter Hepatitis oder anderen vorliegend offenbarten Indikationen erwünscht ist, kann auch dadurch erreicht werden, daß durch dem Fach mann geläufige Verfahren Oligonukleotide, die für einen Anti sense-Strang der nativen Sequenzen der Proteine 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 oder eines anderen nativen Proteins mit einer Leucin reichen Domäne codieren, in die betroffenen Zellen einzuschleusen. Hierdurch wird die in den entsprechend trans formierten Zellen die Translation der nativen mRNA von bspw. 15B3 oder 15B3-1 bzw. 15B3-2 blockiert, was im Ergebnis vor zugsweise die Überlebensfähigkeit der transfizierten Zelle steigert oder modulierend auf Zellwachstum, Zellplastizität, Zellproliferation wirkt. Auch in diesem Fall kann das oben beschriebene Verfahren mit Hilfe rekombinanter Viren einge setzt werden.

Die ggf. pathologisch gesteigerte Zellapoptose oder Zellpro liferation bei Erkrankungen, die auf einer entsprechenden Fehlsteuerung erfindungsgemäßer Sequenzen beruhen (bspw. bei den vorgenannten Indikationen), kann auch durch Ribozym- Methoden therapiert werden. Hierzu werden Ribozyme verwendet, die eine Ziel-mRNA schneiden können. Im vorliegenden Fall werden daher Ribozyme offenbart und stellen einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar, die native 15B3- (oder 15B3-1- oder 15B3-2)-mRNA oder die mRNA anderer Leucin reiche Domänen enthaltender Proteine spalten können. Erfindungsgemäße Ribo zyme müssen dabei mit der erfindungsgemäßen Ziel-mRNA inter agieren können, bspw. über Basenpaarung, und anschließend die mRNA spalten, um die Translation von bspw. 15B3 zu blockie ren. Die erfindungsgemäßen Ribozyme werden über geeignete Vektoren in die Zielzellen geschleust (insbesondere Plasmide, modifizierte Tierviren, insbesondere Retroviren), wobei die Vektoren neben ggf. anderen Sequenzen eine cDNA-Sequenz für ein erfindungsgemäßes Ribozym aufweist).

Neben den vorgenannten Möglichkeiten zur Modulation der bio logischen Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte, insbesonde re der Genprodukte gemäß Fig. 9, 11 oder 13, typischerwei se der Modulation der Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte bei der apoptotischen oder nekrotischen oder proliferativen Signaltransduktion ist dies auch mit Hilfe eines weiteren Ge genstands der vorliegenden Erfindung möglich. Eine erfin dungsgemäße chemische Verbindung wird insbesondere die intra zelluläre Funktion der Proteine 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 modulieren, typischerweise inhibieren (Anspruch 20) oder auf der Ebene der zugrundeliegenden erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen die biologische Funktion beeinflussen. Erfindungs gemäße Verbindungen werden typischerweise spezifisch an ein Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 9, 11 oder 13 bzw. an eine Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 8, 10 oder 12 binden und dadurch eine pharmakologische, insbesondere neuroprotektive oder immunmodulierende, anti-apoptotische o der anti-proliferative Wirkung, hervorrufen.

Daher werden erfindungsgemäß chemische Verbindungen offen bart, vorzugsweise eine organisch-chemische Verbindung, mit einem Molekulargewicht von < 5000, insbesondere < 3000, vor al lem < 1500, die typischerweise physiologisch gut verträglich ist und vorzugsweise die Blut-Hirn-Schranke passieren kann (Anspruch 21). Ggf. wird sie Bestandteil einer Zusammenset zung mit mindestens einem weiteren Wirkstoff sowie vorzugs weise Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sein und als Arzneimittel eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt wird das orga nische Molekül dann sein, wenn die Bindungskonstante für die Bindung an ein erfindungsgemäßes Protein, insbesondere an die Leucin reiche Domäne eines erfindungsgemäßen Proteins, min destens 10⁷ mol^-1 beträgt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird vorzugsweise so beschaffen sein, daß sie die Zellmembran passieren kann, sei es durch Diffusion oder über (intra)membranöse Transportproteine (Anspruch 22), ggf. nach entsprechender Modifikation, bspw. mit einer angekoppelten AS-Sequenz. Weiterhin bevorzugt sind jene Verbindungen, die die Interaktion von 15B3 oder 15B3-1 oder 15B3-2 mit Bin dungspartnern, insbesondere für die Transduktion eines apop totischen oder nekrotischen Signals, inhibiert oder ver stärkt. Insbesondere besetzen derartige Verbindungen Positio nen auf der Oberfläche erfindungsgemäßer Proteine oder rufen bei den erfindungsgemäßen Proteinen einen lokalen Konformati onswechsel hervor, so daß die Bindung eines nativen Bindungs partners an ein erfindungsgemäßes Protein verhindert wird.

Über Strukturanalysen des erfindungsgemäßen Proteins lassen sich gezielt erfindungsgemäße Verbindungen finden, die eine spezifische Bindungsaffinität aufweisen (Rationales Drug De sign (Böhm, Klebe, Kubinyi, 1996, Wirkstoffdesign, Spektrum- Verlag, Heidelberg)). Hier wird die Struktur oder eine Teil struktur, Derivat, Allel, Isoform oder ein Teil einer solchen von einem der gemäß Fig. 9, 11 oder 13 dargestellten Pro teinen über NMR- oder Röntgenkristallographie-Verfahren ermittelt oder, sofern eine solche hochaufgelöste Struktur nicht vorliegt, mit Hilfe von Strukturvorhersage-Algorithmen ein Strukturmodell eines erfindungsgemäßen Proteins erstellt, und diese(s) benutzt, um mit Unterstützung von Molecular Mo delling Programmen Verbindungen zu identifizieren, für die sich eine hohe Affinität zum erfindungsgemäßen Protein vor hersagen läßt. Diese Substanzen werden dann synthetisiert und in geeigneten Testverfahren auf ihr Bindungsvermögen und ihre therapeutische Nutzbarkeit getestet.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße Verbindung ein Antikörper, vorzugsweise ein gegen ein erfindungsgemäßes Protein, bspw. 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2, gerichteter Antikörper oder auch gegen die zugrundeliegenden mRNA gerichteter Antikörper, der ex vivo in retransplantierte Wirtszellen oder durch genthera peutische in vivo Verfahren in Wirtszellen eingeschleust wird und dort als "intrabody" nicht sekretiert wird, sondern in trazellulär seine Wirkung entfalten kann. Durch derartige er findungsgemäße "Intrabodies" können die Zellen vor einer fehlgeleiteten apoptotischen Reaktion, bspw. durch Überex pression eines erfindungsgemäßen Proteins, geschützt werden. Eine derartige Vorgehensweise wird typischerweise für Zellen jener Gewebe in Betracht kommen, die beim Patienten ein pa thophysiologisch übersteigertes apoptotisches Verhalten zei gen, also bspw. bei Zellen der Bauchspeicheldrüse, Keratino zyten, Bindegewebszellen, Immunzellen, Neuronen oder Muskel zellen. Neben den Antikörper oder Intrabodies sind auch der artig mit erfindungsgemäßen "Intrabodies" gentherapeutisch modifizierte Zellen Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

Eine erfindungsgemäße Verbindung mit der Funktion der Blocka de der biologischen Funktion von nativem 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 gemäß Fig. 9, 11 oder 13 oder entsprechender nati ver Allele oder nativer Spleißvarianten, bspw. der apoptoti schen Funktion, kann als Arzneimittel Verwendung finden. Hierbei sind als Verbindungen alle vorgenannten Varianten eingeschlossen, also bspw. organisch-chemische Verbindungen, Antikörper, anti-sense Oligonukleotide, Ribozyme. Insbesonde re ist eine erfindungsgemäße Verbindung (zur Herstellung ei nes Arzneimittels) zur Behandlung von Erkrankungen, für die zumindest tw. eine pathologische hyperapoptotische oder hy pernekrotische oder inflammatorische Reaktion kausal oder symptomatisch ist, geeignet. Damit kann ein erfindungsgemäßer Inhibitor (bspw. ein inhibitorisch wirkender Antikörper (ins besondere ein Intrabody), ein Ribozym, anti-sense RNA, domi nant-negative Mutanten oder eine der vorgenannten inhibitori schen organisch-chemischen Verbindungen) der zellulären Funk tion eines erfindungsgemäßen nativen Proteins 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 oder seiner nativen Varianten, also bspw. der a poptotischen, nekrotischen oder proliferativen Reaktion, als Arzneimittel und ganz besonders bei der Behandlung der fol genden Erkrankungen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der folgenden Erkrankungen eingesetzt werden: Tumorerkrankungen, Autoimmunerkrankungen, insbesondere Diabe tes, Psoriasis, multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis oder Asthma, virale Infektionserkrankungen (bspw. HIV), degenera tiven Erkrankungen, insbesondere neurodegenerativen Erkran kungen, bspw. Morbus Alzheimer oder Morbus Parkinson, Epilep sie oder Muskeldystrophien, GvHD (bspw. Leber, Niere oder Herz), ischämischer Infarkt oder akuter Hepatitis. Die vorge nannten bspw. apoptoseinhibitorischen erfindungsgemäßen Sub stanzen können auch Bestandteil einer pharmazeutischen Zusam mensetzung sein, die weitere pharmazeutische Träger- Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthalten kann, um derartige Zusammen setzungen für die therapeutische Verabreichung bspw. zu stabilisieren, die biologische Verfügbarkeit und/oder die Phar makodynamik zu verbessern.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Ver fahren ("Screening-Methoden") zur Identifizierung von pharma zeutisch wirksamen Verbindungen, insbesondere mit inhibitori schen Eigenschaften in Hinblick auf die Auslösung oder Wei terleitung von Signalen, die mit durch physiologisch auftre tende, erfindungsgemäße Sequenzen ausgelöste apoptotischen Reaktionen, in Zusammenhang stehen (Anspruch 23). Erfindungs gemäße Verfahren sehen vor, daß (a) Zellen mit einem Expres sionsvektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressions vektor, der für das Polypeptid 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 co diert, und ggf. mindestens einem Expressionsvektor, der für mindestens ein Reporter-Gen codiert, transfiziert werden, und (b) ein zur Beobachtung der 15B3 vermittelten Funktion, bspw. der Apoptose, geeigneter Parameter, insbesondere die Aktivie rung der Caspase-3, nach Zugabe einer Testverbindung im Ver gleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem gemessen wird. Hierzu werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise meh rere parallele Versuche mit ansteigenden Konzentrationen der Testsubstanz angesetzt, um im Falle einer pharmazeutischen Wirksamkeit, bspw. die Apoptose inhibierenden Wirkung, der Testsubstanz deren ID₅₀-Wert bestimmen zu können.

Insbesondere werden in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung "Hochdurchsatz-Suchverfahren" ("High- throughput screening assays", HTS) zur Identifikation von In hibitoren von 15B3 offenbart. Ganz besonders bevorzugt ist dabei der Einsatz von (allen bekannten) Komponenten des ras- Signaltransduktionswegs im Rahmen des erfindungsgemäßen Ver fahrens zur Identifikation von Inhibitoren, insbesondere zur Identifikation kleiner organischer Verbindungen an. Vorzugs weise bieten sich Systeme mit dem "Scintillation Proximity Assay" (SPA) an (Fa. Amersham Life Science, MAP kinase SPA (s. McDonald et al., 1999, Anal Biochem, 268, 318-29)). Vor genannte Druckschrift, die einen Assayaufbau für die Raf/MEK/ERK-Kaskade, die Inhibitoren der ganzen Kaskade iden tifizieren kann, beschreibt, gehört vollinhaltlich zur Offen barung der vorliegenden Erfindung. Die MAP-Kaskade wird hier bei in vitro rekonstituiert, mit den einzelnen Bestandteilen als GST-Fusionsproteinen (E. coli exprimiert) oder im Falle von cRAF1 mit dem Baculovirussystem hergestellt (Anspruch 25). Das erste Element der Kaskade (MAP-KKK) muss hierbei stän 39707 00070 552 001000280000000200012000285913959600040 0002010106835 00004 39588dig gleichmäßig aktiviert sein, um verläßlich Inhibitoren testen zu können. Typischerweise wird dies wird durch Coexpression von src im Baculovirussystem erreicht. Dadurch wird eine ras-analoge Aktivierung von cRafsichergestellt. Nach Transfektion von 15B3, 15B3-1, 15B3-2 oder anderen er findungsgemäßen Varianten wird eine Modulierung der Kaskade hervorgerufen, die herangezogen wird, um in einem HTS durch Zugabe von zu testenden Substanzen eine Beeinflussung dieser Modulation messen zu können.

Nach Identifizierung hochaffiner, selektiver Substanzen nach vorgenanntem erfindungsgemäßen Verfahren werden diese auf ih re Verwendung als Medikamente gegen Epilepsie, Schlaganfall und andere neurologische, immunologische oder proliferative Erkrankungen (Tumorerkrankungen) getestet. Darüber hinaus können die Bindungsplätze der identifizierten und pharmakolo gisch wirksamen Substanzen an die erfindungsgemäßen Genpro dukte, insbesondere 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2, mit Hilfe des two-hybrid Systems oder anderen Assays ermittelt werden, d. h., dass die für die Interaktion verantwortlichen Aminosäu ren eingegrenzt werden (Anspruch 24). Auf diese Weise können auch Substanzen aufgefunden werden, mit denen die Interaktion zwischen erfindungsgemäßen Polypeptiden und etwaigen nativen intrazellulären Interaktionspartnern derselben beeinflusst, insbesondere inhibiert, werden können. Hierdurch wird erfin dungsgemäß ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen mit spezifischer Bindungsaffinität zum erfindungsgemäßen Protein offenbart.

Aufgrund der pharmakologischen Bedeutung von 15B3, 15B3-1 und 15B3-2 bzw. deren nativen Varianten für zahlreiche Erkrankun gen, bspw. in neurodegenerativen oder proliferativen Erkran kungen, haben gemäß erfindungsgemäßem Verfahren identifizier te pharmazeutisch wirksame Substanzen ein weites Anwendungs spektrum. Neben der Inhibierung einer Interaktion mit einem oder mehreren anderen Molekülen, z. B. im Signaltransduktions weg downstream befindlichen Proteinkinasen, oder Adaptoren kann insbesondere auch eine Beeinflussung der Transkription oder der Transkriptmenge von erfindungsgemäßen Proteinen in der Zelle Ursache pharmazeutischer Wirksamkeit sein. Bei spielhaft wäre die Suppression der schnellen Hochregulation von Transkripten erfindungsgemäßer DNA-Sequenzen nach patho logischen Prozessen durch erfindungsgemäße Verbindungen zu nennen, da 15B3, 15B3-1 bzw. 15B3-2 einer sehr raschen Regu lation durch transkriptionelle Aktivierung unterliegen. Vor zugsweise ist ein Angriffsziel für eine pharmazeutisch wirk same Verbindung daher die Regulation der Transkription, bspw. durch spezifische Bindung der Substanzen an eine Regulatorre gion (bspw. Promotor- oder Enhancer-Sequenzen) eines erfin dungsgemäßen Genprodukts, Bindung an einen oder mehrere Transkriptionsfaktoren eines erfindungsgemäßen Genprodukts (mit dem Resultat einer Aktivierung oder Inhibierung des Transkriptionsfaktors) oder eine Regulation der Expression (Transkription oder Translation) eines solchen Transkripti onsfaktors selbst.

Neben der transkriptionellen Regulation, d. h. Regulation der mRNA-Menge eines erfindungsgemäßen Gens in der Zelle, kann eine erfindungsgemäße pharmazeutisch wirksame Verbindung auch in andere Kontrollprozesse der Zelle eingreifen, die bspw. die Expressionsrate eines erfindungsgemäßem Proteins beein flussen können (z. B. Translation, Spleißvorgänge, native De rivatisierung von erfindungsgemäßem Genprodukt, bspw. Phosphorylierungen, oder Regulation der Degradation von er findungsgemäßem Genprodukt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von zellulären Interaktions partnern von erfindungsgemäßen Polypeptiden, insbesondere der Proteine 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 bzw. deren nativ auftreten den Varianten (Isoformen, Allele, Spleißformen, Fragmente) (Anspruch 27). Auf diese Weise können als Interaktionspartner Proteine identifiziert werden, die zum erfindungsgemäßen Pro tein spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen, oder zur I dentifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zum erfindungsgemäßen Protein spezifische Bindungsaffini täten aufweisen. Ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren bzw. die Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide, erfin dungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen und/oder erfindungsgemäßer Nukleinsäurekonstrukte zur Durchführung derartiger Verfahren wird vorzugsweise mit Hilfe einer "Yeast-two-hybrid"- Durchmusterung (y2h-"Screens") allein oder in Kombination mit anderen biochemischen Verfahren durchgeführt (Fields and Song, 1989, Nature, 340, 245-6). Derartige Screens finden sich auch bei Van Aelst et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 6213-7) und Vojtek et al. (1993, Cell, 74, 205-14) beschrieben. Typischerweise können anstelle von Hefesystemen auch Säugetiersysteme zur Durchführung eines erfindungsgemä ßen Verfahrens verwendet werden, bspw. wie bei Luo et al. (1997, Biotechniques, 22, 350-2) beschrieben.

Für einen y2h-Screen wird das offene Leseraster von 15B3, 15B3-1, 15B3-2 oder einer nativen Variante bspw. in einen sog. bait-Vektor "in-frame" mit der GAL4-Bindungsdomäne klo niert (z. B. pGBT10, Fa. Clontech). Damit kann vorzugsweise eine sog. "prey-library" in einem Hefestamm nach gängigem Protokoll auf interagierende Proteine durchsucht werden. Vor zugsweise werden hierfür Kinase-negative Mutanten eingesetzt, da diese oft stabiler mit etwaigen Phosphorylierungstargets interagieren. Serin-/Threoninkinasen in einem Stoffwechselweg können durch Adaptermoleküle in räumliche Nähe gebracht wer den, um spezifische Phosphorylierungen besser durchführen zu können (Chang et al., 1998, Science, 281, 1860-3), (Yasuda et al., 1999, Mol Cell Biol, 19, 7245-54, (Whitmarsh and Da vis, 1998, Trends Biochem Sci, 23, 481-5), Whitmarsh et al., 1998, Science, 281, 1671-4). Es ist deshalb erfindungsgemäß auch möglich, über zwei Schritte im yeast-two-hybrid System auf Phosphorylierungstargets zu stoßen, indem zunächst ein Adapterprotein kloniert wird und mit diesem als "bait" das spezifische Zielprotein ("target") ermittelt wird. Darüber hinaus können mit y2h-Systemen auch sog. Mapping-Experimente durchgeführt werden, um spezifische Interaktionsdomänen zu identifizieren.

Erfindungsgemäß können Interaktionspartner auch über Co- Immunpräzipitationen aus mit 15B3-, 15B3-1- oder 15B3-2-(bzw. deren native Varianten)Expressionsvektoren transfizierten Zellen zu benutzen, um daran bindende Proteine aufzureinigen, und über Proteinsequenzierungsmethoden (z. B. MALDI-TOF, ESI- tandem-MALDI) nachfolgend die dazugehörigen Gene zu identifi zieren.

Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung des two-hybrid Systems oder anderer biochemi scher Verfahren zur Identifizierung von Interaktionsdomänen von 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 bzw. nativ auftretender Varian ten derselben und die Verwendung dieser Interaktionsdomänen (Fragmente der nativen Sequenzen) zur pharmakotherapeutischen Intervention.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere nativ auftre tende Formen oder aber auch nicht-native, artifiziell erzeug te Varianten, deren biologische Funktion untersucht werden soll, können erfindungsgemäß in einem Apoptoseassay verwen det werden bzw. in einem Verfahren zur Untersuchung der Funk tion und/oder Wirksamkeit erfindungsgemäßer Polypeptide bei Induktion, Transduktion oder Inhibition von Zelltodsignalen zum Einsatz kommen. Die Beteiligung von 15B3, 15B3-1, 15B3-2 oder vorgenannten Varianten an apoptotischen Kaskaden kann untersucht werden, indem Expressionskonstrukte mit 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 oder Varianten in eukaryontische Zellen transfiziert werden, und danach die Induktion von Apoptose untersucht werden kann. Dies kann z. B. durch Anfärbung mit Annexin geschehen (Fa. Roche Diagnostics), durch Antikörper, die die aktive Form von Caspase-3 erkennen (Fa. New England Biolabs), oder durch ELISAs, die DNA-Histon-Bruchstücke er kennen (cell-death elisa, Roche Diagnostics). Diese Induktion von Apoptose ist ggf zelltyp-spezifisch, weswegen erfindungs gemäß vorzugsweise mehrere Zelllinien und primäre Zellen un tersucht werden. Die Induktion von Apoptose kann ggf. auch Stimulus-spezifisch sein. Daher werden in einem erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise mehrere Streß-Situationen zug rundegelegt, z. B. Hitzeschock, Hypoxiebedingungen, Cytokinbe handlungen (z. B. Il-1, Il-6, TNF-alpha, H₂O₂-Behandlung). Als typische Zelltypen für ein derartiges erfindungsgemäßes Ver fahren kommen gebräuchliche Zellinien, z. B. Cos-Zellen, HEK- Zellen, PC12-Zellen, THP-1-Zellen, oder primäre Zellen, wie z. B. Neurone, Astrozyten, in Betracht, ebenso wie andere im mortalisierte und primäre Zellinien nach Bedarf.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, Nukleinsäure konstrukte oder erfindungsgemäßer Genprodukte zur Durchfüh rung eines Proliferationsassays. Bspw. kann die Beteiligung von 15B3, 15B3-1, 15B3-2 sowie nativer oder nicht nativer Va rianten derselben beim Wachstum von Zellen, beim Durchlauf des Zellzyklus oder bei tumorigener Transformation untersucht werden, indem Expressionskonstrukte mit 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 oder entsprechender Varianten in eukaryontische Zellen transfiziert werden und danach bspw. die Induktion von Tumo rigenizität untersucht wird, z. B. mit Hilfe eines Soft-Agar- Tests (Housey, et al., 1988, Adv Exp Med Biol, 234, 127-40). Als bevorzugte Zelltypen kommen gebräuchliche Linien, z. B. Cos-Zellen, HEK-Zellen, PC12-Zellen, THP-1-Zellen, und primä re Zellen, wie z. B. Neurone, Astrozyten, in Betracht, ebenso wie andere immortalisierte und primäre Zellinien nach Bedarf. Insbesondere kann mit Hilfe eines solchen erfindungsgemäßen Verfahrens die Funktion erfindungsgemäßer Genprodukte am ras- Signalübertragungsweg und die Wechselwirkung erfindungsgemä ßer Genprodukte mit anderen Komponenten des ras- Signalübertragungswegs, insbesondere in Hinblick auf prolife rative oder apoptotische Prozesse, untersucht werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als Suizidgen/-protein für die in vivo oder ex vivo Transformati on von Wirtszellen (Anspruch 29). Insbesondere in Hinblick auf die biologische Funktion von erfindungsgemäßem Protein bei der Signaltransduktion von apoptotischen und/oder nekro tischen Signalen kann auf diese Weise in Wirtszellen der Zelltod gezielt ausgelöst werden. Vorzugsweise wird hierbei die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. eines erfindungsgemäßen Proteins so ausgestaltet sein, daß das Sui zidgen operabel mit einem Promotor verbunden ist, wobei die Transkription reprimiert ist und nur im Bedarfsfall aktiviert wird (Anspruch 30). Insbesondere kann nach Transplantation von Patienten-Zellen ex vivo oder in vivo im Rahmen einer Gentherapie gezielt die transfizierte Zelle ausgeschaltet werden.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figu ren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt ein RMDD-Schema (restriction-mediated differen tial display). Eine Beschreibung ist in Ausführungsbeispiel 1 dargelegt.

In Fig. 2 ist das Ergebnis einer 15B3-LightCycler- Verifizierung dargestellt. Wie in Ausführungsbeispiel 1 er läutert, wurde 2 Stunden nach einem experimentellen Schlagan fall (MCAO, 90 min Okklusion) die Hochregulation von 15B3 ge messen, und zwar im kontralateralen und im ipsolateralen Bereich. Die Expression (auf der y-Achse) ist normalisiert ge gen die Expression des Standardgenprodukts Cyclophilin, also als relative Expression aufgetragen.

Fig. 3 gibt die 15B3-Gewebeexpression in verschiedenen Gewe ben der Maus (Herz, Milz, Hirn, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Hoden) oder nach verschiedenen Phasen der Embryonal entwicklung der Maus wieder. Das Ergebnis wurde mittels einer quantitativen PCR mit 15B3-Primern auf ein cDNA-Set der Fa. Clontech gewonnen, d. h. das vorgestellte Gen, 15B3, wird bei Mensch und Maus ubiqitär exprimiert. Aufgetragen ist die Ex pressionsrate gegen die einzelnen Gewebe.

Fig. 4 stellt einen Homologie-Vergleich auf Proteinebene der Proteine 15B3, 15B3-1 und 15B3-2 mit Hilfe des Programms Clustal (Megalign, Lasergene, Madison, WI) dar. Dunkel unter legt sind die jeweils identischen Aminosäuren. Insgesamt fällt der hohe Grad der Konservierung der Aminosäuren bei den drei Genprodukten auf. Die ober- oder unterhalb der Sequenz eingezeichneten Linien stellen jene Bereiche (insgesamt 4, und zwar ca. zwischen (1) AS 234 und 254, (2) 45 und 63, (3) 24 und 43 und (4) 184 und 203 (Numerierung nach Sequenz von 15B3-2) dar, die als Transmembrandomänen bezeichnet werden. Linien mit Pfeilen (insgesamt 10) markieren Bereiche, die Leucin-reiche Bereiche sind ("leucin-rich-repeats" (LRR)). Derartige LRR-Protein-Interaktionmodule sind in Proteinen mit diversen Funktionen bekannt. So enthält z. B. der humane und murine Toll-like Receptor 6 (TLR6) neben den Transmembrando mänen eine extrazelluläre LRR-Domäne (Takeuchi et al., 1999).

In Fig. 5 ist ein phylogenetischer Stammbaum der Proteine mit "leucin-rich-repeat"-Domänen dargestellt. Zur Bestimmung des Stammbaums wurde das Programm Megalign eingesetzt. Die 15B3-Familie stellt dabei eine neue Untergruppe innerhalb der LRR-Domänen enthaltenden Proteine dar.

In Fig. 6 ist eine Proteinstruktur-Vorhersage für erfin dungsgemäßes Protein 15B3 mit Hilfe des Programms Protean (DNAStar, Lasergene, Madison, WI) abgebildet. Deutlich sicht bar sind die 4 putativen Transmembrandomänen.

Fig. 7: Ras-MAPK-Kaskade. Gezeigt sind putative Interaktio nen von 15B3 innerhalb des Ras-Signaltransduktionsweges. 15B3 hat hier modulatorische Funktionen.

Fig. 8 stellt die humane 15B3-Nukleinsäuresequenz (SEQ ID 1) dar.

Fig. 9 stellt die Aminosäuresequenz von humanem 15B3-Protein dar (SEQ ID 2), und zwar durchlaufend vom N- zum C-Terminus.

Fig. 10 stellt die humane Nukleotidsequenz von humanem 15B3-1 dar (Seq ID 3).

Fig. 11 stellt die Aminosäuresequenz vom humanen Protein 15B3- 1 dar (Seq ID 4), und zwar durchlaufend vom N- zum C- Terminus.

Fig. 12 stellt die Nukleotidsequenz von Protein 15B3-2 dar (Seq ID 5).

Fig. 13 stellt die Aminosäuresequenz von Protein 15B3-2 dar (Seq ID 6), und zwar durchlaufend vom N- zum C-Terminus.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Aus führungsbeispiele näher erläutert:

Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein bislang nicht in der Vollänge definiertes und entsprechend bislang in sei ner Funktion nicht charakterisiertes Protein, einschließlich der zugrundeliegenden DNA-Sequenz, wurde aufgrund einer dif ferentiellen Regulation im zentralen Nervensystem kloniert. Die RNA-Produkte des Gens 15B3 wurden nach fokaler cerebraler Ischämie im Gehirn von Mäusen in der ischämischen Hemisphäre verstärkt exprimiert, und konnten durch ein differentielles Klonierungssystem (restriction-mediated differential display, RMDD) kloniert werden. Zur Herbeiführung von fokalen cerebra len Ischämien wurde hierbei das Fadenmodell benutzt (middle cerebral artery occlusion, MCAO), ein valides Modell für die Schlaganfallerkrankung beim Menschen. Dieses experimentelle System wurde erfindungsgemäß eingesetzt, um Gene zu identifi zieren, die neben anderen Funktionen auch von pathophysiolo gischer Bedeutung für das Ereignisse nach einer cerebralen Ischämie sind. Im einzelnen wurde wie folgt experimentell verfahren, und molekulare targets für neue Medikamente bei neurodegenerativen Erkrankungen darstellen können.

(a) Herbeiführen des Fadenmodells in Mäusen

Zum Herbeiführen einer fokalen cerebralen Ischämie in c57/b16 Mäusen wurden 3 Monate alte Mäuse benutzt. Nach Herbeiführen einer Inhalationsnarkose (70% N20, 30% O2, 0,8-1% Ha lothan) wurde ein 5-0 Prolenefaden (Fa. Ethicon), der mit 0.1% Poly-L-Lysin beschichtet war, über die A. carotis exter na in die A. carotis interna bis zum Abgang der A. cerebri media vorgeschoben. Die richtige Position des Fadens wird durch einen Abfall des Laser-Doppler-Signals (Fa. Perimed) auf 10-20% des Ausgangssignals angezeigt. Nach Durchführung dieser Operation und gegebenenfalls Bestimmung zusätzlicher physiologischer Parameter (Blutdruck, Puls, Blutgase, Blut glukose) erwachen die Mäuse aus der Narkose. Nach bestimmten Okklusionszeiten werden die Mäuse wieder einer Narkose unter zogen, und der Faden zurückgezogen. Dadurch findet eine Re perfusion des Gewebes statt. Nach bestimmten Reperfusionszei ten werden die Mäuse durch Genickbruch getötet, und das Ge hirn sofort präpariert und auf Trockeneis weggefroren.

Im vorliegenden Fall wurden keine Reperfusionen durchgeführt, sondern nur eine Okklusion von 90 min bzw. 24 h.

(b) Präparation von mRNA aus den Hirnen

Dazu wurde das mRNA-Präparationskit von der Fa. Invitrogen (Fasttrack) verwendet. Es wird auf die beschriebene Standard präparationsmethode verwiesen, die Bestandteil der Offenba rung der vorliegenden Patentanmeldung ist.

(c) Durchführung des RMDD-Protokolls (siehe auch Abb. 1)

Die Durchführung erfolgte nach den in den Druckschriften EP 0 743 367 A2 und US 5,876,932 beschriebenen Verfahren, wobei abweichend hiervon 2 µg polyA-RNA für die Erststrangsynthese eingesetzt wurden. Nach Durchführung von Erststrang-, Zweit strangsynthese, MboI-Restriktion wurde eine Ligation mit A daptoren durchgeführt. Zwei aufeinanderfolgende PCR- Reaktionen mit Subsets von Primerkombinationen schlossen sich an. Die PCR-Reaktionen wurden danach auf ein denaturierendes Gel geladen und auf eine Nylonmembran geblottet (Fa. GATC).

Die biotin-markierten Banden wurden mit Hilfe einer gebräuch lichen Streptavidin-Peroxidase-Reaktion visualisiert. Auf das Gel wurden jeweils PCR-Proben von der ischämischen und kontralateralen Hemisphäre zusammen aufgetragen (24 h MCAO rechts und links und 90 min MCAO rechts und links). Banden unterschiedlicher Intensität in der rechten oder linken Hemi sphäre wurden ausgeschnitten, und eine Reamplifikation des entsprechenden PCR-Produktes durchgeführt. Erhaltene amplifi zierte Produkte wurden in den TOPO TA Vektor pcDNA 2.1 (Fa. Invitrogen) kloniert und mit T7 und M13rev-Primern sequen ziert (ABI 3700 Kapillarelektrophoresesequencer). Erhaltene Sequenzen werden mit der EMBL-Datenbank verglichen.

(d) Klonierung von 15B3

Nach Ausführung der vorbeschriebenen Verfahrensschritte wurde eine Sequenz identifiziert, die nach 90 min auf der ischämi schen Seite hochreguliert schien. Eine "Lightcycler"-Analyse bestätigte eine schnelle Regulation nach MCAO (90 min MCAO und 2 h Reperfusion) (s. auch Fig. 2).

Diese Sequenz wies starke Homologie zu den Genen SUR-8 etc. auf. Das isolierte 3'-gelegene PCR-Fragment wurde benutzt, um eine Maushirnbank zu hybridisieren. Dabei fanden sich mehrere Klone, die Sequenzteile von dieser Sequenz (Seq1) enthielten. Diese wurden mit ESTs aus der EMBL-Datenbank verglichen, und die Sequenzen Seq1 assembliert. Eine Maus Probe aus dem 5'- Bereich wurde benutzt, um eine humane fötale Hirnbank in lambdaZapII (Stratagene) zu durchsuchen ("screening") Eine Darstellung der Herstellung der benutzten humanen cDNA- Bibliothek ist in Fig. 1 dargestellt. Die erhaltenen humanen Klone wurden sequenziert und mit humanen ESTs aus der EMBL- Datenbank und der humanen mRNA des KIAA1437-Proteins AB037858 verglichen.

Die Nukleotid- und Proteinsequenzen der 15B3 verwandten Klone 15B3-1 und 15B3-2 erbrachte eine Datenbanksuche der EMBL-, nrdb- und swissprot-Datenbanken (mit dem Programm BLAST 2, beschrieben bei Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res, 25, 3389-402). Diese Druckschrift ist vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung. Mittels EMBL-Datenbank wurden weitere humane ESTs ermittelt, so dass für 15B3-2 der ORF er mittelt werden konnte. Diese Sequenzen sind als Sequenzen Seq ID 5, 6 in den Fig. 10 bis 13 dargestellt.

(e) Herstellung der humanen cDNA-Bibliothek

Mit dem cDNA-Synthese Kit der Fa. Stratagene wurde ausgehend von 2 µg humaner fötaler Gehirn-mRNA (Fa. Clontech) und von 5 µg mRNA aus adultem Mausgehirn entsprechende cDNA- Bibliotheken hergestellt. Dabei wurde im wesentlichen ent sprechend der Angaben des Herstellers verfahren. Zur Synthese der Erststrang cDNA wurde nach den Herstellerangaben ein oli godT-Primer verwendet. Die klonierungs-kompatiblen (Eco- RI/XhoI) doppel-strängigen cDNA-Fragmente wurden größenselek tioniert (nach Herstellerangaben/ Fa. Stratagene) und in den Plasmidvektor pBluescript SKII (Stratagene) ligiert. Die Li gation wurde durch Elektroporation in E.coli (DH10B, Gibco) transformiert und auf LB-Ampizillin Agar-Platten amplifi ziert. Die Plasmid-DNA wurde mittels alkalischer Lyse und Io nenaustauscher-Chromatographie isoliert (QIAfilter-Kit, Fa. Qiagen).

Die Komplexität an Einzelklonen betrug für die fötale humane Gehirn-cDNA-Bank 4 Millionen. Von jeder cDNA-Bank wurden zu fallsmäßig 24 Einzelklone nach Insertgrößen analysiert, die eine Größenverteilung von 800 bp bis zu 4,5 kb zeigten, die durchschnittliche Länge der cDNA-Inserts betrug für die huma ne Bank ca. 1,2 kb.

Ausführungsbeispiel 2 Durchführung eines Reportergen-Assays

Die erhaltene Sequenz von 15B3 wurde dazu benutzt, Aufschlüs se über die Einordnung des Proteins in deren Funktion als E lement von Signaltransduktionskaskaden, insbesondere der ras/MapK- Kaskade, zu gewinnen. Dazu wurde das offene Le seraster des Gens in einen gängigen Expressionsvektor (z. B. pCMV-tag, Fa. Stratagene) kloniert. Dieses Konstrukt wurde mit anderen Konstrukten zusammen in eukaryontische Zellen transfiziert werden (z. B. mit der Calciumphosphatmethode, siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, New York, 1997). Hierbei handelte es sich typischerweise um Reporterkonstrukte, z. B. ein Luciferase-Gen, unter Kontrolle eines Minimalpromotors mit mehreren SRE-Elementen, der Bin dungssequenz für den ELK-Transkriptionsfaktor. Extrakte aus den Zellen wurden dann einer Messung im Luminometer (z. B. Fa. Bertold) unterzogen. Eine Erhöhung des Luciferase-Wertes wur de als Beeinflussung des Signaltransduktionsweges gewertet, der in der Aktivierung eines bestimmten Transkriptionsfaktors (ELK) mündet. Kombinationen mit anderen Expressionskonstruk ten (bspw. für andere Gene, z. B. MAP-Kinasen) konnten Auf schlüsse über die genaue Position von 15B3 in Signalkaskaden geben.

Ggf. wurden diese Reporter-Assays auch mit anderen Systemen durchgeführt, z. B. lacZ oder Chloramphenicol-Transferase (CAT-Assays), wobei dem Assay das gleiche Prinzip, wie oben beschrieben, zugrundelag.

Ausführungsbeispiel 3 Untersuchungen zur Gewebeexpression von 15B3

Zur Untersuchung der Gewebeexpression von 15B3 wurde eine quantitative PCR mit Hilfe des LightCyclers (Roche Di agnostics, Mannheim) durchgeführt. Es wurden cDNA-Proben von 8 murinen Geweben verwendet, die bereits mengenstandardisiert auf 4 verschiedene housekeeping Gene sind (Fa. Clontech). Als Kontrolle verwendet wurde Plasmid xx15B3, das ein amplifi ziertes Fragment der murinen 15B3-cDNA enthielt. Als PCR- Programm wurde ein Standard-Protokoll (annealling-temp 60°C) gewählt. Es fand in allen Gewebeproben Amplifikation eines Produktes mit dem Schmelzpunkt 89°C statt, dieser deckte sich mit der Kontroll-PCR. Die Amplifikation wird im LightCycler ab Zyklus 25 sichtbar. Folgende Primer wurden verwendet:
seq_15B3.1 GAGCTGCCAAGAAAGGGGGAGACT (in Exon 2)
seq_15B3.2 CAGAAAACACAAATGGACGGAGAG (in Exon 2)

Die quantitative Analyse (Fig. 3) zeigt eine relativ ubiqui täre Gewebeverteilung mit Schwerpunkten in Herz, Lunge, Leber und Gehirn. 15B3 Expression ist ebenfalls in Testis, Muskel, Niere und Milz sowie während der Embryonalentwicklung nach weisbar.

Durch eine Homologiesuche (BLAST) mit der humanen 15B3 Se quenz konnten humane ESTs (expressed sequence tags) aus dem 3' untranslatierten Bereich des Gens identifiziert werden. Dabei finden sich Klone aus Aorta, Knochen, Gehirn, CNS, Co lon, Auge, Geschlechtsorganen, Herz, Niere, Lunge, Lymphsys tem, Pankreas, Prostata, Magen, Testis, Uterus, Embryo, Brustgewebe, Muskel, nervous Tumor, Ovar, Uterus, die auf ei ne breite Gewebeverteilung schließen lassen. Dies deckt sich mit den erhaltenen quantitativen PCR-Daten.

Ausführungsbeispiel 4 Untersuchungen zur und Charakterisierung der Proteinsequenz von 15B3

Für die humane Proteinsequenz ergibt sich ein offenes Le seraster, das für ein Protein mit 811 Aminosäuren kodiert (94.2 kD Molekulargewicht; isoelektr. Punkt bei pH 7.9).

(a) Bestimmung von Protein-Domänen

Zur Ermittlung von Transmembran-Domänen wurde das Computer programm Tmpred verwendet Es sagt mit hohen Wahrscheinlich keiten 4 Transmembran-Domänen für den N-terminus des Proteins 15B3 voraus (s. Fig. 6). Ein "Score" über 500 weist auf die Signifikanz potentieller Transmembransegmente hin, für das Protein 15B3 ist der "Score" für alle vier potentiellen Do mänen sehr hoch (1361, 1965, 757, 2592).

4 strong transmembrane helices, total score: 6675 from to length score orientation

Weiterhin wurde Kyte-Doolittle Hydrophobizitätsplot erstellt. Das Ergebnis dieser Auftragung indiziert im N-Terminus vier hydrophobe Bereiche an (Index < -3), die mit der oben angege benen Sequenz übereinstimmen (AS: 26-45, 124-144, 267-287, 320-341), dies unterstützt die Hypothese, daß es sich hierbei um Transmembranregionen handelt.

Mit Hilfe des Kyte-Doolittle Hydrophobizitätsplots wurde er findungsgemäß festgestellt, daß eine hydrophile Region für AS 350-435 vorliegt, während der anschließende C-Terminus einen grösseren hydrophoben Bereich aufweist. Unter Verwendung des Programm HMMPFAM wurde weiterhin erfindungsgemäß bestimmt, daß diese Region (AS 461-803) einen charakteristischen Leu cin-Rich-Repeats-Bereich (LRR) darstellt.

Desweiteren wurde das Programm PSORTII zur näheren Charakte risierung der erfindungsgemäßen Sequenz eingesetzt. Derart wurden in der Proteinsequenz zwei Signalsequenzen identifi ziert. Die letzten 4 Aminosäuren des 15B3-C-Terminus, DKEQ, weisen signifikante Ähnlichkeit zu einem "ER Membrane Reten tion Signal" ähnlichen Motif, KKXX, auf. Eine weitere Sequenz an Position 695 as des Proteins 15B3 wurde ggf. als peroxiso males Targeting-Signal (KIEKIPTQL) identifiziert. Die Ergeb nisse der vorgenannten Experimente erlauben den Schluß, daß ein erfindungsgemäßes Protein im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist.

(b) Sequenzvergleiche des 15B3 Proteins

Es wurden Sequenzvergleiche der 15B3 Sequenz mit EMBL, nrdb und swissprot-Datenbanken durchgeführt. Hierbei ergaben sich Übereinstimmungen mit folgenden humanen Sequenzen:
(i) BAA92675 und (ii) BAA91549.

Der Protein-Sequenzvergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Protein 15B3 und BAA92675 ergab eine 100% Identität auf Pro teinebene. Die Autoren geben für den Klon BAA92675 an, dass das Startcodon nicht identifiziert wurde. Durch die Ermitt lung des offenen Leserahmens der 4,7 kb langen Nukleotidse quenz von 15B3 konnten wir jedoch feststellen, dass es sich bei der zweiten AS der annotierten BAA92675-Proteinsequenz sehr wahrscheinlich um das Startcodon von 15B3 handelt. Es konnten keine längeren ORF identifiziert werden, die mit dem translatierten Protein übereinstimmen. Auch konnten keine weiteren ORFs mit anderem Leseraster aufgezeigt werden. Die Nukleotidsequenz des Klons BAA92675 zeigt einen Nukleoti daustausch in Position 274B bp (C statt T) und in Position 3891 bp (A statt G). Die Fehler in der Nukleotidsequenz be wirken jedoch keinen Aminosäureaustausch auf Proteinebene.

(c) Klassifizierung von 15B3, homologe Proteine

Eine Datenbanksuche (BLAST 2 (Altschul, et al., 1997, Nucleic Acids Res, 25,3389-402)) der EMBL, nrdb und swissprot- Datenbanken erbrachte Verwandte dieses Proteins.

Die stärksten Homologien zeigt 15B3 zu zwei annotierten Pro teinsequenzen:

- 58.8% Identität auf 670 AS zu BAA9131,
- 58.8% Identität auf 803 AS zu Q92627.

Konserviert ist hierbei die LRR-Bindungsdomäne im C-Terminus sowie die vier potentiellen Transmembrandomänen im N-Terminus (Fig. 4).

Die annotierte Proteinsequenz von 476 AS des Klons Q92627 zeigte keinen vollständigen ORF. Durch Translation der ermit telten 5'-liegenden genomischen Sequenzen konnte das Startco don bestimmt sowie der ORF auf 804 AS vervollständigt werden. Auch in den N-terminalen Sequenzen besteht eine gewisse Ho mologie zu 15B3. Die Proteinsequenz weist ebenfalls vier po tentielle konservierte Transmembransegmente, 10 Leucin- reiche repeats sowie ein "ER Membrane Retention Signal" ähn lichen Motifs auf.

Die Proteinsequenz des Klon BAA9131 beginnt zwar mit einem Startcodon, jedoch besteht aufgrund der Sequenzvergleiche zu 15B3 und Q92627 die Annahme, daß der ORF im N-Terminus un vollständig ist. Die Proteinsequenz zeigt starke Konservie rung zu den potentiellen Transmembransegmenten (3 und 4, Fig. 6) und weist ebenfalls 10 Leucin-reiche repeats auf. Aufgrund der Konservierung auf Proteinebene, besonders inner halb der potentiellen Transmembrandomänen und der LRR-Domänen kann davon ausgegangen werden, dass 15B3 mit BAA9131 und Q92627 einer gemeinsamen Genfamilie angehört und eine neue Subgruppe definiert (Fig. 5). Aus diesem Grund wurde BAA9131 in 15B3-1 und Q92627 in 15B3-2 umbenannt.

Mit Hilfe einer Datenbanksuche konnten außerdem Sequenzähn lichkeiten zu Proteinen aus anderen Spezies oder Organismen wie Mensch, Maus, Ratte, Drosophila melanogaster, C.elegans, S. cerevisiae, E. coli: nachgewiesen werden:
(1) H. sapiens: PID: g1504042 - similar to yeast adenylate cy clase (69%/148 aa)
(2) M. musculus: PID: g3252981 - Ras-binding protein SUR-8 (35 %/141 aa)
(3) R. norvegicus: PID: g1657758 - densin-180 (30%/112 aa)
(4) D. melanogaster: PIR: S60461 - S60461 gene flightless-I protein - fruit fly (34%/141)
(5) C. elegans: PID: g3168891 - contains similarity to re peated leucine-rich (29%/145 aa)
(6) S. cerevisiae: PID: g1006714 - ORF YJL005w (34%/114 aa)
(7) E. coli: PID: g1788752 - cell division protein involved in FtsZ ring (34%/123 aa).

Weitere Homologien zu bekannten Proteinen des Menschen und der Maus hat erfindungsgemäßes 15B3 zu Sur-8 (Li W., et al., Genes Dev. 2000 Apr 15; 14 (8): 895-900), Soc-2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, pp. 6903-6908, June 1998), Rsu-1 (Tsuda et al., Genomics. 1993 Nov; 18(2): 461-2), Densin-180 (Apper son et al., J. Neurosci. 1996, Nov 1, 16(21): 6839-52), Scribble (Nature 403 (6770): 676-680 (2000) und der Adenylate Cyclase aus Hefe (X).

Dabei liegen verschiedene Gruppen von homologen Sequenzen vor, die verschiedene Untergruppen der LLR-Proteine bilden, wie in Fig. 5 in einem phylogenetischen Baum dargestellt. Die Proteine Adenylyl Cyclase aus Saccharomyces cerevisiae sowie Sur-8, egl-15 und Rsu-1 haben eine wichtige Funktion in der Ras/Erk Signalkaskade. Die in C.elegans identifizierten Soc- Gene (egl-15, sem-5, soc-1 und soc-2), Suppressoren der Re zeptor Tyrosin Phophatase clr-1, beeinflussen die FGF- Signalkaskade. Soc-2, ein Protein mit einer 18 Tandern-LRR- Domäne, unterdrückt die aktivierte Form des EGL-15 FGF- Rezeptors (Fibroblast Wachstumstumsfactor). Die FGF- Signalkaskade soll ebenfalls einen aktivierenden Effekt auf die Ras-Kaskade bewirken. Die humane Form Shoc-2, ist beim Menschen auf Chromosom 10q25 lokalisiert, einer Region, die mit bestimmten Knochen und -Krebserkrankungen assoziiert wird.

Die anderen Untergruppen der LLR-Proteine sind die LAP- Proteine, die sowohl eine LLR-Domäne im N-Terminus und als auch eine PDZ-Domäne im Carboxy-Terminus besitzen. Zu den LAP-Proteinen gehört das C. elgans Protein Let-413, das Dro sophila-Protein Scribble, die Vertebraten-Proteine Densin- 180, Erbin und das humane Scribble. Interessanterweise haben die LAP-Proteine ein gemeinsames Expressionsmuster entlang der Zellmembran.

Aufgrund der Ergebinsse des hieraus resultierenden phylogene tischen Baum (Fig. 5) kann angenommen werden, dass 15B3 nicht zu den bisher bekannten LLR-Subgruppen zugeordnet werden kann.

(d) Genomische Struktur von 15B3 beim Menschen

Eine auf den erfindungsgemäßen Erkenntnissen beruhende Daten banksuche mit dem Programm BLAST 2 (Altschul, et al., 1997, Nucleic Acids Res, 25, 3389-402)) in der EMBL-Datenbank er brachte zusätzliche humane genomische Sequenzinformation. Der Klon AL136108, bestehend aus 36 zusammengesetzen contigs, enthält große Bereiche der 15B3-cDNA. Sequenzvergleiche zwi schen der genomischen Nucleotidsequenz deuten darauf hin, daß der humane cDNA Klon mindestens von zwei Exons kodiert wird. Der 3'-Bereich ist dabei komplett konserviert. 15B3 befindet sich beim Menschen auf Chromosom 9 (Position: 9q22.32-31.3; http:/ / www.sanger.ac.uk/cgi-bin/humace/searcher.cgi).

(e) LRR-Domäne der erfindungsgemäßen Proteine

Aufgrund der Konservierung der LLR-Domäne bei 15B3 weist eine LLR-Domäne auf, wie sie für Proteine, die an einer Interakti on mit Ras beteiligt sind, typisch ist. So gehört die mit Ras assoziierende LRR-Domäne von S. Cerevisiae Adenylyl Cyclase einer kleine Untergruppe an, die einen bestimmten 23-AS Con sensus-Unit besitzt (PXXaXXLXXLXXLXLNXLXXa, a ist hierbei ei ne aliphatische, X jede beliebige Aminosäure). Andere Mit glieder dieser Untergruppe wie z. B. RSU1 und SUR-8 sind zwei mutmaßliche Gerüstproteine, die einen modulierenden Effekt auf die Ras-abhängige Signalkaskade haben. Beiden gemeinsam ist die Bildung eines ternären Komplexes mit Ras und Rafund der daraus resultierenden Aktivierung der Ras-MAP-Kinase Signaltransduktion. Aus dem Stand der Technik ist bspw. fer ner bekannt, daß die Aktivierung von Ras und der Raf/Erk- Kaskade (Raf, Mek; Erk2) auch eine wesentliche Rolle für die Sauerstoff-Glucosemangel Toleranz in Neuronen besitzt. Wäh rend der Sauerstoff-Glucosemangel-Preconditionierung in Neu ronen wird eine Signalkasade gestartet, die durch die Akti vierung der NMDA-Rezeptoren mittels Ca2+ Einstrom und Produk tion von NO ausgelöst wird. NO ist ein Mediator der Ras Akti vierung mittels NMDA Rezeptor Stimulation. Die ischämische Toleranz erfolgt durch eine Aktvierung der NMDA-Glutamat Re zeptoren.

Die erfindungsgemäßen Proteine enthalten im C-terminus eine Tandern-Leucin-Repeat-reichen Domäne (LRR). Diese LRRs im er findungemäßen Protein sind Protein-Protein- Interaktionsdomänen bestehend aus 20-28 Aminosäuren mit einem Core-Consensus von Leucinen und Asparaginen (LXXLXLXXN). Bei dem Protein 15B3 besteht diese Domäne typischerweise aus 10 Leucin-Rich Repeats (Fig. 4).

Zusammenfassung der experimentellen Daten

Die experimentellen Daten nach der vorliegenden Erfindung zeigen, daß die identifizierten Proteine eine entscheidende Rolle bei der Regulation der fokalen cerebralen Ischämie, ei nem Schlaganfallmodell, spielen.

Mit den Proteinen 15B3, 15B3-1 bzw. 15B3-2 wurden Zielsequen zen für Pharmaka ("drug targets") mittels eines Verfahrens zur Klonierung differentiell regulierter Gene (RMDD) in der ischämischen Hemisphäre von Mäusen nach fokaler cerebraler Ischämie identifiziert. Die Regulation der Genexpression spielt bei der cerebralen Ischämie eine entscheidende Rolle für den Ablauf und das Ausmaß des Neuronenschadens (Koistinaho and Hokfelt, 1997, Neuroreport, 8, i-viii; Schneider et al., 1999, Nat. Med., 5, 554-9). Insbesondere sog. "immediate early genes" spielen hier eine Rolle (Atkins et al., 1996, Stroke, 27, 1682-1687), wie z. B. cox-2, (Nogawa, et al., 1997, J. Neurosci., 17, 2746-2755). Das Tiermodell der fokalen cerebralen Ischämie stellt dabei ein valides Modell für den humanen ischämischen Schlaganfall dar. Um eine fokale cerebrale Ischmämie herbeizuführen, wurde das sog. Fadenmodell, bei dem ein beschichteter Nylonfaden durch die A. carotis interna an den Abgang der A. cerebri media vorgeschoben wird und einen ischämischen Schlaganfall indu ziert, benutzt (Clark et al., 1997, Neurol. Res., 19, 641-648).

Die 15B3-Expression wurde nach einer fokalen cerebralen I schämie in drei Zeitverläufen beobachtet: Zum einen in einer transienten Ischämie nach zwei Reperfusionszeiten (90 min I schämie, 2 h und 6 h Reperfusion), und zum anderen in einer permanenten Ischämie von 24 h (Fig. 2). RNA wurde aus den beiden Hemisphärenhälften von 3-4 Gehirnen ohne Hirnstamm und Kleinhirn gewonnen (Fasttrack kit, Invitrogen). Mit Hilfe des LightCycler™ Systems (Roche Diagnostics, Mannheim) wurde eine quantitative PCR durchgeführt. Der cDNA Gehalt der Proben wurde auf die Expression von Cyclophilin und S20 normiert (Schneider, et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 4447-51). Benutzte Primer zur Amplifikation von Cyclophilin waren:
cyc5 ACCCCACCGTGTTCTTCGAC
acyc300 CATTTGCCATGGACAAGATG
und zur Amplifikation von Maus 15B3:
seq_15B3.1 GAGCTGCCAAGAAAGGGGGAGACT (in Exon 2)
seq_15B3.2 CAGAAAACACAAATGGACGGAGAG (in Exon 2).
(Diese Primer amplifizieren ein Amplimer von 501 bp, das am 3'-Ende der Maus-cDNA liegt).

Im Ergebnis zeigt sich eine deutliche Hochregulation um den Faktor 2-3 von 15B3-RNA auf der ischämischen (linken) Hirn hälfte 2 h nach dem ischämischen Ereignis (middle cerebral ar tery occlusion von 90 min und 2 h Reperfusion, also in einem Modell akuter Neurodegeneration (Fig. 2); die Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen, diese ergeben sich aus Messungen mit 3-fach seriell verdünnten cDNA-Proben und spiegelt damit die Reliabilität der Messergebnisse dar). Nach 24 h (in einem permanenten Modell) hingegen konnte kein Unterschied mehr festgestellt werden. Erfindungsgemäße Proteine, also bspw. 15B3 nimmt bei intrazellulären Signaltransduktionsprozessen eine wichtige Funktion ein, weswegen sie auch bei pathologi schen Prozessen (z. B. dem Schlaganfall) beteiligt sind.

Claims

1. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Se quenzbereich enthält, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von AS 312 bis AS 711 (15B3), AS 180 bis AS 579 (15B3-1) oder AS 306 bis AS 705 (15B3-2) (Nu merierung gemäß Fig. 4) codiert, einschließlich aller funktionshomologen Derivate, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Sequenzbereich enthält, der für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß Fig. 9, 11 oder 13 codiert, einschließlich aller funktionshomologen Deriva te, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisierenden DNA-Sequenzen.

3. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß sie für ein Polypeptid gemäß Fig. 9, 11 oder 13 codiert, einschließlich aller funktionshomologen De rivate, Fragmente oder Allele, oder hiermit hybridisie renden DNA-Sequenzen.

4. DNA-Sequenz nach einem der vorgenannten Ansprüche, da durch gekennzeichnet, daß sie die in Fig. 8, 10 oder 12 angegebene (c)DNA-Sequenz enthält.

5. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

6. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert ist.

7. Wirtszelle nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle, ist.

8. Aufgereinigtes Genprodukt, dadurch gekennzeichnet, daß es durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.

9. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8, dadurch ge kennzeichnet, daß es ein Polypeptid ist.

10. Aufgereinigtes Genprodukt nach Anspruch 8 oder 9, da durch gekennzeichnet, daß es die in Fig. 9, 11 oder 13 angegebene Aminosäuresequenz enthält, einschließlich al ler funktionshomologen Allele, Fragmente oder Derivate.

11. Transgene Tiere, dadurch gekennzeichnet, daß sie gene tisch dahingehend verändert, daß sie eine im Vergleich zum Normaltier (spezifisch) veränderte Menge mindestens einer Aminosäuresequenz nach Anspruch 9 oder 10 oder ei ne spezifisch gegenüber einer nativen Sequenz (gemäß Fig. 9, 11 oder 13) veränderte Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 9 oder 10 enthalten oder daß ihnen mindestens eine Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 9 oder Teile davon fehlt oder verändert vorliegt.

12. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Epitop auf einem Genprodukt nach einem der Ansprüche 8 bis 10 erkennt.

13. Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

14. Antikörper nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen einen Sequenzabschnitt auf der cytoplasmatischen Domäne als Epitop gerichtet ist.

15. Verfahren zur Expression von Genprodukten nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Wirts zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transformiert werden.

16. Verfahren zur Isolierung von Genprodukten nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Wirts zellen nach Anspruch 6 oder 7 unter geeigneten, die Ex pression fördernden Bedingungen kultiviert werden und das Genprodukt anschließend aus der Kultur aufgereinigt wird.

17. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als Arz neimittel.

18. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arz neimittels zur Behandlung) von Erkrankungen, die auf fehlgesteuerter Regulation von Zelltod- und/oder Zellproliferationsereignissen beruhen.

19. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Behandlung (bzw. zur Herstellung eines Arz neimittels zur Behandlung) von Tumorerkrankungen und neurologischen Erkrankungen, insbesondere Schlaganfall, Multipler Sklerose, Morbus Parkinson, Amyotrophe Late ralsklerose, Heredodegenerative Ataxien, Morbus Hunting ton, Neuropathien und Epilepsien.

20. Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die intra zelluläre Funktion des Proteins 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 moduliert, insbesondere inhibiert.

21. Verbindung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekenn zeichnet, daß sie eine organisch-chemische Verbindung mit einem Molekulargewicht von vorzugsweise < 3000 ist.

22. Verbindung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Zellmembran durch Diffusion oder über membranöse Transportproteine passiert.

23. Verfahren zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksa men Verbindungen nach einem der Ansprüche 19 bis 22, da durch gekennzeichnet, daß

a) ein geeignetes Wirtszellsystem mit einem Expressions vektor nach Anspruch 5, insbesondere einem Expressi onsvektor, der für das Protein 15B3, 15B3-1 oder 15B3-2 codiert, und ggf. mindestens einem Expressi onsvektor, der für mindestens ein Reporter-Gen co diert, transfiziert wird, und
b) ein zur Beobachtung der 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 vermittelten Funktion, insbesondere ein zur Beobach tung der Apoptose, des Zellwachstums, der Zellproli feration und/oder der Zellplastizität geeigneter Pa rameter nach Zugabe einer Testverbindung im Vergleich zur Kontrolle ohne Zugabe einer Testverbindung für das gemäß (a) erhaltene Wirtszellsystem in einem ge eigneten Testsystem gemessen wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß

a) der Bindungsplatz der pharmazeutisch wirksamen Verbindung auf einem erfindungsgemäßen Protein durch ein geeignetes biochemisches oder strukturbiologisches Verfahren ermit telt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeich net, daß ein Parameter gemäß (b) innerhalb eines Assay aufbaus für die Raf/MEK/ERK-Kaskade gemessen wird.

26. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 19 bis 22 zur Behandlung von (bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von) neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere Alzheimer-Demenz und Morbus Parkinson, Mus keldystrophie, viralen Infektionserkrankungen, Tumorer krankungen und Autoimmunerkrankungen oder cerebralen I schämien.

27. Verfahren zur Identifizierung eines zellulären Interak tionspartner des Proteins 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 oder eines nativen Allels, Fragments oder Derivats, wo bei ein sog. "yeast-two-hybrid"-System eingesetzt wird.

28. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 zur Identifizierung von weiteren an der durch das Protein 15B3, 15B3-1 und/oder 15B3-2 vermittelten Signaltransduktion beteiligten Proteinen.

29. Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Genprodukts nach einem der Ansprüche 8 bis 10 als Suizidgen/-protein für die in vivo oder ex vivo Transformation von Wirtszellen.

30. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 29, wobei das Suizidgen operabel mit einem Promotor verbunden ist, wo bei die Transkription reprimiert ist und nur im Bedarfs fall aktiviert wird.