DD295927A5 - Immobilisiertes immunologisch aktives reagens - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung stabilisierter immobilisierter immunologisch aktiver Verbindungen fuer Immunoassays beschrieben. Die nach dem "Kaschierprinzip" langzeitstabilisierten immunologisch aktiven Reagenzien werden vorzugsweise fuer Festphasen-Immuntechniken zum In-vitro-Nachweis von Antikoerpern oder Antigenen eingesetzt.{immunologisch aktive Verbindungen; langzeitstabilisierte Reagenzien; Festphasen-Immuntechnik; Antikoerper; Antigen; In-vitro-Nachweis; Immunoassay}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Immobilisierte Verbindungen haben in der Pharmazie, Biowissenschaft, Biotechnologie, Lebensmitteltechnik, Enzymologie,

Medizin, Immunologie ein breites Anwendungsgebiet, z. B. zur schnellen und einfachen Abtrennung von Reaktionsprodukten und nicht gewünschten Begleitstoffen,

Immobilisierte immunologisch aktive Verbindungen werden insbesondere für immundiagnostische Zwecke, vorzugsweise für Festphasen-Immuntechnik und In-vitro-Nachweis oder zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Reaktionspartners

eingesetzt.

Charakteristik dos bekannten Standes der Technik

Der Nachweis oder die Bestimmung von Antigenen, Haptenen oder Antikörpern erfolgt vorzugsweise mittels immunologischer Methoden, die auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion beruhen. Aufgrund der leichten Abtrennung der Reaktionsprodukte werden hierfür Festphasentechniken bevorzugt, bei denen ein Reaktionspartner an einen unlöslichen Träger gebunden ist

Das von K. J. CATT und C. W.TREGAR {Science 15 [1967] 1570) entwickelte Verfahren zur adsorptiven Bindung von Proteinen an polymere Kohlenwasserstoffe fand weite Verbreitung.

Die homogene Beschichtung des Trägers mit dem immunologischen Reaktionspartner ist eine Voraussetzung für sichere Resultatsermittlungen bei Festphasenimmunoassays, ganz besonders bei der Erfassung medizinisch bedeutsamer Substanzen. Es gibt Versuche (DD 236400, OS 2 337 095), durch Vorbeschichtung mit bestimmten hydrophoben Verbindungen eine homogenere Beschichtung mit dem Immunreaktanten zu erreichen. Ebenso ist versucht worden, durch Behandlung der Oberfläche des Kunststoffträgers mit organischen Lösungsmitteln oder Säuren bessere adsorptive Eigenschaften des Trägers zu erzielen (DE 2509895, DT 2509895,1.C.SHEKARCHI et al. J. Clin. Microbiol. 19 [1984] 89 u.a.)

Das an den einen polymeren Träger gebundene empfindliche, biologisch, immunologisch aktive Material unterliegt dauernden, insbesondere hydrophoben Wechselwirkungen mit dem Träger, partielle Strukturänderungen des immobilisierten Immunreaktanten und ein relativ schneller Verlust seiner immunologischen Aktivität sind die Folge.

Es ist bekannt, daß besonders an polymeren Kohlenwasserstoffen mit unpolarer Oberfläche wie Polystyren u. a, gebundene immunologisch aktive Moleküle, besonders Polypeptide und Proteine, durch hydrophobe Wechselwirkungen Konformationsänderungen unterliegen, wodurch nachfolgende Antigen-Antikörper-Reaktionen eingeschränkt oder unterbunden werden können, je nach Ausmaß der räumlichen Veränderungen. Darüber hinaus können sich eine Reihe von Antigenen, besonders niedermolekulare immunologisch aktive Stoffe wie Allergene, Peptide, bestimmte Haptene, aktive Amine, als Antigene wirkende Pharmaka u.a. nicht oder nur im unbefriedigenden Maße mit den üblichen Methoden an den festenTräger wie Polystyren binden.

Es wurde deshalb von verschiedenen Autoren versucht, Polystyren durch Einführung funktioneller Gruppen, z. B. Nitrogruppen, chemisch zu modifizieren (Übersicht: G.H. PARSONS: Methods in Enzymology 73 [1981], 224), um biologisch aktive Verbindungen, insbesondere auch Haptene, kovalent zu binden. Diese Verfahrensweise führte aber zu Verfärbungen der Reaktionsplatte und damit zu Störungen der Vertikal-Photometrie.

Die direkten Wechselwirkungen mit dem polymeren hydrophoben Kohlenwasserstoff und damit verbundene Aktivitätsverluste werden dabei nicht unterbunden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, eine feste Bindung einer ausreichenden Anzahl von Molekülen des zu immobilisierenden Immunreaktanten, eine Verminderung oder Unterbindung der Wechselwirkungen mit dem festen Träger, eine Beschichtung mit der immunologisch aktiven Verbindung unter standardisierten industriellen Bedingungen, einen möglichst langen Erhalt der immunologischen Aktivität, eine Verlängerung der Lagerzeit und eine Verminderung der Anfälligkeit gegenüber erhöhten Temperaturen und somit eine Langzeitstabilität des mit empfindlichen immunologisch aktiven Substanzen beschichteten Trägers zu erreichen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, eine Verbesserung der Stabilität immobilisierter immunologisch aktiver Substanzen und gleichzeitig eine Erhöhung der Bindungsfähigkeit für bestimmte immunologisch aktive Verbindungen an den festen Träger zu erreichen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die zu immobilisierende immunologisch aktive Verbindung nach dem Kaschierprinzip und unter Ausnutzung des Spacereffektes an den festen Träger gebunden wird. Dies hat den Vorteil, daß direkte Wechselwirkungen der empfindlichen immunologisch aktiven Substanz mit der festen Matrix vermieden werden. Die Unterbindung dieser Wechselwirkungen erfolgt durch Auftragung einer Unterschicht einer inerten, die Struktur der immunologisch aktiven Verbindung nicht nachteilig beeinflussenden Verbindung. Eine Deckschicht gleicher Art von Verbindung erhöht den stabilisierenden Effekt.

Durch Ausnutzung funktioneller Gruppen der Unterschicht läßt sich die immunologisch aktive Verbindung mit geeigneten Substanzen über chemisch-kovalente Bindungen fest binden, gleichzeitig wird die Bindungsfähigkeit, insbesondere für Verbindungen mit relativ niedrigem Molekulargewicht, erhöht bzw. in manchen Fällen überhaupt erst realisiert. Gleichzeitig wird eine homogene Bindung erzielt. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eignen sich alle Arten organischer und anorganischer polymerer Träger, die in der Medizin, Pharmazie, Tiermedizin, Biologie, Biochemie, Landwirtschaft usw. für immunologische Festphasentechniken eingesetzt werden.

Polystyren, deren Mischpolymerisate und Polyvinylchlorid werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung in Form von Mikrotitrationsplatten und anderen Reaktionsträgern oder Riegeln, die entsprechende Vertiefungen mit einem Fassungsvolumen von 10 bis etwa 1000 μΙ zur Ausführung der Immunreaktionen haben, besonders bevorzugt. Als Unterschicht lassen sich erfindungsgemäß Substanzen proteinogener Struktur einsetzen.

Hierfür eigenen sich insbesondere leicht zugängliche Polypeptide und Proteine wie tierische und menschliche Albumine (z. B. Rinderserumalbumin, Humanserumalbumin, Kaninchen-, Ziegen-, Schaf-, Pferd-, Schweineserumalbumin, Lactalbumin usw.), Globuline, Glykoproteine (wie Ovomucoid, Human-Choriogonadotropin) abgebaute Proteine, vorwiegend Abbauprodukte von Proteinen des Stütz- und Bindegewebes, Polyaminosäuren, bakterielle Proteine u.a.

Die Haftung der Unterschicht an den festen Träger kann unter Ausnutzung van der Waalsscher Kräfte, elektrostatischer oder anderer nicht-kovalenter Bindungskräfte oder im geeigneten Fall durch kovalente Bindung erfolgen.

Die Bindung an organische aliphatische und aromatische polymere Kohlenwasserstoffe wie Polyethylen, Polystyren u.a. wird in bekannter Weise durch Adsorption, vorzugsweise unter Ausnutzung hydrophober Wechselwirkungen des Trägers mit der proteinogenen Unterschicht erzielt. Eine Verstärkung der hydrophoben Wechselwirkungen und damit eine besondere dichte und festhaftende proteinogene Unterschicht läßt sich vorteilhaft durch vorherige Überführung der Polypeptide oder Proteine „random-coil"-Struktur erreichen.

Zur Erzielung einer randam-coil-Struktur eignen sich solche bekannten Verfahren wie Erhitzen, wobei vorzugsweise ein Bereich von 50 bis 80°C ausgewählt wird, Einwirkung von Ultraschall, Einwirkung ionisierendsr Strahlen, Einwirkung von Wasserstoffbrückenbindung-spaltenden chemischen Stoffen wie Harnstoff, Guanidin oder organische Lösungsmittel, pH-Wert-Änderungen.

Die Bindung des Immunreaktanten an die proteinogene inerte Unterschicht erfolgt kovalent mit bekannten Kupplungsreagenzien und herkömmlichen Kupplungsmethoden.

Beispielsweise kann der Immunreaktant mittels p-Phenylendiisothiocyanat, substituierter Di-Sulfonsäuren und anderer homobifunktioneller Reagenzien, mittels Dinitrodifluorbenzol, Acrolein-, Methacrolein, Methylgloxal, Glutaraldehyd oder anderer ungesättigter Aldehyde; oder mit bifunktionellen Succinimidestern (wie Ethylenglycolbissuccinimidylsuccinat), Dissuccinimidyl -Carbonsäureester, BislZ-succinimidooxycarbonyloxyethyDsulfone; mittels heterobifunktioneller

Succinimidestor von Maleinsäurederivaten, mittels Diazo-, AzId-, Säurechlorid-, Anhydrid-, Aktivestermethode, Carbodiimid-WOODWARD-Methode, Methode der aktivierten Amide, Carbodiimid-Methode unter Zusätzen wie N-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxysuccinimid u.a., Sulfenylthiocyanat-Methode u.a. an die Unterschicht gebunden werden.

Ferner ist es möglich, Haptene mit der Hemisuccinat-, Oxim-, Mischanhydrid-Methode, N-Hydroxysuccinimidester- oder Carbodiimidester-Methode an die Unterschicht zu binden.

Wird als Unterschicht ein inertes Glykoprotein wie Ovomucoid, Ovalbumin, Humancnoriogonadotropin oder Immunglobulin verwendet, ist die Kupplung nach der Perjodat-Methode möglich, indem die OH-Gruppen der Zuckerreste des Glykoproteins zu Aldehydgruppen oxidiert und dann mit dem Immunroaktanten umgesetzt werden.

Eine besonders hohe Stabilität der an die Unterschicht gebundenen immunologisch aktiven Substanz wird erzielt, wenn mit einem Medium, das Amonocarbonsäuren bzw. säureamidartig verknüpfte Aminocarbonsäuren sowie Polyhydroxyverbindungen enthält, „überschichtet" bzw. die Substanz damit eingeben wird.

Als Aminocarbonsäuren können natürliche Aminosäuren, einzeln oder als Gemisch oder als Proteinhydrolysat oder auch synthetische Aminosäuren oder Aminosäurederivate eingesetzt werden.

Als säureamidartig-verknüpfte Verbindungen bieten sich billig im Handel erhältliche Polypeptide, wie durch oxidativ-thermische Abbauvorgänge aus großtechnisch gewonnenen depolymerisierten Hydrolyseprodukten fibrillärer Skleroproteine des tierischen Bindegewebes kollagonen Ursprungs oder säure- und enzymatisch-hydrolytisch abgebaute Eiweiße, z. B. des Caseins,

Lactalbumins, Sphäroproteine, Eiweiße verschiedener Ölsaaten und Leguminosen, der Getreidesamen in einer Konzentration von 0,006g N/100ml bis 5g N/100ml Lösung vorzugsweise 0,05 bis 1gN/100ml Lösung an.

Es kommen auch billig erhältliche, leicht zugängliche Proteine von Tier und Mensch, wie Albumine, Globuline, Lactalbumine u.a.

oder Skleroproteine, wie Gelatine in Frage, die in einer Konzentration von 0,01 bis 20%, vorzugsweise 0,1 bis 2%, eingesetzt werden.

Als Polyhydroxyverbindungen werden insbesondere Monosaccharide und deren Derivate, z. B. Aldosen, Ketosen, Desoxyzucker, Zuckerester, Zuckersäuren, Zuckeralkohole, Zuckeranhydride, Anhydrozucker, ungesättigte Zucker, Aldonsäuren, Zuckercarbonylsäuren, Zuckeracetale, Zuckeräther, Cyclite und acetalartig-verknüpfte Polyhydroxycarbonylverbindungen, wie Oligosaccharide, vorzugsweise Disaccharide und Polysaccharide, wie Homopolysaccharide und Heterosaccharide verwendet.

Konzentrationen von 0,5 bis 30%, vorzugsweise von 5 bis 20%, haben sich als besonders günstig erwiesen.

Die Inkubationszeit des Mediums soll mindestens 20 s betragen und kann bis auf mehrere Tage ausgedehnt werden.

Es ist erfindungsgemäß weiterhin in bestimmten Fällen vorteilhaft, fü: die „Unterschicht" Proteinderivate oder Proteinkonjugate einzusetzen -wie Proteine, die an Aminogruppen, Carboxygruppen, Guanidino-, Imidazol-, Thioether-, Sulfhydryl- oder Hydroxygruppen mit:

a) geeigneten, mit den funktionellen Gruppen des Proteins reagierenden organischen Gruppen, vorzugsweise substituierte aromatische Verbindungen, heterocyclische Verbindungen, z.B. 2-Ket-3,4-imidazolin-2-tetrahydrothiophen-n-valeriansäure u.a., die antigene Eigenschaften aufweisen oder mit anderen Haptenen oder künstlichen Antigenen

b) Peptiden (homodet oder heterodetverknüpft), Peptidhormonen, Peptidantibiotika, Peptidtoxinen, Peptidalkaloiden, Peptoiden (Nucleo-, Phosphos-, Lipo-, Glyko-, Chromopeptide), Depsipeptiden bzw. proteinogenen Konjugaten, z. B. peptidartig verbundenes 2-Ket-3,4-imidazolin-2-tetra-hydrothiophen-n-valeryl-lysin,

c) Proteinen, insbesondere Immunglobulinen; Enzymen,

d) Vitaminen oder Vitaminderivaten

e) Lectinen

f) Polysacchariden

g) Nucleinsäuren, Nucleotiden

h) Zellen, Zellbestandteile, Bakterien oder Viren oder deren Bestandteile substituiert bzw. kondensiert wurden.

Dieses bietet den Vorteil, daß nachfolgend die Bindung des im Test eingesetzten Immunreaktanten über Protein-Rezeptor-Wechselwirkungen erfolgt, wodurch weiter Aktivitätsverluste des Reaktanten, die sonst bei chemischen Reaktionen unumgänglich auftreten, vermieden werden.

Die Herstellung der als Unterschicht verwendeten Proteinderivate und Proteinkondensaten erfolgt in bekannter Weise mit herkömmlichen Kupplungsmethoden und Reaktionen, wie mittels Säurechlorid-, Anhydrid-, Aktivester-, Azid-, Diazo-, Carbodiimid-Methode oder anderen bekannten elektrophilen oder nucliophilen Substitutionsreaktionen („Organikum", organisch-chemisches Grundpraktikum, Berlin 1985).

Nach Bindung des Immunreaktanten durch Protein-Rezeptur-Wechselwirkungen erfolgt erfindungsgemäß, wie bereits beschrieben, das „In-Kontakt-Bringen" mit dem Überschichtungs-/EinbettungsmQdium.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Jede Vertiefung einer Polystyren-Mikrotitrationsplatte (F-Form) wird mit 200 μΙ einer Lösung Rinderserumalbumins (100 ng/ml) in Carbonatpuffer (0,1 mol/l; pH9,5), die auf 7O⁰C erhitzt wurde, beschickt. Es wird 2 h bei 37⁰C stehengelassen, abgesaugt oder ausgekippt und zweimal mit Wasser gewaschen.

Die feuchten oder getrockneten Platten werden mit einer Lösung von Methylglyoxal (1,0%) in Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 5,8) 4 h bei 23 ± 5⁰C inkubiert und anschließend mit Phosphatpuffer gewaschen.

Anschließend werden 100μΙ einer Immunglobulin-Lösung (5pg anti-HBe-lgG/ml) in Phosphatpuffer (pH7,6) pipettiert und 4h inkubiert. Es wird mit Phosphatpuffer (0,01 mol/l), der Natriumchlorid (0,13 mol/l) enthält, zweimal gewaschen.

In jede Vertiefung der Platte werden 200 μΙ einer sterilfiltrierten Phosphat-Natriumchlorid-Lösung, die Pferdeserumalbumin (0,0003mol/l) und alpha-D-Glucopyranosido-ß-D-fructofuranosid (0,50mol/l) enthält, pipettiert.

Nach 2 h Inkubation bei 23 ± 5⁰C wird abgesaugt, getrocknet und in wasserdampfdichter plastbeschichteter Aluminiumfolie eingeschweißt und bei 37⁰C gelagert.

Zur Messung der immunologischen Aktivität wird der P/N-Quotient ermittelt, der sich als Quotient aus der Extinktion der Positiv-Kontrolle und der Extinktion der Negativ-Kontrolle errechnet. Hierfür wird ein Teil der Mikrotitrationsplatte mit einem HBe-Antigen enthaltenen Serum (Positiv-Kontrolle) (je Vertiefung 100μΙ) und der andere Teil mit der Negativ-Kontrolle (Serum, das kein HBe-Antigen enthält) beschickt. Es wird 2h bei 37⁰C inkubiert, wie üblich mit Phosphat-Natriumchlorid-Puffer gewaschen, anschließend mit anti-HBe-lgG-Peroxidase-Knnjugat (100μΙ je Vertiefung) 2 h bei 37°C inkubiert und erneut gewaschen.

In jede Vertiefung werden 100μΙ Phosphat/Citratpuffer pH 5,0, der 9mmolo-Phenylendiamin und 7mmol Wasserstoffperoxid enthält, pipettiert. Nach 30min Inkubation bei 23⁰C wird mit 100 μΙ Schwefelsäure (1 mol/l) gestoppt und bei 492 nm die Extinktion ausgewertet. Der P/N-Quotient beträgt nach Lagerung bei 37⁰C: 10. Woche 12,5; 20. Woche 11,8 und vor der Lagerung 12,9.

Zum Vergleich wird eine Polystyren-Mikrotitrationsplatte direkt mit anti-HBe-lmmunglobulin in Carbonatpuffer beschichtet, 4h bei 23 ± 5°C inkubiert, abgesaugt, mit Phosphatpuffer gewaschen, getrocknet und in plastbeschichteter Aluminiumfolie eingeschweißt.

Wie beschrieben, wird vor und nach Lagerung bei 37 ⁰C die immunologische Aktivität gemessen und der P/N-Quotient ermittelt.

P/N-Quotient: vor Lagerung 10,2; 10. Woche nach Lagerung: 1,3

Beispiel 2

A. Jede Vertiefung einer EIA-Reaktionsplatte wird mit 200 μΙ einer Lösung Ovalbumins, die einen Stickstoffgehalt von

1 mg/100 ml aufweist und zusätzlich 6mol/l Harnstoff enthält, versetzt und bei 23⁰C aufbewahrt. Nach 4 h wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und 4 h bei 37°C getrocknet.

Jede Vertiefung der Platte wird mit 100μΙ einer Lösung von i-Ethyl-S-fö-N-N-dimethylaminopropyllcarbodiimid · HCI (0,05 mol/l) beschickt. Nach 1 h wird mit Wasser gewaschen. In jede Vertiefung werden 100μΙ gereinigten Röteln-Virus-Antigens (HA-Titer 1:8) pipettiert. Nach einer Reaktionszeit von 2h (37⁰C) wird gewaschen. Jede Vertiefung wird mit 200μΙ einer Lösung, die Albumin aus dem Serum vom Rind (5,0g/l) und 0,50 mo! alpha-D-Gluco-pyranosido-beta-D-fructofuranosid enthält, gefüllt. Nach 3h wird abgesaugt, getrocknet, in wasserdampfdichter Folie eingeschweißt und gelagert.

B. Jede Vertiefung einer EIA-Reaktionsplatte wird mit 100 μΙ gereinigten Röteln-Virus-Antigens (HA-Titer 1:8) beschickt. Nach einer Reaktionszeit von 2 h (37⁰C) wird gewaschen. Die Platten werden getrocknet, in wasserdampfdichter Folie eingeschweißt und gelagert.

C. Die immunologische Aktivität wird im Enzymimmunoassay bestimmt.

Hierzu werden die mit Phosphat/Natriumchlorid/Tween-Puffer gewaschenen Vertiefungen der Platte mit 100μΙ eines Serums, das mit einer Pufferlösung (0,01 M Phosphat/0,13 M Natriumchlorid/10% Schafserum, 0,05%Tween 20, pH7,2) im Verhältnis 1:200 verdünnt ist und IgG-Antikörper gegen Röteln-Virus enthält, beschickt und 2h bei 37⁰C inkubiert. Nach Waschen werden je Vertiefung ΙΟΟμΙ eines Phosphatase-markierten anti-human-Fc-Antikörpers (1 μΙ/ml) pipettiert. Nach 45min Inkubation bei 37⁰C und Stoppen mit 100μΙ Natriumhydroxidlösung (2mol/l) wird durch Vertikalphotometrie bei 405nm die festphasengebundene enzymatische Aktivität bestimmt.

Nach 10 Tagen Lagerung bei 37⁰C wurden bei A 93% und bei B18%, nach 30Tagen Lagerung bei 37°C bei A 89% und bei B 0% der nach der Trocknung erhaltenen immunologischen Aktivität wiedergefunden.

Beispiel 3

A. Die Oberfläche jeder Vertiefung der EIA-Reaktionsplatte (F-Form) wird mit Rinderserumalbumin beschichtet, wie im Beispiel 1 beschrieben.

Die feuchten oder getrockneten Platten werden mit einer Lösung von Glutaraldehyd (5 mg/ml) in Phosphatpuffer (0,1 mol/l, pH 6,8) 2 h bei 23°C ± 5 K inkubiert und anschließend mit Phosphatpuffer gewaschen.

In jede Vertiefung der Platte werden 200 μΙ einer Lösung Toxoplasma-Lysat-Antigens (25 μρ/ΓηΙ), das auf bekannte Art und Weise nach WP G 01 N/2307405 hergestellt wurde, pipettiert und 2 h bei 37⁰C und 1 h bei 2 bis 8°C inkubiert. Nach Waschen wird jede Vertiefung mit 250 μΙ einer Lösung, die partiell abgebaute Gelatine („Gelafusal"-Infusionslösung, 1,5mg N/ml) und 4-(beta-D-Galactopyranosido)-D-glucopyranose (0,6mol/l) enthält, beschickt.

Nach 2 h (23⁰C) wird abgesaugt, getrocknet, eingeschweißt und gelagert.

B. Jede Vertiefung der EIA-Reaktionsplatte wird mit 200μΙ Toxoplasma-Lysat-Antigen-Lösung (25pg/ml) beschickt. Nach Inkubation über 16h bei 2 bis 8⁰C wird abgesaugt, gewaschen und jede Vertiefung wird mit 250μΙ einer Lösung, die analog „Gelafusal"-Lösung und 4-/beta-D-Galactopyranosido)-D-glucopyranose enlhält, gefüllt. Nach 2h (23°C) wird abgesaugt, getrocknet und in wasserdampfdichter Verpackung eingeschweißt und gelagert.

C. Die Messung der immunologischen Aktivität erfolgt, wie im Beispiel 2 C beschrieben, wobei anstelle des Röteln-Serums ein Anti-Toxoplas:na-Serum verwendet wird, das 0,2 IE Antikörper gegen Toxoplasmen enthält.

Nach 20 Tagon Lagerung bei 37°C wurden bei A 86% und bei B 51 % der nach der Trocknung erhaltenen immunologischen Aktivität wiedergefunden.

Beispiel 4

A. Wie im Beispiel 1 beschrieben, wird die Oberfläche der Vertiefungen von EIA-Reaktionsplatte mit Serum vom Rind beschichtet und anschließend mit Wasser gewaschen. Jede Vertiefung der Platte wird mit 100 μΙ einer wäßrigen Lösung von 1-Ethyl-3-(3-N-N-dimethylaminopropyl)carbodiimid · HCI (2mg/ml) beschickt. Nach 2 Stunden wird mit Wasser gewaschen, in jede Vertiefung werden 100μΙ eines Pollenextraktes (500 NOON) der Gräser Phleum pratense, Poa pratensis, Lolium perenne pipettiert. Nach einer Reaktionszeit von 1 h (37⁰C) wird gewaschen. Jede Vertiefung wird mit 200 μΙ einer Lösung, die Rinderserumalbumin (0,1 mmol/l) und 0,50 mol alpha-D-Gluco-pyranosido-beta-D-fructo-furanosid enthält, gefüllt. Nach 2 h wird abgesaugt, getrocknet, in wasserdampfdichter Folie eingeschweißt und gelagert.

B. EIA-Reaktionsplatten werden in bekannter Weise mit dem 3-Gräserpollenextrakt (0,1 M Carbonatpuffer pH 9,6; 16h, 20°C) beschichtet. Nach Waschen wird analog A mit einer Lösung Albumins und alpha-Glucopyranosido-beta-D-fructo-furanosid überschichtet, getrocknet, eingeschweißt, gelagert. ·

C. Zur Ermittlung der immunologischen Aktivität werden die mit Allergen beschichteten Platten je Vertiefung mit ΙΟΟμΙ eines Serums, das mit 100 Teilen Phosphat (0,01 MJ-Natriumchlorid (O,15M)-Puffer (pH7,2) verdünnt ist und spezifische IgE-

Antikörper gegen Gräserpollenallergene enthält, beschickt. Nach 2 h (23⁰C) wird abgesaugt und gewaschen. Nach Zugabe eines monokionalen Maus-anti-lgE-Antikörpers (1 ;600 verdünnt in phosphatgepufferter Natriumchlorid-Lösung (0,15 mol/l), der Rinderserumalbumin (20 mg/ml) zugesetzt wurde); wird 2 h (23⁰C) inkubiort und abgesaugt.

Nach Reaktion (2 h, 23⁰C) eines peroxidasemarkierten anti-Maus-Antikörpers (Ziege) (0,6pg/ml) (1 ΟΟμΙ je Vertiefung) wird die festphasengebundene Enzymaktivität durch Umsatz mit o-Phenylondiamin/Wasserstoffperoxid-Reagens, wie im Beispiel 1 beschrieben, ermittelt.

Nach demTrocknen wurde beiA:E = 1,542beiB:E = 1,040 und nach Lagerung über 30 Tage bei 23 ± 5°CwurdebeiA:E = 1,420 und bei B:E = 0,803 ermittelt.

C)

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten immunologischen Reagens, dadurch
gekennzeichnet, daß eine immunologisch aktive Substanz an eine, einen Festphasenträger
überziehende hydrophile Schicht gebunden und anschließend mit einem Medium gleicher Art
überschichtet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die den Träger überziehende Schicht
proteinogener Natur ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Proteinderivate bzw.
Proteinkonjugate als den Träger überziehende Schicht verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß wasserlösliche Polypeptide oder Proteine mit „random-coil "-Struktur eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologisch aktive Substanz mit bekannten Methoden kovalent an die den Träger überziehende Schicht gebunden wird oder im Falle der Verwendung von Proteinderivaten bzw. Proteinkonjugaten als Träger-überziehende
Schicht durch Protein-Rezeptur-Wechselwirkungen an die den Träger überziehende Schicht
gebunden wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zum Überschichten verwendete
Medium Stickstoffverbindungen und Polyhydroxyverbindungen enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffverbindungen
Aminocarbonsäuren oder nieder- oder höhermolekulare säureamidartig verknüpfte
Aminocarbonsäuren darstellen.

8. Verfahren nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyhydroxyverbindung ein Polyalkohol, ein Polyhydroxyaldehyd, ein Polyhydroxyketon, ein Derivat der
Polyhydroxycarbonylverbindung, eine acetalartig verknüpfte Polyhydroxycarbonylverbindung ist.

9. Verwendung des nach Anspruch 1 hergestellten immunologischen Reagens, dadurch
gekennzeichnet, daß es zum qualitativen Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von
Antigenen, wie Haptene, Viren, Bakterien, Pharmaka, Proteine, Allergene sowie von Antikörpern
gegen die genannten Antigene und anderer biologisch aktiven Verbindungen, und daß es
außerdem zur Reinigung und Isolierung korrespondierender Reaktionspartner, die mit der
gebundenen immunologisch aktiven Substanz spezifische Wechselwirkungen eingehen, eingesetzt wird.