DE10012259A1 - Arzneimittelkombination gegen virale Erkrankungen - Google Patents

Arzneimittelkombination gegen virale Erkrankungen

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DE10012259A1
DE10012259A1 DE2000112259 DE10012259A DE10012259A1 DE 10012259 A1 DE10012259 A1 DE 10012259A1 DE 2000112259 DE2000112259 DE 2000112259 DE 10012259 A DE10012259 A DE 10012259A DE 10012259 A1 DE10012259 A1 DE 10012259A1
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Abstract

Kombinationen von Dihydropyrimidinen, Lamivudin und gegebenenfalls Interferon hemmen die Vermehrung von HBV-Viren besser als bislang bekannte Mittel.

Description

Die Erfindung betrifft Kombinationen von A) nicht-nukleosidischen Hemmstoffen, wie z. B. Dihydropyrimidinen, B) anderen antiviralen Mitteln und gegebenenfalls C) Immunmodulatoren, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung und Prophylaxe von HBV-Infektionen.
Unter "Kombinationen" im Sinne der Erfindung werden nicht nur Darreichungsfor­ men, die alle Komponenten enthalten (sog. Fixkombinationen), und Kombinations­ packungen, die die Komponenten voneinander getrennt enthalten, verstanden, son­ dern auch gleichzeitig oder zeitlich versetzt applizierte Komponenten, sofern sie zur Behandlung oder Prophylaxe derselben Krankheit eingesetzt werden.
Das Hepatitis-B-Virus gehört zur Familie der Hepadna-Viren. Es verursacht eine akute und/oder eine peristent-progrediente, chronische Erkrankung. Vielfältige andere klinische Manifestationen im Krankheitsbild werden durch das Hepatitis-B- Virus mitverursacht - insbesondere chronische Leberentzündung, Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom. Weiterhin kann eine Koinfektion mit dem Hepatitis- Delta-Virus den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen.
Zur Virushemmung sind bereits mehrere Möglichkeiten vorgeschlagen worden:
  • 1. die Hemmung der Polymerase des HBV durch Analoga der Substrate dieses Enzyms wie Lamivudin, FTC, Adefovir Dipivoxil, Abacavir, β-L-FDDC, L-FMAU und BMS 200 475:
    Die Polymerase ist eine der wesentlichen und im Vermehrungszyklus essentiellen enzymatischen Aktivitäten des HBV-Virus; vgl. Radziwill et al., J. Virol. 64, 613- 620 (1990). Analoga der natürlichen Substrate - zumeist nach Phosphorylierung durch die wirtseigenen Enzyme - des viralen Polymerasekomplexes hemmen die Polymeraseaktivität und somit die Replikation des HBV in vitro und in vivo; vgl. z. B. Chang et al., J. Biol. Chem. 267, 13938-13942 (1992).
    Lamivudin wird seit kurzem zur Behandlung von chronisch HBV-infizierten Patien­ ten eingesetzt. Es zeigt allerdings nach Absetzen der Therapie einen hohen Rebound­ effekt und führt während der Langzeittherapie zu Resistenzen. Für Adefovir Dipi­ voxil, BMS 200 475 und die anderen oben erwähnten Hemmstoffe liegen noch keine allgemein zugänglichen klinischen Erfahrungen vor.
  • 2. die Hemmung des HBV durch immunologische Prinzipien, wie z. B. die Behandlung chronischer Hepatitis durch Interferon; allerdings ist es nur mäßig wirksam und hat unerwünschte Nebenwirkungen. Kombinationen von Interferon mit Lamivudin sind nicht synergistisch wirksam.
    Auch die Stimulierung wirtseigener Immunabwehr, wie z. B. mit Thymosin-α, ist bereits vorgeschlagen worden.
  • 3. die Hemmung durch andere Wirksubstanzen, deren Wirkungsweisen nicht bekannt oder Gegenstand von Spekulationen sind, wie z. B. AT-61 = N-[(1E)- 2-Chlor-2-phenyl-1-(1-piperidinylcarbonyl)-ethenyl]-benzamid, das offenbar in den Vorgang der Verpackung der prägenomischen RNA in die unfertigen core-Partikel eingreift; vgl. King et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 42, 3179-3186 (1998). Wenn auch der Mechanismus noch nicht völlig auf­ geklärt ist, scheinen die Autoren eine Wirkung auf das core-Protein auszu­ schließen. Die in-vitro-Kombination von AT-61 und Lamivudin wird als synergistisch wirksam beschrieben.
Bisherige Therapeutika zur Behandlung HBV-infizierter Patienten, wie z. B. Inter­ feron oder Lamivudin, werden als Monotherapie eingesetzt. Aus klinischen Studien ist bekannt, dass Kombinationen beider Hemmstoffe keinen Vorteil bei der Bekämp­ fung von HBV-Erkrankungen aufweisen.
Neue Mittel für eine bessere und wirksame Therapie sind daher wünschenswert.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Kombinationen von A) nicht- nukleosidischen Hemmstoffen wie Dihydropyrimidinen, B) anderen HBV-antiviralen Mitteln und gegebenenfalls C) Immunmodulatoren die Nachteile des Standes der Technik nicht oder nur noch teilweise aufweisen.
Gegenstand der Erfindung sind daher Kombinationen A) mindestens eines Dihydro­ pyrimidins, B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antivixalen Mittels, vor­ zugsweise eines HBV-Polymerase-Inhibitors, und gegebenenfalls C) mindestens eines Immunmodulators. Die Erfindung betrifft also Kombinationen von nukleosidi­ schen und nicht-nukleosidischen Hemmstoffen und gegebenenfalls Immunmodula­ toren zur Behandlung und Prophylaxe von HBV-Infektionen sowie die Verwendung dieser Kombinationen zur Behandlung HBV-induzierter Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Kombinationen hemmen die Vermehrung des HBV-Virus unvorhersehbar wesentlich besser als die aus dem Stand der Technik bekannten Mittel oder deren bekannte Kombinationen. Die Verwendung der erfindungsgemäßen Kombinationen bietet bei der Behandlung HBV-induzierter Erkrankungen wertvolle Vorteile im Vergleich zur Monotherapie mit den Einzelverbindungen, nämlich haupt­ sächlich eine synergistische antivirale Wirksamkeit, aber auch eine gute Verträglich­ keit der erfindungsgemäßen Kombinationen im Bereich der Toxizität, bei der 50% der Zellen überleben ("Tox-50") - im Vergleich zur Tox-50 der Einzelkomponenten.
Bevorzugte Dihydropyrimidine A entsprechen beispielsweise der Formel
bzw. deren isomerer Form
worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlen­ stoffatomen oder Reste der Formeln
oder
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Alkoxycarbonyl und C1-C6-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Koh­ lenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann,
und die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch
-S-R6, -NR7R8, -CO-NR9R10, -SO2-CF3 und -A-CH2-R11 substituiert sind,
worin
R6 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R7 bis R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy-substitu­ iertes Phenyl, Hydroxy, C1-C6-Acyl oder C1-C6-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, C1-C6-Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2-,
R11 Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, C1-C6-Alkyl und C1-C6-Alkoxy, substituiert ist,
bedeuten,
R2 einen Rest der Formeln -XR12 oder -NR13R14,
worin
X eine Einfachbindung oder Sauerstoff,
R12 Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkoxycarbonyl, einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C1-C8-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(C1-C4-Alkyl)-,
-S- oder -SO2- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR15R16 substituiert ist,
worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder C1-C6-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, C1-C6-Alkyl oder Cyclo­ alkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten,
R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
oder
Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes C1-C6-Alkylthio, Trifluormethyl oder Pyridyl oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder unge­ sättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebe­ nenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Halogen, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, C1-C6- Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, C1-C6- Alkylthio oder C1-C6-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seiner­ seits durch Azido, Amino, Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)a-NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder C1-C6-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch C1-C6-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschie­ den durch Hydroxy, Carboxyl, C1-C6-Alkyl oder C1-C6-Alkoxy sub­ stituiert sind und/oder C1-C6-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO- CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten, oder
R3 gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl oder
R2 und R3 gemeinsam einen Rest der Formel
R4 Wasserstoff, C1-C4-Alkyl, C2-C4-Alkenyl, Benzoyl oder Acyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Wasserstoff, Methyl, Benzoyl oder C2-C6- Acyl, und
R5 Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl, die jeweils bis zu 3-fach, gleich oder ver­ schieden durch Halogen, Hydroxy, Cyano, Trifluormethyl, C1-C6-Alkoxy, C1- C6-Alkyl, C1-C6-Alkylthio, Carbalkoxy, C1-C6-Acyloxy, Amino, Nitro, Mono- oder Di-C1-C6-alkylamino substituiert sein können,
bedeuten, sowie deren Salze.
Die Verbindungen I bzw. Ia schließen die Isomeren der Formeln (I) und (Ia) sowie deren Mischungen ein. Wenn R4 Wasserstoff ist, liegen die Isomeren (I) und (Ia) im tautomeren Gleichgewicht vor:
Bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) bzw. (Ia), worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Reste der Formeln
oder
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, -SO2-CF3, Methyl, Cyano, Trifluor­ methoxy, Hydroxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln -
CO-NH-CH2-C(CH3)3, -CO-NH(CH2)2OH,
-CO-NH-CH2-C6H5, -CO-NH-C6H5, -CO-NH-(pOH)-C6H4,
-O-CH2-C6H5 oder -S-pCl-C6H4 substituiert sind,
R2 einen Rest der Formeln -XR12 oder -NR13R14, worin
X eine Einfachbindung oder ein Sauerstoffatom,
R12 Wasserstoff, C2-C4-Alkenyl, C1-C4-Alkoxycarbonyl oder C1-C4-Alkyl, wobei der Alkylrest gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR15R16 substituiert ist, worin
R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Benzyl oder C1-C4-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, C1-C4-Alkyl oder Cyc­ lopropyl bedeuten,
R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
oder
Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes C1-C4-Alkylthio, Trifluormethyl, Cyclopropyl, Pyridyl oder C1-C4-Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest gege­ benenfalls durch Halogen, C1-C4-Alkoxycarbonyl, Hydroxy und/oder durch die Gruppe
-(CO)a-NR17R18 substituiert ist,
worin
a Null oder 1,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Benzyl oder C1- C4-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch C1-C3-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei unab­ hängig voneinander Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder zwei­ fach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxy, C1-C3-Alkyl oder C1-C3-Alkoxy substituiert sind und C1-C3-Alkyl gegebenenfalls durch Reste der Formeln -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist, Phenyl oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
oder
R3 gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl
oder
R2 und R3 gemeinsam einen Rest der Formel
R4 Wasserstoff, Methyl, Vinyl oder Acetyl und
R5 Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl bedeuten, und deren Salze.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) und (Ia), worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Reste der Formeln
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Fluor, Chlor, Brom, Iod, Hydroxy, Trifluormethyl, Nitro, -SO2-CF3, Methyl, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln -CO-NH-CH2-C(CH3)3, -CO-NH(CH2)2OH, -CO-NH-CH2- C6H5, -CO-NH-C6H5, -CO-NH-(pOH)-C6H4, -O-CH2-C6H5 oder -S-pCl- C6H4 substituiert sind,
R2 einen Rest der Formeln -XR12 oder -NR13R14,
worin
X eine Einfachbindung oder ein Sauerstoffatom,
R12 Wasserstoff, C2-C3-Alkenyl, C1-C4-Alkoxycarbonyl oder C1-C4-Alkyl, worin der Alkylrest gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR15R16 substituiert ist,
worin
R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl bedeu­ ten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, C1-C3-Alkyl oder Cyc­ lopropyl bedeuten,
R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
oder
Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl, Pyridyl oder C1-C4-Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest gegebenenfalls durch Fluor, Chlor, C1-C3- Alkoxycarbonyl oder Hydroxy substituiert ist,
oder
R3 gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl oder
R2 und R3 gemeinsam einen Rest der Formel
R4 Wasserstoff, Methyl, Vinyl oder Acetyl und
R5 Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl
bedeuten,
und deren Salze.
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) und (Ia), worin
R1 Phenyl oder Triazolyl, die gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder ver­ schieden durch Fluor, Chlor, Brom oder Iod substituiert sind,
R2 geradkettiges oder verzweigtes Alkoxycarbonyl mit bis zu 4 Kohlenstoff­ atomen,
R3 Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl oder
R2 und R3 gemeinsam einen Rest der Formel
R4 Wasserstoff, Vinyl oder Acetyl und
R5 Pyridyl
bedeuten.
Speziell bevorzugte Dihydropyrimidine A sind in Tabelle A aufgeführt.
Tabelle A
Ganz speziell bevorzugt sind die in Tabelle B aufgeführten Dihydropyrimidine A.
Tabelle B
Ganz besonders bevorzugt sind die folgenden Verbindungen:
ihre isomeren Formen und ihre Salze.
Die Verbindungen der Formeln (I), (Ia) bzw. der Tabellen A und B können herge­ stellt werden, indem man
  • 1. [A] Aldehyde der Formel
    R1-CHO (II)
    worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
    mit Amidinen der Formel
    worin R5 die oben angegebene Bedeutung hat,
    und Verbindungen der Formel
    R3-CO-CH2-CO-R2 (IV)
    worin R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
    mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz gegebenenfalls in Gegenwart inerter orga­ nischer Lösemittel umsetzt oder
  • 2. [B] Verbindungen der Formel
    worin R1 bis R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
    mit Amidinen der Formel
    worin R5 die oben angegebene Bedeutung hat,
    mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 150°C, umsetzt,
    oder
  • 3. [C] Aldehyde der Formel
    R1-CHO (II)
    worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
    mit Verbindungen der Formel
    worin R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
    und Amidinen der Formel (III) wie oben beschrieben umsetzt oder
  • 4. [D] Aldehyde der Formel (II) mit Verbindungen der Formel (IV) und Iminoethern der Formel
    worin R5 die oben angegebene Bedeutung hat und R1 für (C1-C4)-Alkyl steht,
    in Gegenwart von Ammoniumsalzen umsetzt.
Das bevorzugte Verfahren [A] kann durch folgendes Formelschema beispielhaft erläutert werden:
Für die Verfahrensvarianten A, B, C und D kommen als Lösemittel alle inerten organischen Lösemittel in Frage. Hierzu gehören vorzugsweise Alkohole wie Ethanol, Methanol, Isopropanol, Ether wie Diethylether, Tetrahydrofuran, Dioxan, Glykolmonomethylether, Glykoldimethylether, Carbonsäuren wie Eisessig, oder Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Pyridin und Hexamethylphosphorsäuretriamid.
Die Reaktionstemperaturen können innerhalb eines größeren Bereichs variiert werden. Im allgemeinen arbeitet man im Bereich von 20 bis 150°C, vorzugsweise jedoch bei der Siedetemperatur des jeweiligen Lösemittels.
Die Umsetzung kann bei Normaldruck, aber auch bei erhöhtem Druck, durchgeführt werden; im allgemeinen arbeitet man unter Normaldruck.
Die Umsetzung kann mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz durchgeführt werden; die Gegenwart von schwächeren Säuren, wie z. B. Essigsäure oder Ameisensäure, wird bevorzugt.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Aldehyde (II) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. T. D. Harris und G. P. Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 21 65 260 und 2 401 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, (1963), 13 929c, E. Adler und H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849 (1961), E. P. Papadopoulos, M. Mardin und Ch. Issidoridis, J. Org. Chem. Soc. 78, 2543 (1956)).
Die als Ausgangsstoffe verwendeten β-Ketocarbonsäureester (IV) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [z. B. D. Borrmann, "Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen" in "Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. VII/4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano und O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Yliden-β-ketoester (V) können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. G. Jones, "The Knoevenagel Condensation" in Organic Reactions, Vol. XV, 204 ff. (1967)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Enaminocarbonsäureester (VI) und die Iminoether (VII) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. S. A. Glickman and A. C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].
Die Verbindungen (III) können hergestellt werden, indem man Verbindungen der Formel
R5-CN (VIII)
worin R5 die oben angegebene Bedeutung hat,
wie üblich über die Iminoether und abschließend mit Ammoniumchlorid in Methanol umsetzt [vgl. hierzu W. K. Fife, Heterocycles 22, 93-96 (1984); T. Sakamoto, S. Kaneda, S. Nishimura, H. Yamanaka, Chem. Pharm. Bull. 33, 565, 571 (1986)] oder andere literaturbekannte Verfahren, wie z. B. Garigipati, Tetrahedron Lett. 1990, 1969- 1972, Boere et al., J. Organomet. Chem. 1987, 331, 161, oder Caton et al., J. Chem. Soc. 1967, 1204.
Alle Verfahrensschritte können bei Normaldruck und in einem Temperaturbereich von 0 bis 130°C, vorzugsweise von 20 bis 100°C, erfolgen.
Die Verbindungen (VIII) sind bekannt oder können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden, indem man beispielsweise Pyridine der Formel
R5-H (IX)
worin der Wasserstoff in ortho-Position zum Stickstoff steht und R5 die oben angegebene Bedeutung hat,
zunächst vorzugsweise bei 50 bis 150°C, insbesondere bei etwa 100°C, in H2O2/Eis­ essig zu den entsprechenden N-Oxiden umsetzt und anschließend mit Trimethyl­ silylcyanid (TMSCN) nach literaturbekannten Verfahren, beispielsweise in den oben aufgeführten inerten Lösungsmitteln, vorzugsweise Acetonitril, THF, Toluol bei Raumtemperatur oder bei Rückflusstemperatur, gegebenenfalls unter Zusatz von Basen wie Triethylamin oder DBU, umsetzt oder indem man in Verbindungen der Formel
worin Y und Z die unter R5 angegebenen Substitutionsreste des Pyridylringes darstellen,
mit Hilfe von Cyaniden, wie Kaliumcyanid oder Kupfercyanid, das Chlor gegen Cyanid austauscht,
oder für den Fall, dass R5 Difluorpyridyl bedeutet, Verbindungen der Formel
worin Y' und Z' unabhängig voneinander Chlor oder Brom bedeuten,
mit Alkali- bzw. Ammoniumfluoriden, vorzugsweise Kaliumfluorid, nach literatur­ bekannten Verfahren gegebenenfalls in polaren Lösemitteln, wie beispielsweise Polyglykolen, Polyglykolethern, DMSO oder Sulfolan, gegebenenfalls unter Zusatz von Phasentransfer-katalysatoren, im Sinne einer Halogen/Fluor-Austauschreaktion, umsetzt.
Das obige Verfahren wird bezüglich der 3,5-Difluorpyridylverbindungen beispielhaft durch das folgende Reaktionsschema erläutert:
Die obigen Verbindungen I bzw. Ia und verschiedene Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus den DE-OS 198 17 264 (= WO 99/54 326) und 198 17 265 (= WO 99/54 312) bekannt.
Weitere bevorzugte Dihydropyrimidine A entsprechen der Formel
bzw. deren isomerer Form
worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Rest der Formeln
oder
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Alkoxycarbonyl und C1-C6-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann,
und/oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der Formeln -S-R6, -NR7R8, -CO-NR9R10,
-SO2-CF3 und -A-CH2-R11 substituiert sind,
worin
R6 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R7 bis R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy-substitu­ iertes Phenyl, Hydroxy, C1-C6-Acyl oder C1-C6-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, C1-C6-Alkoxycarbonyl, Phenyl oder Hydroxy substituiertes Phenyl substituiert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2-,
R11 Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, C1-C6-Alkyl und C1-C6-Alkoxy, substituiert ist,
bedeuten,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14,
worin
R12 Wasserstoff, C1-C6-Alkoxycarbonyl oder einen geradkettigen, ver­ zweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C1-C8-Koh­ lenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder ver­ schiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(C1-C4-Alkyl)-, -S- und -SO2- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR15R16 substituiert ist, worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Ben­ zyl oder C1-C6-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, C1-C6-Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
oder Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes C1-C4 Alkylthio, Trifluormethyl
oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder unge­ sättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebe­ nenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, C1-C6-Alkoxy­ carbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, C1-C6-Alkylthio oder C1-C6-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)a-NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder C1-C6-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch C1-C6-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, C1-C6- Alkyl oder C1-C6-Alkoxy substituiert sind und/oder C1-C6-Alkyl gege­ benenfalls durch -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten,
und deren Salze.
Bevorzugt werden Verbindungen der Formeln I bzw. Ia,
worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl, wobei diese Ringsysteme gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro,
-SO2-CF3, Methyl, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Methoxycarbonyl oder Resten der Formeln -CO-NH-CH2-C(CH3)3, -CO-NH(CH2)2OH, - CO-NH-CH2-C6H5, -CO-NH-C6H5, -CO-NH-(pOH)-C6H4, -O-CH2-C6H5 oder -S-pCl-C6H4 substituiert sind,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14 bedeutet,
worin
R12 Wasserstoff, C2-C4-Alkenyl oder C1-C4-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR15R16 substituiert ist,
worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl bedeuten,
R3 Wasserstoff oder einen Rest der Formel
oder
Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl oder C1-C4-Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Reste der Formeln - SO2CH3, -NH-CO-CH3, -NH-CO-CF3, Fluor, Chlor, C1-C3-Alkoxycarbonyl, Hydroxy und/oder durch die Gruppe -(CO)a-NR17R18 substituiert ist,
worin
a Null oder 1,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Benzyl oder C1- C4-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch C1-C3-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei unab­ hängig voneinander Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder zwei­ fach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxy, C1-C3-Alkyl oder C1-C3-Alkoxy substituiert sind und C1-C3-Alkyl gegebenenfalls durch Reste der Formeln -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist, Phenyl oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeuten,
R4 Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Acetyl,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Halogen oder C1-C4-Alkyl
bedeuten,
und deren Salze.
Besonders bevorzugt werden Verbindungen der Formeln I und Ia,
worin
R1 Phenyl oder Thienyl, wobei diese Ringsysteme gegebenenfalls bis zu zwei­ fach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Fluor, Chlor, Methyl, Trifluormethyl und Nitro, substituiert sind,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14,
worin
R12 Wasserstoff oder C1-C4-Alkyl und
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl bedeuten,
R3 Wasserstoff oder Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl oder gegebe­ nenfalls durch Fluor, Chlor, Hydroxy substituiertes C1-C3-Alkyl bedeutet, das seinerseits bis zu 3-fach durch C1-C3-Alkoxycarbonyl substituiert sein kann,
R4 Wasserstoff oder Methyl,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Fluor, Chlor oder C1-C3-Alkyl
bedeuten, und deren Salze.
Ganz besonders bevorzugt werden Verbindungen der Formeln I und Ia, worin
R1 Phenyl oder Thienyl, die gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder ver­ schieden durch Fluor oder Chlor substituiert sind,
R2 Methoxy, Ethoxy oder n-Propoxy,
R3 Wasserstoff, Methyl oder Cyclopropyl,
R4 Wasserstoff,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Fluor oder Chlor
bedeuten,
und deren Salze.
Bevorzugte solche 2-heterocyclisch substituierte Dihydropyrimidine umfassen beispielsweise die Verbindungen der folgenden Tabelle.
Tabelle C
Die Rf-Werte wurden in Cyclohexan/Essigsäureethylester (7 : 3 Volumenteile) bestimmt.
Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen steht im Rahmen der Erfindung für Cyclo­ propyl, Cyclopentyl, Cyclobutyl, Cyclohexyl, vorzugsweise Cyclopentyl und Cyclo­ hexyl.
Aryl steht im allgemeinen für einen aromatischen Rest mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Phenyl und Naphthyl.
Aralkyl steht im Rahmen der Erfindung für Aralkyl mit vorzugsweise 6 bis 10, insbe­ sondere 6 Kohlenstoffatomen im Arylteil (vorzugsweise Phenyl oder Naphthyl, insbe­ sondere Phenyl) und vorzugsweise 1 bis 4, insbesondere 1 oder 2 Kohlenstoffatomen im Alkylteil, wobei der Alkylteil linear oder verzweigt sein kann. Bevorzugte Aralkyl­ reste sind Benzyl und Phenethyl.
Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für 5- bis 7-gliedrige Ringe mit vorzugs­ weise 1 bis 3, insbesondere 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Heteroatomen aus der Reihe Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff. Bevorzugte Beispiele umfassen Furyl, Thiophenyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, 1.2.3- und 1.2.4-Triazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, 1.2.3-, 1.3.4-, 1.2.4- und 1.2.5-Oxadiazolyl, Pyrrolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, 1.3.5-, 1.2.4- und 1.2.3-Triazinyl, 1.2.4-, 1.3.2-, 1.3.6- und 1.2.6-Oxazinyl.
Acyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Acylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Acetyl und Propionyl.
Alkyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkyl­ rest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.
Alkenyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkenylrest mit 2 bis 6, vorzugsweise 3 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Ethenyl, Propenyl, Isopropenyl, tert.Butenyl, n-Pentenyl und n-Hexenyl.
Alkoxy steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkoxyrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, tert.-Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.
Alkylthio steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylthiorest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Methylthio, Ethylthio und Propylthio.
Alkoxycarbonyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder ver­ zweigten Alkoxycarbonylrest mit 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl, tert.- Butoxycarbonyl, n-Pentoxycarbonyl und n-Hexoxycarbonyl.
Halogen steht im Rahmen der Erfindung für Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Die Verbindungen I bzw. Ia können in stereoisomeren Formen, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere) oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild (Diastereomere) verhalten, existieren. Die Verbindungen I bzw. Ia umfassen also sowohl die Enantiomeren als auch die Diastereomeren sowie deren jeweiligen Mischungen. Die Racemformen lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen.
Die Verbindungen I bzw. Ia können auch als Salze vorliegen. Im Rahmen der Er­ findung sind physiologisch unbedenkliche Salze bevorzugt.
Physiologisch unbedenkliche Salze können Salze der Verbindungen I bzw. Ia mit anorganischen oder organischen Säuren sein. Bevorzugt werden Salze anorganischer Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, oder Salze organischer Carbon- oder Sulfonsäuren, wie beispiels­ weise Essigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Benzoesäure, oder Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Phenylsulfon­ säure, Toluolsulfonsäure oder Naphthalindisulfonsäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze können ebenso Metall- oder Ammoniumsalze der Verbindungen I bzw. Ia sein. Besonders bevorzugt sind z. B. Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze sowie Ammoniumsalze, die von Ammoniak oder organischen Aminen, wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw. Triethylamin, Di- bzw. Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethy­ lendiamin oder 2-Phenylethylamin, abgeleitet sind.
Die Verbindungen (I) bzw. (Ia) können hergestellt werden, indem man
  • 1. [A] Aldehyde der Formel
    R1-CHO (II)
    worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
    mit Amidinen oder deren Hydrochloriden der Formel
    worin R5 und D die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
    und Verbindungen der Formel
    R3-CO-CH2-CO-R2 (IV)
    worin R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
    mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz, gegebenenfalls in Gegenwart inerter orga­ nischer Lösemittel, umsetzt oder
  • 2. [B] Verbindungen der Formel
    worin R1 bis R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
    mit Amidinen der Formel
    worin R5 und D die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
    mit oder ohne Basen- oder Säurezusatz, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 150°C, gegebenenfalls in Gegenwart inerter organischer Lösemittel, umsetzt oder
  • 3. [C] Aldehyde der Formel
    R1-CHO (II)
    worin R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
    mit Verbindungen der Formel
    worin R2 und R3 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,
    und Amidinen der Formel (III) wie oben beschrieben umsetzt.
Die Herstellungsverfahren können durch folgende Formelschemata beispielhaft erläutert werden:
Für alle Verfahrensvarianten A, B und C kommen als Lösemittel alle inerten orga­ nischen Lösemittel in Frage. Hierzu gehören vorzugsweise Alkohole wie Ethanol, Methanol, Isopropanol, Ether wie Dioxan, Diethylether, Tetrahydrofuran, Glykol­ monomethylether, Glykoldimethylether, Carbonsäuren wie Eisessig, oder Dimethyl­ formamid, Dimethylsulfoxid, Acetonitril, Pyridin und Hexamethylphosphorsäuretri­ amid.
Die Reaktionstemperaturen können innerhalb eines größeren Bereichs variiert wer­ den; im allgemeinen arbeitet man in einem Bereich von 20 bis 150°C, vorzugsweise jedoch bei der Siedetemperatur des jeweiligen Lösemittels.
Die Umsetzung kann bei Normaldruck, aber auch bei erhöhtem Druck durchgeführt werden; im allgemeinen arbeitet man unter Normaldruck.
Die Umsetzung kann mit oder ohne Basen- bzw. Säurezusatz, vorzugsweise in Gegenwart von schwächeren Säuren, wie z. B. Essigsäure oder Ameisensäure, durch­ geführt werden.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Aldehyde (II) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden herstellt werden [vgl. T. D. Harns und G. P. Roth, J. Org. Chem. 44, 146 (1979), DE-OS 21 65 260 und 24 01 665, Mijano et al., Chem. Abstr. 59, (1963), 13 929c, E. Adler und H.-D. Becker, Chem. Scand. 15, 849 (1961), E. P. Papadopoulos, M. Mardin und Ch. Issidoridis, J. Org. Chem. Soc. 78, 2543 (1956)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Amidine (III) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. "Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. 11/2, Seite 38 ff (1958); R. L. Shoiner und F. W. Neumann, Chem. Review 35, 351 (1944)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten β-Ketocarbonsäureester (IV) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [z. B. D. Borrmann, "Umsetzung von Diketen mit Alkoholen, Phenolen und Mercaptanen", in "Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Vol. VII/4, 230 ff (1968); Y. Oikawa, K. Sugano und O. Yonemitsu, J. Org. Chem. 43, 2087 (1978)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Yliden-β-ketoester (V) können nach literaturbe­ kannten Methoden hergestellt werden [vgl. G. Jones, "The Knoevenagel Conden­ sation" in Organic Reactions, Vol. XV, 204 ff. (1967)].
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Enaminocarbonsäureester (VI) sind bekannt oder können nach literaturbekannten Methoden hergestellt werden [vgl. A. C. Cope, J. Am. Chem. Soc. 67, 1017 (1945)].
Die Verbindungen I bzw. Ia, welche in 2-Stellung einen gegebenenfalls substituierten Oxazolyl- oder Thiazolylrest enthalten, und verschiedene Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus der DE-OS 198 17 262 (= WO 99/54 329) bekannt.
Die Dihydropyrimidine A wirken als HBV-core-Protein-Inhibitoren.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind deshalb Kombinationen
  • A) mindestens eines HBV-core-Protein-Inhibitors,
  • B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels, vorzugsweise mindestens eines HBV-Polymerase-Inhibitors, und gegebenenfalls C) mindestens eines Immunmodulators.
HBV-core-Protein-Inhibitoren im Sinne der Erfindung sind solche nicht-nukleosi­ dischen Hemmstoffe, die in der Zelle (i) die Halbwertszeit des HBV-core-Proteins mindestens halbieren bzw. (ii) den nachfolgend beschriebenen Bindungstest beste­ hen.
(i) Pulse-Chase-Markierung von HepG2.2.15-Zellen und anschließender Nachweis des HBV-core-Proteins durch Immunpräzipitation Allgemeine Beschreibung
Durch Pulse-Chase-Markierung von HepG2.2.15-Zellen und anschließende Immunpräzipitation des HBV-core-Proteins wird die Syntheserate und die Stabilität des HBV-core-Proteins messbar. Als Maß der Stabilität wird die Halbwertzeit des core-Proteins herangezogen. Die Halbwertzeit des core-Proteins ist durch die Zeit definiert, innerhalb der die core-Proteinmenge auf die Hälfte der zum Anfangszeit­ punkt t0 = 0 vorliegenden Menge reduziert worden ist.
Die Proteinmenge korreliert mit der eingebauten Radioaktivität und folglich der Schwärzung eines Röntgenfilms bzw. der Strahlungsintensität, die durch einen Phos­ phorimager sichtbar gemacht werden kann.
Mit Hilfe dieser Technik kann der Einfluss potentieller Inhibitoren auf die Halbwert­ zeit des viralen HBV-core-Proteins untersucht werden. Eine Substanz ist demnach dann ein HBV-core-Protein-Inhibitor, wenn die Halbwertzeit des HBV-core-Proteins mindestens halbiert wird; vgl. nachfolgende Testbeschreibung.
Versuchsdurchführung Einsaat der Zellen
An Tag 1 werden die HepG2.2.15-Zellen in Zellkulturflaschen (75 cm2; Costar) in einer Dichte von 6 × 106 Zellen pro Flasche in HepG2-Zellkulturmedium (Fa. Bio­ chrom KG, Berlin) eingesetzt. 100 Liter dieses Mediums bestehen aus 74,8 Litern ®seromed RPMI 1640-Medium und 14,4 Litern ®seromed Medium 199 mit Earle's Salzen (beide Medien von der Fa. Biochrom KG, Berlin; die Zusammensetzungen werden vor den Beispielen beschrieben); weiterhin werden 200 g NaHCO3, 5000 000 Einheiten Penicillin-G-Natrium, 5 g Streptomycin, 25 mg Amphotericin B, 30 g Aminoglykosid-Antibiotikum G418 (Fa. Sigma, München), wässrige Natriumpyru­ vat-Lösung (bis zu einer Natriumpyruvat-Konzentration der Gesamtlösung von 2 mM), wässrige Glutamin-Lösung (bis zu einer Glutamin-Konzentration der Gesamt­ lösung von 2 mM), wässriges FCS (FCS = fötales Kälberserum; bis zu einer FCS- Konzentration der Gesamtlösung von 2% (v/v)) zugesetzt. Die Testsubstanz wird als 50 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO; Fa. Sigma, München) zubereitet. Sie wird in HepG2-Zellkulturmedium verdünnt und auf die 100-fache IC50Kon­ zentration eingestellt. 1 ml dieser Testsubstanzlösung wird zu 19 ml HepG2-Zell­ kulturmedium gegeben. Die Testsubstanz wird mit der Einsaat in abgestuften Ver­ dünnungsschritten hinzugegeben. Die Zellen werden bei 37°C und 5% CO2 (v/v) im Brutschrank inkubiert.
Markierung der Proteine
An Tag 3 wird das Kulturmedium verworfen und durch 20 ml eines Mediums ersetzt, dem die Aminosäuren Methionin und Cystin entzogen sind ("Hungermedium"). Das Hungermedium (500 ml) enthält MEM (= minimum essential medium mit Earle's Salzen; Gibco 51091-015 - die Zusammensetzung wird vor den Beispielen beschrie­ ben), 5 ml wässrige L-Glutamin-Lösung (200 mM), 5 ml L-wässrige Leucin-Lösung (5.2 g/l), 5 ml wässrige Glucose-Lösung (100 g/l), 5 ml wässrige i-Inosit-Lösung (0.2 g/l), 5 ml wässrige L-Arginin-Lösung (12.46 g/l) und wässriges FCS (bis zu einer FCS-Konzentration der Gesamtlösung von 2% v/v). Die Inkubation mit Hungerme­ dium wird in Gegenwart der Testsubstanz (Konzentration wie oben) vorgenommen. Die Zellen werden für 45 Minuten bei 37°C und 5% CO2 (v/v) im Brutschrank inku­ biert. Anschließend werden 16 ml Hungermedium abgenommen und das verbleiben­ de Medium mit 25 µl 35S-Redivue Promix (2,5 mCi/175 µl) (Amersham, AGQ 0080) versetzt. Die Zellen werden für weitere 10 Minuten bei 37°C und 5% CO2 (v/v) im Brutschrank inkubiert ("Pulse"). Im Anschluss wird die Markierungslösung entfernt und durch Hungermedium plus wässrige L-Cystin-Lösung (bis zu einer Cystin-Kon­ zentration der Gesamtlösung von 1 mM) und wässrige L-Methionin-Lösung (bis zu einer Methionin-Konzentration der Gesamtlösung von 1 mM) ("Labelstopmedium") ersetzt. Damit wird die Markierung abgestoppt. Die Inkubation mit Labelstopme­ dium wird ebenfalls in Gegenwart der Testsubstanz (Konzentration wie oben) vorge­ nommen. Das Gesamtvolumen liegt bei 20 ml pro Flasche. Die Kulturen werden bei 37°C und 5% CO2 (v/v) im Brutschrank inkubiert ("chase"). 5 Minuten nach Zugabe des Labelstopmediums wird der Zeitwert t0 = 0 ("0-Stunden-Wert") genom­ men. Weitere Versuchszeiten sind variabel im Bereich bis zu 96 Stunden. An jedem weiteren Zeitwert im Verlauf des "chase" wird ein Probensatz (behandelt/unbehan­ delt) entnommen, um den core-Protein-Gehalt zu diesem Zeitpunkt zu ermitteln. Dazu wird das Medium abgenommen und die Zellen werden einmal mit PBS (phos­ phatgepufferte Saline ohne Ca/Mg++) (Biochrom Nr. L1825) gewaschen. Anschlie­ ßend wird der Zellrasen mit 1 ml Lysispuffer {10 mM Tris-HCl pH 7,5; 1% (v/v) des nichtionischen Detergens ®Triton X-100 [Marke der Fa. Rohm & Haas, 4- (1.1.3.3-Tetramethylbutyl)-phenol-polyethoxyethanol]; 140 mM NaCl} lysiert. (Der Begriff "Tris" steht für 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1.3-propandiol). Das Lysat wird in 2 ml-Eppendorfröhrchen überführt und zentrifugiert (2 Minuten; 4000 Upm). Der Überstand wird in ein neues Eppendorfröhrchen überführt, und das Sediment (= Zellkerne) wird verworfen. Das Lysat wird bei +4°C gelagert.
Fällung des HBV-core-Proteins durch spezifische Immunpräzipitation
Zu dem Lysat werden 10 µl Kanichen-Normalserum (Sigma 7523) und 200 µl Sepharosekügelchen, die in PBS suspendiert sind (Protein-A-Sepharose Cl-4B; Pharmacia, 17-0780-01), hinzugegeben (Alternativ kann der Komplex aus Kügelchen und Antikörper vorgeformt werden). Es folgt eine Inkubation für 2 Stunden bei 4°C auf dem Drehrad. Die Immunpräzipitate werden durch Zentrifugation abgetrennt (2 Minuten; 1000 Upm) und bei 4°C gelagert. Der Überstand wird in ein neues Eppen­ dorfröhrchen überführt.
Anschließend werden 5 µl anti-humanes HBV-core-Kaninchen-Antiserum und 200 µl Sepharosekügelchen, die in PBS suspendiert sind (Protein-A-Sepharose Cl-4B; Pharmacia, 17-0780-01) hinzugegeben (Alternativ kann der Komplex aus Kügelchen und Antikörper vorgeformt werden). Es folgt eine Inkubation (2 Stunden bei 4°C) auf dem Drehrad. Die Immunpräzipitate werden durch Zentrifugation abgetrennt (2 Minuten; 1000 Upm) und bei 4°C gelagert. Der Überstand wird in ein neues Eppen­ dorfröhrchen überführt und bei 4°C aufgehoben.
Die Kügelchen werden dreimal mit NET-Puffer [50 mM Tris-HCl pH 7,4; 0,5% (v/v) des nichtionischen Detergens ®Nonident NP-40 (Fa. Boehringer Mannheim); 150 mM NaCl; 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)] gewaschen, d. h. abwechselnd suspendiert und abzentrifugiert (2 Minuten bei 1000 Upm). Die gewa­ schenen Immunpräzipitate werden bei 4°C gelagert.
SDS-Page und Visualierung der radioaktiv markierten HBV-core-Proteine (SDS = Dodecylsulfat-Natrium)
Die gewaschenen Immunpräzipitate werden durch 12 Gew.-% SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Dazu wird jede Probe mit 50 µl zwei­ fach konzentriertem SDS-Probenpuffer (BioRad) versetzt, einmal gevortext (geschüttelt), 5 Minuten bei 95°C gekocht, auf Eis abgeschreckt und kurz zentrifugiert. In jede Geltasche werden 20 µl des Überstandes aufgetragen. Das Gel läuft 1,5 Stunden bei 120 Volt (= 15 Volt/cm).
Das Gel wird dreimal 5 Minuten in Fixierlösung (70 Vol.-% Ethanol; 10 Vol.-% Essigsäure; 20 Vol.-% Wasser) immersiert. Anschließend wird das Gel für 20 Minu­ ten in Enhancer (Enlightning Rapid Autoradiography Enhancer NEN Research Products Nr. NEF-974) gebadet. Das Gel wird auf Filterpapier gelegt (BioRad Nr. 165-0921) und mit Cellophan (BioRad Nr. 165-0922) abgedeckt. Diese Anord­ nung wird 50 Minuten mit dem BioRad Geltrockner getrocknet.
Das getrocknete Gel wird auf einen Röntgenfilm (Hyperfilm MP; Amersham RPN 2115H) gelegt und nach angemessener Expositionsdauer entwickelt. Alternativ kann das getrocknete Gel auf einem Phosphorimager (Fujix BAS100) analysiert werden. Die Auswertung vergleicht die Halbwertzeiten des HBV-core-Proteins in An- und Abwesenheit der Testsubstanz.
(ii) Gelchromatographischer Nachweis der Bindung einer markierten Testsubstanz an HBV-core-Protein Allgemeine Beschreibung
Das chromatographische Verhalten eines Proteins oder eines seiner natürlich auftre­ tenden Aggregationsformen (Dimere, Multimere) während der Gelpermeationschro­ matographie hängt von der Wahl des verwendeten Gelmaterials ab. Beispielsweise kann das Gelmaterial, das in Entsalzungssäulchen verwendet wird (z. B. Sephadex G- 25; Pharmacia), eine Ausschlussgrenze haben, die für globuläre Proteine bei einem Molekulargewicht von 5000 Dalton liegt; d. h. alle Proteine mit einem Molekularge­ wicht größer als 5000 Da werden im Ausschlussvolumen eluiert. Andererseits dringt ein globuläres Protein, das ein Molekulargewicht unter 5000 Da aufweist, in das Trennmaterial ein und wird auf der Säule zurückgehalten. Sieht man von Effekten, die nicht durch die Molekülgröße bestimmt werden (z. B. Adsorption), einmal ab, gilt in der Regel: Je geringer das Molekulargewicht eines Moleküls, desto länger dauert der Weg durch das Gelbett und desto später wird das Molekül eluiert. Diese prinzi­ pielle Versuchsanordnung kann für einen Bindungstest genutzt werden. Der Bin­ dungstest dient der Untersuchung, ob eine Testsubstanz an ein Protein von Interesse bindet. Dazu wird die Testsubstanz, die hinreichend unter der Ausschlussgrenze liegen muss, markiert (z. B. durch Austausch eines Wasserstoffatoms gegen Tritium) und mit dem Protein (z. B. dem HBV-core-Protein oder seiner Aggregationsform = "Kapsid"), das hinreichend über der Ausschlussgrenze liegen muss, inkubiert. Das Material wird auf die Säule aufgetragen und mit einem Elutionspuffer (z. B. 10 mM Tris pH 7,4 und 1 mM EDTA) eluiert. Durch die Bindung an das Protein wird die markierte Testsubstanz wie das freie Protein im Ausschlussvolumen eluiert. Eine nicht bindende Testsubstanz oder der Testsubstanz-Überschuss wird dagegen im späten Elutionsvolumen eluiert. Zum Nachweis des Elutionsverhaltens werden einzelne Fraktionen aufgefangen und die Radioaktivität im Szintillationszähler (oder durch ein anderes geeignetes Detektionsverfahren) bestimmt.
In der Regel wird dieses Verfahren als Variante des Bindungstest so durchgeführt werden, dass man beispielsweise eine markierte Substanz, die an das HBV-core- Protein bindet ("markierte Substanz"), dazu benutzt, weitere core-Protein-Binder aufzufinden: Die markierte Substanz wird durch eine Testsubstanz ("verdrängende Substanz") direkt verdrängt (Wettbewerb um die gleiche Bindungsstelle) oder die Testsubstanz modifiziert das Protein (bzw. eines seiner Aggregatformen) derart, dass die markierte Substanz nicht länger binden kann (Modifikation der Bindungsstelle).
Versuchsdurchführung Bereitstellung der Säule
Die Sephadex-G-25-Säule (Höhe der Säule: 5 cm, Durchmesser der Säule: 1,5 cm) wird nach Standardverfahren (Herstelleranweisungen) gegossen oder fertig von einem Hersteller (z. B. PD10-Entsalzungssäulchen von Phamacia) bezogen. Die Säule wird im gewünschten Puffer (10 mM Tris pH 7,4 und 1 mM EDTA) äquilibriert. Eine Probe (32 µl), bestehend aus 2 µl (= 64 µmol) markierter Substanzlösung (spezifische Aktivität einer z. B. tritiierten Verbindung liegt typischerweise im mCi/ml-Bereich), gemischt mit HBV-core-Protein (10 µg = 2,7 µmol), das in Form des Kapsids vorliegt, und mit verdrängender Substanz (100 × molarer Überschuss, bezogen auf markierte Substanz) wird auf die Säule appliziert. Der Äquilibrierungs­ puffer wird zur Elution verwendet. Es werden Fraktionen von 1 ml aufgefangen. Die gesamte Fraktion oder ein Aliquot davon wird mit Szintillatorflüssigkeit (Ultima Gold, Packard) gemischt und mit einem Szintillationszähler ausgemessen. Im Fall einer Verdrängung von markierter Substanz durch die Testsubstanz wird in den Fraktionen; die Ausschlussvolumen beinhalten, eine geringere Aktivität als in Fraktionen gemessen, in denen keine Testsubstanz vorlag (Nullwert). Ein HBV-core- Protein-Inhibitor liegt dann vor, wenn maximal 50% der Aktivität des Nullwerts vorliegen.
Der oben beschriebene Halbwertzeittest (i) ergibt in der Regel die genaueren Werte; er ist jedoch zeitaufwendig. Sollen viele Substanzen getestet werden, so wird man wegen der höheren Testgeschwindigkeit den Bindungstest (ii) wählen; er ist auch zu einem Screening geeignet, woran sich dann ein Halbwertzeittest (i) für ausgewählte Verbindungen anschließen kann. HBV-core-Protein-Inhibitoren im Sinne der Erfin­ dung sind solche, die mindestens den weiter oben beschriebenen Halbwertszeit-Test (i) bestehen.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia), B) HBV-Polymerase-Inhibitoren und gegebenenfalls C) Immunmodulatoren.
Als HBV-Polymerase-Inhibitoren B im Sinne der Erfindung werden solche Stoffe bezeichnet, die im nachfolgend beschriebenen endogenen Polymerase-Assay, das von Ph. A. Furman et al. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 36 (No. 12), 2688 (1992) publiziert worden ist, zu einer Hemmung der Bildung eines HBV-DNA- Doppelstranges derart führen, dass sich maximal 50% der Aktivität des Nullwerts ergeben:
HBV-Virionen aus Kulturüberständen bauen in vitro Nucleosid-5'-triphosphate in den Plusstrang der HBV-DNA ein. Unter Verwendung von Agarosegel-Elektropho­ rese wird der Einbau von [α-32P]-Deoxynucleosid-5'-triphosphat in das virale 3.2-kb DNA-Produkt in An- und Abwesenheit einer Substanz mit potentiell HBV-Polyme­ rase-hemmenden Eigenschaften beobachtet. HBV-Virionen werden aus dem Zell­ kultur-Überstand von HepG2.2.15-Zellen durch Fällung mit Polyethylenglykol gewonnen und aufkonzentriert. 1 Volumenteil geklärter Zellkulturüberstand wird mit ¼ Volumenteil einer wässrigen Lösung enthaltend 50 Gew-% Polyethylenglykol 8000 und 0.6 M Kochsalz gemischt. Die Virionen werden durch Zentrifugieren bei 2,500 × g/15 Minuten sedimentiert. Die Sedimente werden in 2 ml Puffer enthaltend 0.05 M Tris-HCl (pH 7.5) resuspendiert und gegen den gleichen Puffer enthaltend 100 mM Kaliumchlorid dialysiert. Die Proben können bei -80°C eingefroren werden. Jeder Reaktionsansatz (100 µl) enthält mindestens 105 HBV-Virionen; 50 mM Tris- HCl (pH 7.5); 300 mM Kaliumchlorid; 50 mM Magnesiumchlorid; 0.1% ®Nonident P-40 (nichtionisches Detergens der Fa. Boehringer Mannheim); je 10 µM dATP, dGTP und dTTP; 10 µCi [32P]dCTP (3000 Ci/mmol; Endkonzentration 33 nM) und 1 µM des potentiellen Polymerase-Inhibitors in seiner triphosphorylierten Form. Die Proben werden bei 37°C eine Stunde lang inkubiert, und dann wird die Reaktion durch Zugabe von 50 mM EDTA gestoppt. Eine 10%-ige Gewichtsvolumen-SDS- Lösung (enthaltend 10 g SDS pro 90 ml Wasser) wird bis zu einer Endkonzentration von 1 Vol.-% (bezogen auf Gesamtvolumen) zugegeben, und Proteinase K wird bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben. Nach Inkubation bei 37°C für eine Stunde werden Proben mit demselben Volumen Phenol/Chloroform/Isoamyl­ alkohol (Volumen-Verhältnis 25 : 24 : 1) extrahiert, und aus der wässrigen Phase wird die DNA mit Ethanol gefällt. Das DNA-Pellet wird in 10 µl Gelpuffer (Lösung von 10.8 g Tris, 5.S g Borsäure und 0.75 g EDTA in 1 Liter Wasser (= TBE-Puffer)) resuspendiert und durch Elektrophorese in einem Agarosegel getrennt. Das Gel wird entweder getrocknet oder die darin enthaltenen Nukleinsäuren mittels Southern- Transfertechnik auf eine Membran übertragen. Danach wird die Menge des gebilde­ ten und markierten DNA-Doppelstranges im Verhältnis zur Negativkontrolle (= Endo-Pol-Reaktion ohne Substanz oder mit Kontrollsubstanz ohne Wirkung) bestimmt. Ein HBV-Polymerase-Inhibitor liegt dann vor, wenn maximal 50% der Aktivität der Negativkontrolle vorliegen.
Bevorzugte HBV-Polymerase-Inhibitoren B) umfassen beispielsweise
3TC = Lamivudin =
= 4-Amino-1-[(2R-cis)-2-(hydroxymethyl)-1.3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin-2(1H)-on, vgl. EP-PS 382 526 (= US-PS S 047 407) und WO 91/11186 (= US-PS 5 204 466);
Adefovir Dipivoxil =
9- {2-[[Bis[(Pivaloyloxy)-methoxy]-phosphinyl]-methoxy]-ethyl}-adenin, vgl. EP-PS 481 214 (= US-PS 5 663 1S9 und 5 792 7S6), US-PS 4 724 233 und 4 808 716;
BMS 200 475 =
[1S-(1.α,3.α,4.β)]-2-Amino-1.9-dihydro-9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methy­ len-cyclopentyl]-6H-purin-6-on, vgl. EP-PS 481 754 (= US-PS S 206 244 und 5 340 816), WO 98/09964 und 99/41275;
Abacavir =
(-)-(1S-cis)-4-[2-Amino-6-(cyclopropylamino)-9H-purin-9-yl]-2-cyclopenten-1- methanol, vgl. EP-PS 349 242 (= US-PS 5 049 671) und EP-PS 434 4S0 (= US-PS 5 034 394);
FTC =
(2R-cis)-4-Amino-5-fluor-1-[2-(hydroxymethyl)-1.3-oxathiolan-5-yl]-pyrimidin- 2(1H)-on, vgl. WO 92/14743 (= US-PS 5 204 466, 5 210 085, 5 539 116, 5 700 937, 5 728 575, 5 814 639, 5 827 727, 5 852 027, 5 892 025, 5 914 331, 5 914 400) und WO 92/18517;
β-L-FDDC =
5-(6-Amino-2-fluor-9H-purin-9-yl)-tetrahydro-2-furanmethanol, vgl. WO 94/27616 (= US-PS 5 627 160, 5 561 120, 5 631 239 und 5 830 881);
L-FMAU = 1-(2-Deoxy-2-fluor-β-L-arabinofuranosyl)-5-methyl-pyrimidin-2.4(1H, 3H)-dion, vgl. WO 99/05157, WO 99/05158 und US-PS 5 753 789.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia) und B) Lamivudin.
Andere bevorzugte HBV-antivirale Mittel B umfassen z. B. Phenylpropenamide der Formel
worin
R1 und R2 unabhängig voneinander C1-C4-Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlen­ stoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden,
R3-R12 unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, C1-C4-Alkyl, gegebenenfalls substituiertes C1-C4-Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluormethyl,
R13 Wasserstoff, C1-C4-Alkyl, C1-C7-Acyl oder Aralkyl und
X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes C1-C4-Alkyl
bedeuten,
und deren Salze.
Diese Phenylpropenamide und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus der WO 98/33501 bekannt, auf die hiermit zum Zwecke der Offenbarung Bezug genommen wird. AT-61 ist die Verbindung der obigen Formel, worin X Chlor, A 1-Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten. Eigene Untersuchungen haben gezeigt, dass AT-61 kein HBV-core-Protein-Inhibitor im Sinne dieser Erfindung ist (Test s. oben).
Bevorzugte Immunmodulatoren C) umfassen beispielsweise sämtliche Interferone wie α-, β- und γ-Interferone, insbesondere auch α-2a- und α-2b-Interferone, Interleu­ kine wie Interleukin-2, Polypeptide wie Thymosin-α-1 und Thymoctonan, Imidazo­ chinolinderivate wie ®Levamisole, Immunglobuline und therapeutische Vaccine.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Kombinationen von A) obigen Dihydropyrimidinen (I) bzw. (Ia), B) Lamivudin und gegebenbenfalls C) Interferon.
Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht- toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere erfindungsgemäße Kombinationen enthalten oder die aus einer erfindungsgemäßen Kombination bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.
Das Mengenverhältnis der Komponenten A, B und gegebenenfalls C der erfindungs­ gemäßen Kombinationen kann innerhalb weiter Grenzen schwanken; vorzugsweise beträgt es 5 bis 500 mg A/10 bis 1000 mg B, insbesondere 10 bis 200 mg A/20 bis 400 mg B.
Die gegebenenfalls mitzuverwendende Komponente C kann in Mengen von vorzugs­ weise 1 bis 10 Millionen, insbesondere 2 bis 7 Millionen IE. (internationale Einheiten), etwa dreimal wöchentlich über einen Zeitraum bis zu einem Jahr angewandt werden.
Die erfindungsgemäßen Kombinationen sollen in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise etwa 0,5 bis 95, Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfindungsgemäßen Kombinationen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen kann in üblicher Weise nach bekannten Methoden erfolgen, z. B. durch Mischen des Wirkstoffs oder der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen.
Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, die erfindungsgemäßen Kombinationen in Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise 1 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den Wirkstoff oder die Wirkstoffe vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 1 bis 30 mg/kg Körper­ gewicht. Es kann jedoch erforderlich sein, von den genannten Dosierungen ab­ zuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Objekts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt.
Die erfindungsgemäßen Kombinationen sind antiviral gegen Hepatitis-B-Viren (HBV) wirksam, indem sie eine außerordentlich starke Reduktion von intra- und/oder extrazellulärer HBV-DNA verursachen. Die erfindungsgemäßen Kombinationen sind somit zur Behandlung von virusinduzierten Erkrankungen, insbesondere von akut und chronisch persistenten Virusinfektionen des HBV geeignet. Eine chronische Viruserkrankung, hervorgerufen durch das HBV, kann zu unterschiedlich schweren Krankheitsbildern führen; bekanntermaßen führt die chronische Hepatitis-B-Virusin­ fektion in vielen Fällen zur Leberzirrhose und/oder zum hepatozellulären Karzinom.
Die Indikationsgebiete für die erfindungsgemäßen Kombinationen umfassen:
  • 1. die Behandlung von akuten und chronischen Virusinfektionen, die zu einer in­ fektiösen Hepatitis führen können, vorzugsweise die Behandlung von akuten und chronischen Hepatits-B-Virus-Infektionen;
  • 2. die Behandlung von akuten und chronischen HBV-Infektionen bei Koinfektion mit dem Hepatitis-Delta-Virus;
  • 3. die Behandlung von akuten und chronischen HBV-Infektionen bei Koinfektion mit anderen Viren, wie z. B. HIV oder HCV, und
  • 4. die prophylaktische/therapeutische Behandlung bei Transplantationen, wie z. B. Lebertransplantationen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher die oben definierten Kombinationen zur Bekämpfung von Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der oben definierten Kombinationen und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben definierten Kombinationen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe der oben beschriebenen Erkrankungen, vorzugsweise von Viruserkrankungen, insbesondere von Hepatitis B.
Zusammensetzung (mg/l) des aus ®seromed RPMI 1640 hergestellten 1 x-Mediums:
NaCl 6000
KCl 400
Na2HPO4 × 7 H2O 1512
MgSO4 × 7 H2O 100
Ca(NO3)2 × 4 H2O 100
D-Glucose 2000
Phenolrot 5
NaHCO3 2000
Phenolrot 5
NaHCO3 2000
L-Arginin 200
L-Asparagin 50
L-Asparaginsäure 20
L-Cystin 50
L-Glutamin 300
L-Glutaminsäure 20
Glycin 10
L-Histidin 15
L-Hydroxyprolin 20
L-Isoleucin 50
L-Leucin 50
L-Lysin × HCl 40
L-Methionin 15
L-Phenylalanin 15
L-Prolin 20
L-Serin 30
L-Threonin 20
L-Tryptophan 5
L-Tyrosin 20
L-Valin 20
Glutathion 1
Biotin 0,2
Vitamin B12 0,005
D-Ca-Pantothenat 0,25
Cholinchlorid 3
Folsäure 1
i-Inosit 35
Nicotinamid 1
p-Aminobenzoesäure 1
Pyridoxin × HCl 1
Riboflavin 0,2
Thiamin × HCl 1
Zusammensetzung (mg/l) des aus ©seromed Medium 199 mit Earle's Salzen hergestellten 1x-Mediums:
NaCl 6800
KCl 400
NaH2PO4 × H2O 140
MgSO4 × 7 H2O 200
CaCl2 200
D-Glucose 1000
Phenolrot 17
NaHCO3 2200
DL-Alanin 50
L-Arginin × HCl 70
DL-Asparaginsäure 60
L-Cystein × HCl 0,1
L-Cystin 20
L-Glutamin 100
DL-Glutaminsäure × H2O 150
AL=L<Glycin
L-Histidin × HCl 50
L-Hydroxyprolin 20
DL-Isoleucin 10
DL-Leucin 40
L-Lysin × HCl 120
DL-Methionin 70
DL-Phenylalanin 30
L-Prolin 50
DL-Serin 40
DL-Threonin 50
DL-Tryptophan 60
L-Tyrosin 20
DL-Valin 40
Glutathion 50
Natriumacetat 0,05
Fe(NO3)3 50
®Tween 80* 0,1
20
Adeninsulfat 10
Guanin × HCl 0,3
Hypoxanthin 0,3
Thymin 0,3
Uracil 0,3
Xanthin 0,3
ATP,Na2 1
AMP 2
Ascorbinsäure 0,05
Biotin 0,01
Calciferol 0,1
D-Ca-Pantothenat 0,01
Cholinchlorid 0,5
Folsäure 0,01
i-Inosit 0,05
Menadion 0,01
Nicotinsäure 0,025
Nicotinsäureamid 0,025
p-Aminobenzoesäure 0,05
Pyridoxal × HCl 0,025
Pyridoxin × HCl 0,025
Riboflavin 0,01
Thiamin × HCl 0,01
DL-α-Tocopherolphosphat-Na2 0,01
Vitamin A 0,1
Cholesterin 0,2
2-Desoxy-D-Ribose 0,5
D-Ribose 0,5
AL=L<* Marke der Atlas Chemie
Mediumzusammensetzung (mg/l) der aus Gibco 51091-015 hergestellten MEM-1x- Lösung
CaCl2 × 2 H2O 264
KCl 400
MgSO4 × 7 H2O 200
NaCl 6800
NaHCO3 2200
NaH2PO4 × 2 H2O 158
Phenolrot 10
L-Histidin × HCl × H2O 41,92
L-Isoleucin 52,46
L-Lysin × HCl 73,06
L-Phenylalanin 33,02
L-Threonin 47,64
L-Tryptophan 10,20
L-Tyrosin 36,22
L-Valin 46,86
D-Ca-Pantothenat 1,00
Cholinchlorid 1,00
Folsäure 1,00
Nicotinamid 1,00
Pyridoxal × HCl 1,00
Riboflavin 0,10
Thiamin × HCl 1,00
Beispiele HBV in Zellkultur
Die antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Kombinationen wurde in Anlehnung an die von M. A. Sells et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1005-1009 (1987) und B. E. Korba et al., Antiviral Research 19, 55-70 (1992) beschriebenen Methoden unter­ sucht.
Die Tests der kombinatorischen Prüfung der Prüfsubstanzen wurde mittels Schach­ brett-Titration durchgeführt.
Die antiviralen Tests wurden in 96 weil Mikrotiterplatten durchgeführt. Die erste vertikale Reihe der Platte erhielt nur HepG2.2.15-Zellen in Wachstumsmedium. Sie diente als Viruskontrolle.
Stammlösungen der Testverbindungen (50 mM) wurden zunächst in DMSO gelöst; weitere Verdünnungen wurden in Wachstumsmedium hergestellt. Die übrigen Näpfe enthielten die erfindungsgemäßen Kombinationen oder deren Einzelkomponenten in den Testkonzentrationen von z. B. 5 µM bis 0,01 µM, ausgehend von A2 bis H11 der 96-well Mikrotiterplatte.
Stammlösungen der zu testenden Substanzen wurden auf separaten 96-well Platten vorbereitet und anschließend auf die Testplatte mit HepG2.2.15-Zellen zusammen­ pipettiert. Damit waren Testkonzentrationen im Bereich von ca. 10-50 fach ober- und unterhalb der 04532 00070 552 001000280000000200012000285910442100040 0002010012259 00004 04413 IC-50 Konzentrationen abgedeckt.
Der Testansatz wurde 8 Tage bei 37° Celsius und 5% CO2 (v/v) inkubiert. Am Tag 4 wurde das Medium durch frisches inhibitorhaltiges Medium ersetzt.
Zytotoxizitätsbestimmung
Vor der Ernte der Überstände/Zell-Lysate zur Bestimmung des antiviralen Effektes wurden die HepG2.2.15-Zellen lichtmikroskopisch oder mittels biochemischer Nachweisverfahren (z. B. Alamar-Blue-Färbung oder Trypanblau-Färbung) auf zyto­ toxische Veränderungen untersucht.
Substanzinduzierte zytotoxische oder zytostatische Veränderungen der HepG2.2.15- Zellen wurden z. B. lichtmikroskopisch als Änderungen der Zellmorphologie ermit­ telt. Derartige Substanzinduzierte Veränderungen der HepG2.2.15-Zellen im Ver­ gleich zu unbehandelten Zelten wurden z. B. als Zellyse, Vakuolisierung oder verän­ derte Zellmorphologie sichtbar. 50% Zytotoxizität ("Tox.-50") bedeuten, dass 50% der Zellen eine der entsprechenden Zellkontrolle vergleichbare Morphologie aufwei­ sen.
Die Verträglichkeit einiger erfindungsgemäßer Kombinationen wurde zusätzlich auf anderen Wirtszellen, wie z. B. HeLa-Zellen, primären peripheren Blutzellen des Men­ schen oder transformierten Zellinien wie H-9 Zellen, ausgetestet.
Es konnten keine Zell-zytotoxischen Veränderungen im Test-Konzentrationsbereich festgestellt werden.
Bestimmung der antiviralen Wirkung
Anschließend wurden die Überstände/Zell-Lysate geerntet und mittels vermindertem Druck auf mit Nylonmembran bespannte 96-Napf-Dot-Blot-Kammern (entsprechend den Herstellerangaben) gesogen.
In Kürze: Nach Transfer der Überstände oder Gesamtzell-Lysate auf die Nylon- Membran der Blot-Apparatur (s. o.) wurden die darin enthaltenen Nukleinsäuren denaturiert (1.5 M NaCl/0.5 N NaOH), neutralisiert (3 M NaCl/0.5 M Tris Hcl, pH 7.5) und gewaschen (2 × SSC). Anschließend wurde die DNA durch Inkubation der Filter bei 120°C, 2-4 Stunden, an die Membran gebacken.
Hybridisierung der DNA
Der Nachweis der viralen DNA von den behandelten HepG2.2.15-Zellen auf den Nylonfiltern wurde in der Regel mit nichtradioaktiven, Digoxigenin-markierten Hepatitis = B-spezifischen DNA-Sonden durchgeführt, die jeweils nach Herstelleran­ gabe mit Digoxigenin markiert, gereinigt und zur Hybidisierung eingesetzt wurden.
Kurz: Die Prähybidisierung und Hybidisierung erfolgten in 6 × SSC, 1 × Blockie­ rungsreagenz, 0.1% N-Lauroylsarcosin, 0.02% SDS und 100 µg Sperma-DNA des Herings. Die Prähybridisierung erfolgte 30 Minuten bei 60°C, die spezifische Hybri­ disierung mit 20-40 ng/ml der digoxigenierten, denaturierten HBV-spezifischen DNA (14 Stunden, 60°C). Anschließend wurden die Filter gewaschen.
Nachweis der HBV-DNA durch Digoxigenin-Antikörper
Der immunologische Nachweis der Digoxigenin-markierten DNA erfolgte nach Her­ stellerangaben.
Kurz: Die Filter wurden gewaschen und in einem Blockierungsreagenz (nach Her­ stellerangabe) prähybridisiert. Anschließend wurde mit einem Anti-DIG-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt war, 30 Minuten hybridisiert. Nach einem Waschschritt wurde das Substrat der alkalischen Phosphatase, CSPD, zugefügt, 5 Minuten mit den Filtern inkubiert, anschließend in Plastikfolie eingepackt und wei­ tere 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Chemilumineszenz der Hepatitis-B-spezi­ fischen DNA-Signale wurde über eine Exposition der Filter mittels Biolumineszenz auf einem Röntgenfilm oder mit einem Lumi-Imager sichtbar gemacht (Inkubation je nach Signalstärke: ca. 2 Minuten bis ca. 2 Stunden) und der Grad der Schwärzung vermessen.
Die Hemmwerte wurden entsprechend den Cut-Off-Werten aus den internen Test­ kontrollen in %-Hemmwerte umgerechnet. Zur Analyse der synergistischen Wirk­ samkeit der Kombinationen wurden die Differenzwerte von errechneten und gemes­ senen Hemmwerten jeder Kombination ermittelt; vgl. Prichard et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37, 540-545 (1993).
Die Behandlung von HBV mit den erfindungsgemäßen Kombinationen wirkt antivi­ ral besser als die Einzelbehandlung; die Behandlung der Hepatits-B-Virus produzie­ renden HepG2.2.15-Zellen mit den erfindungsgemäßen Kombinationen führte zu einer stärkeren Reduktion der intrazellulären viralen DNA; die Kombinationsbe­ handlung ist synergistisch wirksam.

Claims (19)

1. Kombinationen
  • A) mindestens eines Dihydropyrimidins,
  • B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels und gegebenenfalls
  • C) mindestens eines Immunmodulators.
2. Kombinationen nach Anspruch 1, worin das Dihydropyrimidin A der Formel
bzw. deren isomerer Form
entspricht, worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Triazolyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Reste der Formeln
oder
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Alkoxy­ carbonyl und C1-C6-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann,
und die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch
-S-R6, -NR7R8, -CO-NR9R10, -SO2-CF3 oder -A-CH2-R11 substitu­ iert sind,
worin
R6 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R7 bis R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy­ substituiertes Phenyl, Hydroxy, C1-C6-Acyl oder C1-C6-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, C1-C6-Alkoxy­ carbonyl, Phenyl oder Hydroxy substituiertes Phenyl substitu­ iert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2-,
R11 Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, C1-C6-Alkyl und C1-C6- Alkoxy, substituiert ist,
bedeuten,
R2 einen Rest der Formeln -XR12 oder -NR13R14,
worin
X eine Einfachbindung oder Sauerstoff,
R12 Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkoxy­ carbonyl, einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C1-C8-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-, -CO-, -NH-, -N-(C1- C4-Alkyl)-,
-S- oder -SO2- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel
-NR15R16 substituiert ist,
worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Ben­ zyl oder C1-C6-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, C1-C6-Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten,
R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
oder
Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes C1-C6-Alkylthio, Trifluor­ methyl oder Pyridyl oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Halogen, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, C1-C6-Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring, C1-C6-Alkylthio oder C1-C6-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)a- NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoff­ atomen oder C1-C6-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch C1-C6-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, C1-C6-Alkyl oder C1-C6-Alkoxy substituiert sind und/oder C1-C6-Alkyl gegebenenfalls durch -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeu­ ten,
oder
R3 gegebenenfalls Methoxy-substituiertes Phenyl
oder
R2 und R3 gemeinsam einen Rest der Formel
R4 Wasserstoff, C1-C4-Alkyl, C2-C4-Alkenyl, Benzoyl oder Acyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und
R5 Pyridyl, Pyrimidyl oder Pyrazinyl, die jeweils bis zu 3-fach, gleich oder verschieden durch Halogen, Hydroxy, Cyano, Trifluormethyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkylthio, Carbalkoxy, C1-C6- Acyloxy, Amino, Nitro, Mono- oder Di-C1-C6-alkylamino substituiert sein können,
bedeuten,
sowie deren Salze.
3. Kombinationen nach Anspruch 1, worin das Dihydropyrimidin A der Formel
bzw. deren isomerer Form
entspricht, worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoff­ atomen oder einen Rest der Formeln
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Alkoxy­ carbonyl und C1-C6-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann,
und/oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der Formeln -S-R6, -NR7R8, -CO-NR9R10,
-SO2-CF3 und -A-CH2-R11 substituiert sind,
worin
R6 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R7 bis R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy­ substituiertes Phenyl, Hydroxy, C1-C6-Acyl oder C1-C6-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, C1-C6-Alkoxy­ carbonyl, Phenyl oder Hydroxy substituiertes Phenyl substitu­ iert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2-,
R11 Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder ver­ schieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, C1-C6-Alkyl und C1-C6- Alkoxy, substituiert ist,
bedeuten,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14,
worin
R12 Wasserstoff, C1-C6-Alkoxycarbonyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C1- C8-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-,
-CO-, -NH-, -N-(C1-C4-Alkyl)-, -S- und -SO3- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR15R16 substituiert ist,
worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Ben­ zyl oder C1-C6-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, C1-C6-Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
oder
Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes C1-C4-Alkylthio, Trifluor­ methyl oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, C1-C6-Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen hetero­ cyclischen Ring, C1-C6-Alkylthio oder C1-C6-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)a- NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder C1-C6-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch C1-C6-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, C1-C6-Alkyl oder C1- C6-Alkoxy substituiert sind und/oder C1-C6-Alkyl gegebenen­ falls durch -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeu­ ten,
R4 Wasserstoff, C1-C4-Alkyl, Acetyl oder Benzoyl,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten,
und deren Salze.
4. Kombinationen nach Anspruch 3, worin das Dihydropyrimidin A den For­ meln
und/oder
und/oder ihren isomeren Formen und/oder ihren Salzen entspricht.
5. Kombinationen nach Anspruch 3, worin die Dihydropyrimidine A der Formel
bzw. deren isomerer Form
entsprechen, worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoff­ atomen oder einen Rest der Formeln
bedeutet, wobei die oben aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Hydroxyl, C1-C6-Alkoxy, C1-C6-Alkoxy­ carbonyl und C1-C6-Alkyl, substituiert sind, wobei der Alkylrest seinerseits durch Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Halogen substituiert sein kann,
und/oder die aufgeführten Ringsysteme gegebenenfalls durch Gruppen der Formeln -S-R6, -NR7R8, -CO-NR9R10, -SO2-CF3 und -A-CH2-R11 substituiert sind,
worin
R6 gegebenenfalls Halogen-substituiertes Phenyl,
R7 bis R10 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Hydroxy­ substituiertes Phenyl, Hydroxy, C1-C6-Acyl oder C1-C6-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits durch Hydroxy, C1-C6-Alkoxy­ carbonyl, Phenyl oder Hydroxy substituiertes Phenyl substitu­ iert sein kann,
A einen Rest -O-, -S-, -SO- oder -SO2-,
R11 Phenyl, das gegebenenfalls ein- bis mehrfach, gleich oder ver­ schieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Nitro, Trifluormethyl, C1-C6-Alkyl und C1-C6- Alkoxy, substituiert ist,
bedeuten,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14,
worin
R Wasserstoff, C1-C6-Alkoxycarbonyl oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten C1- C8-Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls ein oder zwei gleiche oder verschiedene Heterokettenglieder aus der Gruppe -O-,
-CO-, -NH-, -N-(C1-C4-Alkyl)-, -S- und -SO2- enthält und der gegebenenfalls durch Halogen, Nitro, Cyano, Hydroxy, Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Heteroaryl oder eine Gruppe der Formel -NR15R16 substituiert ist,
worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Ben­ zyl oder C1-C6-Alkyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, C1-C6-Alkyl oder Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R3 Wasserstoff, Amino oder einen Rest der Formel
oder Formyl, Cyano, Hydroxy substituiertes C1-C4-Alkylthio, Trifluormethyl oder
einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Aryloxy mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, Azido, Cyano, Hydroxy, Carboxyl, C1-C6-Alkoxycarbonyl, einen 5- bis 7-gliedrigen hetero­ cyclischen Ring, C1-C6-Alkylthio oder C1-C6-Alkoxy (wobei der Alkylthio- bzw. Alkoxyrest seinerseits durch Azido, Amino oder Hydroxyl substituiert sein kann) und/oder durch die Gruppe -(CO)a- NR17R18 substituiert ist,
worin a Null oder 1 bedeutet,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Aryl, Aralkyl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder C1-C6-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch C1-C6-Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl substituiert sind, wobei Phenyl und Benzyl gegebenenfalls ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl, C1-C6-Alkyl oder C1- C6-Alkoxy substituiert sind und/oder C1-C6-Alkyl gegebenen­ falls durch -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist,
oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeu­ ten,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Halogen oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen
bedeuten,
und deren Salze.
6. Kombinationen nach Anspruch 3, worin
R1 Phenyl, Furyl, Thienyl, Pyridyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl, wobei diese Ringsysteme gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder ver­ schieden durch Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe Halogen, Trifluormethyl, Nitro,
-SO2-CF3, Methyl, Cyano, Trifluormethoxy, Carboxyl, Methoxy­ carbonyl oder Resten der Formeln -CO-NH-CH2-C(CH3)3, - CO-NH(CH2)2OH, -CO-NH-CH2-C6H5, -CO-NH-C6H5, - CO-NH-(pOH)-C6H4, -O-CH2-C6H5 oder -S-pCl-C6H4 substituiert sind,
R2 einen Rest der Formeln -OR12 oder -NR13R14 bedeutet,
worin
R12 Wasserstoff, C2-C4-Alkenyl oder C1-C4-Alkyl, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Pyridyl, Cyano, Phenoxy, Benzyl oder durch einen Rest der Formel -NR15R16 substituiert ist,
worin R15 und R16 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeuten,
R13 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl bedeuten,
R3 Wasserstoff oder einen Rest der Formel
oder
Formyl, Cyano, Trifluormethyl, Cyclopropyl oder C1-C4-Alkyl bedeutet, wobei der Alkylrest seinerseits gegebenenfalls durch Reste der Formeln -SO2CH3, -NH-CO-CH3, -NH-CO-CF3, Fluor, Chlor, C1-C3-Alkoxycarbonyl, Hydroxy und/oder durch die Gruppe -(CO)a-NR17R18 substituiert ist,
worin
a Null oder 1,
R17 und R18 unabhängig voneinander Wasserstoff, Phenyl, Benzyl oder C1-C4-Alkyl bedeuten, die gegebenenfalls durch C1-C3- Alkoxycarbonyl, Amino, Hydroxyl, Phenyl oder Benzyl sub­ stituiert sind, wobei unabhängig voneinander Phenyl und Ben­ zyl gegebenenfalls ein- oder zweifach, gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxy, C1-C3-Alkyl oder C1-C3-Alkoxy substituiert sind und C1-C3-Alkyl gegebenenfalls durch Reste der Formeln -NH-CO-CH3 oder -NH-CO-CF3 substituiert ist, Phenyl oder
R17 und R18 gemeinsam mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Morpholinyl-, Piperidinyl- oder Pyrrolidinylring bedeu­ ten,
R4 Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Acetyl,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Halogen oder C1-C4-Alkyl
bedeuten,
und deren Salze.
7. Kombinationen nach Anspruch 3, worin
R1 Phenyl oder Thienyl, die gegebenenfalls bis zu zweifach, gleich oder verschieden durch Fluor oder Chlor substituiert sind,
R2 Methoxy, Ethoxy oder n-Propoxy,
R3 Wasserstoff, Methyl oder Cyclopropyl,
R4 Wasserstoff,
D ein Sauerstoff oder Schwefelatom und
R5 Wasserstoff, Fluor oder Chlor
bedeuten,
und deren Salze.
8. Kombinationen
  • A) mindestens eines HBV-core-Protein-Inhibitors,
  • B) mindestens eines von A verschiedenen HBV-antiviralen Mittels und gegebenenfalls
  • C) mindestens eines Immunmodulators.
9. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 8, worin Komponente B ein HBV- Polymerase-Inhibitor ist.
10. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 8, worin Komponente B Lamivudin ist.
11. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 8, worin Komponente B aus den Ver­ bindungen der Formel
worin
R1 und R unabhängig voneinander C1-C4-Alkyl bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom, an dem sie stehen, einen Ring mit 5 bis 6 Ringatomen, die Kohlenstoff und/oder Sauerstoff umfassen, bilden,
R3-R12 unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, C1-C4-Alkyl, gegebe­ nenfalls substituiertes C1-C4-Alkoxy, Nitro, Cyano oder Trifluor­ methyl,
R13 Wasserstoff, C1-C4-Alkyl, C1-C7-Acyl oder Aralkyl und
X Halogen oder gegebenenfalls substituiertes C1-C4-Alkyl
bedeuten,
und deren Salzen ausgewählt ist.
12. Kombinationen nach Anspruch 11, worin
X Chlor, A 1-Piperidinyl und Y und Z jeweils Phenyl bedeuten.
13. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 12, worin der Immunmodulator C Interferone enthält.
14. Kombinationen von A) Dihydropyrimidin, B) Lamivudin und gegebenenfalls C) Interferon.
15. Verfahren zur Herstellung der Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass man die Komponenten A und B in geeigneter Weise kombiniert oder herrichtet.
16. Kombinationen nach Ansprüchen 1 bis 14 zur Bekämpfung von Erkrankun­ gen.
17. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Kombination gemäß Ansprüchen 1 bis 14 und gegebenenfalls weitere pharmazeutische Wirkstoffe.
18. Verwendung von Kombinationen der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Viruserkrankungen.
19. Verwendung von Kombinationen der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe von Hepatitis-B-Infek­ tionen.
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