CZ83393A3

CZ83393A3 - Process of treating humors when determining neopterin and means for carrying out said process

Info

Publication number: CZ83393A3
Application number: CZ93833A
Authority: CZ
Inventors: Wilfried Dr Rautenberg
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1992-05-09
Filing date: 1993-05-06
Publication date: 1993-11-17
Also published as: IL105629A0; CA2095780A1; IL105629A; JPH0643160A; ZA933221B; EP0569768A1; DE4215275A1; US5439799A

Description

Způsob zpracování tělesných tekutin při Ustanovení neopterinu— ^:a prostředek k provádění tohoto způsobu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu zpracování tělesných tekutin při imunologickém stanovení neopterinu pomocí specifické protilátky proti neopterinu a detekčního systému a prostředku k provádění tohoto způsobu.

Od objevu neopterinu v moči pacientů trpících maligními nebo virovými chorobami r. 1979 se neopterin etabloval jako parametr pro určování stavu buněčné imunity u mnoha pacientů s nejrůznějšími chorobami.

Neopterin patří do skupiny pteridinů, což jsou heterocyklické sloučeniny, které jsou velmi rozšířeny v rostlinné a živočišné říši. Zatímco některé biologické funkce pteridinů jsou dobře dokumentovány, biologická úloha neopterinu je až dosud v podstatě neznámá.

Neopterin produkují monocyty/makrofágy po indukci interferonem-gamma. Interferon gamma Je pak přímo spřažen s aktivací imunity zprostředkované buňkami a vytvářejí ho aktivované T-lymfocyty, pokud jsou ve vybuzeném stavu.

Při řadě chorob, jako jsou virové infekce, intracelulární parazitické choroby, septikemie, odmítání transplantátů, autoimunitní choroby rozhodující úlohu, tělesných tekutinách a neoplasie, hraje buněčná imunita Zvýšené koncentrace neopterinu v přímo odrážejí stupeň aktivace buněčného imunitního systému. Stanovení koncentrace neopterinu v tělesných tekutinách slouží proto velmi dobře pro kontrolu stavu buněčné imunity.

Stanovení neopterinu v tělesných tekutinách, za účelem zjištění stavu buněčné imunity v případě zhoubných nádorových a/nebo virových onemocnění je například popsáno v EP 12 444. Jako až dosud obvyklé postupy stanovení neopterinu v tělesných tekutinách, přednostně v séru a moči, je možno uvést vysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC), [J. Chromatogr. 277, 61 (1982)] a radioimunostanovení [Chem. Biol. Pteridines, str. 815 a další, W. de Gruyter, Berlín - New York (1983)]. Obě tyto metody mají několik nevýhod. Pomocí HPLC je možno stanovit neopterin teprve po poměrně nákladném způsobu zpracování. Každá analýza pak trvá ještě přibližně 10 až 15 minut, takže měření většího počtu vzorků je i při automatizovaném provozu spojeno s velkou pracností a časovými ztrátami. Radioimunostanovení je pak možno provádět pouze v laboratořích, které jsou k tomuto účelu schváleny podle zvláštních předpisů a a také při zbavování se radioaktivně kontaminovaných pracovních roztoků a odpadů je nutno dodržovat určité předpisy.

Při kompetitivním imunostanovení neopterinu, které je základem tohoto vynálezu se vnitřní povrchy plastových nádob, jamky mikrotitrační plotny,-polystyrénové kuličky, polystyrénový latex nebo skleněné kuličky, jakožto pevná fáze, povlékají protilátkou, která je specifická vzhledem k neopterinu. Tak například se do jamek mikrotitrační plotny napipetují vzorky s obsahem neopterinu, které se mají analyzovat a konjugát neopterinu a markerového enzymu. Neopterin ve vzorku a konjugát vzájemně soutěží o omezený počet vazebných míst na pevné fázi. Vysoké koncentrace neopterinu ve vzorku přitom vedou k nízké vazbě konjugátu na pevné fázi. Tento jev vede, po provedení promývacího stupně, který slouží pro odstranění všech nenavázaných látek, k vývoji malého zabarvení při následující reakci substrátu, která je specifická pro použitý markerový enzym.

Kvantifikace koncentrace neopterinu ve vzorcích se provádí pomocí kalibrační křivky, která se sestrojí za použití standardů s přesně definovanými koncentracemi neopterinu. U zdravých osob je střední koncentrace

Hodnoty nad 10 až 15 Vzhledem k požadované přinejmenším 1 nmol neopterinu v séru přibližně 5 nmol/1 nmol/1 jsou považovány za patologické vysoké citlivosti imunostanovení, neopterinu/1, se musí vzorek séra přímo uvádět do styku s reakcňimi složkami, t.j. séra se při stanovení musí používat v nezředěném stavu. Přitom se však ukázalo, že stanovení neopterinu v čerstvých sérech, která slouží zpravidla jako měřené vzorky, vede vždy k příliš vysokým naměřeným hodnotám. Při koncentraci 5 nmol/1 byly například naměřené hodnoty falešně vyšší o více než 100 %.

Rušení měření prostřednictvím součástí séra je zpravidla možno odstranit vysokým zředěním séra, což však v tomto případě není možné, vzhledem k požadované citlivosti. Pro stanovení neopterinu se nehodí ani možná denaturace vzorku teplem nebo přídavkem denaturačních činidel. Ukázalo se však, že rušivý vliv klesá v průběhu skladování séra a ve starších sérech je možno obsah neopterinu naměřit správně, což bylo možno potvrdit velmi dobrou korelací s jinými metodami stanovení neopterinu. Jelikož však je stanovení neopterinu ve všech případech nutno provádět na čerstvých sérech, představují falešně zvýšené hodnoty pro diagnostiku velkou nevýhodu.

Úkolem vynálezu je vyvynout způsob zpracování tělesných tekutin při imunologickém stanovení neopterinu a prostředek k provádění tohoto způsobu, který by umožňoval stanovit neopterin přesně i v čerstvých tělesných tekutinách.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je prostředek pro zpracování tělesných tekutin při imunologickém stanovení neopterinu pomocí protilátky, která je specifická vůči neopterinu a detekčního systému, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje oxidační činidlo.

Dlaším předmětem tohoto vynálezu je způsob zpracování tělesných tekutin při imunologickém stanovení neopterinu pomocí protilátky, která je specifická vůči neopterinu a detekčního systému, jehož podstata spočívá v tom, že se provádí inkubace všech reakčních složek za přítomnosti oxidačního činidla.

S překvapením se ukázalo, že za pomoci prostředku a způsobu podle vynálezu je možno správně stanovit neopterin pomocí imunostanovení i v čerstvých sérech. Prostředek podle vynálezu nezhoršuje imunologickou aktivitu protilátek a enzymatickou aktivitu markerových enzymů a je stálá po dobu přinejmenším jednoho roku při teplotách skladování, které jsou obvyklé u klinických reagencií (2 až 8 °C).

Jako oxidační činidlo se hodí hexakyanoželezitan(III) draselný nebo sodný, kombinace železitá sůl/chelatační činidlo, peroxosulfáty, peroxoboráty, nitroprusid (pentakyanonitrosylželatinan), přednostně hexakyanoželezitan(III) draselný v koncentraci 0,05 až 100 mmol/1, přednostně 0,5 až 50 mmol/1. Podobných výsledků se také dosáhne s jinými oxidačními činidly, například s kombinací železitá sůl/chelatační činidlo, přednostně dusičnan železitý/kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), v koncentračním rozmezí přibližně 0,25 až 25 mmol/1.

Oxidačního činidla podle vynálezu se používá ve vodném roztoku, který je silně iontově tlumen na hodnotu pH v rozmezí od 5 do 10, přednostně od 7 do 8. Jako tlumivých látek se může použít všech pufrů nebo jejich kombinací, které jsou známy v oblasti klinické chemie a které jsou schopny udržovat hodnotu pH v rozmezí od 5 do 10, přednostně od 7 do 8a nepředstavují žádný rušivý vliv pro zkoušené složky. Vhodný je například fosfátový pufr, TRIS- pufr, citrátový pufr, HEPES-pufr, přednostně fosfátový pufr. Koncentrace pufru by měla ležet v rozmezí od 50 do 300 mmol/1, přednostně od 150 do 250 mmol/1. Oxidační činidlo podle vynálezu optimálně působí v teplotním intervalu, který je obvyklý v oblasti klinické chemie (15 až 40 °C).

Výroba protilátky, která je specifická vůči neopterinu a vazba protilátek na pevnou fázi je známa z literatury. Dlouho známou metodou je rovněž značení protilátek, antigenů a haptenů markerovými enzymy. Při na neopterin přednostně váže fosfatasa, jako markerový enzym, jiných markerových enzymů.

zkoušce podle vynálezu se peroxidasa a alkalická Může se však používat i

Detekční systém obsahuje typický substrátový konkrétně použitý markerový enzym,který se substrátu, pufru, detergentů, chromogenu atd., známo z klinické diagnostiky.

roztok pro skládá ze jak je to

Imunostanovení, které slouží k určení neopterinu v séru, se provádí následujícím způsobem: do prázdných jamek mikrotitrové plotny, jejichž vnitřní povrch je povlečen protilátkou, která je specifická vůči neopterinu, se napipetuje reagenční roztok podle vynálezu, standardy, kontrolní vzorky a měřené vzorky. Po inkubační dobé se přidá tlumený roztok konjugátu neopterin-enzym a provádí se další inkubace. Potom se jamky opláchnou a napipetuje se do nich substrátový roztok, který je typický pro markerový enzym.

Potom se reakce substrátu zastaví přídavkem zastavovacího činidla a změří se extinkce vytvořeného barviva při maximu absorpce. Koncentrace ve vzorku se stanoví z předem sestrojené kalibrační křivky. Koncentrace neopterinu ve vzorku je nepřímo úměrná stanovenému signálu.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Stanovení neopterinu za použití konjugátu neopterin-křenová peroxidasa

Koncentrace v reakčním činidle

Roztok pufru:

fosfátový pufr, pH 7,2 hexakyanoželezitan(III) draselný chlorid sodný benzoát sodný

3-(3-cholamidopropyl)dimethylamonium1- propansulfonát (CHAPS)

5-chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on/

2- methyl-4-isothiazolin-3-on polyoxyethylensorbitanmonolaurát želatinový hydrolyzát

250 mmol/1 1,5 mmol/1

150 mmol/1 10 mmol/1 mmol/1

0,1 %

0,05 % %

Provedení stanovení

Do jamek mikrotitrační plotny, jejichž vnitřní povrch je povlečen protilátkou, která je specifická vůči neopterinu, se napipetuje 300 μΐ promývacího roztoku, který se skládá z isotonického roztoku chloridu sodného a 0,05 % polyoxyethylensorbitanmonolaurátu, načež se plotny nechají 30 minut stát. Po úplném odstranění této tekutiny se do každé jamky napipetuje 50 μΐ reagenčního roztoku podle vynálezu a potom po 50 μΐ standardu, kontrolního vzorku a zkoušeného vzorku. Po inkubační době 30 minut se při teplotě místnosti přidá 50 μΐ tlumeného roztoku kombinace neopterin-křenová peroxidasa a jamky se dalších 60 minut inkubují při teplotě místnosti. Po dvojnásobném promývání výše uvedeným promývacím roztokem se do jamek napipetuje 150 μΐ susbstrátového roztoku obsahujícího 3,8 mmol/1 2,2’-azinodi(3-ethylbenzthiazolinsulfonátu) ve 100 mmol/1 citrátového pufru o pH 4,3. Po dalších 30 minutách při teplotě místnosti se reakce substrátu zastaví přídavkem 0,095% roztoku azidu sodného a měří se extinkce utvořeného barviva při 405 nm. Koncentrace vzorků se určí z předem sestrojené kalibrační křivky. Koncentrace neopterinu ve vzorku je nepřímo úměrná stanovenému signálu.

Příklad 2

Porovnání naměřených hodnot v čerstvém a starším séru

Neopterin	Naměřená koncentrace	neopterinu	[nmol/1]
[nmol/1]	Staré sérum	Čerstvé	sérum
	s obsahem bez obsahu	s obsahem	bez obsahu
		reagenčního roztoku podle příkladu 1
5	5,3	5,2	4,7	11,2
10	11,5	10,6	10,1	17,1
15	16,1	16,2	16,0	21,9
20	21,1	21,5	20,1	26,4
25	24,5	25,3	24,8	29,1
35	35,4	36,3	37,9	41,8
45	46,9	45,9	43,3	50,8
V tabulce	jsou	uvedeny výsledky	pokusů provedených se

vzorky čerstvého a staršího séra se stoupající koncentrací neopterinu. Je možno si všimnout účinného snížení zdánlivě zvýšené koncentrace neopterinu V čerstvém séru, kterého se dosahuje za použití reagenčního roztoku podle vynálezu, popsaného v příkladu 1.

Příklad 3

Stanovení neopterinu v závislosti na přidané koncentraci hexakyanoželezitanu(III) draselného

Stanovení se provádí způsobem popsaným v příkladu 1 (séra č. 1 a 2) nebo podobně jako v příkladu 1, pouze s tím rozdílem, že se místo křenové peroxidasy použije alkalické fosfatasy (séra č. 3 a 4).

Substrát: p-nitrofenylfosfát

Zastavovací činidlo: 0,1 mol/1 hydroxid sodný

Vlnová délka: 405 nm

Výsledky zjištěné při stanovení neopterinu v čerstvých sérech zdravých dárců, v závislosti na přidané koncentraci hexakyanoželezitanu draselného v reagenčním roztoku podle vynálezu, jsou uvedeny v následující tabulce.

Hexakyanoželezitan(III)	Neopterin-HRP*	Neopterin-AP**
draselný
v reagenčním	Neopterin	[nmol/1]
roztoku [mmol/1]	Sérum č.
1	2	3 4

0	12,5	16,4	18,2	19,3
0,05	7,3	6,8	6,8	5,5
0,10	7,2	6,6	6,6	5,2
0,19	7,2	6,4	6,7	4,5
0,38	4,5	4,8	5,6	5,7
0,75	4,1	4,9	5,9	4,1
1,50	4,3	5,3	5,1	4,0
3,0	5,1	5,6	7,3	4,8
6,0	4,1	5,5	7,1	6,2
12,0	4,8	6,9	8,2	6,6
24,0	4,6	7,8	8,1	7,7
48,0	7,1	7,5	8,7	8,8
* křenová	peroxidasa
** alkalická fosfatasa
Tabulka	ukazuje, že	čerstvá séra	bez přísady	kyano-
železitanu	draselného v	reagenčním	roztoku vykazují při

měření falešně vysoké hodnnoty koncentrace neopterinu (které jsou vyšší 2 až 3x). Přitom je lhostejné, zda se při imunostanovení používá konjugátu neopterin-peroxidasa nebo konjugátu neopterin-alkalická fosfatasa. V koncentračním rozmezí, kterému se při provádění vynálezu dává přednost, byly zjištěny koncentrace neopterinu, které velmi dobře korelují s etablovanými metodami stanovení pomocí HPLC a RIA (radioimunostanovení). Analogických výsledků se také dosáhne, když se místo hexakyanoželezitanů(III) draselného použije hexakyanoželezitanu(III) sodného, kombinace dusičnan železitý/EDTA, peroxodisulfátu draselného, peroxoborátu sodného nebo sodné soli nitroprusidu (pentakyanonitrosylželezitanu(III) sodného).

- 11 PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostředek pro zpracování tělesných tekutin při imunologickém stanovení neopterinu pomocí protilátky, která

je specifická vůči neopterinu a detekčního systému, vyznačuj ící se tím, že obsahuje oxidační činidlo. 4 2. Prostředek podle nároku 1, v y z n a č u j í c i se

tím, že jako oxidační činidlo obsahuje hexakyanoželezitan (III) draselný.
3. Prostředek podle nároku 2,vyznačuj ící se tím, že obsahuje 0,05 až 100 mmol/1 hexakyanoželezitanu (III) draselného.
4. Způsob zpracování tělesných tekutin při imunologickém stanovení neopterinu pomocí protilátky, která je specifická vůči neopterinu a detekčního systému, vyznačuj ící se t í m, že se provádí inkubace všech reakčních složek za přítomnosti oxidačního činidla.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se inkubace všech reakčních složek provádí za přítomnosti hexakyanoželezitanu(III) draselného.