DE1815332C3 - Verfahren zur Bindung von Proteinen, Polypeptiden, Peptiden oder Derivaten derselben an in Wasser unlösliche Polymere mit einer oder mehreren Hydroxyl- oder primären oder sekundären Aminogruppen - Google Patents

Verfahren zur Bindung von Proteinen, Polypeptiden, Peptiden oder Derivaten derselben an in Wasser unlösliche Polymere mit einer oder mehreren Hydroxyl- oder primären oder sekundären Aminogruppen

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DE1815332C3 DE1815332A DE1815332A DE1815332C3 DE 1815332 C3 DE1815332 C3 DE 1815332C3 DE 1815332 A DE1815332 A DE 1815332A DE 1815332 A DE1815332 A DE 1815332A DE 1815332 C3 DE1815332 C3 DE 1815332C3
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Description

Vorliegende (.rfindung betriffl den in den Palcntan-Sprüchen definierten Gegenstand
Proteine. Polypeptide. Peptide oder Derivate dcrscl bcn mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -YII. wobei YH eine primäre oder sekundäre Aminogruppe isi. dc.cn Bindung an Polymere von i"> Speziellem Interesse ist. sind beispielsweise Fnzyme. Antikörper. Protein- und/oder Peptid-Hormone. Anti gen-Proteine. Allcrgenc sowie llaptene. Fm wichtiges Beispiel sind die Antikörper, die zur analytischen Bestimmung auf diese Weise .in Polymere gebunden v> werden können.
Beispiele für Polymere mn einer oder mehreren Gruppen der lormel XII. wobei XII cmc Hydroxyl oder cmc primäre oder sekundäre Aminu gruppe darstellt, sind Polysaccharide wie Dcxlrnn. v, Cellulose. Slarkc. Dextrin und Agar Agar. Copolymere von Dextran mil Fpichlorhydnn oder Derivate dieser Verbindungen wie I lydroxyaihyli ellulosc und 2 I lydro xy-J (4 amino phenoxy) propyl substituierte (opoly mere vun Dextran mn Lpichlurhydnii. Audi l'olyaminu mi styrol isl ein geeignetes Polymer.
Zur Herstellung eines reaktionsfähigen Derivats eines derartigen Polymeren bislang bekannte Verbindungen willen Mittel zur Kinfiihrting von A/idgruppcn, Isocyanatgruppen und Diazonitinigrtippen. Die I lersicl- Wi lung derartiger reaktionsfähiger Derivate war häufig kompliziert und die f'rgcbnissc nur schwer reproduzierbar. Fs war ferner bekannt, reaktionsfähige Gruppen in ein Polymeres einzuführen, das eine oder mehrere Gruppen der Formel - XH aufweist, und zwar durch Behandeln des Polymers mit Bromcyan. Diese Verbindung ist jedoch sehr toxisch und daher zum Arbeiten in technischem Maßstab ungeeignet. Während Bromcyan ein reaktionsfähiges Derivat ergibt, das unter verschiedenen Gesichtspunkten außerordentlich gute Eigenschaften zeigt, besteht ein gravierender Nachteil dieser Verbindung darin, daß die Reaktionsfähigkeit des so erhaltenen Derivates kaum variiert bzw. dem jeweiligen Fall angepaßt werden kann. Demgegenüber wird erfindungsgemäß zur Bildung des reaktionsfähigen Derivats des Polymeren eine Verbindung eingesetzt, die eine oder mehrere Cyanatgruppen aufweist
Aus Annual Review of Biochemistry, Bd. 35, S. 873 ff. (1966) ist bekannt, verschiedene aminogruppenhaltige Enzyme durch kovalenle Bindungen an polymere Träger zu kuppeln, welche durch Einführung von Azid-. Bromacetyl- oder Diazoniumgruppen aktiviert wurden.
Die Verwendung von Cyanatverbindungen als »Bindungsvermittler« zwischen z. B. Enzymen oder Antikörpern mit einer oder mehreren primären oder sekundären Aminogruppen einerseits und andererseits polymeren Trägern, wie /_ B. einem Polysaccharid, wurde jedoch durch den Stand der Technik nicht nahegelegt, und es isl als im hohen Maße überraschend anzusehen, daß z. B. Enzyme und Antikörper nach dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise Antikörper — auch sehr empfindliche — unter Verwendung dieser speziellen Bindungsvcrmiitler an polymere Träger unter sehr schonenden Bedingungen gebunden werden können, ohne daß hierbei deren Fähigkeit, ihr Antigen zu binden, verlorengeht.
[■'in beträchtlicher \ urteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darüber hinaus in der Möglichkeit, dieses an die jeweiligen speziellen zu bindenden organischen Verbindungen, wie z. B. Proteine, hinsieht lieh Reaktivität und Reaktionsgeschwindigkeit anzupas sen. indem man eine unter dem jeweiligen dominieren den Gesichtspunkt optimale Cyanatvcrbindung aus wählt, was mit keinem der bislang bekannten Bindungs Vermittler möglich war.
Bevorzugte, cmc oder mehrere Cyanatgruppcn aufweisende, als Biiulungsvermittler verwendbare Vcr bindungen besitzen die allgemeine Formel
U(OCN),
in der R beispielsweise emc I lalogcnalkylgruppc. eine substituierte aroma 1 ische (!nippe, cir !lelerocyclisclu-s Ringsyslcm oder cmc cycloaliphatische Gruppe und t du· Zahl I oder 2 bedeuten. Substilucnlen der aniiiiiitiM'hcn (»"tippe sind beispielsweise Nitrogruppen. Halogen, wie z.B. Chlor. Aikylrcstc. wie ζ. Β der Melhyl oder tcrl. Bulylrcsl. und Alkoxygruppcn. wie z. B. die Mclhoxygruppc
Die beim crfindiingsgcmäBen Verfahren eingesetzten Verbindungen mit mindestens einer ( ynnalgriippi· können sehr verschiedener Natur scm Fs kann sich beispielsweise iini substituierte oder unsubstiliiierle urgiinisdic VcrbtnUungwn, wig /. H. subsliuiicnc üiler iihsubslilüicrtc aliphatischc, alicycliseh-aromalischc öder heterocyclische: Cyimillvefbindüngcin handeln, oder um an anorganische Cyanate, wie z. B. Nalriumodcf Kiilitimcyanal. Als Beispiele für derartige Verbindungen seien genannt.
/J./i./if-TrichloriiihylcyaniJt,
I -AdüinaniylcyanaU Phcliylcyanat,
o-Nitrophcnylcyanal, p-Niirophcnylcyniiai.
m-Chlorphenylcyanai, p-Meihoxyphenylcyanai.
o-ieru-Butylphenylcyanat,
2^-Dimeihyiphenylcynnat,
Z^b-Tri-teru-butylphenylcyanat.
2-Naphthylcyanat und
1,4-Dicyanatobenzo!.
Das erfindungsgeniäße Verfahren besteht aus zwei Stufen. In der ersten Stufe wird das reaktionsfähige Derivat des Polymeren hergestellt, indem man das eine oder mehrere Gruppen der Formel — XH enthaltende Poiymere mit dem betreffenden Cyanat in Berührung bringt. Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in wäßriger Lösung oder Suspension, ivunei sowohl saure wie auch basische Bedingungen möglich sind. Die pH-Werte liegen jedoch im allgemeinen zwischen 7 und 13. Die Reaktion kann ferner in von Wasser verschiedenen Lösungsmitteln, beispielsweise mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie z. B. Aceton oder Dioxan. erfolgen. Zur Einstellung des /weckmäßigen pH-Werts oder pH-Bereichs geeignete Verbindungen sind Natriumhydroxyd. Calciumhydroxyd. Natriumbicarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat und Triäthylamin. Der geeignete pH Wert oder pH-Bereich, der unter anderem von der Reaktionstemperatur und -/eil abhängt, kann leicht ermittelt werden. Die Umsetzung kann bei verschiedenen Temperaturen, beispielsweise 0 bis 50"C, durchgeführt werden, und die Reaktionszeit kann in einem breiten Bereich schwanken und beispielsweise bis zu mehreren Stunden betragen. Das reaktionsfähige Derivat des Polymeren wird vor der Bindung an die oibanische Verbindung, wie z.B. das Protein, zwcckmäßigerweise gcrcir ^t, beispielsweise durch Waschen mit geeigneten '.ösungsiriiteln. wie z. B. Wasser oder Aceton.
In der zweiten Verfahrensslufe. d. h bei der Bindung des reaktionsfähigen Derivats des Polymeren an die organische Verbindung, wie z. B. das Protein, die eine oder mehrere Gruppen der Funnel - Yl I aufweist, wird in einer schwach alkalischen wäßrigen Lösung bei einer Temperatur von im allgemeinen 0 bis 50"C". beispielsweise bei Raumtemperatur, gearbeitet.
Fin wesentlicher Vorteil bei der Verwendung von Cyanverbindungen als Mittel zur Finführung der reaktionsfähigen Gruppen in das Polymere besteht darin, daß man auch sehr empfindliche organische Verbindungen, wie z. B. Proteine, an Polymere binden kann, ohne daß crsterc einer nicht erwünschten Veränderung unterliegen. Durch Umsetzung des die Gruppen der Formel XH enthaltenden Polymeren mn verschiedenen ('yanalverbindungen erhält man sehr reaktionsfähige Zwischenprodukte, die schema lisch wie folgt dargestellt werden können:
P X ( O U1
NII
worm X die weiter oben genannte üedeiiUing besil/l. Ri den Resl des ( yanals und P das Polvmcre darstellen. Diese iiwischcnpmilukle reagieren leithl unler milden Keäklioiisbcdingüngcn mit einer Aniihogrlippe der betreffender) organischen Verbindung, Wie /. Ii. des i'roicins. Beispielsweise kann man eitlen Antikörper auf diese Weise an das Polymere binden, ohne daß die Fähigkeit des Antikörpers zur Bindung seines Antigens vcrlorcngchl.
Ein Beispiel für ein in Wasser unlösliches Polymeres ist ein Copolymcrcs aus Dextran und Epichlorhydrin (»Sephadex«). Dieses Polymer zeichnet sich durch verschiedene Wasseraufnahme und variierende Teilchengrößen aus. Zur Bindung beispielsweise von Antikörpern an das Dextran-Copolymere kann man eine aus kleinen Körnchen, vorzugsweise von 1 — 10 μηι bestehende Form derselben verwenden.
Aus nachstehendem Beispiel ist ersichtlich, daß die Art des Substituenien in der organischen C'yanatve. bindung variiert werden kann. Der Substituent kann fähig
to sein. Elektronen abzugeben oder aufzunehmen, ferner kann er eine gewisse sterische Hinderung verursachen: die Stellung des Substiluenten zur Cyanatgruppe ist nicht wesentlich. Die Aktivierung des Polymeren kann bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen erfolgen, wobei für jede einzelne Cyanatverbindung die besten Bedingungen leicht feststellbar sind.
Beispiel 1
A) Die Herstellung des
reaktionsfähigen Derivats des Polymeren
Allgemeines Verfahren
1 g des Polymeren (/.. B. vcrnetztes Dextran. Agar-gel r> von Agar-Agar. Cellulose) wird in 40 ml destilliertem Wasser 3 Minuten lang gerührt, dann werden 2 g der mindestens eine Cyanatgruppe aufweisenden Verbindung zugesetzt. Der pH-Wert wird aul 10.7 eingestellt und durch automatische Zugabe einer wäßrigen jo 2molaren Lösung von Natriumhydroxid auf diesem Wert gehalten. Die Reaktion wird 6 Minuten lang fortgesel/t. dann wird das Reaklionsprodukt abfiltriert und sorgfältig mit Wasser. Aceton und Wasser und schließlich Aceton gewaschen und getrocknet.
r> Die Herstellung des reaktionsfähigen Derivats kann auch bei anderen pH-Werten und unter Verwendung anderer Reaktionszeiten (Tabelle 5) erfolgen.
B) Bindung von organischen Verbindungen,
in die eine oder mehrere (iruppen der Formel YH
enthalten, an das
reaktionsfähige Derivat des Polymeren
I. Bindung von Insulin-Antikörpern an Teilchen
aus vernetzten) Di Uran. Agar-Agar und Cellulose
100 mg des reaktionsfähigen Derivats werden in 400 μΙ eines Natriuincarbonai-Natriumcarbonat-Pufiers (pH-Wen 9.2) 10 Minuten lang gequollen. 100 μΙ der 1 östing des Antikörpers in der gleichen Pufferlösung
in werdendem reaktionsfähigen Derivat zugegeben, dann wird bei f 4 C 2 bis 3 Tage lang geschüttelt. Danach gibt .nan wenige ml einer 0.1 molaren Nalriumbicarbo nallösting zu. worauf zentrifugiert und die klare Losung abgesaugt wird. Der feste Rückstand wird mn
r, 0,1 molarer Nairitimbicarbonallösiing. 0,5molarcni Is sigsäurcpuffer (pH-Wert 4.5) und schließlich mit dem Puffer, der später für die auszuführende Analyse der 125 g Insulin Adsoibtion verweuclil wird (vgl. Tabelle I —4). gewaschen.
2. Bindung von Glycyllciicin und
GlycyltyiOsin an das reaktionsfähige Derivat
von vernetztcm Dextran
0,20 g des reaktionsfähigen Derivats von verhetztem Dextran und 0,08 g Glyeyllcuein oder Glycyltyrosin Werden in I nil einer Nalriumcafbonät-Nälriiimbicafboiiat-Ptiffcriösung (pH 9,2) 2 Tage lang bei 4°C gerührt. Das Produkt wird abfiltriert Und (Hit 0,5niolarcr
Natriumbicarbonatlösung und 0,01 molarer Salzsäure und und 1 molarem NaCI und schließlich mil Wasser gewaschen. Das gewaschene Produkt wird mit Aceton geschrumpft und getrocknet.
Analyse:
1) Die an das vernetzte Dextran gebundene Menge Gljcylleucin beträgt 13%.
2) Die an das vernetzte Dextran gebundene Menge Glycyltyrosin beträgt 12%.
3) In den folgenden Tabelle werden die Eigenschaften verschiedener Arten von vernetzten! Dextran, die durch verschiedene organische Cyanate aktiviert sind, miteinander verglichen.
Die Ergebnisse der jeweiligen Tabellen sind nicht untereinander vergleichbar. Unter cpm wird die Anzahl von Ausschlägen pro Minute angegeben, die mit 125 J-Insuün, absorbiert durch 0,1 mg eines Komplexes zwischen Antikörpern und aktiviertem vernetzten Dextran, erhallen wird.
Tabelle 1 Tabelle 6
Cyanat
cpm
Phenylcyanat
p-Nitrophenylcyanat
o-Nitrophenylcyanat
in-Chlorphenylcyanat
Tabelle 2
9200 9300 4600 1400
Cyanat
cpm
Phenylcyanal
p-Methoxyphenylcyanat
2,4-Dichlorphenylcyanat
2-tert.-Butylphenylcyanat
1-Ad- mantylcyanat
2.6-Dimethylphenylcyanat
Tabelle 3
2600 2240
540 2040
580 1100
Cyanal
^,ff./i-Trichloräthylcyanat
2.4.b-Tri-tert.-bulyIphcnylcyanai
Tabelle 4
Cyanal
cpm
34 18
cpm
I-Naphihylcyanat
1.4-Phenylendicyanal
l'henykyanal
Tabelle 5
1200
600
1250
Cyanal
pH
Aklivierungszcil
Min.
cpm
Phcnylcyanat 10,7 1,5 112 000
Plienylcyarmt 10,7 6 93 000
Fhenylcyanal ?. 6 44 000
Phenylcyanat I 6 4 000
Phetiyleyarial 4 6 7 000
Cyanal
Polymer
cpm
Phenylcyanat
im Handel erhältliches.
mit Epiehlorhydrin
vemetzies Dextran 9200
(Handelprodukt
Sephadex®)
Cellulose 9000
Agar-Agar 9100
(Handelsprodukt
Sepharos®)
Tabelle 7
Cyanat
Polymer
cpm
Natriumcyanat
Polyvinylalkohol
vernei-; es Dextran 1000
(vgl. Tab. 6)
dito 700
i. Bindung von Insulin-Antikörpern an Teilchen aus vernelztem Dextran
Es wurde nach obigem Verfahren. B) Kap. 1. gearbeitet, jedoch mit folgenden Abweichungen:
Die Lösung des Antikörpers wurde dem reaktionsfähigen Derivat zugesetzt und bei +23"C 1. 2.4.6 bzw. 24 Stunden lang geschüttelt. Dk- Lrgebnissc sind in Tabelle 8 zusammengefaßt.
Tabelle
Cyanal
Reaktionszeit
cpm
Phenylcyanat
Phenylcyanat
Phenylcyanal
Phenylcyanal
Phenylcyanat
4500 4700 4800 4800 4800
Mit Ausnahme von I-Adamaniykyanal und o-Nitro-4Ί phenylcyanal waren alle getesteten Cyanat-Verbindung aus der Literatur bekannt (vgl. Angew. Chem.. Bd. 79. S.
219 [1967]). Das l-Adamaniylcyanat wurde nach einem an sich bekannten Verfahren wie folgt hergestellt (vgl. J.
Am. Chem. Soc. Bd. 86. S. 4732. [1964]). ebenso das o-Nitrophenylcyanat (vgl. Chem. Ber. Bd. 97. S. 1018 [!964]).
1-Adamantylcyanat
Fine 50%ige Suspension von 5 g Nairiumhydrid in Öl
5·; winde zweimal mil trockenem Benzol gewaschen, das dann abdekanliert wurde. Das Nairiumhydrid wurde sodann in 75 ml trockenem Benzol dispergicrt. danach wurden Ib.' g 1-Adamamanol zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Rühren 4 Stunden unter Rückfluß erwärmt.
dann wurde auf Raumtemperatur abgekühlt.
Sodann wurden 10,5 g Bromcysn in 25 ml trockenem Benzol gelöst, im Verlauf von etwa 15 Minuten zugetropft. Nach weiterem lOminüligcm Rühren wurde der Niedersc'tlag abfiltriert und mit trockenem Benzol gewaschen. Filtrat und Waschlösungen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft. 10 g des Rückstands wurden in 25 ml siedendem Benzol gelöst, und die Lösung wurde über Nacht bei -20°C stehengelassen.
Der resultierende Niederschlag wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde als Aktivicrungsmittel verwendet.
o-Nilrophenylcyanat
13,9 g o-Nitrophenol und 11,1 g Bromcyan wurden in ml Aceton gelöst. Dann wurden 10,1 g Triüihylumiii unter Eiskühlung mit solcher Geschwindigkeit zugetropft, daß die Temperatur nicht über 100C anstieg. Nach beendeter Zugabe wurde noch 5 Minuten lang geführt. Sodann wurde das Rcaklionsgemisch filtriert, und das Fillrat wurde in Eiswasscr gegossen. Das Produkt wurde abfiltrierl und in einem Exsiccator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhielt 14,2 g Produkt (87% Ausbeute). Dieses Rohprodukt wurde als Aktivicrungsmittcl verwendet.
Beispiel 2
Bindung von Antikörpern
gegen Immunglobulin-lgF. an ein mit aromatischen
Aminogruppen substituiertes
Polyacrylnmidpolymcr und an Keratin
(A) Aktivierung des Polymeren
durch Umsetzung mit Phenylcyanat
I) Als Polymeres wurde ein mit p-Aniinophcnylgruppcn substituiertes, vernctztcs Polyacrylamid verwendet, dessen Struktur-Hauptmerkmale aus der nachfolgenden Formel ersichtlich sind (Handelsprodukl Enzacryl® der Firma United Kingdom Company, Koch-Light Laboratories, Ltd., CaImbrook, Buckinghamshire)
— CU — CUj--CH — CH2-CH — ClU—CH -CHt -CH CH*
CONH, CONH,
CONH,
NH CO j
CII, j CONII < O> Nil,
NH — CO i
-CH CH2-CH -CH2-CH-CH2-CH CH2- CH CtI,
CONH,
CONH CONH, CONH,
NII,
Zur Aktivierung des Polyarylamidpolymeren wurden 50 g desselben in 10 ml destilliertem Wasser 3 Minuten bewegt, wonach 100 mg Phcnylcyanal
/.UgCgtUCl:
UlVJCtI. L-MV. Γ-MVUVICI Ullg WUIUC UCI
45
einem pH-Wert von 10,7 durch automatische Zugabe einer wäßrigen 2-m Natronlauge während 6 Minuten bei Raumtemperatur bewirkt. Das aktivierte Gel wurde auf einem Glasfilter unter Absaugen zuerst mit Wasser, dann mit Aceton und abermals mit Wasser gewaschen. Das Produkt wurde in Aceton geschrumpft und im Vakuum bei 20° C getrocknet.
2) In 40 ml destilliertem Wasser wurde 1 g entfettete Schafwolle (Keratin) während 3 Minuten bewegt, wonach 1 g Phenylcyanat zugegeben wunde. Der pH-Wert wurde auf 10,7 eingestellt und durch automatische Zugabe einer wäßrigen 2-m Natronlauge bei diesem Wert gehalten. Die Umsetzung wurde 6 Minuten fortschreiten gelassen, wonach das Reaktionsprodukt abfiltriert und sorgfältig mit Wasser und Aceton gewaschen, sodann mit Aceton geschrumpft und im Vakuum bei 20°C getrocknet wurde.
(B) Bindung von Antikörpern
gegen ImmungIobulin-IgE(Anti-IgE)anden
polymeren Träger
1) 25 mg des aktivierten Polyacrylamidpoiymeren in 4 ml einer 0.1 -m Natriumbicarbonatlösung wurde mit 50 ul einer Lösung von A--E. weiche 10 mg pro ml enthielt, versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bewegt, und die Teilchen wurden zunächst zweimal während 30 Minuten mit einer G,5-tn iNlii
gcWaaCiieu ünvi
sodann 3 Stunden mit 0,5-m Ethanolamin in 0,1 molarer Natriumbicarbonatlösung umgesetzt. Die Teilchen wurden zweimal mit 0.5-m NaHCOj-Lösung, sodann 2 Minuten mit einer 0,1-m Natriumacetatlösung und sodann 30 Minuten mit einer 0.1-m Natriumacetatlösung gewaschen. Die Teilchen wurden in einem Puffer suspendiert, welcher 0,05-m Phosphalpuffer vom pH-Wert 4, 0.9% NaCI, 0,3% Humanserumalbumin, 0,05% des Handelsproduktes Tween 20 und 0,01% NaN3 (als Inkubationspuffer) enthielt.
0.5 ml der zuvor beschriebenen Suspension mit einem Gehalt an 0,5 mg Teilchen pro ml wurden mit 50 ml einer IgE-Lösung mit einem Gehalt an 400 Einheiten (British Research Standard 68/341) IgE pro ml vermischt und 3 Stunden bewegt. Die Probe wurde mit dem Inkubationspuffer gewaschen, und eine Lösung von 100 μ] von 125 J Anti-lgE mit einem Gehalt an 3 ng pro lOOul wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bewegt, und die Probe wurde mit 05% NaCl und 0,05% Tween 20 gewaschen; die gebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines y-Zählers bestimmt.
2) 0,5 g der aktivierten Schafwolle (Keratin) wurden mit 0.1 ml einer Lösung von Anti-lgE mit einem
10
Gehalt von IO mg/ml in 40 ml einer 0,1 in Natriumbicarbonatlösung vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bewegt, und die Teilchen wurden zunächst zweimal mil einer 0,5-m Natriumbicarbonatlösung während 30 Minuten gewaschen und sodann mit 0,5-m Ethanolamin in ever 0,1-m Natriumbicarbonatlösung während 3 Stuifden umgesetzt. Die Teilchen wurden zweimal mit einer 0,5-m Natriumbicarbonatlösung und sodann mit einer 0.1-m Natriuir.icctatlösung während 2 Minuten und schließlich mit einer 0,1-m Natriumacelallösürig während 30 Minuten gewaschen. Die Teilchen würden in einem Puffer suspendiert, welcher Ö,05-m Phosphalpuffer vom pH-Wert 4, 0,9% NaCI% Humanserumalbumin, η 0,05% Tween 20 und 0,01 NaN3(!nkubationspuffer)
enthielt. '
0.5 nil der zuvor beschriebenen Suspension mit Polymeres einem Gehalt art I mg Teilchen pro 100 μΙ wurden mit 50 μΙ einer IgE-Lösung mit einem Gehalt an 400 20 Polyacrylamid Einheiten (British. Research Standard 68/341) IgE (Handclspfödükl pro ml vermischt, wonach 3 Stunden bewegt wurde. Enzacryl®) Die Probe wurde mit dem Inkubationspuffer Keratin
gewaschen, wonach eine Lösung von 100 μΙ 125 J Anli-lgE zugegeben wurde, welche 3 ng pro 100 μΙ enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bewegt, und die Probe wurde mit 0,9% NaCI und 0,05% Tween 20 gewaschen; die gebundene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines y-Zählers bestimmt.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Unter »cpm« wird die Anzahl von Ausschlägen pro Minule angegeben, die mit J AnIi-IgE erhalten wurde, das immunochemisch an mg des Poiyacryianiidkonjiigats oder an I mg des Keratinkonjtlgats gebunden war.
Tabelle Aklivierungsmittel
cpm
Phenylcyanal Phenylcyanat
31 000
13 000

Claims (2)

Palentansprüche:
1. Verfahren zur Bindung von Proteinen. Polypeptiden, Peptiden oder Derivaten derselben mit einer oder mehreren Gruppen -YH, wobei -YH eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt, an in Wasser unlösliche Polymere mit einer oder mehreren Gruppen der Formel -XH, die eine Hydroxylgruppe oder eine primäre oder sekundäre Aminogruppe darstellt, durch kovalente Bindungen, wobei das die Gruppe(n) der Formel -XH enthaltende Polymer mit einer Verbindung umgesetzt wird, die ein reaktionsfähiges Derivat des Polymers zu bilden vermag, worauf das Derivat mit is dem Protein, Poypeptid. Peptid bzw. Derivat derselben umgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als zur Bildung des reaktionsfähigen Derivates des Polymers befähigte Verbindung eine Verbindung mit einer oder mehreren Cyanatgruppen verwendet, wobei die Umsetzung in Lösung mit Wasser oder in einem mit Wasser mischbaren Losungsmittel oder wäßriger Suspension durchgeführt wird, und daß das Umsetzungsprodukt, gegebenenfalls nach Reinigung, mit dem 2ϊ Protein. Polypeptid. Peptid bzw. Derivat derselben in einer schwach alkalischen wäßrigen Lösung bei einer Temperatur von im allgemeinen 0 bis 50' C umgesetzt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1. dadurch gekenn· jo zeichnet, da'i man bei der Umsetzung des Polymers mit der Verbindung nut einer oder mehreren i'yanatgruppen in wäßriger Lösung odrr in wäßriger Suspension bei einem pH·Wert zwischen 7 und
1 J arbeitel. r.
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