DE10043992A1 - Verfahren zur Untersuchung einer Probe und konfokales Scan-Mikroskop - Google Patents
Verfahren zur Untersuchung einer Probe und konfokales Scan-MikroskopInfo
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Abstract
Ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe (11) mittels eines konfokalen Scan-Mikroskops mit mindestens einer Lichtquelle (1), vorzugsweise einem Laser, zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls (4) für die Probe (11) und einer Strahlablenkeinrichtung (9) zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls (4) über die Probe (11) weist im Hinblick auf eine sichere Festlegung interessierender Details oder Bereiche der Probe (11) die folgenden Verfahrensschritte auf: Zunächst erfolgt ein Aufnehmen eines Voransichtsbilds. Anschließend wird mindestens ein interessierender Bereich im Voransichtsbild markiert. Dann erfolgt ein Zuordnen individueller Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zu dem Bereich oder den Bereichen. Anschließend erfolgt ein Beleuchten des Bereichs oder der Bereiche der Probe (11) gemäß der Zuordnung. Schließlich wird das von der Probe (11) ausgehenden Reflexions- und/oder Fluoreszenzlicht detektiert. Des weiteren ist ein konfokales Scan-Mikroskop mit mindestens einer Lichtquelle (1), vorzugsweise einem Laser, zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls (4) für eine Probe (11) und einer Strahlablenkeinrichtung (9) zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls (4) über die Probe (11) angegeben, wobei Mittel zum Aufnahmen eines Voansichtsbilds und Mittel zum Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild vorgesehen sind, wobei dem Bereich oder den Bereichen individuelle ...
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe
mittels eines konfokalen Scan-Mikroskops mit mindestens einer Lichtquelle,
vorzugsweise einem Laser, zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls für
die Probe und einer Strahlablenkeinrichtung zur Führung des Beleuchtungs
lichtstrahls über die Probe.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein konfokales Scan-Mikroskop
mit mindestens einer Lichtquelle, vorzugsweise einem Laser, zur Erzeugung
eines Beleuchtungslichtstrahls für eine Probe und einer Strahlablenkeinrich
tung zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls über die Probe.
Ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe mittels eines Scan-Mikroskops
und ein konfokales Scan-Mikroskop der eingangs genannten Arten sind aus
der Praxis bekannt. In der bekannten Scan-Mikroskopie wird eine Probe mit
einem Beleuchtungslichtstrahl für die Probe beleuchtet, um das von der Probe
emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus des
Beleuchtungslichtstrahls wird im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel
in einer Probenebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht auf
einander stehen, so dass ein Spiegel in X- und der andere in Y-Richtung ab
lenkt. Die Verkippung der die Strahlablenkeinrichtung im Wesentlichen bilden
den Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen
bewerkstelligt, wobei sowohl schnelle resonante als auch langsamere und ge
nauere nichtresonante Galvanometer zum Einsatz kommen. Die Leistung des
von der Probe kommenden Lichts wird in Abhängigkeit von der Position des
Abtaststrahls bzw. Beleuchtungslichtstrahls gemessen.
Speziell in der konfokalen Scan-Mikroskopie wird eine Probe mit dem Fokus
eines Beleuchtungslichtstrahls in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales
Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussierop
tik, mit der das Licht der Lichtquelle auf eine Lochblende fokussiert wird, einen
Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskop
optik, eine Detektionsblende und Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw.
Fluoreszenzlichts. Das Beleuchtungslicht bzw. der Beleuchtungslicht
strahl wird meist über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das von der Probe
kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt in der meist üblichen
Descan-Anordnung über dieselben Scanspiegel bzw. über dieselbe Strahlab
lenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler und passiert diesen, um anschließend
auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren,
meist Photomultiplier, befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fo
kusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detek
tionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch se
quentielles Abtasten der Probe zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist
wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt.
Proben werden derzeit meist über das gesamte Scan-Feld hinweg mit Licht
einer Wellenlänge oder simultan mit Licht mehrerer Wellenlängen beleuchtet.
Aus diesem Grund werden Vergleichsuntersuchungen, die darauf abzielen,
Proben unter unterschiedlichen spektralen Beleuchtungsbedingungen, jedoch
unter sonst identischen Randbedingungen, zu untersuchen, sequentiell an
einer Probe oder sequentiell an gleich präparierten Proben durchgeführt.
Bei Untersuchungen, die auf dem Fluoreszenz-Resonanz-Energy-Transfer
(FRET) beruhen, werden Moleküle optisch, beispielsweise mit Licht von 488 nm
Wellenlänge, angeregt. Das Emissionslicht dieser sogenannten Donator
moleküle, das im Beispielfall eine Wellenlänge von ca. 543 nm aufweisen
würde, führt über den sogenannten Förstertransfer zur Anregung eng benach
barter anderer Moleküle, der Akzeptormoleküle. Diese emittieren dann Licht
von ca. 570 nm Wellenlänge. Zur Kontrolle der Probenaufbereitung bei Expe
rimenten, die auf Fluoreszenz-Resonanz-Energy-Transfer (FRET) beruhen,
werden derzeit vor der Durchführung der eigentlichen Untersuchungen Test
messungen durchgeführt. Im Beispielfall würde man zunächst Licht mit einer
Wellenlänge von 543 nm einstrahlen, um die Akzeptormoleküle direkt anzure
gen und um bei der Detektionslichtwellenlänge von 570 nm ein Bild aufzu
nehmen. Anschließend würde man die Probe mechanisch, beispielsweise mit
einem x-y-Tisch, verfahren und an anderer Stelle die "eigentliche" Untersu
chung mit Anregungslicht von 488 nm Wellenlänge durchführen.
Um Direktanregung des Akzeptors mit dem Licht, das eigentlich zur Anregung
des Donators gedacht ist - im Beispiel 488 nm -, auszuschließen, kann man
das Bleichverhalten von Akzeptor und Donator in Direktanregung messen.
Aus dem Vergleich der Bleichkoeffizienten bei Direktanregung mit denen bei
FRET-Anregung kann auf den Grad der Direktanregung geschlossen werden.
Im Idealfall müsste die Bahn des abgelenkten Beleuchtungslichtstrahls auf der
Probenoberfläche oder bei einer konfokalen Anordnung in einer Schichtebene
in der Probe einen Mäander beschreiben. Dabei erfolgt zunächst ein Abtasten
einer Zeile in X-Richtung bei konstanter Y-Position, anschließend eine Y-Ver
schiebung bei angehaltener X-Position und nachfolgend bei konstanter Y-Po
sition ein Abfahren einer Zeile in negativer X-Richtung. In der Realität kann
eine derartige Mäanderform aufgrund der Massenträgheit der bewegten Gal
vanometerbauteile und der Spiegel der Strahlablenkeinrichtung nur für geringe
Scanraten annähernd erreicht werden. Tatsächlich beschreibt die Scanbahn
des Beleuchtungslichtstrahls bei sinnvollen Scanraten von mehr als 100 Hz
eine sinusähnliche Kurve, was eine Korrektur der sich daraus ergebenden
Abweichungen vom Idealfall erforderlich werden lässt. So ist beispielsweise
die Bahngeschwindigkeit in der Nähe der Umkehrpunkte niedriger als im linea
ren Sinusbereich, was unter anderem zu verstärktem Bleichen in diesen Be
reichen führt. Es ist daher seit langem üblich, während des Durchlaufens der
Umkehrteilstücke die Probenbeleuchtung mit Hilfe von mechanischen, das
Bildfeld eingrenzenden Blenden oder durch geeignete optische Anordnungen
- beispielsweise mit akustooptischen Modulatoren (AOTF) - zu unterbrechen.
Diese Technik der Strahlunterbrechung während des Scannens wird Blanking
genannt. Eine Anordnung mit mechanischen Blenden wurde bereits 1990 in
einem konfokalen Laser-Scan-Mikroskop der Anmelderin eingebaut. Eine An
ordnung mit einem akustooptischen Modulator ist in "Scientific and Technical
Information Vol. XI, No. pp. 1, 9-19, Juni 1995, Leica TCS 4D UV - The sy
stem concept for Multiparameter Confocal Microscopy" beschrieben. In dieser
Schrift werden die sinusähnliche Bahnkurve und die damit verbundenen Pro
bleme erklärt, wobei das Blanking jedoch nicht explizit erwähnt wird. Ein kon
trolliertes Ausbleichen beliebiger vorbestimmbarer Probenbereiche mit Hilfe
einer AOTF-Anordnung, die es ermöglicht, verschiedene Bereiche einer Probe
mit unterschiedlicher Lichtintensität zu beleuchten, ist in P. Wedekind et al.
"Scanning microphotolysis: a new photobleaching technique based on fast
intensity modulation of a scanned laser beam and confocal imaging", Journal
of Microscopy, Vol. 176, Pt 1, October 1994, pp 23-33" beschrieben. Diese
Schrift illustriert eine Blanking-Technik auf sehr hohem technischem Niveau.
Die Offenlegungsschrift DE 198 29 981 "Verfahren und Anordnung zur konfo
kalen Mikroskopie", Carl Zeiss Jena GmbH, beschreibt die Vermeidung des
Bleichproblems und zusätzlich die Vermeidung des Durchblutens dadurch,
dass die spektrale Zusammensetzung und/oder die Intensität des in den Mi
kroskopstrahlengang eingekoppelten Laserlichts verändert wird, während die
Ablenkung ununterbrochen fortgesetzt wird, wodurch mindestens zwei neben
einanderliegende Orte bzw. Rasterpunkte der Probe mit Licht unterschiedli
cher Spektraleigenschaften und/oder unterschiedlicher Intensität beaufschlagt
werden.
Bei dem bekannten Verfahren und bei dem bekannten konfokalen Scan-Mi
kroskop ist problematisch, dass nicht klar ist, wie ein auszuwertendes Detail
einer Probe für eine differenzierte Beleuchtung auswählbar ist. Somit ist eine
sichere Auswahl und Festlegung der interessierenden Details der Probe nicht
möglich.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zur Untersuchung einer Probe und ein konfokales Scan-Mikroskop bereitzu
stellen, wonach eine sichere Definierung interessierender Details einer Probe
für eine differenzierte Beleuchtung auf einfache Weise ermöglicht ist.
Erfindungsgemäß ist die voranstehende Aufgabe durch ein Verfahren zur
Untersuchung einer Probe mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.
Demnach weist das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte auf:
Zunächst erfolgt ein Aufnehmen eines Voransichtsbilds. Hierdurch wird eine bildhafte Darstellung der zu untersuchenden Probe für den Beobachter gelie fert. Anschließend erfolgt ein Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild. Durch diese beiden Verfahrensschritte ist in er findungsgemäßer Weise eine besonders einfache Auswahl und Festlegung eines interessierenden Details einer Probe ermöglicht. Der Beobachter muß lediglich das Voransichtsbild studieren, um dann eine Markierung im Voran sichtsbild vorzunehmen.
Zunächst erfolgt ein Aufnehmen eines Voransichtsbilds. Hierdurch wird eine bildhafte Darstellung der zu untersuchenden Probe für den Beobachter gelie fert. Anschließend erfolgt ein Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild. Durch diese beiden Verfahrensschritte ist in er findungsgemäßer Weise eine besonders einfache Auswahl und Festlegung eines interessierenden Details einer Probe ermöglicht. Der Beobachter muß lediglich das Voransichtsbild studieren, um dann eine Markierung im Voran sichtsbild vorzunehmen.
Anschließend erfolgt ein Zuordnen individueller Beleuchtungslichtstrahl-Wel
lenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zu dem Bereich oder
den Bereichen. Anschließend wird der Bereich oder werden die Bereiche der
Probe gemäß der Zuordnung beleuchtet, worauf eine Detektion des von der
Probe ausgehenden Reflexions- und/oder Fluoreszenzlichts erfolgt. Hiermit ist
das Untersuchungsverfahren vervollständigt. Dabei können ganz individuell
ausgewählte Bereiche beleuchtet werden.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens könnte der Beleuch
tungslichtstrahl zur Vermeidung einer unerwünschten Belichtung der Probe
außerhalb des zu untersuchenden Bereichs oder der zu untersuchenden Be
reiche derart geführt werden, dass im Wesentlichen nur der markierte Bereich
oder die markierten Bereiche der Probe beleuchtet werden. Der Beleuch
tungslichtstrahl könnte dabei den kürzesten Weg zu dem ausgewählten Be
reich oder den ausgewählten Bereichen oder zwischen den ausgewählten
Bereichen überstreichen.
In besonders vorteilhafter Weise könnte das Verfahren bei Untersuchungen
angewendet werden, die auf Fluoreszenz-Resonanz-Energy-Transfer (FRET)
beruhen. Hierdurch kann die Präparationskontrolle vereinfacht werden. Im
Konkreten könnte in einem Bereich eine Kontrollmessung mit Licht der Ak
zeptormolekül-Anregungswellenlänge durchgeführt werden, während quasi
gleichzeitig in einem anderen Bereich eine FRET-Messung mit der
Donator-Anregungswellenlänge durchgeführt wird. Die Akzeptormolekül-Anregungs
wellenlänge könnte beispielsweise 543 nm betragen, während die
Donator-Anregungswellenlänge 488 nm betragen könnte.
Im Konkreten könnte in zwei Bereichen quasi gleichzeitig der jeweilige Bleich
koeffizient ermittelt werden. Dies ist insbesondere bei zeitkritischen Experi
menten mit lebenden Proben von Interesse.
Des weiteren könnte das Maß der Direktanregung des Akzeptors mit Anre
gungslicht für den Donator durch Messung der Fluoreszenzphotonenausbeute
bei gleichzeitigem Ausbleichen des Akzeptors mit Licht der
Akzeptormolekül-Anregungswellenlänge ermittelt werden.
Denkbar ist auch, bei einer ersten Kontrollmessung mit der Akzeptormolekül-
Anregungswellenlänge die Lage der Akzeptormoleküle festzustellen und zu
speichern, um anschließend ausschließlich an diesen Orten mit Licht der Do
nator-Anregungswellenlänge zu beleuchten. Der Rest des Bilds könnte dann
unbeleuchtet bleiben oder mit einer anderen Lichtwellenlänge beobachtet
werden.
Sowohl in einer zweidimensionalen X-Y-Darstellung als auch in einer dreidi
mensionalen X-Y-Z-Darstellung könnte man den interessierenden Bereich
oder die interessierenden Bereiche der Probe über einen Rechner und vor
zugsweise eine Computermaus auswählen oder markieren.
Über einen derartigen Rechner könnte dann auch das Zuordnen individueller
Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Lei
stungen zu dem Bereich oder den Bereichen erfolgen.
Zur Vermeidung des Beleuchtens der Probe außerhalb des Bereichs oder der
Bereiche könnte ein vorgebbares Blanking durchgeführt werden. Hierbei wird
der Beleuchtungslichtstrahl während des Scannens gezielt unterbrochen, so
dass die nicht markierten Bereiche gar nicht beleuchtet werden. Hierdurch
wird oder werden der Bereich oder die Bereiche besonders hervorgehoben
und der nicht markierte Restbereich der Probe nicht unnötig ausgeblichen.
Zur Erzielung eines höheren Kontrasts und zur Verringerung der Gesamtda
tennahmezeit könnte oder könnten der Bereich oder die Bereiche im Ver
gleich zur verbleibenden Probe langsamer und mit erhöhter Photonenstatistik
abgetastet werden.
Die Probe könnte außerhalb des Bereichs oder der Bereiche oder zwischen
den Bereichen mit maximaler Ablenkgeschwindigkeit abgetastet werden. Eine
weitere Reduktion der Gesamtdatennahmezeit könnte dadurch erreicht wer
den, dass die Strahlablenkung außerhalb des Bereichs oder der Bereiche
oder zwischen den Bereichen von der sinus-, sägezahn- oder mäanderförmi
gen Strahlablenkung abweicht. Hierdurch könnten die Bereiche auf einem
kürzeren Weg angefahren werden. Im Idealfall könnte die Strahlablenkung
zwischen zwei oder den Bereichen im Wesentlichen in direkter Linie von
einem Bereich zu einem anderen Bereich erfolgen.
Im Hinblick auf ein konfokales Scan-Mikroskop ist die obige Aufgabe durch ein
konfokales Scan-Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 14 ge
löst. Danach ist das konfokale Scan-Mikroskop der eingangs genannten Art
durch Mittel zum Aufnehmen eines Voransichtsbilds und Mittel zum Markieren
mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild gekennzeich
net, wobei dem Bereich oder den Bereichen individuelle Beleuchtungslicht
strahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zuordenbar
und der Bereich oder die Bereiche der Probe gemäß der Zuordnung beleucht
bar sind.
Im Konkreten könnte das konfokale Scan-Mikroskop ein spektral selektives
Element zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlänge oder
-Wellenlängen aufweisen. Das spektral selektive Element könnte ein AOTF -
ein akustooptischer einstellbarer Filter -, ein AOD - ein akustooptischer
Deflektor -, ein EOM - ein elektrooptischer Modulator - oder ein me
chanisches Bauteil sein. Akustooptische einstellbare Filter zeichnen sich
durch hohe Flexibilität aus und ermöglichen es, die Beleuchtungslichtstrahl-
Wellenlänge sehr schnell, d. h. im Bereich von µs, umzuschalten, Licht einer
oder mehrerer Wellenlängen zuzuschalten oder die Lichtleistung zu variieren.
Ein derartiges spektral selektives Element könnte über einen Rechner, vor
zugsweise in Abhängigkeit von der Ablenkposition, steuerbar sein.
Des weiteren könnte das konfokale Scan-Mikroskop ein Element zur Einstel
lung der Beleuchtungslichtstrahl-Leistung aufweisen. Ein derartiges Element
zur Einstellung der Beleuchtungslichtstrahl-Leistung könnte einen AOTF oder
ein mechanisches Bauteil aufweisen. Auch das Element zur Einstellung der
Beleuchtungslichtstrahl-Leistung könnte über einen Rechner, vorzugsweise in
Abhängigkeit von der Ablenkposition, steuerbar sein.
In besonders einfacher Weise könnte dasselbe Element zur Einstellung der
Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlänge oder -Wellenlängen und zur Einstellung
der Beleuchtungslichtstrahl-Leistung verwendbar sein. Hierbei kommt insbe
sondere ein AOTF in Frage.
Zur Bereitstellung mehrerer unterschiedlicher Beleuchtungslichtstrahl-Wellen
längen könnten mehrere Laser zur Erzeugung des Beleuchtungslichtstrahls
vorgesehen sein. Alternativ könnten auch ein oder mehrere Mehrlinienlaser
zur Erzeugung des Beleuchtungslichtstrahls vorgesehen sein.
Zur Darstellung und Markierung des Bereichs oder der Bereiche könnte ein
PC verwendbar sein, auf dessen Monitor das Bild oder Voransichtsbild der
Probe angezeigt wird.
Die Markierung eines dreidimensionalen Bereichs oder dreidimensionaler Be
reiche könnte in einer x,y,z-Darstellung oder in zweidimensionalen Schnitt
darstellungen durchführbar sein.
Die Strahlablenkeinrichtung könnte in besonders einfacher Weise Galvano
meterstellelemente aufweisen. Derartige Galvanometerstellelemente könnten
vorzugsweise mit Hilfe eines Rechners steuerbar sein, mit dem die Strahlab
lenk-Geschwindigkeiten individuell an Erfordernisse bezüglich des markierten
Bereichs oder der markierten Bereiche anpassbar sind.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung
in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits
auf die nachgeordneten Ansprüche, andererseits auf die nachfolgende Erläu
terung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Zeichnung zu
verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung des bevorzugten Ausführungs
beispiels der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen
bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der
Zeichnung zeigen
Fig. 1 in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel
eines erfindungsgemäßen konfokalen Scan-Mikroskops,
Fig. 2 in einer schematischen Darstellung zwei mittels eines Monitors
dargestellte markierte zweidimensionale Bereiche,
Fig. 3 in einer schematischen Darstellung die markierten Bereiche
gemäß Fig. 2 mit einer sinusförmigen Abtastbahn des Be
leuchtungslichtstrahls für die Probe,
Fig. 4 in einer schematischen Darstellung die markierten Bereiche
gemäß Fig. 2, wobei die Bereiche spezifisch abgetastet werden,
und
Fig. 5 in einer schematischen Darstellung zwei mittels eines Monitors
dargestellte markierte dreidimensionale Bereiche.
Fig. 1 zeigt in einer schematischen Darstellung das Ausführungsbeispiel eines
erfindungsgemäßen konfokalen Scan-Mikroskops zur Untersuchung einer
Probe 11. Das konfokale Scan-Mikroskop weist eine Lichtquelle 1 in Form
eines ersten Lasers auf. Das Scan-Mikroskop weist des weiteren einen zwei
ten Laser 2 in Form eines Multilinelasers auf. Die durch den ersten und den
zweiten Laser 2 erzeugten Lichtstrahlen werden mittels eines Strahlvereini
gers 3 zur Bildung des Beleuchtungslichtstrahls 4 vereinigt.
Der Beleuchtungslichtstrahl 4 durchläuft einen AOTF 5, der mittels einer
AOTF-Hochfrequenz-Ansteuerung 6 betrieben wird. An den AOTF 5 schließt
sich eine Strahlfalle 7 an. Das durch den AOTF 5 ausgewählte Beleuchtungs
licht wird mittels eines Hauptstrahlteilers 8 auf eine Strahlablenkeinrichtung 9
reflektiert. An die Strahlablenkeinrichtung 9 schließt sich ein Objektiv 10 an,
das das Beleuchtungslicht auf die Probe 11 leitet.
Des weiteren ist ein Detektor 12 für Fluoreszenz- bzw. Reflexionslicht vorge
sehen.
Zur Steuerung der AOTF-Hochfrequenz-Ansteuerung 6 und der Strahlablenk
einrichtung 9 ist ein Steuerungsrechner 13 vorgesehen. Der Steuerungsrech
ner 13 ist mit einem PC 14 und einem Monitor 15 gekoppelt. Hierdurch sind
eine Darstellung der Probe 11 und eine Markierung der interessierenden Be
reiche mittels einer Computermaus 31 ermöglicht.
Fig. 2 zeigt in einer schematischen Darstellung zwei mittels des Monitors 15
dargestellte markierte zweidimensionale Bereiche 16 und 17. Die Bereiche 16
und 17 sind mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge zu beleuchten. Zur Mar
kierung der Bereiche 16 und 17 ist ein Mauszeiger 18 vorgesehen, der über
das Voransichtsbild 19 führbar ist. Durch Drücken einer Maustaste während
des Umfahrens der Bereiche 16 und 17 wird eine für den Benutzer sichtbare
Umrandungslinie gezogen.
Fig. 3 zeigt in einer schematischen Darstellung Probenbereiche 24 und 25, die
den markierten Bereichen 17 und 16 gemäß Fig. 2 entsprechen, wobei das
Scanfeld 20 entlang einer Scanbahn 23 sinusförmig abgetastet wird. Der Pro
benbereich 25 wird einer Beleuchtung 21 mit der Wellenlänge λ1 unterworfen,
wohingegen der Probenbereich 24 einer Beleuchtung 22 mit der Wellenlänge
λ2 unterworfen wird.
Fig. 4 zeigt in einer schematischen Darstellung die Probenbereiche 24 und 25,
wobei die Bereiche 24 und 25 spezifisch abgetastet werden. Hierzu ist eine
bereichsangepasste Scanbahn 26 erzeugt. Die Strahlablenkung erfolgt zwi
schen den Bereichen 24 und 25 im Wesentlichen auf direktem Weg, was ein
Bleichen von Probenbereichen außerhalb der Bereiche 24 und 25 verhindert
und die Totzeit zwischen dem Abtasten der Probenbereiche 24 und 25 redu
ziert. Darüber hinaus kann zusätzlich der Beleuchtungslichtstrahl nach der
Abtastung des Bereichs 24 mit Hilfe des AOTF 5 unterbrochen werden, bis die
Abtastung des Bereichs 25 beginnt.
Fig. 5 zeigt in einer schematischen Darstellung zwei mittels des Monitors 15
dargestellte markierte dreidimensionale Bereiche 27 und 28. Des weiteren ist
ein Mauszeiger 29 zur Bereichsmarkierung gezeigt. Hierdurch ist ein dreidi
mensionales Voransichtsbild 30 gebildet. Auch hier sollen die Probenbereiche
27 und 28 mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge und/oder unterschiedlicher
Intensität beleuchtet werden.
Hinsichtlich weiterer vorteilhafter Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen
Verfahrens bzw. des erfindungsgemäßen konfokalen Scan-Mikroskops wird
zur Vermeidung von Wiederholungen auf den allgemeinen Teil der Beschrei
bung sowie auf die beigefügten Patentansprüche verwiesen.
Schließlich sei ausdrücklich darauf hingewiesen, dass das voranstehend be
schriebene Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen konfokalen
Scan-Mikroskops lediglich zur Erörterung der beanspruchten Lehre dient, diese
jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiel einschränkt.
Claims (27)
1. Verfahren zur Untersuchung einer Probe (11) mittels eines konfokalen
Scan-Mikroskops mit mindestens einer Lichtquelle (1), vorzugsweise einem
Laser, zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls (4) für die Probe (11)
und einer Strahlablenkeinrichtung (9) zur Führung des Beleuchtungslicht
strahls (4) über die Probe (11),
mit den folgenden Verfahrensschritten:
- - Aufnehmen eines Voransichtsbilds (19, 30);
- - Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs (16, 17; 27, 28) im Voransichtsbild (19, 30);
- - Zuordnen individueller Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zu dem Bereich (16, 17; 27, 28) oder den Bereichen (16, 17; 27, 28);
- - Beleuchten des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) der Probe (11) gemäß der Zuordnung;
- - Detektieren des von der Probe (11) ausgehenden Reflexions- und/oder Fluoreszenzlichts.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Be
leuchtungslichtstrahl (4) derart geführt wird, dass im Wesentlichen nur der
markierte Bereich (24, 25) oder die markierten Bereiche (24, 25) der Probe
(11) beleuchtet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es
bei Untersuchungen angewendet wird, die auf
Fluoreszenz-Resonanz-Energy-Transfer (FRET) beruhen.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in einem
Bereich eine Kontrollmessung mit Licht der Akzeptormolekül-Anregungswel
lenlänge durchgeführt wird, während quasi gleichzeitig in einem anderen Be
reich eine FRET-Messung mit der Donator-Anregungswellenlänge durchge
führt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass in
zwei Bereichen quasi gleichzeitig der jeweilige Bleichkoeffizient ermittelt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeich
net, dass das Maß der Direktanregung des Akzeptors mit Anregungslicht für
den Donator durch Messung der Fluoreszenzphotonenausbeute bei gleichzei
tigem Ausbleichen des Akzeptors mit Licht der Akzeptormolekül-Anregungs
wellenlänge ermittelt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich
net, dass der Bereich (16, 17, 27, 28) oder die Bereiche (16, 17; 27, 18) über
einen Rechner und vorzugsweise eine Computermaus (31) markiert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Zu
ordnen individueller Beleuchtungslichtstrahl-Wellenlängen und/oder Beleuch
tungslichtstrahl-Leistungen zu dem Bereich (16, 17; 27, 28) oder den Berei
chen (16, 17; 27, 28) über den Rechner erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeich
net, dass zur Vermeidung des Beleuchtens der Probe (11) außerhalb des Be
reichs (24, 25) oder der Bereiche (24, 25) ein vorgebbares Blanking durchge
führt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeich
net, dass der Bereich (24, 25) oder die Bereiche (24, 25) im Vergleich zur ver
bleibenden Probe (11) langsamer und mit erhöhter Photonenstatistik abge
tastet werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeich
net, dass die Probe (11) außerhalb des Bereichs (24, 25) oder der Bereiche
(24, 25) oder zwischen den Bereichen (24, 25) mit maximaler Ablenkge
schwindigkeit abgetastet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeich
net, dass die Strahlablenkung außerhalb des Bereichs (24, 25) oder der Be
reiche (24, 25) oder zwischen den Bereichen (24, 25) von der sinus-,
sägezahn- oder mäanderförmigen Strahlablenkung abweicht.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeich
net, dass die Strahlablenkung zwischen zwei oder den Bereichen (24, 25) im
Wesentlichen in direkter Linie von einem Bereich (24, 25) zu einem anderen
Bereich (25, 24) erfolgt.
14. Konfokales Scan-Mikroskop, insbesondere zur Durchführung eines
Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13, mit mindestens einer Licht
quelle (1), vorzugsweise einem Laser, zur Erzeugung eines Beleuchtungs
lichtstrahls (4) für eine Probe (11) und einer Strahlablenkeinrichtung (9) zur
Führung des Beleuchtungslichtstrahls (4) über die Probe (11),
gekennzeichnet durch Mittel zum Aufnehmen eines Voransichts
bilds (19, 30) und Mittel zum Markieren mindestens eines interessierenden
Bereichs (16, 17; 27, 28) im Voransichtsbild (19, 30), wobei dem Bereich (16,
17; 27, 28) oder den Bereichen (16, 17; 27, 28) individuelle Beleuchtungslicht
strahl-Wellenlängen und/oder Beleuchtungslichtstrahl-Leistungen zuordenbar
und der Bereich (24, 25) oder die Bereiche (24, 25) der Probe (11) gemäß der
Zuordnung beleuchtbar sind.
15. Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 14, dadurch gekennzeich
net, dass ein spektral selektives Element zur Einstellung der Beleuchtungs
lichtstrahl-Wellenlänge oder -Wellenlängen vorgesehen ist.
16. Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 15, dadurch gekennzeich
net, dass das spektral selektive Element ein AOTF (5), ein AOD, ein EOM
oder ein mechanisches Bauteil ist.
17. Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 15 oder 16, dadurch ge
kennzeichnet, dass das spektral selektive Element über einen Rechner (13),
vorzugsweise in Abhängigkeit von der Ablenkposition, steuerbar ist.
18. Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 17, da
durch gekennzeichnet, dass ein Element zur Einstellung der Beleuchtungs
lichtstrahl-Leistung vorgesehen ist.
19. Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 18, dadurch gekennzeich
net, dass das Element einen AOTF (5) oder ein mechanisches Bauteil auf
weist.
20. Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 18 oder 19, dadurch ge
kennzeichnet, dass das Element über einen Rechner (13), vorzugsweise in
Abhängigkeit von der Ablenkposition, steuerbar ist.
21. Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 18 bis 20, da
durch gekennzeichnet, dass dasselbe Element zur Einstellung der Beleuch
tungslichtstrahl-Wellenlänge oder -Wellenlängen und zur Einstellung der Be
leuchtungslichtstrahl-Leistung verwendbar ist.
22. Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 21, da
durch gekennzeichnet, dass mehrere Laser (2) zur Erzeugung des Beleuch
tungslichtstrahls (4) vorgesehen sind.
23. Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 22, da
durch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Mehrlinienlaser zur Erzeugung
des Beleuchtungslichtstrahls (4) vorgesehen sind.
24. Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 23, da
durch gekennzeichnet, dass zur Darstellung und Markierung des Bereichs (16,
17; 27, 28) oder der Bereiche (16, 17; 27, 28) ein PC (14) verwendbar ist, auf
dessen Monitor (15) das Bild oder Voransichtsbild (19, 30) der Probe (11) an
gezeigt wird.
25. Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 24, dadurch gekennzeich
net, dass die Markierung eines dreidimensionalen Bereichs oder dreidimen
sionaler Bereiche in einer x,y,z-Darstellung oder in zweidimensionalen
Schnittdarstellungen durchführbar ist.
26. Konfokales Scan-Mikroskop nach einem der Ansprüche 14 bis 25, da
durch gekennzeichnet, dass die Strahlablenkeinrichtung (9) Galvanometer
stellelemente aufweist.
27. Konfokales Scan-Mikroskop nach Anspruch 26, dadurch gekennzeich
net, dass die Galvanometerstellelemente vorzugsweise mit Hilfe eines Rech
ners (13) steuerbar sind, mit dem die Strahlablenk-Geschwindigkeiten indivi
duell an Erfordernisse bezüglich des markierten Bereichs oder der markierten
Bereiche anpassbar sind.
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