DD159993B1 - Immunosorbentchromatographische reinigung von alkalischer phosphatase aus kaelberdarm - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung wird zweckpnäßigerweise auf dem Gebiet der Enzymologie und dem Gebiet der industriellen Gewinnung von Biochemikalien, zur ökonomischen Gewinnung von alkalischer Phosphatase für die biochemische und klinisch-chemische Analytik verwendet. Sie kann auch auf anderen Gebieten, bei denen alkalische Phosphatase zum Einsatz kommt, genutzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm ist ein Enzym, das mit hoher spezifischer Aktivität gereinigt werden kann und welches sich durch hohe Stabilität auszeichnet. Für das Enzym sind stabile Substrate bekannt, die den Nachweis des Enzyms mittels Absorptions- und Fluoreszenzmessung erlauben. Diese Eigenschaften haben dazu geführt, daß dieses Enzym im zunehmenden Maße als Markerenzym für Enzymimmunassays eingesetzt wird.

Alle bisher bekannten Verfahren zur Reinigung des Enzyms sind relativ aufwendige Mehrschrittverfahren. Für einige neuere Verfahren wurden neben den klassischen Mitteln der Enzymreinigung wie Fällungsschritte mit konzentrierten Salzlösungen und organischen Lösungsmitteln, Affinitätschromatographische Schritte eingebaut. Die Vielzahl der aufwendigen Schritte führt dazu, daß kommerziell erhältliche Enzymchargen, die die für Enzymimmunassays notwendige Reinheit besitzen, vergleichsweise sehr teuer sind.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, alkalische Phosphatase aus Kälberdarm mit einem einfachen und spezifischen Verfahren zu hoher spezifischer Aktivität mit wenigen Reinigungsschritten zu reinigen.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, alkalische Phosphatase aus Kälberdarm durch Immunosorbentchromatographie zu reinigen. Die Aufgabe wird mittels eines Verfahrens zur immunosorbentchromatischen Reinigung von alkalischer Phosphatase zu einer enzymatisch aktiven Form aus Kälberdarm, wobei Antikörper gegen reine alkalische Phosphatase als Immunosorbentien eingesetzt werden, erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Rohextrakt der alkalischen Phosphatase mittels Butanolextraktion vorbehandelt wird, und daß die Desorption desEnzym-Antienzym-Komplexesin einem Milieu mit pH-Werten von 10 bis 11,9 erfolgt.

Es wurde überraschend gefunden, daß durch die Vorbehandlung des Rohextraktes der alkalischen Phosphatase mittels Butanolextraktion wenig kreuzreagierende Bindungen des Immunoadsorbent mit den Proteinen des Rohextraktes auftreten. Überrascht hat weiterhin die Erhaltung der Aktivität der alkalischen Phosphatase nach Desorption des Enzym-Antienzym-Komplexesbei pH-Werten zwischen 10 bis 11,8. In der Regel läßt sich die Desorption wegen der hohen Festigkeit des Enzym-Antienzym-Komplexes nur mit Hilfe von denaturierenden Desorbentien realisieren.

Die Verwendung früher Antikörper zurTrägerfixierung begünstigt die Desorption des Enzym-Antienzym-Komplexes. Vorteilhaft für die Nachreinigung von reiner alkalischer Phosphatase ist, wenn das zur Immunisierung verwendete Enzym mit Hilfe von Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt, im Gel über Aktivitätsbestimmung lokalisiert und als Gelenzymsuspension frei von Fremdprotein dem Tier zur Antikörperproduktion injiziert wird.

Dadurch werden immunologisch wirksame Spuren von Fremdproteinen abgetrennt. Die reine alkalische Phosphatase wird durch Aktivitätsfärbung erkannt und das Gel, daß dem Tier injiziert wird, hat einen Adjuvanseffekt, der die Bildung der Antikörper begünstigt. Rohextrakte, die außerhalb des Bereiches 2-201U/mI liegen, haben erfahrungsgemäß einen höheren Gehalt von kreuzreagierenden Verunreinigungen.

Weiterhin begünstigt wird die Desorption, wenn chaotrope Substanzen im Konzentrationsbereich von 0,1-0,5 M eingesetzt werden. Die elektrophoretisch^ Homogenität der alkalischen Phosphatase wird dadurch erreicht, daß nach der immunosorbentchromatographischen Reinigung eine lonenaustauscherchromatographie durchgeführt wird, wobei als Endreinigungsmittel eine Adsorption von Fremdproteinen von DEAE-Cellulose bei pH7,5 in 8OmM Tris erfolgt. Im Gegensatz zu den anderen affinitäts-chromatographischen Verfahren kann die Adsorption des Enzyms an diesem trägergebundenen Antikörper direkt aus einem Rohextrakt ohne vorherige Vorreinigung erfolgen. Die Qualität und Effizienz des Schrittes hängt sehr wesentlich von der Qualität des zu fixierenden Antikörpers ab. Wird ein absolut reines Enzym zur Antikörpergewinnung eingesetzt, ist es möglich, höchstgereinigtes Enzym mit einem Säulenschritt aus dem Rohextrakt zu gewinnen, wenn die Desorption des Immunkomplexes mit geeigneten Desorbentien unter schonenden Bedingungen erfolgt. Die Auswahl dieser Desorptionsbedingungen bestimmt auch die Häufigkeit mit der die Immunosorbentchromatographie mit ein und derselben Antikörpersäule durchgeführt werden kann. Ein weiterer Vorteil dieser Technik besteht darin, daß zur wiederholten Antikörpergewinnung ein einmal immunisiertes Tier leicht durch Boosterung reaktiviert werden kann.

Ausführungsbeispiel

Aus 2 m Kälberdünndarmstücken (Duodenum und oberes Jejunum) frisch geschlachteter Kälber wird die Darmschleimhaut gewonnen und zu Acetontrockenpulver verarbeitet. Das Acetontrockenpulver wird mit n-Butanol extrahiert und mit Natriumacetat-Magnesiumacetat (0,01 M) im Homogenisator aufgeschlossen. Nach Zentrifugation wird der Überstand des Rohextraktes 2 Stunden bei Zimmertemperatur mit 60ml gepackten Immunosorbent, bestehend aus AH-Sepharose4B, an die Antikörper von 9 ml Antiserum kovalent gebunden wurden, gerührt.

Das Immunogel wird abfiltriert und mit PBS-Tween (137mM NaCI, 2,68mM KCI, 1OmM Phosphat, 0,02% NaN₃,0,05% Tween pH = 7,4) gewaschen bis bei 280ηm keine Extinktionsänderung auftritt. 60ml Immunogel binden etwa 10000 Internationale Einheiten alkalische Phosphatase. Die Elution des Enzyms erfolgt mit 0,5M NaJ in 0,2M Borat oder Nitrat und 2OmM Phosphat pH = 11,4 und beträgt 65-75%. Das Enzym wird dann gegen eine Lösung von 8OmM Tris, 2 mM MgCI₂ und 0,025mM ZnCI₂ pH = 7,5 dialysiert und über eine DEAE-Cellulose-Säule weiter gereinigt. Dabei werden Fremdproteine gebunden, während das Enzym im Durchlauf erscheint und durch Ultrafiltration mit einer Amiconapparatur über eine UM-20 E Diaflo-Membran konzentriert werden kann. An der DEAE-Cellulose-Säule treten kaum Verluste auf (80-90% Wiederfindung). Das Enzym hat am Schluß der Reinigung eine spezifische Aktivität von 1000-2000IU/mg Protein (bei 25⁰C, p-Nitrophenylphosphat in Diäthanolamin, 0,05 M MgCI₂, pH = 9,8).

Zur Stabilisierung des Enzyms erfolgt eine Dialyse gegen eine Lösung aus 3M NaCI, 0,1 mM ZnCI₂ und 0,03 M Triethanolamin pH = 7,6.

Claims (6)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Immunosorbentchromatographische Reinigung von alkalischer Phosphatase zu einer enzymatisch aktiven Form aus Kälberdarm, wobei Antikörper gegen reine alkalische Phosphatase als Immunosorbentien trägerfixiert eingesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, daß als Immunosorbent vorzugsweise frühe Antikörper eingesetzt werden, der Rohextrakt der alkalischen Phosphatase mittels Butanolextraktion vorbehandelt wird, und daß die Desorption des Enzym-Antienzym-Komplexes in einem Milieu mit pH-Werten von 10 bis 11,8 erfolgt.
2. 2. Immunosorbentchromatographische Reinigung nach Pkt. 1, dadurch gekennzeichnet, daß die als Immunosorbent eingesetzten Antikörper aus mit Enzym immunisierten Tieren gewonnen werden, wobei zuvor das zur Immunisierung verwendete Enzym mit Hilfe von Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt, im Gel über Aktivitätsbestimmung lokalisiert und als Gelenzymsuspension frei von Fremdprotein dem Tier injiziert wurde.
3. 3. Immunosorbentchromatographische Reinigung nach Pkt. 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Adsorption des Enzyms aus einem Rohextrakt mit einer Aktivität von 2-20IU/ml erfolgt.
4. 4. Immunosorbentchromatographische Reinigung nach Pkt. 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Desorption vorzugsweise bei pH 11,4 erfolgt.
5. 5. Immunosorbentchromatographische Reinigung nach Pkt. 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verbesserung der Desorption chaotrope Substanzen im Konzentrationsbereich von 0,1-0,5M verwendet werden.
6. 6. Immunosorbentchromatographische Reinigung nach Pkt. 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Endreinigungsmittel eine Adsorption von Fremdproteinen an DEAE-Cellulose bei pH7,5 in 8OmM Tris erfolgt.