DE19836213A1 - Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien - Google Patents
Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-MaterialienInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien durch Zusatz von Polyolen zu einer Elutionslösung, die Erfindung betrifft weiter ein Sulfon der folgenden Formel (I) DOLLAR A CH¶2¶OHCHOHCH¶2¶SCH¶2¶CH¶2¶SO¶2¶CH¶2¶CH¶2¶SCH¶2¶CHOHCH¶2¶OH als eine in dem Verfahren verwendbare eluierende Verbindung.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Elution von Biomolekülen von
Chromatographie-Materalien sowie ein neues Sulfon mit der folgenden Formel
CH2OHCHOHCH2SCH2CH2SO2CH2CH2SCH2CHOHCH2OH als eine in dem Ver
fahren verwendbare eluierende Verbindung.
Die Adsorptionschromatographie ist in verschiedenen methodischen Varianten
(z. B. Ionenaustausch-, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie,
thiophile Chromatographie usw.) sowohl für analytische als für präparative
Zwecke als Trenn- und Reinigungsverfahren seit Jahren etabliert. Ihr Prinzip
besteht darin, daß aus Lösungen unter bestimmten Bedingungen Verbindungen
an Chromatographiemateralien, im nachfolgenden Chromatografiematrix ge
nannt, gebunden werden und anschließend durch Änderung der Bedingungen
wieder abgelöst (eluiert) werden. Eine Trennung verschiedener Verbindungen
erhält man dann, wenn aus Mischungen nur einige der enthaltenen Verbindun
gen gebunden werden und andere nicht. Auf dieser Basis beinhaltet das Schema
der Reinigung und Trennung von Verbindungen mit Hilfe der Adsorptionschroma
tographie folgende Schritte:
- - Vorbereitung der Chromatografiematrix (z. B. Einfüllen in eine Säule oder einen anderen Träger und Äquilibrieren) und der Probe (z. B. Lösen in Puffer)
- - Auftrag der Probe
- - Waschen der Chromatografiematrix zur Entfernung aller nicht ge bundenen Stoffe
- - Elution der gebundenen Stoffe.
Die erfolgreiche Durchführung der Adsorptionschromatografie hängt in entschei
dendem Maße von der Wahl der Bedingungen (pH-Wert, Salzkonzentration,
Ionenspezies, Zusätze, Temperatur) ab. Diese Bedingungen entscheiden über
Bindung/Nichtbindung der in der Ausgangsmischung enthaltenen Verbindungen
und nachfolgende Ablösung der gebundenen Stoffe von der Chromatografiema
trix. Besonders bei Biomolekülen (z. B. Nukleinsäuren, Proteine) müssen diese
Bedingungen auf den Erhalt der komplexen Strukturen dieser Verbindungen
ausgerichtet sein, d. h. Bedingungen, unter denen die Biomoleküle ihre Nativität
verlieren und denaturieren, müssen vermieden werden. Im Gegenteil, es sollten
günstigerweise Bedingungen zur Anwendung kommen, die einen stabilisierenden
Einfluß auf die Biomolekülstrukturen haben. Die Auswahl der Bedingungen ist
aber in vielen Fällen mit Problemen behaftet. So lassen sich z. B. humane IgG-
Antikörper an Trägern, die mit Protein A oder Protein G ligandiert sind, binden.
Die Bindung ist aber so außerordentlich fest, daß die Elution unter drastischen
Bedingungen stattfinden muß. Dazu zählt z. B. starkes Ansäuern (bis pH 2),
wodurch die Antikörper oft einen Aktivitätsverlust erleiden. Bei einigen "emp
findlichen" Antikörpern versagt aus diesem Grund diese Reinigungsmethode
gänzlich. Das analoge Problem findet sich bei der hydrophoben und thiophilen
Chromatografie. Diese beiden adsorptiven Trennverfahren beruhen auf dem
Verhalten hydrophober bzw. thiophiler Proteine, sich in Gegenwart hoher bzw.
sehr hoher Salzkonztrationen an entsprechende Chromotografiematrices zu
binden. Diese Bindebedingungen sind aber für einige Biomoleküle, insbesondere
Proteine, so schädlich, daß sie denaturieren und sogar ausgefällt werden, so daß
nach Elution dieser Moleküle unter Verwendung niedriger Salzkonzentrationen
zerstörte Produkte resultieren.
Ein weiteres Problem der Adsorptionschromatografie liegt in der Tatsache, daß
sich aus komplexen Mischungen meist mehrere Substanzen an die Chromatogra
fiematrix binden und bei der Elution auf gleiche Bedingungen ansprechen. Eine
gleichzeitige Elution aller gebundenen Substanzen liefert dann erneut eine Mi
schung, wenn auch einige Verbindungen aufgrund ihrer "Nichtbindung" abge
trennt werden konnten. Wünschenswert ist unter solchen Verhältnissen eine
selektive bzw. spezifische Ablösung einzelner Substanzen von der Chroma
tografiematrix. Dies kann einmal durch schrittweise Änderung der Elutions
bedingungen (Salzgradient, pH-Gradient usw.) geschehen oder durch Affinitäts
elution, wie sie von Wilchek et al. in Meth. Enzymol. 104, S. 3-55 beschrieben
worden ist. Aber auch diese Methoden haben gravierende Nachteile, da unter
den einzuhaltenden Bedingungen die Biomoleküle einen Schaden erleiden und
diese für nachfolgende Zwecke nicht mehr brauchbar sind.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren zur
Elution von Biomolekülen von Chromatografiematrices zur Verfügung zu stellen,
das obige Nachteile vermeidet.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Gegenstände der Patentansprüche.
Von den Erfindern wurde gefunden, daß die Elution von Biomolekülen von
Chromatografiematrices unter Verwendung eines Elutionsmittels enthaltend
mindestens ein Polyol schonend geschehen kann und die zu trennenden oder zu
reinigenden Biomoleküle ohne irgendwelche Schäden zu nehmen aus dem
Verfahren hervorgehen.
Unter dem Begriff "Biomolekül" sollen erfindungsgemäß Nukleinsäuren (DNA
oder RNA), Peptide, Proteine (z. B. Plasmaproteine), Rezeptoren und Immunglo
buline (Antikörper), und Peptid(Protein)-Strukturen aufweisende Substanzen, wie
Viren, Mikroorganismen und Zellen, verstanden werden. Die Biomoleküle können
in den verschiedensten Flüssigkeiten vorliegen. Beispiele solcher Flüssigkeiten
sind Körperflüssigkeiten, wie Blut, Lymphe, Urin, Sputum und Liquor, und
Überstände bzw. Lysate von Zellen und Geweben.
Als Chromtografiematrices eignen sich die dem Fachmann bekannten Chromato
grafiematerialen, insbesondere jene Materialien, die für hydrohobe, thiophile oder
Affinitätschromatografie bekannt sind. Beispielhaft seien Agarosegele (z. B.
Sepharose®), Dextrangele (z. B. Sephadex®), Latex, Cellulose-Gelmatrices, Acryl
amid-Gelmatrices genannt. Ganz besonders sei auf die in der Patentanmeldung
DE 196 23 131.0 beschriebenen Konjugate als Chromatografiematerialien
hingewiesen sowie auf thiophile Gele (T-Gele). Nach Porath (Porath, J. J. Chro
matogr., 376 (1986), S. 331) lassen sich thiophile Gele einteilen in T-Adsorben
tien (Thioether-sulphonyl-Liganden) und thioaromatische Adsorbentien (Liganden
mit der Struktur R-SO2-CH2- oder R-S-CH2-CH2-SO2-, wobei R eine p-elektronen
reiche aromatische oder heteroaromatische Struktur aufweist). Das als erstes
entwickelte T-Gel entstand durch Kopplung von Mercaptoethanol an Divinylsul
fon-aktivierte Agarose. Damit weist es die Struktur Agarose-O-CH2CH2-SO2-
CH2CH2-S-CH2CH2OH auf. An dieses Gel binden sich in Gegenwart hoher Salz
konzentrationen bestimmte Proteine, die entsprechend diesem Verhalten als
thiophil bezeichnet werden. Eine Ablösung gebundener Proteine vom T-Gel wird
durch die Erniedrigung der Salzkonzentration bewirkt.
Die Chromatografiematerialien können auch aktiviert sein, z. B. durch Cyan
bromid-Aktivierung (CnBr-Aktivierung) oder NHS-Aktivierung. In einer bevor
zugten Ausführungsform kann das Chromatografiematerial auch daran gebunde
ne Spacer/Linker enthalten. Diese Spacer sind bevorzugt aliphatische oder
cyclische Kohlenwasserstoffe. Die aliphatischen Kohlenwasserstoffe können
gerade oder verzweigte Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-,
Octyl-, Nonyl- oder Decylgruppen sein. Bei den cyclischen Kohlenwasserstoff
gruppen sind Phenyl-, Benzyl-, Cyclohexylgruppen zu nennen. Bevorzugt sind -
CH2-CH2-SO2-CH2-CH2- oder -CH2-CH2-.
Die Erfindung beruht nun auf der Beobachtung, daß den üblichen Elutionspuf
fern, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind und je nach verwendeter
Chromatografiematrix von diesem ausgewählt werden können, ein Polyol zu
gesetzt werden kann, welches unter Anwendung schonenderer Elutionsbedin
gungen als eigentlich üblich, für eine Elution der Biomoleküle von den Chromato
grafiematrices sorgt. Es ist beispielsweise nicht mehr notwendig, den pH-Wert
auf schädlich saure Werte (z. B. pH 2-3) abzusenken oder hohe bzw. niedrige
Salzkontrationen anzuwenden. Dies kann so erklärt werden, daß die Polyole als
"lösliche" Matrixanaloga anzusehen sind, die die zwischen Chromatografiematrix
und Biomolekül sowie zwischen Spacer und Biomolekül zustandegekommene
Wechselwirkung schwächen. Zu dem Polyol als "löslichem" Matrixanalogon wird
dadurch von dem Biomolekül eine stärkere Wechselwirkung aufgebaut, die für
die Ablösung des Biomoleküls von der Chromatografiematrix sorgt. Die Polyole
stabilisieren auch die Biomolekülstrukturen, wie Faltung zu Sekundär- oder
Tertiärstruktur bei Proteinen. Dies ist um so überrraschender als von Berna et al.
(J. of Chromatography A 764 (1997), S. 193-200) herausgefunden worden ist,
daß Polyole eine Verstärkung der Proteinbindung an hydrophobe oder thiophile
Gele bewirken.
Unter Polyolen sollen erfindungsgemäß Glycerin, (Poly)Ethylenglykol, Sorbit,
Saccharose, Inositol, Pentaerythrit, Trimethylolpropan, Mannit sowie Dulcit,
Erythrit, Threitol und deren Derivate verstanden werden. Die Derivate können
durch die dem Fachmann bekannte chemische Derivatisierung, z. B. Einführen
von Halogenid- (z. B. F-, Cl-, Br-, I-) Alkyl- (Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-,
Butylole, Pentyl-, usw.) Acetat-, Aldehyd-, Alkoxy- oder Sulfhydrylgruppen herge
stellt werden. Es können auch Mischungen der obigen Polyole verwendet wer
den.
Die Menge an dem in der Elutionslösung enthaltenen Polyol beträgt 10% bis
60% (w/v) (oder 100 bis 600 g/l,). Die für den jeweiligen Zweck eingesetzte
Konzentration ist abhängig von der Löslichkeit des verwendeten Polyols in dem
beabsichtigten Puffer und von der Art des von der Matrix abzulösenden Proteins.
Eine vollständige Ablösung von humanem IgG aus menschlichem Serum wird
z. B. durch 55% Glycerin und 40% Ethylenglykol bewirkt. Viele murine monoklo
nale Antikörper eluieren bereits bei 10-35% Glycerin. Einen gewissen Einfluß hat
der Puffer, in dem die Polyole gelöst werden. Für eine Elution im sauren Bereich
(z. B. pH 5) wird eine höhere Polyolkonzentration zur Elution benötigt als im
alkalischen Bereich (z. B. pH 8). Die niedrigste Polyolkonzentration ist erforder
lich, wenn es sich bei dem Polyol um ein Derivat handelt, das durch Vernetzung
mit Divinylsulfon entstanden ist.
Von den Erfindern wurde ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Arbeits
weise entdeckt. Häufig werden Proteine, insbesondere Immunglobuline, nach
ihrer Aufreinigung modifiziert. Bekannte Beispiele sind hierfür die Biotinylierung,
die radioaktive Markierung (z. B. 125Jodmarkierung) oder die Kopplung mit ande
ren Proteinen, z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase als Indikatorenzym.
Dies sind Modifizierungen, die zur Einsetzbarkeit der Proteine, insbesondere
Immunglobuline, in speziellen Immuntests (ELISA etc.) erforderlich sind. Die
jeweilige Kopplungschemie stellt Anforderungen an die Lösung, in der sich das
zu modifizierende Protein befindet: pH-Wert, Art und Konzentration der Puffer
salze. Da diese Modifikationen meist an Amino- oder Sulfhydrylgruppen erfolgen,
stören Polyole derartige Reaktionen nicht, und konsequenterweise, benutzt man
zur Ablösung den entsprechenden Modifizierungspuffer mit Polyolzusatz, so daß
das Eluat direkt, ohne aufwendige Umpufferungen in die Reaktion eingehen
kann.
Wie bereits oben ausgeführt, kann das Polyol jedem bekannten Elutionspuffer
zugefügt werden. Es ist erfindungsgemäß aber auch möglich eine wäßrige
Lösung eines Polyols ohne weiteren Pufferzusatz zu verwenden.
In diesem Zusammenhang wurde von den Erfindern eine neue Verbindung
entwickelt, mit der Biomoleküle auf sehr schonende Weise von Chromatografie
matrices abgelöst werden können. Dabei handelt es sich um ein Sulfon mit
folgender Formel
CH2OHCHOHCH2SCH2CH2SO2CH2CH2SCH2CHOHCH2OH (I).
Diese Verbindung erhält man durch Umsetzung von Mercaptoglycerin mit Divi
nylsulfon wie im nachfolgenden Beispiel näher beschrieben ist.
Die Erfindung wird näher durch die nachfolgenden Beispiele beschrieben:
40 g Sepharose 4B-CL werden mit Wasser gewaschen, auf einer Glasfritte im
Wassserstrahlvakuum trockengesaugt und in 100 ml 0,5 M Soda resuspendiert.
Unter Rühren werden der Suspension 4 ml Divinylsulfon zugegeben. Die Suspen
sion wird anschließend bei Raumtemperatur 2 Stunden lang geschüttelt. Das Gel
wird danach auf einer Glasfritte gesammelt und intensiv mit Wasser gewaschen,
bis das Filtrat neutral ist. Dieses Vinylsulfon-aktivierte Gel wird in Wasser re
suspendiert und bei 4°C aufbewahrt.
Zur Kopplung mit Mercaptoethanol werden 2 g der Vinylsulfon-aktivierten
Sepharose mit 0,5 M Soda vorgewaschen und mit 150 µMol Mercaptoethanol,
gelöst in 2 ml 0,5 M Soda, resuspendiert. Die Suspension wird 7 Stunden
geschüttelt bei Raumtemperatur und anschließend das Gel auf einer Glasfritte
gesammelt, mit Wassser gewaschen und in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH
7,4 resuspendiert. Das erhaltene T-Gel wird ggf. bei 4°C gelagert, wobei der
Suspension dann 0,1% Natriumazid zugesetzt wird.
1 g des T-Gels wird in eine Chromatographiesäule eingefüllt und mit 25 mM
Phosphatpuffer, pH 7,4, supplementiert mit 0,5 M Natriumsulfat ( = Äquilibrie
rungspuffer) äquilibriert. 1 ml Humanserum (vorher dialysiert über 24 Std. gegen
den Äquilibrierungspuffer und durch Zentrifugation bei 15.000 g von Partikeln
befreit) wird anschließend auf die Säule aufgetragen. Nichtgebundene Proteine
werden durch Spülen der Säule mit 20 ml Äquilibrierungspuffer entfernt.
Die Säule wird mit 25 mM Phosphatpuffer, supplementiert mit 0,5 M Natrium
sulfat und 40% Glycerin, gespült. Dabei werden 11,5 mg Protein eluiert. Über
90% der eluierten Proteine sind Immunglobuline. Anschließend wird die Säule
mit 25% Phosphatpuffer (ohne Zusätze) gewaschen. Dabei werden nur noch
Spuren von Protein eluiert, so daß die stattgefundene Elution als im wesentli
chen vollständig anzusehen ist.
Bei dem MECH-Gel handelt es sich um 3-(2-Mercaptoethyl)chinazolin-
2,4(14,34)dion gekoppelt an Agarose. Ein solches Gel-Konjugat ist Gegenstand
der Patentanmeldung DE 196 23 131.0.
40 g Sepharose 4B-CL werden mit Wasser gewaschen, auf einer Glasfritte im
Wassserstrahlvakuum trockengesaugt und in 100 ml 0,5 M Soda resuspendiert.
Unter Rühren werden der Suspension 4 ml Divinylsulfon zugegeben. Die Suspen
sion wird anschließend bei Raumtemperatur 2 Stunden lang geschüttelt. Das Gel
wird danach auf einer Glasfritte gesammelt und intensiv mit Wasser gewaschen,
bis das Filtrat neutral ist. Diese Vinylsulfon-aktivierte Gel wird in Wasser re
suspendiert und bei 4°C aufbewahrt.
Zur Kopplung mit MECH werden 2 g der Vinylsulfon-aktivierten Sepharose mit
0,5 M Soda vorgewaschen und mit 150 µMol MECH, gelöst in 2 ml 0,5 M Soda,
resuspendiert. Die Suspension wird 7 Stunden geschüttelt bei Raumtemperatur
und anschließend das Gel auf einer Glasfritte gesammelt, mit Wassser gewa
schen und in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 resuspendiert. Das erhalte
ne T-Gel wird ggf. bei 4°C gelagert, wobei der Suspension dann 0,1% Natriu
mazid zugesetzt wird.
1 g des MECH-Gels wird in eine Chromatographiesäule eingefüllt und mit 25 mM
Phosphatpuffer, pH 7,4 ( = Äquilibrierungspuffer) äquilibriert. 1 ml Humanserum
(vorher dialysiert über 24 Std. gegen den Äquilibrierungspuffer und durch Zen
trifugation bei 15.000 g von Partikeln befreit) wird anschließend auf die Säule
aufgetragen. Nichtgebundene Proteine werden durch Spülen der Säule mit 20 ml
Äquilibrierungspuffer entfernt.
Die Säule wird mit dem Äquilibrierungspuffer, dem 10 g/100 ml des erfindungs
gemäßen Sulfons zugegeben worden waren, gespült. Es werden 10,3 mg
Protein eluiert. Über 90% der eluierten Proteine sind Immunglobuline.
80 mmol Mercaptoglycerin (3-Mercapto-1,2-propandiol; Fa Aldrich, Katalog #
M560-7) wird mit 1 ml Triethylamin vorgelegt und unter Eiskühlung 30 Min.
gerührt. Danach wird langsam 40 mmol Divinylsulfon (Fa Aldrich, Katalog # V
370-0) zugetropft. Die starke Erwärmung wird durch Eiskühlung beherrscht. Aus
der viskosen Lösung scheidet sich ein weißer Niederschlag ab. Nachfolgend
werden 12 ml Wasser zugegeben und weiter gerührt. Nach 4 Stunden wird der
Ansatz langsam auf Raumtemperatur gebracht und mit etwas Methanol versetzt.
Danach wird der Reaktionsansatz im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rück
stand wird in wenig Methanol aufgenommen und umkristallisiert. Ausbeute ca.
75%.
weißer Feststoff, MG 334,48
Schmelzpunkt: 101-104°C
Schmelzpunkt: 101-104°C
- 1. IR: 2974, 2922, 2862 CH-Valenzschw.; 1432 CH-Deformationsschw.
1314, 1148 SO2; 3372 OH-Valenzschw.
NMR: 2.49-2.56 (m, 2H, CH2) 2.68-2.74 (m, 2H, CH2) 2.84-2.90 (m, 4H, CH2) 3.32-3.44 (m, 8H, CH2) 3.58 (sextett, 2H, 2 × CH) 4.59 (t, 2H, 2 × CH2OH) 4.84 (d, 2H, 2 × CHOH) 4.59 und 4.84 tauschen mit D2O aus
13C-NMR: 23.96 (CH2), 35.24 (CH2), 52.59 (CH2), 64,43 (CH2OH), 71.41 (CHOH)
1 g des MECH-Gels wird in eine Chromatographiesäule gefüllt und mit 25 mM
Phosphatpuffer, 1 mM EDTA, pH 7,4 äquilibriert. 1 ml Humanplasma (EDTA-
Blut) wird durch Zentrifugation bei 15000 × g von Partikeln befreit und auf die
äquilibrierte Säule aufgetragen. Nichtgebundene Proteine werden durch Spülen
der Säule mit 20 ml Äquilibrierungspuffer entfernt. In einem ersten Durchgang
wird die Säule mit einem Elutionspuffer ( = Äquilibrierungspuffer, dem 40%
Ethylenglykol zugesetzt wurden) gespült. Die Ablösung erfolgt solange bis das
Säuleneluat proteinfrei ist. Auf diese Weise werden 11,2 mg Protein vom Gel
abgelöst. Etwa 85% der mit diesem Schritt eluierten Proteine stellen Immunglo
buline, insbesondere IgG, dar. Die Säule wird anschließend mit dem Äquilibrie
rungspuffer zurückäquilibriert. Anschließend werden die noch auf dem Gel
befindlichen Protein durch Spülen der Säule mit 10 mM Natronlauge abgelöst.
Dabei werden 8,4 mg Protein eluiert. Über 90% dieses durch NaOH eluierten
Proteins wird durch Fibrinogen repräsentiert.
Der obige Befund zeigt unzweifelhaft, daß die erfindungsgemäße Ablösung
selektiv erfolgt und daß Immunglobuline durch Polyole einfach eluiert werden
können, wobei Fibrinogen, das eine hohe Affinität für thiophile Gele aufweist,
nicht eluierbar ist. Die Reinigung von Fibrinogen ist dadurch sehr gut möglich.
Sepharose 4B-CL wird wie in Beispiel 1 mit Divinylsulfon aktiviert. 10 g Vinylsul
fon-aktivierte Sepharose werden mit Wasser gewaschen und in 10 ml Wasser
resuspendiert. Die Suspension wird mit 30 ml Dimethylformamid, in dem 200
mg Chlorethylchinazolindion (Aldrich, Kat. # 42770-5) gelöst wurden, gemischt
und unter Rühren mit Stickstoff gespült. Anschließend werden unter ständiger
Stickstoffeinfuhr 5 ml einer wäßrigen Natriumhydrogensulfidlösung (10 mg/ml)
zugetropft. Der Ansatz wird mit Natronlauge auf pH 8,0 eingestellt und die
Suspension danach 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei weiter
Stickstoff eingeleitet wird. Der Ansatz wird nach Zugabe von 5 ml Glycerin in
einem geschlossenen Gefäß 24 Std. geschüttelt. Das Gel wird auf einer Glas
fritte gesammelt, mit Wasser gewaschen und bis zur Verwendung in 20%
Ethanol bei 4°C gelagert.
1 ml des Gels wird in eine Chromatografiesäule gefüllt und mit PBS äquilibriert.
50 ml Überstand der Hybridomazellinie ZIM-0505 (Patent DD 293265 B5),
kultiviert in Hybridomamedium S 8284 (Sigma), werden auf die Säule aufgetra
gen und die nichtgebundenen Anteile durch Waschen der Säule mit 20 mL PBS
entfernt. Der Antikörper wird anschließend mit Natriumphosphatpuffer, supp
lementiert mit Ethylenglykol (erhalten durch Rekonstitution des Phosphatpuffers
aus dem ImmunoProbeTM Biotinylation Kit (Sigma) mit 5 m) 40% Ethylenglykol
anstelle von 5 ml Wasser), von der Säule abgelöst und ohne weitere Behandlung
direkt zur Biotinylierung eingesetzt. Der modfizierte Antikörper ist in Verbindung
mit Avidin bzw. Streptavidin mit üblichen Techniken zur Detektion von Rubellavi
ren im Immunoblot oder im ELISA sowie zur Bestimmung von Antikörpern (z. B
nach einer Rötelninfektion beim Menschen) gegen Rubella-Viren verwendbar.
Claims (9)
1. Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatografie-Materialien
bei der Adsorptionschromatografie, dadurch gekennzeichnet, daß eine zur
Elution verwendete Lösung mindestens ein Polyol enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Biomoleküle Nukleinsäuren, Protei
ne, Peptide oder Antikörper sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polyol Glycerin, Sorbit,
(Poly)Ethylenglykol, Saccharose, Inositol, Pentaerythrit, Trimethylolpro
pan, Mannit sowie Dulcit, Erythrit, Threitol bzw. ein Derivat davon ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polyol in der Elu
tionslösung in einer Menge von 10% bis 60% (w/v) enthalten ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Chromatografie-
Materialien auf Agarosegelen, Dextrangelen, Latex, Cellulose-Gelmatrices
oder Acrylamid-Gelmatrices basieren.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei das Polyol einem für
eine Modfikationsreaktion erforderlichen Puffer zugesetzt ist und die mit
diesem Elutionspuffer eluierten Moleküle direkt nach der Elution modifier
bar sind.
7. Sulfon mit der Formel
CH2OHCHOHCH2SCH2CH2SO2CH2CH2SCH2CHOHCH2OH (I)
CH2OHCHOHCH2SCH2CH2SO2CH2CH2SCH2CHOHCH2OH (I)
8. Verfahren zur Herstellung des Sulfons gemäß Anspruch 7 durch Umset
zung von Mercaptoglycerin mit Divinylsulfon.
9. Verwendung des Sulfons nach Anspruch 7 in einem Verfahren nach
einem der Ansprüche 1-6.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1998136213 DE19836213A1 (de) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien |
Applications Claiming Priority (1)
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DE1998136213 DE19836213A1 (de) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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DE19836213A1 true DE19836213A1 (de) | 2000-02-24 |
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ID=7877092
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE1998136213 Ceased DE19836213A1 (de) | 1998-08-11 | 1998-08-11 | Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19836213A1 (de) |
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