DE3738721C2 - Immobilisierte Antikörper - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft regio-spezifische Konjugatbildung
von oligosaccharidhaltigen Antikörpern vermittels
oxidativer Modifizierung der Carbohydrat-Region der
Antikörper.
Die Fixierung biologisch aktiver Substanzen an Trägern
gehört zu den Standardverfahren in Forschung und Technik
der Biochemie. Dabei sind - in Abhängigkeit von der
chemischen Natur der zu fixierenden Substanzen und dem
Zweck der Anbindung - verschiedene Methoden entwickelt
worden (vgl. z. B. K. Buchholz "Characterization of
Immobilized Biocatalysts", Dechema Monographs, Volume 84,
No. 1724-1731, Verlag Chemie 1979).
Von großer praktischer Bedeutung als Trägermaterialien
waren von Anfang an Polysaccharide wie Cellulose, Stärke,
Dextran, die gewöhnlich zur Aktivierung chemisch
modifiziert werden. Zahlreiche Modifizierungsmethoden sind
vorgeschlagen worden, darunter auch die Aktivierung von
Stärke durch Oxidation mit Periodat [vgl. L. Goldstein, M.
Pecht, S. Blumberg, D. Atlas, Y. Levin, Biochemistry 9
(1979) 2322] unter Bildung von Formylgruppen unter
Spaltung des Hemiacetal-Rings.
Die Kopplung über die Kohlehydratanteile von Zellmembranen
wurde z. B. bei roten Blutkörperchen durch Oxidation mit
Periodat erreicht. Die so gebildeten reaktiven
Aldehydgruppen kuppeln mit den Seitenketten-Aminogruppen
von Proteinen. [Vgl. C.I. Sanderson, D.V. Wilson,
Immunochemistry 1971 (8) 163] Periodat-Oxidation von
Antikörpern wurde auch zur Konjugation von Antikörpern mit
Enzym-Markern benutzt (vgl. A.G. Gaivoronskaya et al.
Chem. Abstr. 95, 130 787j). Ähnlich werden in der EP-A
0 175 617 aus Antikörpern und therapeutischen Wirkstoffen
gebildete Konjugate vorgeschlagen, die gegen ein Target-
Antigen gerichtet sind.
Die US-A 4 671 958 beinhaltet ein Verfahren zur kovalenten
Anbindung von "Linker"-Gruppen an spezifische Stellen von
Antikörper-Molekülen die gegen beliebige Ziel-Antigene
eingesetzt werden können.
Die EP-A 0 088 695 beschreibt mehrere Methoden zur
kovalenten Bindung von löslichen oder unlöslichen
Konjugat-Partnern, wie chemischen Stoffen, Trägern u.ä. an
Antikörper. Die gebildeten Konjugate sind interessant im
Hinblick auf Affinitäts-Trenn- und Reinigungsverfahren,
sowie für diagnostische und therapeutische Anwendungen.
Die Anbindung kann u. a. über den Kohlehydrat-Anteil der
Antikörper erfolgen. Beispielsweise wird für Immunoassays
monoklonales IgM mit Galactose-Oxidase und Katalase
oxidiert und dann mit Phenylhydrazin-Glycyl-glycyl
arginyl-7-amino-4-methyl-cumarin kondensiert. [Vgl. auch
J.D. Rodwell et al. Proc. Natl. Acad. sci. USA. 83, 2632-
36 (1986)/Immunology].
Auch M.M.Chua et al. [Biochem. Biophys. Acta. 800 (3) 291
(1984)) erreichen Anbindung von Immunoglobulin an
liposomale Membrane durch milde Oxidation (mit Periodat
oder Galactose-Oxidase) von Kohlehydrat-Gruppen in der
konstanten Region der schweren Kette des Immunoglobulins,
zu Aldehydfunktionen, die dann mit Hydrazidgruppen
reagieren können, die an der Membranoberfläche der
Liposomen fixiert sind.
Von D.J. O′Shannessy et al. wird ebenfalls die spezifische
Konjugation sowohl polyclonaler als monoclonaler
Antikörper vermittels ihrer Kohlehydrat-Bereiche
vorgeschlagen, wobei zunächst durch milde Oxidation
Aldehydgruppen gebildet und diese mit Hydrazin-Derivaten
des Biotins, geeigneter Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme
in stabile Antikörper-Konjugate überführt werden können,
welche die volle imunologische Aktivität bewahrt haben.
Auch die Möglichkeit der Fixierung an Hydrazin
modifizierte feste Träger wird erwähnt. Als Träger für
Immunaffinitätschromatographie wird z. B. (käufliches)
Agarose-Adipinsäurehydrazid angewendet. [Vgl. J. Appl.
Biochem. 7, 347-355 (1985)]. Im Weiteren bedienen sich
O′Shannessy and W.L. Hoffmann der schwach
säurekatalysierten Kondensation von oxidativ gebildeten
Aldehydgruppen an den Oligosaccharid-Seitenketten von
Glykoproteinen mit Hydrazin-funktionalisierter Agarose,
die durch Umsetzung von käuflicher, aktivierte
Estergruppen-enthaltender Agarose mit Hydrazinhydrat
hergestellt worden war. [Vgl. Biological Chemistry Hoppe-
Seyler Vol. 368 (7) 767, 768 (1987)].
Die Anwendung von polymergebundenen Antikörpern und
Antigenen zum Nachweis der Anwesenheit spezifischer
Substanzen ist zum vielbenutzten biochemisch-analytischen
Werkzeug geworden. (Vgl. Encyclopedia of Polymer Science
und Technology, Vol. 2, J. Wiley 1985, pp. 55-59)
Hervorzuheben ist die Verwendung zum Nachweis spezieller
Hormone, Blutbestandteile, normaler und anormaler Zell-
Typen, Krankheitserregern bis hin zu Molekülen, die
indikativ sind für das Vorliegen maligner Tumore.
Darüber hinaus finden monoklonale Antikörper auch
Anwendung in der Therapie. So besteht z. B. eine Chance,
lethalwirksame Agentien z. B. Wirkstoffe oder Radioisotope
an krebsspezifische Antikörper anzubinden mit dem Ziel,
daß dieser Komplex sich seine Target-Zelle aussucht und
daran bindet und diese schließlich zerstört ohne die
Umgebung nachhaltig zu schädigen.
Beim Umgang mit Antikörpern muß davon ausgegangen werden,
daß diese sowohl hinsichtlich des pH-Werts als auch
hinsichtlich der Ionenstärke des sie umgebenden Mediums
begrenzte Stabilität zeigen. Verständlicherweise ist auch
eine chemische Modifikation von Antikörpern zum Zweck der
kovalenten Fixierung beispielsweise an Trägermaterialien
nicht unproblematisch, da zumindest die Bindungskapazität
für das Antigen nicht beeinträchtigt werden darf. Nicht zu
Unrecht wird darauf hingewiesen, daß konventionelle
Methoden der Immobilisierung von Antikörpern auf festen
Trägern mittels Bromcyan, 1,1-Carbonyldiimidazol,
Periodatoxidation sowie mittels der Epoxidchemie
potentiell zur Bindung über nukleophil aktive Gruppen wie
z. B. Amino-, Thio- oder Hydroxy-Gruppen, nahe der Antigen-
Binding-Site führen und damit das Bindevermögen
beeinträchtigen können. [Vgl. K. Yim, Biological
Chemistry, Hoppe-Seyler Vol. 386 (7) 785 (1987)]. In der
Literatur wird zu Recht betont, daß die Zusammensetzung
des polymeren Trägers über dessen Eigenschaften und
Eignung als Träger entscheidet (K. Buchholz Ed., in
Characterization of Immobilized Biocatalysts loc. cit. S.
64). Den Vorschlägen in der Literatur zu Folge herrscht
eine außerordentlich reichhaltige Auswahl an potentiellen
Trägermaterialien, die sowohl aus im wesentlichen
anorganischem Material, modifizierten Naturstoffen oder
synthetischen organischen Polymeren bestehen können. Bei
Yim (loc.cit) findet die Bindung der Antikörper durch
kovalente Bindung mittels Thiosemicarbazid an Silikagel
statt.
Angesichts der Rolle, die trägergebundene Antikörper in
Biochemie und Medizin bereits spielen, bestand Bedarf an
optimierten Trägersystemen auf Basis polymerer Träger,
wobei einerseits die Wirksamkeit der trägergebundenen
Antikörper so wenig wie möglich beeinträchtigt,
andererseits das Trägersystem in Bezug auf Stabilität,
Anwendungsbreite und Effizienz optimiert sein sollte.
Es wurde gefunden, daß die Forderungen der Technik durch
die erfindungsgemäße Immobilisierung an spezifische
polymere Träger in besonderem Maße erfüllt werden.
Die Erfindung betrifft immobilisierte, vermittels ihrer
modifizierten Kohlehydrat-Region kovalent an ein Matrix-
Polymer gebundene Antikörper, wobei die Bindung des
Antikörpers durch die Kondensation zwischen mindestens
einer Aldehydgruppe der oxidierten Kohlehydratregion und
mindestens einer Epoxyfunktion eines reaktionsfähige
epoxygruppentragenden Matrixpolymerisats (MP) mittels
eines bifunktionellen Reagenzes (BR), das an der einen
Endposition einer mindestens dreigliedrigen,
abstandhaltenden Einheit eine zur Kondensation mit der
Aldehydgruppe befähigte Aminogruppe und an der anderen
Endposition eine kovalent mit der Epoxyfunktion
reagierende Gruppe trägt, bewirkt wird.
Insbesondere handelt es sich bei dem Matrixpolymerisat
(MP) um ein vernetztes Copolymerisat aus Acrylamid bzw.
Methacrylamid und Glycidylacrylat bzw. -methacrylat, das
vorzugsweise aus perlförmigen Partikeln besteht. Derartige
Matrixpolymerisate werden in der DE-C 27 22 751 bzw. US-A
4 190 713 sowie der US-A 4 511 694 beschrieben. Die Perlen
besitzen in der Regel einen Durchmesser von 5-1000 µm,
insbesondere 30-1000 µm und weisen einen inneren
Hohlraum (Hohlperlen) auf. Als Anhalt für den Gehalt an
Glycidylgruppen im Matrixpolymerisat MP, die zur Reaktion
gebracht werden können, sei ein Wert von 0,8-2,5 p Mol
pro mg trockenes Trägermaterial genannt. Weitere Kenndaten
für ein handelsübliches Matrixpolymerisat (EUPERGIT C der
Röhm GmbH) das für Matrixpolymerisate MP des angegebenen
Typs repräsentativ ist, lassen sich der folgenden Tabelle
entnehmen.
Kenndaten | ||
Dimension | ||
Mittlere Korngröße:|140-180 µm | ||
Porendurchmesser: | 40 nm | |
Ausschlußgrenze = MLIM: | 2 · 10⁵ Daltons | |
Bindungsaktive Oberfläche: | 180 m²/g (trocken) | |
Epoxidgehalt: | 800-1000 mmol/g (trocken) | |
Wasseraufnahme: | 2,3 ml/g (trocken) | |
Dichte = d₄²⁰: | 1,20 | |
Schüttdichte: | 0,34 g/ml | |
Bindungskapazität: (bei üblichen Bedingungen) @ | Humanalbumin: | 48 mg/g (feucht) |
Human IgG: | 34 mg/g (feucht) | |
Quellverhalten gegenüber Wasser: | 1 : 1,4 | |
1 ml (trocken) ergibt 1,4 ml (feucht) | ||
Löslichkeit (in Wasser, Puffern und organischen Lösungsmitteln): | unlöslich | |
Druckstabilität: | 300 bar |
Unter dem Elektronenmikroskop erkennt man die makroporöse
Struktur der Perlen mit Kanälen und Hohlräumen, die einen
Durchmesser von 0,1-2,5 m (1000-25000 Å) besitzen, so
daß Enzym- bzw. Substratmoleküle mit einer Größe von
10-100 A das gesamte Innere der makroporösen Matrix erreichen
können.
Grundsätzlich sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung
alle Antikörper geeignet, die wie bekannt, einen Gehalt an
Kohlehydratgrupppen aufweisen und, die der chemischen
Modifikation und anschließenden Fixierung zugänglich sind.
Als Anhaltspunkt kann von einem Gehalt von ca. 3%
Kohlehydratanteil bei den Antikörpern ausgegangen werden.
Im Mittelpunkt des Interesses stehen monoklonale
Antikörper. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen
Antikörpern sind hinreichend bekannt. [Vgl. Kirk-Othmer,
Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd. Ed. Vol. 23,
J.Wiley (1983), pp. 637 bis 643; D. Baron, U. Hartlaub,
Humane Molekulare Antikörper, Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, New York 1987].
Dabei kann im einzelnen wie folgt vorgegangen werden:
Die beispielsweise durch positive Reinigungsverfahren wie
Affinitätschromatographie oder durch negative
Reinigungsverfahren (Eliminierung des Überschusses an
anderen Zellen) wie z. B. Panning, Komplement-Lyse und E-
Rosettierung gereinigten Lymphocyten bzw. monoclonalen
Antikörper werden vorzugsweise vor der Oxidation
dialysiert, beispielsweise mit einem geeigneten,
verträglichen Puffer, im pH-Bereich um 5,5. Die Oxidation
des Kohlehydrat-Anteils zu Formylgruppen kann in an sich
bekannter Weise chemisch mittels Periodat-Oxidation, oder
- weniger bevorzugt - enzymatisch mittels der Enzyme
Galactose-Oxidase und Katalase vorgenommen werden.
Durch Arbeiten bei relativ niedrigem pH, vorzugsweise im
Bereich um 5,5 wird die Gefahr der internen Vernetzung der
Antikörper gemindert bis ausgeschlossen. Eine bevorzugte
Oxidationsmethode besteht in der Oxidation mit
Natriumperiodat, vorzugsweise 0,1 molar in geeigneter,
inerter Pufferlösung, zweckmäßig im pH-Bereich 5,5,
beispielsweise in 0,1 M Acetatpuffer. Vorzugsweise erfolgt
die Reaktion bei relativ niederer Temperatur, etwa 0-5
Grad C und im Dunkeln.
Die Oxidation, die größenordnungsmäßig gewöhnlich
innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden kann, wird
abgestoppt, beispielsweise durch Zugabe kleinerer Mengen
von Ethylenglykol. Danach werden die Antikörper zweckmäßig
auf einer Säule gelchromatographisch aufbereitet. (Vgl.
Ullmann′s Encyclopädie der techn. Chemie, 4. Auflage,
Bd. 5, Verlag Chemie, S. 167; Gel-Filtration, Theory and
Practice, Pharmacia Fine Chemicals 1979, Deutsche
Pharmacia GmbH, Freiburg 1979). Dafür eignet sich z. B. ein
Dextran-Gel (z. B. das Produkt SEPHADEX G 25 der
Pharmacia), vorzugsweise äquilibriert mit einer
Pufferlösung im pH-Bereich 5. Die Konzentration der
Antikörper kann durch Aufkonzentration, beispielsweise
durch Ultrafiltration geschehen. Die Gewinnung der
Antikörper liegt gewöhnlich bei < 90%.
Die gewonnenen oxidierten und gereinigten Antikörper
werden in einem geeigneten, leicht sauren Medium
beispielsweise in Acetatpuffer und im pH-Bereich um 5,5 in
Konzentrationen zwischen 60 und 200 µg mit dem hydrazid
substituierten modifizierten polymeren Träger (HY-MP) in
Mengen von 100 mg für einen gewissen Zeitraum,
beispielsweise 16 ± 4 Stunden bei herabgesetzter
Temperatur, beispielsweise bei 4 Grad C inkubiert. Der
Anteil an immobilisiertem Antikörper wird nach der
Bradford-Methode; vgl. Analyt. Biochem. 72, 248 (1976),
aus der Differenz zwischen dem ursprünglichen und dem
verbliebenen Gehalt an Antikörper bestimmt.
Die über Hydrazinderivate gebundenen Antikörper haben - im
Vergleich mit den am unmodifizierten polymeren Träger P
gebundenen Antikörpern - eine verbesserte Antigen-
Bindungskapazität, die sich dem maximalen theoretischen
Wert von 2 Mol Antigen pro Mol Antikörper annähert,
insbesondere wenn relativ geringe Beladung mit Antikörpern
vorliegt.
Das aus (Meth)acrylamid und Glycidyl(meth)acrylat aufge
baute Matrix-Polymerisat (MP), vorzugsweise aus perl
förmigen Partikeln bestehend (s. oben), speziell das
Produkt ®EUPERGIT C der Röhm GmbH, Darmstadt wird zweck
mäßig in einer geeigneten Pufferlösung im alkalischen
Bereich, beispielsweise in einem Phosphatpuffer und bei pH
8,8 für einen gewissen Zeitraum, beispielsweise 16 ± 3
Stunden bei Raumtemperatur mit dem bifunktionellen Reagenz
(BR) vorzugsweise ein Bishydrazid einer aliphatischen
Dicarbonsäure, insbesondere Adipinsäuredihydrazid
behandelt. Vorzugsweise wendet man das bifunktionelle
Reagenz (BR) in Mengen von 0,1-10 mol BR pro Gramm
polymeren Träger MP, speziell ®EUPERGIT C,
Trockengewicht, insbesondere 1 µmol BR pro g
Trockengewicht an. Zweckmäßig wäscht man das modifizierte
Matrixpolymerisat HY-MP mit Phosphatstandardpuffer (PBS).
Es kann vorzugsweise mit Puffer (z. B. 0,1 M Acetatpuffer)
pH 5,5 äquilibriert und bei niederer Temperatur, z. B. bei
4 Grad C gelagert werden.
Definitionsgemäß besteht das bifunktionelle Reagenz BR aus
einer mindestens dreigliedrigen abstandhaltenden Einheit
mit einer die eine Endposition markierenden, zur
Kondensation mit der Aldehydgruppe befähigten Aminogruppe
und einer kovalent mit der Epoxyfunktion des
Matrixpolymerisats MP reagierenden Gruppe an der anderen
Endposition. Vorzugsweise läßt sich das bifunktionelle
Reagenz (BR) formelmäßig als:
H₂N - (X)n - A - Q
darstellen, wobei A für einen Spacer, vorzugsweise einen
Alkyl oder Cycloalkylrest, mit mindestens drei und bis zu
12 Kettengliedern, vorzugsweise -CH₂-Einheiten, wobei
gegebenenfalls eines oder mehrere der Kettenglieder durch
Sauerstoff ersetzt sein können, und wobei n für null oder
1, X für einen Rest
steht und Q dieselbe
Bedeutung wie -X-NH₂ besitzt oder für -NH₂ stehen kann. Besonders bevorzugt stellt das bifunktionelle Reagenz BR das Bishydrazid einer Dicarbonsäure
Bedeutung wie -X-NH₂ besitzt oder für -NH₂ stehen kann. Besonders bevorzugt stellt das bifunktionelle Reagenz BR das Bishydrazid einer Dicarbonsäure
dar. Ganz besonders bevorzugt ist
das Adipinsäuredihydrazid. Falls BR für einen
Alkylendiamin steht (n = O, A = (CH₂)3-6, Q = NH₂) wird
die Doppelbindung der bei der Kondensation gebildete
Schiff′sche Base vorteilhafterweise reduziert,
beispielsweise mit Natriumborhydrid.
Die Bindungskapazität der erfindungsgemäß immobilisierten
Antikörper wird bestimmt durch Messung der Antigene
insbesondere von Enzymen wie z. B. der Anti-
Carboxypeptidase (CPA) die sich an die Antikörper binden.
Zu diesem Zweck wird beispielsweise CPA in
gleichbleibenden Quantitäten im PBS zu Reagenzgläsern
gegeben, die jeweils 100 mg des modifizierten
Matrixpolymerisats HY-MP aber mit verschiedener Beladung
an immobilisierten monoklonalen Antikörpern tragen.
Der an die Antikörper des Matrixpolymerisats gebundene
CPA-Anteil wurde wie folgt bestimmt:
- α) durch Bestimmung der Differenz des jeweiligen Proteingehalts mittels des BRADFORD-Tests und die enzymatische Aktivität, die in der Ausgangslösung und schließlich in der Restlösung vorhanden war,
- β) durch Bestimmung der enzymatischen Aktivität des an den HY-MP-Träger-Perlen immobilisierten Enzyms-bei CPA z. B. mit Hilfe der Ninhydrin-Methode. Der am Träger gebundene Anteil an Enzym wurde nach Incubation mit Natriumcarbonat-Puffer mit pH 10,5 eluiert. Nach erfolgter pH-Angleichung wird die Aktivität des eluierten Enzyms, beispielsweise der CPA bestimmt.
Die Bestimmung über die Enzymaktivität ist in all den
Fällen angebracht, wo Antikörper vorhanden sind, welche
die Enzymaktivität nicht beeinträchtigen.
Es erweist sich, daß die oxidativ modifizierten Antikörper
die an HY-MP-Träger-Perlen fixiert sind, ihre volle
immunologische Aktivität zur Bindung des Enzyms,
beispielsweise CPA beibehalten.
Das molare Verhältnis von monoclonalem Antikörper zu CPA
bewegte sich im Rahmen 2 : 1 bis 1 : 1
Wie bereits ausgeführt erstreckt sich die erfindungsgemäße
Lehre auf spezifische Kongugate von oligosacharidhaltigen
Antikörpern im allgemeinsten Sinne.
Erwähnt seien insbesondere monoklonale Antikörper, die
gegen Antigene beispielsweise der folgenden Art
gerichtet sind:
Antigen-Klasse | |
Antigen | |
Bakteriell | |
Tetanus-Toxoid | |
H. influenza Typ b Polysaccharid | |
Diphtherie-Toxin | |
Chlamydia trachomatis | |
M. leprae | |
Lipopolysaccharid/Endotoxin | |
Pneumokokken | |
LPS von P.aeruginosa | |
Exotoxin von P.aeruginosa | |
Streptokokken Gruppe A Kohlehydrat | |
Viral | X31 Influenza-Virus-Nukleoprotein |
Masern-Virus | |
HSV Glykoprotein D | |
Maser-Virus, Nukleocapsid | |
Zytomegalie-Virus | |
Influenza A-Viren | |
Röteln-Virus-Antigene | |
HTLV I | |
Varizella-Zoster | |
HBsAg | |
Autoimmun | doppelsträngige DNA |
Inselzellen (Diabetes mellitus) | |
Myasthenia gravis, Antiidiotypen | |
Thyreotropin-Rezeptor | |
Rheuma-Faktor | |
Acetylcholin-Rezeptor | |
Schilddrüse | |
Sperma | |
Tumor | Mamma-Ca |
Prostata-Ca | |
Lungen-Ca | |
Magen-Ca | |
Melanom | |
GD2 (humanes Melanom) | |
Gliom | |
Rectum-Ca | |
Leukämie | |
Cervix-Ca | |
Gewebe/Blut | Rhesus D |
Blutgruppenantigen A | |
HLA-A, B, C, DR | |
Intermediäre Filamente | |
Andere | Malaria |
Forssman-Antigen | |
Schaferythrozyten | |
Nitrophenol | |
Dinitrophenol | |
Trinitrophenol | |
Keyhole limpet hemocyanin (KLH) | |
Rheumafaktor | |
Insulin |
Die erfindungsgemäße Fixierung bietet eine Reihe von
Vorteilen gegenüber dem Stand der Technik, insbesondere
bei Anwendung von Dicarbonsäurehydraziden, insbesondere
Adipinsäurehydrazid. Führt man beispielsweise die
Kondensation bei einem pH-Wert um 5,5 durch, so verhindert
man eine Kondensation der Antikörper-Aminogruppen mit
ihren eigenen Aldehydfunktionen.
Die chemische Bindung über das Hydrazid ist wünschenswert
stabil und inert. Nichtspezifische Bindung der Antikörper
wird minimiert. Eine Blockierung nach der Fixierung der
Antikörper erübrigt sich.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der
Erfindung.
Modifizierte und oxidierte, monoklonale Antikörper aus
Beispiel 2 werden in Konzentrationen die zwischen 60 und
200 µg variieren in je 1 ml eines Acetatpuffers mit pH 5,5
mit 400 µl des modifizierten Matrixpolymerisats MP aus
Beispiel 3 (100 mg) 16 Stunden bei 4 Grad C inkubiert.
Der Anteil an immobilisiertem Antikörper wird nach der
BRADFORD-Methode aus der Differenz zwischen der
ursprünglichen und der verbleibenden Mengen an
Antikörpern bestimmt.
Die erfindungsgemäß fixierten Antikörper haben im
Vergleich zu direkt über die Oxiranfunktion gebundenen
Konjugaten eine höhere Antigen-Bindungskapazität
(z. B. gegenüber CPA). Sie reicht an den theoretischen
Maximalwert von zwei Antigenen pro Mol Antikörper
heran, besonders wenn geringe Beladungen an Antikörper
angewendet werden. (s. Tabelle 2)
Eine Serie affinitätschromatographisch gereinigter
monoklonaler anti-CPA-Antikörper wurden vor der Periodat-
Oxidation gegen 0,1 M Acetatpuffer pH 5,5 dialysiert.
Jeder monoklonale Antikörper wurde mit 0,1 M
Natriumperiodat gelöst in 0,1 M Acetatpuffer von pH 5,5
(10 ml) behandelt. Bei diesem niedrigen pH-Wert wird die
interne Vernetzung der Antikörper-Moleküle unterdrückt.
Die Reaktion wurde während 1 Stunde bei 0 Grad C im
Dunkeln durchgeführt.
Man stoppt die Oxidationswirkung durch Zugabe von drei
Tropfen Ethylenglykol bevor man auf eine ®Sephadex G 25-
Säule, praeäquilibriert mit 0,1 M Acetatpuffer vom pH 5, auf
gibt. Die oxidierten Antikörper werden in einer 10 ml
Amicon Ultrafiltrationszelle ausgestattet mit einer PM 50-
Membran aufkonzentriert und der Gehalt an Protein wird
mittels der BRADFORD-Methode bestimmt. Die Gewinnung der
Antikörper übersteigt gewöhnlich 90%.
2 g des vernetzten Methacrylamid/Glycidylmethacrylat-
Copolyierisats (®EUPERGIT C, Produkt der Röhm GmbH,
Darmstadt) wird mit 0,1 M käuflichem Adipinsäuredihydrazid
in 20 ml eines 0,2 M Phosphatpuffers pH 8,8 16 Stunden bei
Raumtemperatur behandelt. Der modifizierte polymere Träger
wird ausgiebig mit PBS gewaschen, mit 0,1 M Acetatpuffer
pH 5,5 äquilibriert und bei 4 Grad C aufbewahrt.
Claims (10)
1. Immobilisierte, mittels ihrer modifizierten
Kohlehydratregion kovalent an ein Matrix-Polymer
gebundene Antikörper,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Bindung des Antikörpers durch die Kondensation
zwischen mindestens einer Aldehydgruppe der oxidierten
Kohlehydratregion und mindestens einer Epoxyfunktion
eines Epoxygruppentragenden Matrixpolymerisats (MP)
mittels eines bifunktionellen Reagenzes (BR), das an
der einen Endposition einer mindestens dreigliedrigen
abstandhaltenden Einheit eine zur Kondensation mit der
Aldehydgruppe befähigte Aminogruppe und an der anderen
Endposition eine kovalent mit der Epoxyfunktion
reagierende Gruppe trägt, bewirkt wird.
2. Verfahren zur Herstellung der immobilisierten
Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Aldehydgruppen durch Periodatoxidation der
Hemiacetalgruppen der Kohlehydratregion gebildet
werden.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Periodatoxidation bei einem pH-Wert im Bereich
5 bis 5,5, vorzugsweise in einem entsprechenden
inerten Puffer vorgenommen wird.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 und 3, dadurch
gekennzeichnet, daß zum Abschluß der Oxidation mit
Ethylenglykol behandelt wird.
5. Verfahren zu Herstellung der immobilisierten
Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß ein bifunktionelles Reagenz BR der Formel
H₂N - (X)n - A - Qwobei A für eine mindestens dreigliedrige
abstandhaltende Einheit (Spacer), n für null oder
eins, X für einen Rest
steht und Q dieselbe Bedeutung wie
-X-NH₂ besitzt oder für -NH₂ steht,
verwendet wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß als bifunktionelles Reagenz BR eine Verbindung der
Formel
worin n′ für 3-6, vorzugsweise 3-4 steht, verwendet
wird.
7. Verfahren zur Herstellung der immobilisierten
Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß als epoxygruppentragendes Matrixpolymerisat MP ein
Copolymerisat aus im wesentlichen Acrylamid oder
Methacrylamid und Glycidyl(meth)acrylat eingesetzt
wird.
8. Verfahren zur Herstellung der immobilisierten
Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reaktionsprodukt eines bifunktionellen
Reagenzes BR gemäß Anspruch 5 mit dem
Matrixpolymerisat gemäß Anspruch 7 bei pH 8,8-9
hergestellt wird.
9. Verfahren zur Herstellung der immobilisierten
Antikörper gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reaktionsprodukt eines bifunktionellen
Reagenzes BR mit dem Matrixpolymerisat MP mit der
Aldehydgruppe der oxidierten Kohlehydratregion des
Antikörpers kondensiert wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reaktion im pH-Bereich 5-5,5 durchgeführt
wird.
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