DD143262A1

DD143262A1 - Verfahren zur herstellung eines polymeren,zur bindung von nucleophilen gruppen aktivierten traegers

Info

Publication number: DD143262A1
Application number: DD79211127A
Authority: DD
Inventors: Jaroslav Drobnik; Jaroslav Kalal; Jiri Labsky; Vladimir Saudek; Frantisek Svec
Original assignee: Ceskoslovenska Akademie Ved
Priority date: 1978-02-22
Filing date: 1979-02-20
Publication date: 1980-08-13
Also published as: DE2906989A1; CS204190B1; US4245064A; FR2418245A1; GB2015553A; SE7901349L; GB2015553B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines aktivierten festen, unlöslichen Trägers, der zur Bindung von nucleophxlen Gruppen geeignet ist. Der Träger enthält aktive Gruppen der allgemeinen Formel O-CO-OR

Description

1.1 127 -4-

Verfahren zur Herstellung eines aktivierten festen Trägers

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines festen, unlöslichen, zur Bindung von nucleophilen Gruppen aktivierten Trägers.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Bei einer Reihe von chemischen und physikalisch-chemischen Prozessen verwendet man in letzter Zeit Reagenzien, die aus einer praktisch inerten Komponente vorwiegend polymerer Art bestehen (dem Träger), die in dem System von verwendeten Lösungsmitteln unlöslich ist und an welche die die spezifische gewünschte Wirkung bewirkenden Stoffe (Liganden) angelagert (gebunden) werden. Diese Liganden können natürliche oder

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synthetische Stoffe sein, und die spezifische Y/irkung besteht entweder in der Katalyse oder in der selektiven Sorption. Demientsprechend werden die resultierenden Reagenzien in die Gruppe der immobilisierten Enzyme oder in die der immobilisierten Affinanten, wie Enzyme (sur Sorption von Inhibitoren), Inhibitoren, Antigene, Gegenstoffe, Lectine, Nucleinsäuren usw. eingeordnet·

Die Basis der Herstellung dieser Reagenzien bildet die Bindung der spezifischen Liganden an den Träger. Dabei wird am häufigsten die freie Aminogruppe von den Liganden ausgenutzt, obwohl man auch Bindungsverfahren durch Carboxyle, durch Kopplung von fähigen aromatischen Resten oder Hydrogensulfidgruppen kennte Die Bindung kann unmittelbar auf dem aktivierten Träger verwirklicht werden, oder es wird zwischen den Träger und den Liganden ein Verbindungsstück(spacer) eingefügt· Die Träger kann man in zwei Gruppen einteilen, in die aktiven Träger, die schon in ihrer Struktur derartige Gruppen tragen, die zur praktisch spontanen Umsetzung mit den Liganden fähig sind, und die der aktivierbaren Träger, derer Bindungsgruppen man zur Umsetzung mit den Liganden erst aktivieren muß. Wenn es sich um eine solche Aktivierung handelt, daß man den resultierenden aktivierten Träger lagern kann, so' handelt es sich um die überführung eines inaktiven in einen aktiven Träger. Derartige Aktivierungsprosesse sind für die Praxis die geeignetsten« Die gebräuchlichsten aktivierbaren Gruppen bilden die Hydroxyle. Sie sind in allen Trägern vorhanden, die auf den Polysacchariden (Cellulose und ihre Derivate, Dextrane, Agarose navu) beruhen, aber auch in einer Reihe von synthetischen organischen Trägern, die z.B. auf den Mischpolymerisaten des 2~Hydroxyäthylmethacrylats (SPHiJROlT) oder auf den Phenol-Pormaldehydkondensaten (DUOLITPa) aufgebaut werden. Zur Aktivierung der Hy-

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droxylgruppen im Träger verwendet man am häufigsten ihre Umsetzung zum Imidocarbonat mit Hilfe von Bromcyan. Die Hydrolyse des Bromcyans, sowie die Bildung des unreaktiven Carbamats gehören zu den ungewünschten IJebenreaktionen. Der Teil des Imidocarbomats bildet auch die Querbindungen, denn Agarose wird z.B« in siedendem Wasser unlöslich. Eine weitere unerwünschte Reaktion ist die Hydrolyse des Imidocarbonats zum Carbonat bis auf die ursprüngliche Matrix» Diese llebenreaktionen gehören zusammen mit den reaktiven und toxischen Produkten des Hydrolyse des Reagens (Brom, Cyanid und Gyanat) zu den wesentlichen Nachteilen der Bromcyanaktivierung, die die Verwendung in größerem Ausmaß (besonders in der Industrie) verhindern· Zur Aktivierung von Hydroxylgruppen verwendet man auch Titan (17)-ehlorid, sym. Trichlortriazin, Diepoxide, Divinylsulfon und Benzochinon, ferner wird die Oxidation von Hydroxylgruppen durch ITatriumperjodat an den Aldehydgruppen, die die Liganden direkt oder über "Spacer", meistens Acylhydrazid, binden, ausgenutzt« Zur Erhöhung der Bindungsfestigkeit wird in diesen Fällen der entstandene Borohydridkomplex reduziert (siehe z.B. Methode in Enzymology, EdoS.F.Colowick und N.O. Kaplan, Bdo 34 and 44)♦

Andere Verfahren nutzen die Oxidation bis auf Carboxyl aus, das dann mit Hilfe von Carbodiimid aktiviert wird, oder das man in den Alkylester überführt, der dann weiter in Eydrazid und Azid umgesetzt wird. Die Carboxylgruppe am Träger kann man auch in die sog_e aktivierten Ester» z.Be durch Umsetzung mit Di-(p-nitrophenyl)sulfit, überführen. Derart hergestellte Ester reagieren direkt mit den Aminogruppen der Liganden unter Bildung der amidischen Bindung. Ss wurde auch die Aktivierung von Kydroxylen am Träger durch direkte Einwirkung von Phosgen beschrieben, wodurch man reaktive Chlorameisensäureester-

gruppen bildet. Die Zellulose wird häufig in eine ihrer üblichen Derivate überführt, das man dann für die Bindung verwendet. So wird z.B. die CarboxyInethy!cellulose (CM-Oellulose) esterifiziert,.woraufhin der Ester ins Hydrazid übergeführt und die Bindung durch die Azidmethode durchgeführt wird.

Es wurde auch die Anlagerung an CM-Cellulose mit Hilfe von Isoxazol-'-schen Salzen, Carbodiimiden und Isocyaniden beschrieben. Die Cellulose kann man mit Bromacetylbromid reagieren lassen und dadurch die Hydroxyle durch Acyl von Monobromessigsäure esterifizieren, woraufhin dann leicht mit den Aminoliganden, bzw» Thiolen versetzt wird· Zur Bindung (Anlagerung) durch Diazotierung kann man die Cellulose durch 4-Chlormethylnitrobenzol modifizieren, das danach auf das betreffende Aminoderivat, das zur Diazotierung und Kopplung fähig ist, reduziert wird.

Diese und andere weniger häufig verwendete Immobilisierungsverfahren weisen verschiedene Nachteile auf. In einigen Fällen ist es die Gefährlichkeit des verwendeten Reagens (BrCU, Bromacetylbromid, Phosgen), das das Verfahren in größerem Umfang verbietet, in anderem Pail der hohe Preis (Trichlortriazin), aber sehr häufig auch, die unbefriedigenden Ausbeuten (TiCl,, Oxidation durch Perjodat, Herstellung von Azid aus der CM-Cellulose usw.). Nur einige der bekannten Aktivierungsverfahren liefern einen aktivierten Träger, den man lagern und verteilen kann; in der Mehrzahl muß man die Bindung (Anlagerung) der Liganden unmittelbar nach der Aktivierung·durchführen«

Mit. der Erfindung sollen die Mangel des Standes der Technik beseitigt, d*h_e ei.n verbesserter aktivierter fester Träger zur Verfugung gestellt werden*

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Darlegung: des Wesens der Erfindung;

Der verbesserte aktivierte Träger ist dadurch gekennzeichnet, daß Träger auf der Basis von in den Seitenketten eine -O-CO-OR^- Gruppe tragenden Polymerisaten verwendet sind, wo R-, den Rest des aktivierten Esters bildet, der aus einer Gruppe, die 4-Nitrophenyl, 2,4-Dinitrophenyl, 2,4,6-Trichlorphenyl, 2,4,5,-Trichlorphenyl, Pentachlorphenol, H-Succiniinidyl, H-phthalimidyl und 8-Ohinolinyl umfaßt, ausgewählt ist· Diese Träger weisen für die üblicherweise verwendeten Liganden eine vorteilhafte Bindungskapazität auf.

Die neuen aktivierten festen Träger wurden nach einem weiteren Merkmal der Erfindung hergestellt, indem man die unlöslichen die Hydroxylgruppen enthaltenden Träger in wasserfreiem Medium mit aktivierten Estern der Chlorameisensäure der allgemeinen Formel ClCOOR-, versetzt, wo RjL den Rest bedeutet, der einer Gruppe ausgewählt wird, die 4-Nitrophenyl, 2,4-Dinitrophenyl, 2,4t 6-Trichlorphenyl, 2,4_?5-Trichlorphenyi, Pentachlorphenyl, IT-Succiniinidyl, N-phthalimidyl und 8-Chinolinyl umfaßt. Die unversetzten Stoffe werden sodann gemeinsam mit dem freigesetzten Chlorwasserstorf durch Durchwaschen beseitigt, woraufhin man das entstandene Produkt entweder zur direkten Bindung der Liganden verwendet oder mit einer niedermolekularen Substanz der allgemeinen Formel ITHg-^ umsetzt _} in der R2 den Rest des Alkylersters der Alkylsäure oder des aromatischaliphatischen Diamias bedeutet und dann in bekannter Weise als Verbindungs&ück (spacer) benutzt.

Der aktivierte Träger ist in trockenem Zustand und in wasserfreien Löaungsmitteln unbegrenzt haltbar und auch in wäßrigen Losungen von verdünnten Säuren (pH unter 5,5) relativ stabil» Der aktivierte Träger reagiert in

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wasserfreien Lösungsmitteln und auch in wäßrigen Lösungen von Stoffen, die freie primäre oder sekundäre aliphatische Aminogruppen oder Hydrazingruppen besitzen»

Der Vorteil der erfindungsgemäßen Aktivierung liegt in der leichten Z_ugänglichkeit und dem niedrigen Preis der verwendeten Aktivierungsreagenzien, und zwar bei Sicherheitsanforderungen, wie sie im chemischen Laboratorium üblich sind. V/eitere Vorteile sind die Beständigkeit des aktivierten Trägers und die hohen Ausbeuten* Besonders vorteilhaft ist der erfindungsgemäß aktivierte Träger .in Verbindung mit der Einführung des Verbindungsstückes (spacer) durch Reaktion des aktivierten Trägers mit dem Alkylester von ω -Aminosäuren, insbesondere von b-Aminohexansäure, wobei das Alkyl des Esters Methyl, Äthyl oder Propyl darstellt, das mit Hydrazinhydrat ins betreffende Hydrazid übergeführt wird. Das Hydrazin hydrat ist einerseits unzuverlässig und beseitigt eventuelle unversetzte aktivierte Ester, andererseits bindet der so hergestellte Träger in hoher Ausbeute die Verbindungen, die Cytosin_s insbesondere · Nucleisäuren, enthalten. Ein weiterer Vorteil liegt · in der Möglichkeit, die unversetzten Hydrazide durch Glucose zu besetzten, Das Hydrazid kann man zur Bindung der die Aminogruppe enthaltenden Substanzen in bekannter Weise in Azid überführen.

Vorteilhaft ist ferner die erfindungsgemäße Einführung des Zwischengliedes, das durch das aromatiach-aliphatische Diamin gebildet wird. Mit dem aktierten Ester der Kohlensäure reagiert in diesem Pall die aliphatische Aminogruppe, wodurch das aromatische Amin zur Diazo-Vierung oder Bindung der Carboxylgruppen der Liganden frei bleibt, die durch Carbodiimid aktiviert werden, das mit den Arylamines in höherer Ausbeute als mit den

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Alkylaralnen reagiert. Durch Diazotierung und Kupplung kann man Peptide und Eiweißstoffe binden, bei denen die .Aminogruppen erhalten werden sollen· Durch Diazotierung; und Kupplung kann man auch die Nucleinsäuren binden·

Die Erfindung betrifft im einzelnen einen in gebräuchlichen Lösungsmitteln unlöslichen, zur Bindung von nucleophilen. Gruppen aktivierten Träger, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er in der Seitenkette eine Gruppe -0-CO-OH₁ trägt, in der mit R₁ eine 4-Mtrophen.yl-, 2,4-Dinitrophenyl-, 2,4,b-Trichlorphenyl-, 2,4,5-Trichlorphenyl-, Pentachlorphenol-, U-Succinimidyl-, H-Phthalixiidyl-, oder 8-Chinolinylgruppe bezeichnet ist, die in wäßrigem und wasserfreiem Medium mit Stoffen reagiert, die freie primäre oder sekundäre aliphatische Amin- oder Kydrasingruppen enthalten, und die entweder die gewünschte Liganden oder das für Bindung von Liganden geeignete Verbindungsstück (spacer), darstellen.

Ausfuhrun.aisbeispiele:

An einigen Beispielen soll die Erfindung nachfolgend näher erläutert werden:

Beispiel 1

5 ml Sepharose (die Perlform des Agargels, das 4 % Agarose enthält, Produkt der Pa Pharmacia) wurden in 1,4-Dioxan übergeführt, die Lösung wurde mit Dioxan auf 10 ml ergänzt, und es wurden O_?35 g Chlorameisensäure-p'" nitrophenolester zugegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 1 1/2 Stunden lang· geschüttelt und mit 1,4-Dioxan durchge\vaschen_o Daa 1,4-Dioxaa wurde abgesaugt, und danach wurden 5 ml 0_?05 M Boratpuffer (pH 8,2),

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25 mg Trypsin (57 E./mg) und 10 mg OaGl₂ zugefügt und bei 4⁰G innerhalb von 2 Stunden geschüttelt. Das Gemisch wurde mit 0,5 M NaCl, das durch 0,01 M Phosphat auf einen pH 7,0 gepuffert wurde, durchgewaschen, bis das Präparat nach der Alkalisierung mit Carbonat nicht mehr gelb gefärbt wurde. Schließlich wurde mit 0,5 % Triton XIOO (Kondensationsprodukt von Iso-octylphenoxylpölyethoxyäthanol und Oxiran, Pa, BDH, England) durchgewaschen· Die gefundene Aktivität betrug 71 E./ml.

Beispiel 2 . .

5 ml sphärische Cellulose (die nach dem Tschechoslowakischen Urheberschein ITr. 172 640 hergestellt wurde) wurde wie im Beispiel 1 verarbeitet mit dem Unterschied, daß das Schütteln in 1,4-Dioxan mit Chlorameisensäurep-nitrophenylester auf 4 Stunden verlängert wurde, es wurden 0,03b mäquiv/ml Uitrophenol angelagert. Die resultierende Aktivität des immobilisierten Trypsins betrug 62 E./ml·

Beispiel 3

An 5 ml sphärische Cellulose nach dem Tschechoslowakischen Urheberschein Hr. 172 64O wurde Chlorameisensäure-p-nitrophenylester wie im Beispiel 2 angelagert, und nach dem Durchwaschen mit 1,4-Dioxan wurden 10 ml 1,4-Dioxan, das 0,3 g Hydrochlorid des £ -Aminohexansäureaethylesters und O₃39 ml Triäthylamin enthielt, zugegeben. Es wurde eine Stunde geschüttelt, mit Wasser durchgewaschen und mit 5 ml 80 % Hydrazinhydrat übergegossen, bei 6O⁰G 16 Stunden lang stehen gelassen und durchgewaschen» Das Präparat enthielt 0,008 mäquiv/ml Eydrazid von £ -Aminohexansäure.

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Beispiel 4

Das Präparat, das nach dem Beispiel 3 gewonnen wurde, wurde bei 4⁰C innerhalb von 10 Minuten mit 5 ml 1 M HOl und 0,1g NaUOg geschüttelt, das Gemisch wurde filtriert, mit Eiswasser und 50 ml eiskaltem Boratpuffer wie im Beispiel 1 durchgewaschen, und danach wurde Trypsin auf dieselbe Weise wie im Beispiel 1 angelagert· Die gefundene Aktivität betrug Il6 E./ml_o

Beispiel 5

An 5 ml sphärische Cellulose wurde Chlorameisensäure- . p-nitrophenylester wie im Beispiel 2 gebunden und nach Durchwaschen mit 1,4-Dioxan wurde das Gemisch mit 5 ml. 80 % Kydrazinhydrat übergegossen, bei der Raumtemperatur eine Stundengeschüttelt und mit Wasser durchgewaschen. Es wurden 0,01 mäquiv./ml Hydrazin angelagert.

Beispiel 6

Das Produkt aus dem Beispiel 5 wurde nach dem Verfahren vom Beispiel 4 in Azid übergeführt. Die gefundene Aktivität des angelagerten Trypsins betrug β Ε./ml.

Beispiel 7

1 g Spheron P-1000 (makrcporöses Perlmisohpolymerisat von 2-Hydroxyäthylmethacrylat und Aethylendimethacrylat, Produkt der Fa Lachsraa, Brunn (20 bis 40 /um) wurde wie in den Beispielen 3 und 4 verarbeitet. Die gefundene Aktivität des Trypsins betrug 123 E

JLW

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Beisoiel 8

1 g niakroporöses sphärisches Mischpolymerisat aus GIycidylmethacrylat und Athylendimethacrylat (P. Svec und Mitarb, Angewandte Makromolek. Chemie 63, 23 /1977/) wurde durch -Hydrolyse mit 0,25 M HoSO₇, (3 Std./80°C) in die Hydroxylform übergeführt und nach dem Durchwaschen nach dem Verfahren der Beispiele 3 und 4 verar beitet. Die gefundene Aktivität des Trypsins betrug 51 E./ml.

Beispiel %

Nach dem im Beispiel 7 beschriebenen Verfahren wurden an Spheron P-IOOO 125 mg Penicillinamidase (3>5.1.11) mit einer spezifischen Aktivität von 3»5 Ε,/mg gebunden, mit dem Unterschied, daß 10 mg CaCl₂ nicht zugegeben wurden« Die gefundene Aktivität des Endproduktes betrug 40 E./ml.

Beispiel 10

An 5 ml Sepharose C1-4B wurde der Chlorameisensaurep-nitrophenylester wie im Beispiel 1 gebunden und nach dem DurcjTwaschen mit 1,4-Dioxan wurden 10 ml 1,4-Dioxan, das 1,5 g !,b-Diaminohexan enthielt, zugefügt» Nach einstündigem Durchschütteln bei Raumtemperatur wurde mit Wasser durchgewaschen, Es wurden 0,008 mäquiv./ml Diamin gebunden. Das Produkt wurde in 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7), der 1 ml destilliertes Glatardialdehyd enthielt, It Stunden lang bei Baumtemperatur geschüttelte Ss Yv'urde mit reinem Puffer durchgewaschen und mit 5 ml desselben Puffers, der jedoch 10 mg CaGl₂ und 25 mg Trypsin enthielt, übergössen, danach 4 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeschüttelt und wie im Beispiel 1 durchge¥faschen_e Die gefundene Aktivität betrug 47 E./ml.

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Beispiel 11

125 mg Penicillinamidase wie im Beispiel 9 wurden in dem mit Verfahren nach Beispiel 10 verwendet, mit dem Unterschied, daß der übergegossene Puffer kein CaGIp enthielt. Ea wurden 25 E./ml angelagert»

Beispiel 12

Bei dem Verfahren nach Beispiel 1 wurden anstatt des Chloramiessnsäure-p-nitrophenylesters 0,3 g H-Hydroxysuccinimidester der Chlorameisensäure verwendet. Die gefundene Aktivität betrug 83 E*/ml.

Beispiel 13

Bei dem Verfahren nach Beispiel 1 wurden anstatt des Chlorameisensäure~p-nitrophenylesters 0,5 g S-Hydroxychinolinester der Chlorameisensäure verwendet. Die gefundene Aktivität betrug 54 E./ml.

Beispiel 14

Bei dem Verfahren nach Beispiel 1 wurde anstatt des Chlorameisensäure-p-nitrophenylesters des Chlorameisensäure-pentachlorpehnynlester verwendet. Die gefundene Aktivität betrug 35 S./ml_e

Beispiel Ij?

Bei dem Verfahren nach Beispiel 1 wurde anstatt Chlorameisensäure-p-nitrophenylester der.Chlorameisensäure-2,4,5-trichlorphenylester verwendet. Die gefundene Aktivität betrug 73 E./ml_o

All Τι

Beispiel Ib

Bei dem Verfahren nach Beispiel 1 wurde anstatt des Chlorameisensäure-p-nitrophenylesters der Chlorameisensäure-2,4,fc>-trichlorphenylester verwendest. Die gefundene Aktivität betrug 40 Ee/ml.

Beispiel 17

Bei dem Verfahren nach Beispiel 1 wurde anstatt Chlorameisensäure~p-nitrophenylester der Chlorameisensäure-N-hydrozyphthalimidester verwendet. Die gefundene Aktivität betrug 63 S./ml.

Beispiel 18

Bei dem Verfahren nach Beispiel 1 wurde anstatt Chlorameisensäure-p-nitrophenylester der Chlorameisensäure-2,4-dinitrophecLylester verwendet. Die gefundene Aktivität betrug 86 Eo/mle

Beispiel 19

An 5 Eil Spheron P-1000 wurde Chlorameisensäure-p-nitrophenylester wie im Beispiel 2 durch Schütteln innerhalb von 4 Stunden gebunden, und nach Durchwaschen mit 1,4-Diosan yrarden 10 ml 1,4-Dioxan, das 1,5 g 4-Amino-(2->aminoäthyl)benzamidhydrochlorid und 0,55 ml (100 %) Triäthylamih enthielt, zugegeben, eine Stunde lang geschüttelt und mit Wasser durchgewaschen. Ss wurden 0,01 mäquiVo/ml Arylamin des 4-Aminobenzamids angelagert.

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Beispiel 20

Das nach dem Beispiel 19 erhaltene Produkt wurde wie im Beispiel 4 verarbeitet, mit dem Unterschied, daß anstatt des Boratpuffers eine gesättigte Lösung von HaHCOo im Eiswasser verwendet wurde» Die festgestellte Aktivität des angelagerten Trypsins betrug 54 E*/ml.

Beispiel 21

Das nach dem Beispiel 19 erhaltene Produkt wurde in 20 ml Eiswasser suspendiert, und der pH wurde auf 5»O eingestellte Es wurden 50 mg Penicillinamidase (wie im Beispiel 9) zugefügt und 740 mg li-C^clohexyl-N^l-2-(4-morpholinyl)acethylcarbodiimid des Methyl-p-toluolsulfonate in drei Portionen unter ständigem Kühlen mit Eis aufgelöst. Im Laufe der Reaktion wurde der pH unter leichtem Rühren mit Hilfe eines automatischen Titrators auf dem Ausgangswert gehalten. Die Zugabe dauerte 2 Stunden, das Kühlen mit Eis wurde eine weiters Stunde lang fortgesetzt, und die Reaktion wurde durch Inkubation bei Raumtemperatur innerhalb von weiteren drei Stunden 'beendet. Das Durchwaschen verlief wie im Beispiel 1. Die gefundene Aktivität des immobilisierten Enzyms betrug 20 E./ml,

Beispiel 22

Das im Beispiel 9 gewonnene immobilisierte Präparat wurde mit 25 %iger Saccharose-Lösung im Verhältnis 1;5 vermischt und lyophilisiert. Es wurde in eingeschmolzener Ampulle bei der Raumtemperatur ein Monat lang aufbewahrte Nach dieser Zeit wurde die Aktivität kontrolliert» Es wurden 93 % der ursprünglichen aktivität festgestellt»

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Beispiel 3Q

5 ml festes N-(2-Hydroxypropy1Methacrylamid, das mit Äthylendimethacrylat vernetzt.wurdej wurden wie im Beispiel 7 verarbeitet· Anschließend wurde das Verfahren wie im Beispiel 3 und 4 angewendet. Die Schlußaktivität des gebundenen Trypsins betrug 62 Eo/ml.

Claims

-ι?- 211 12.7;

Erfindungsanspruch

Verfahren zu* Hexstellung eines polymeren, zux Bindung von nucleophilen Gxuppen aktivierten Trägers, der aktive Gruppen der allgemeinen Formel I

- 0 - CO'- 0Ii₁ (I) .

enthält, worin mit R₁ ein 4-Nitrophenyl-, 2,4-Dinitrophenyl-, 2,4-,6-Trichlorphenyl-, 2,4,5-T^iciiloxphenyl-, Pentachlorphenyl-, N-Succinimidyl-, N-Phthaliaiidyl- oder 8-ChinolinyIxest bezeichnet ist, gekennzeichnet daduxch, daß man die Polymerisate mit den Hydroxylgruppen, die aus der Gruppe, die Polysaccharide·, Phenol-Formaldehyd-Haxz, Polyacrylat oder Polyacrylamid der allgemeinen Formel II

X
I
—4—CHp-C-* (II)

COYZ

, worin X ein Wasserstoffatom oder eine CHv-Gruppe, Y eine KH-Gruppe oder ein Sauerstoffatom und Z ein Mono- oder Di-hydroxyalkyl mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen im Aikylrest bedeuten, enthält, ausgev/ählt sind, mit aktiven Estern der Chlorameisensäure der allgemeinen Formel III

Cl-CO-O-R₁ . (Ill)

versetzt, worin R₁ den Rest bedeutet, der aus einer Gruppe, die 4-Kitxophenyl, 2,4-Dinitrophenyl, 2,4-,6-£richlorphenyl, 2,4,5-Trichlorphenyl-, Pentachlorphenyl, N-Succiaimidyl, K-Phthalimidyl und 8-Chinolinyl umfaßt, ausgewählt ist.

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Beiepiel 23

Das nach dein Beispiel 3 erhaltene Produkt wurde in 10 ml Acetatpuffer (0,2 M, pH 4,2) suspendiert und es wurden 10 ml Lösung der Desoxyribonucleinsäure in 1 M UaGl, die 1,7 iag Desoxyribonucleinsäure DNA/ml enthielt, zugegeben. Es wurde bei 60⁰G 24 Stunden lang geschüttelt. Nach dieser Zeit wurde die Suspension mit 1 M NaGl und mit Wasser durchgewaschen, es wurden 10 ml Acetatpuffer (pH 5), der 5 % Glucose enthielt, zugegeben. Danach wurde wiederum bei 60 C 2 Stunden lang geschüttelt und wie vorher durchgewaschen. Das Präparat enthielt 12 mg DNA/ml und wies keine Reaktion auf reie Hydrazide auf·

Beispiel 24

Bei dem Yerfahren des Beispiels 23 wurde anstatt der DNA-Lösung eine Lösung von Cytosin in einer Menge von 8,9 mg/ml verwendeten Träger verwendet. Es wurden 0,7 mg Cytosin pro 1 ml Präparat angelagert.

.Beispiel 25

An einem sphärischen makroporösen Träger wie im Beispiel 8 wurde spezifischer Gegenstoff (Immunoglobin, IgG) gegenüber dem Kaninehen¹s Gammaglobulin angelagert. Zu dem aktivierten Träger wurden 25 mg IgG je 1 g Träger zugegeben» Es wurden 85 % zugegebener Eiweißstoff angelagert, der sich seine immumologische Spezifität erhielt, wie sie durch Anlagerung des betreffenden Antigens verifiziert wurde.

Be JSpJeI2 6 ·

Das Produkt des Beispiels 19 wurde wie im Beispiel 20 verarbeitet, mit dem Unterschied, daß anstatt des Tryp~

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If 127

sins der pancreatische Inhibitor des Trypsins verwendet wurde. Zu dem aktivierten (Träger wurden 15 mg/g Inhibitor zugegeben. Es wurden 6 % zugegebene PoIypeptid angelagert, das zur Affinitätsreinigung des Trypsins verwendet wurde»

Beispiel 27

5 ial sphärische Cellulose (hergestellt nach dem Tschechoslowakischen Urheberschein ITr. 17ö 64O) wurden wie im Beispiel 2 aktiviert. Each der Aktivierung wurde anstatt der Trypsinlösung eine Lösung, die in 5 ml 25 mg Concanavalin A enthielt, verwendet. Das gewonnene Präparat wurde in eine Kolonne übergeführt, auf die das Kalbserum aufgetragen wurde. Nach gründlichem Durchwaschen wurden die angelagerten Glycoproteine mit der GIucoeelösung freigesetzt. Aus den 5 ml des verwendeten Präparates v/urden insgesamt 11,5 mg Glycoproteine freigee setzt.

Beispiel 28

5 ml Sorbens Duolite S 30 (makroporöses Phenol-Formal« dehyd-Polymerisat, Produkt der Pa JJiamond-Shamrocl, USA) wurden auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2 verarbeitet. Die gefundene Aktivität betrug b8 Ξ,/ml.

Beispiel 29

5 ml fester Phenol-Pormalsdehyd-Träger "Duolite Enzyme Support" (Produkt Ser Pa Diamond-Shamrock, USA) wurden wie im Beispiel 2 verarbeitet, mit dem Unterschied, daß anstatt des Trypsins die Penicillinamidaae, die im Beispiel 9 beschrieben wurde, ohne gleichzeitige Zugabe von CaGl₂ zugefügt wurde _a Die gefundene Aktivität des resultierenden Produktes betrug 34 iS./ml»

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