SE506533C2 - En process för in vitro analys av substansers toxiska och allergena egenskaper samt användning av neopterin för att skilja mellan allergiska immunreaktioner - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 506 533 2 Metoden erbjuds alltså som en altemativ metod till djurtester för att testa läkemedel, livsmedelstillsatser, kosmetika och hygienprodukter, industrikemikalier eller andra substanser som människor kan exponeras för och där man vill undvika biverkningar. ln vitro utvärdering av toxiska effekter på immunsystemet har testats med mjältceller från möss (” ln vitro evaluation of drug-induced toxic effects on the im- mune system as assessed by prolifeative assays and cytokine production, (M. Pal- lardy et al Eur. Cytokine Net., Vol 2 No 3, May-June 1991 pp 201-206). Metoden uppvisade låg förmåga för att upptäcka molekyler som kan inducera autoirnmunitet och överkänslighet.

Med hjälp av den föreliggande uppfmningen har det nu framkommit att det är möj- ligt att analysera biverkningsframkallande förmåga hos främmande substanser ge- nom att odla humant helblod som förhindrats koagulera tillsammans med substansema och sedan analysera cytokinema som producerats av de humana cellema.

Redan innan en substans har varit i användning, och innan målgruppen av männi- skor utsatts för substansen erbjuder den föreliggande metoden möjligheten att förut- säga huruvida risk för biverkningar av inflamrnatorisk eller allergisk typ kan för- väntas uppkomma.

Uppfinningen tillhandahåller en tolkningsnyckel för utvärdera potentiella biverk- ningspotentialen hos främmande substanser. 10 l5 20 25 30 506 553 3 Sarnrnarrfatming av uppfinningen: Metoden definieras i Patentkrav 1 och baseras på odling av blodceller in vitro. Substansen som skall utvärderas sättes till blododling- en. Om de reaktiva cellema i blodet uppfattar testmaterialet som frärnrnande eller skadligt sker produktion av inflammatoriska signalsubstanser, cytokiner. Blodet innehåller olika typer av vita blodkroppar med olika funktioner vid reaktionen mot främmande substanser. De olika typerna av inflarnmatoriska celler utsöndrar olika cytokinrepertoarer. Mönstren (profilema) hos de utsöndrade cytokinerna ger hän- visning till vilken del av immunsystemet som har reagerat. Därför är det också möj- ligt att förutsäga vad man kan förvänta sig för slags biverkningsreaktion om en sub- stans tillförs människa eller eventuellt till försöksdjur. Vissa substanser kan inducera cytokinprofrler som driver immunsystemet mot IgE-förrnedlad allergi, därigenom indikerande en förmåga hos substansema att frarnkalla astma, hösnuva och nässelfeber. Andra substanser kan inducera en cytokinprofil som driver irnmun- svaret mot cellulär immunitet och därför har de en potential att framkalla kontakt- eksem som biverkning. Slutligen kan ämnen som inte är irnmunogena men enbart toxiska eller irriterande framkalla ett cytokinmönster som är typiskt för vävnads- skada (alarrnreaktion). Konceptet som föreliggande uppfinning bygger på är att an- vända en tolkning av cytokinmönstret som en substans frarnkallar i odlade blodceller för att förutsäga om substansen har potential att framkalla allergi av olika typer eller om allmänt skadliga egenskaper föreligger, som skulle framkalla toxisk vävnads- skada eller irritation.

Vi klassificerar biverkningar på vävnaderna av främmande substanser på följande sätt Klass 0: Vävnadsskada. ospecifik kemisk., mekanisk eller fysikalisk skada.

Klass 1: Allergisk immunreaktion av typ l. Denna reaktion kallas även snabb över- känslighetsreaktion och medieras av IgE-antikroppar som producerats specifikt mot den främmande substansen. En akut inflammatorisk reaktion uppstår och histamin produceras ofta .Typexempel på symtom är astma, hösnuva och nässelfeber. Denna 10 15 20 25 30 506 553 4 reaktionstyp kräver att ett helt utmoget iinmunsvar där alla komponenter i immun- systemet är involverade. Denna reaktionsform anses vara slutsteget i ett immunsvar.

Klass IV: lnflammatorisk immunreaktion av typ IV. Denna inflanimation kallas ock- så fördröjd överkänslighetsreaktion och förrnedlas av immuniserade specifika T-lyrnfocyter typ TH-1. Denna reaktion anses vara första steget i ett specifikt immunsvar. Typexempel på Klass IV är allergiskt kontakteksem.

Klass O är vår egen klassifikation av ospecifik skada på vävnader och irnmun- systemet. För definition av Klass I och Klass IV hänvisas till ”Immunology” av Ivan Roitt, Jonathan Brostoff och David Male, Gower Medical Publishing, London -New York 1989 pp 19.1 - 19.20 och 22.1- 22.10 som vi åberopar som referens.

I det föreliggande arbetet har tre huvudtyper av cytokinprofiler identifierats.

Huvudtyp Klass 0: Utsöndring av alarmcytokiner som resultat av cellskada på bind- väv, fibroblaster, endotelceller, epitelceller och ospecifika inflarnmatoriska vita blodkroppar som monocyter och makrofager. I denna grupp av cytokiner ingår IL-1, 1L-6, IL-12 och TNF.

Huvudtyp Klass I: Utsöndiing av cytokiner av immunsvartyp från lyrnfocyter och inflammatoriska celler. Här ingår cytokiner från Klass O samt dessutom IFN-y, Neopterin, IL-2 och IL-10. Från djurförsök in vivo borde teoretiskt sett även IL-4 och IL-5 produceras här, men av tekniska skäl som har med analysemas känslighet att göra inkluderas dessa inte alltid i våra rutinmässiga testprotokoll, 15 20 25 30 506 533 5 Huvudtyp Klass IV: Utsöndring av cytokiner av ospecifik typ från Klass 0 och dessutom IL-2, IL-8, IL-10 och IFN-y.

Ett oväntat fynd, som inte kunde förutsägas var att det fullständiga immunsvaret av mogen typ Klass I driver immunsvaret ända till Neopterinproduktion medan det primära immunsvaret av Klass IV inte stimulerar immunsystemet så långt som till att producera Neopterin.

I de tre gruppema ovan är endast uppräknat ett representativt urval av cytokiner fi'ån respektive grupp. Gruppema kan innehålla andra cytokiner. och patentkravet inne- fattar användandet av alla cytokiner och deras receptorer som räknas upp i ”The Cytokine Facts Book” av Callard och Geraring, Academic Press 1994 och fiamtida uppdaterade upplagor som härmed åberopas som referens for an förutsäga graden av mogenhet hos ett irnmunsvar som en substans kan ha förmagan an framkalla. F.n är 50 cytokiner kända. lnterleukiner IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, lL-l I, lL-l2, lL-13, IL-14, IL-15.

Andra cytokiner ( i alfabetisk ordning ) BDNF, CNTF, EGF, Epo, FGF, G-CSM. GM-CSF, I-309/TCA-3, yIP-IO, IFNa, IFNB, IFNy, LIF, LT ( TNFB ), MCP-LZ och 3, M-CSF, MIF, MIP-la, MIfI-lß, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PDGF, PF-4, RANTES, SCF, TGFa, TGF ß, TNFoL, Tpo, VEGF. 10 15 20 25 30 506 533 6 Baserat på utfallet av in vitro testet, används cytokinmönstret som framkallas av en substans som undersöks, för att göra en förutsägelse om substansens biverknings- potential utifall människor eller djur exponeras för substansen. Helblod, företrädes- vis venblod, används. Blodet förhindras från att koagulera. Detta kan göras genom att använda endotoxinfria heparinrör. Andra metoder såsom tillsats av EDTA eller citrat kan användas. Alternativt kan blodet defibrineras genom skakning med glaspärlor.

Antalet vita blodkroppar i outspätt humant blod uppgår normalt till mellan 3x109 och 7x109 per liter. Omkring 30% av dessa är lymfocyter, 5-10% är monocyter och resten polymorfkärni ga vita blodkroppar.

Totalantalet vita blodkroppar och differentialräkning utförs innan blodet används vidare i proceduren. Blodkroppsräkningen kan med fördel utföras men någon hematologisk rutinmetod exempelvis Coulter STKS-instrument.

Helblodet används i koncentrationema 1:1 - 1: 10.000, företrädesvis i koncentrationen 1:2 - 1: 100 utspätt i vävnadsodlingsmedium företrädesvis i typ RPMI 1640 med tillsats av glutarnin. Nonnalt, 1,5 - 5 mM företrädesvis 2 mM används. Blodet används oftast spätt 1:5, 1:10, 1:20 eller fortsatt till 1: 40, 1; 80, l: 100.

Antibiotika kan med fördel tillsättas för att förebygga oönskad växt av mikro- organismer. Penicillin och streptomycin kan tillsättas i 25-100 U/ml företrädesvis 50 U/ml.

Mitogener eller substanser med kända effekter på immunsystemet kan användas som positiva kontroller för att få säkrare resultat. Något av alla de mitogener som nämns i Daniel P. Sites: Clinical Laboratory Methods for Detection of Antigens and 10 15 20 25 30 506 535 7 Antibodies 'm Basic and Clinical Immunology, Lange Medical Publications, Los Altos California, 1984 kan användas. Denna referens inkluderas i denna beskrivning och åberopas som referens. Fytohemagglutinin (PHA-L) används företrädesvis och späds i mediet till en slutkoncentration i rnikroplattornas brunnar av 250 pg per rnl.

Testet kan utföras i vilket som helst lämpligt kärl t. ex. i provrör men företrädesvis i brunnama på mikrotiterplattor.

För att utlösa cytokinproduktion i in vitro är cellkoncentrationen av kritisk betydelse. Om testet utförs endast med en cellkoncentration kan det inträffa att endast nâgra av de intressanta cytokinerna upptäcks optimalt. Om en serie av cell- koncentrationer används upptäcks den fullständiga bilden av cytokinmönstret som förutsägs ovan i ” Sammanfattning av uppfinningen”. När det gäller substanser som skall testas för effekter i systemet tillsätts olika koncentrationer till blodet. Den högsta koncentrationen av substansen som inte är toxisk för cellerna påvisat genom inspektion i mikroskop i närvaro av vitalfárgärnne t. ex trypanblått används som ut- gångskoncentration. Seriespädningar av substansen utförs sedan ned till en utspäd- ning av minst 1: 1.000 och företrädesvis ned till 1: 10.000, 1: 100.000 eller 1: 1.000.000. I de fall substansen spädes i RPMI 1640 är den relevanta kontrollen endast detta medium. När andra spädningsvätskor användes är den relevanta kon- trollen motsvarande koncentrationen av denna spädningsvätska.

Kärlen inkuberas vid 25 -40°C, företrädesvis vid 37°C, företrädesvis vid 90% luft- fuktighet och i närvaro av 2 - 15% C02 men företrädesvis 5%. Ett lämpligt antal rör eller mikrotiterplattor görs i ordning och tas ur inkubatorn för test efter tidsintervall.

Standard för tidsintervall är 1 timme till 10 dagar; företrädesvis 1 timme, 1 dag, 2 dagar, och 4 - 6 dagar. 10 15 20 25 30 506 ÉSS 8 kan utföras på följande sätt. En uppsättning plattor används för att uppskatta donatorcellemas spontana proliferationsaktivitet (= medium eller an- nan lösningsvätska för substansen) en arman för svar mot mitogener och andra för svar mot testsubstanser vid olika koncentrationer. Detta kan göras på följande sätt eller med någon annan läinplig metod. Vid de tidpunkter som plattorna testas till- sätts till varje brunn i respektive platta märkt nukleinsyrebyggsten såsom 3H-tymidin upplöst i medium. Plattoma inkuberas sedan ytterligare 4 timmar vid 37°C för att nukleinsyrebyggstenen skall byggas in i cellemas arvsmassa. Cellema skördas sedan med en Skatron cell ha1vester(Skatron, Lier, Norge) och Titertek cellulosafilter (papper) eller annan läinplig metod. Resultatet av denna skördeprocedur är att cel- lemas DNA fångas i filterpappret och att det 3H-tymidin som inte byggts in i DNA passerar genom filtret och sköljs ut med tvättvattnet. Radioaktiviteten i filter- papprena är sålunda proportionell till den DNA-syntes som ägde rum under de 4 'timmama före skördningen. Radioaktiviteten i filterpapprena mäts sedan med en Packard vätskescintillationsräknare och inbyggt tymidin uttrycks som desintegre- ringar (counts), dpm (cpm). Radioaktiviteten kan mätas i DNA skördat på vilket annat lämpligt kämfysiskt eller kemiskt instrument.

Cytokintester: En annan uppsättning plattor som preparerats enligt samma design som i ovanstående protokoll tas ur inkubatorn enligt samma tidsschema som ovan.

Cytokinerna som frisläppts från de odlade cellema mäts i supematantema som fås efter att mikroplattoma centrifugerats med 650 g under 10 minuter. Supematantema kan antingen testas direkt eller förvaras frysta vid -ZOOC till de testas. Cytokinbe- stäinningama mäts med kommersiellt tillgängliga kit från olika fabrikanter. Patent- kravet med den beskrivna uppfinningen innefattar cytokinbestämningar med alla nu tillgängliga eller i fraintiden konstruerade cytokinmätningsmetoder innefattande bio- logiska metoder (bioassays), immuntester, kemiska metoder eller andra. 10 15 20 25 30 506 533 9 Fabrikantemas anvisningar följs. Alla de cytokinbestämningar som beskrivs i patentansökan är enzyme immuno assays (EIA). Principen är att brunnar i mikro- titerplattor är märkta med cytokinspecifik fångande (Capture) antikropp. Om cytokin finns i det prov som satts till en brunn fångas det i brunnens botten. För att kvantite- ra hur mycket cytokin som har fångats tillsätter man en andra enzymmärkt antikropp mot cytokinet. Efter substrattillsats fås en färgreaktion som kan mätas, och som järn- förs med den färgreaktion som fås i en serie standarder med känt cytokinirmehåll.

Testets bakgrundsvärde fås från brunnar där ingen testsubstans tillsatts. Positiva mätvärden bedöms föreligga när värden över 2 SD över bakgrundsvariationen upp- mäts.

Uppfinningen kommer nedan att beskrivas med följande icke begränsande utförande exempel (Resultatet summerade i Tabell 1) Exempel Blodggivare och blodtannnina: Fem friska blodgivare av båda könen med ålder mel- lan 25 och 55 år användes. 4 ml venblod tappas till endotoxirifria heparinrör (Coatech, Ljungby, Sverige) innehållande 120 IU heparin. Ingen av blodgivama hade allergi eller atopiskt eksem eller någon arman pågående sjukdom.

Hemograrn: Totalantalet vita blodkroppar och differentialräkriing utfördes med I Coulter STKS instrument. De fem blodgivama hade respektive 9,8; 7,1; 9,8;6,9 och 5,8x 109 /L som totalantal vita blodkroppar.

Cellodlingsgrotokoll: Helblodet spädes i en serie om 1:2, 1:3, 1:20, 1:4, 1:10, och 1:20 i vävnadsodlingsmedium, RPMI 1640 med 2mM glutamin, 50 U/ml penicillin och 50 ug/ ml streptomycin. 100 ul blod sättes till brunnama i Nunclon mikrotiter- 10 15 20 25 30 506 033 10 plattor. Mitogenet fytohemagglutinin (PHA-L) (L-144 Sigma St Louis USA) upplöst i RPMI 1640 tillsätts i mängden 50 ul uppspätt så att varje brurm innehåller 25 pg.

För substanser som skall testas i systemet tillsätts olika koncentrationer till blodet i brunnama. Den högsta koncentrationen av substansen som icke är toxisk för celler, bestämt genom mikroskopisk inspektion i närvaro av vitalfárgänmet trypanblått, an- vänds som utgångskoncentration. Substanser användes i följande koncentrationer och respektive spädnjngar: Klass 0: TritonX- 100 i koncentration 1: 2.000, 1: 4.000, 1: 8.000, 1: 16.000, 1: 32.00, 1: 64.000, l: 128.000 Klass IV: NiClz i mängd 100 pg, 10ug, lug, 0,1 pg, 0,01 pg, och 0,00lp.g.

Klass I: Kvalsterextrakt i spädning 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 Pos: PHA 25 pg per brunn (brunn totalt 200 ul) l de fall där substansen är spädd i RPMI 1640 är den lämpliga negativa kontrollen enbart detta medium. När andra spädningsvehikler används är den lämpliga negativa kontrollen enbart denna vehikel i tillämplig koncentration. lnkubation: Mikrotiterplattoma inkuberas vid 37°C i 90% luftfuktighet och i 5% C02. Ett för ändamålet lämpligt antal av identiska plattor har gjorts i ordning och ett för analys nödvändigt antal plattor tas ut ur inkubatorn efter inkubationstidema l dag, 2 dagar och 6 dagar.

Proliferationstest: En uppsättning av plattoma används för att uppskatta celldel- ningsaktiviteten hos de odlade cellerna antingen spontant (= i medium eller sub- stansvehikel) eller som svar på PHA och som svar på testsubstanser. 10 15 20 25 30 506 533 ll Testsubstanserna sättes som ovan nänmts till brunnama med celler i olika fallande koncentrationer med början med den koncentration som är den högsta utan toxisk påverkan på cellema bedömt genom inspektion i mikroskop i närvaro av vitalfärg- ämne såsom ttrypanblått.

Till varje brunn i plattan tillsattes 1 uC 3H-tymidin (Amersham International Amherham. Storbritannien) i 50 pl RPMI 1640. Plattorna inkuberades sedan ytterli- gare 4 timmar vid 37°C under ovan angivna fysikaliska förhållanden.

Cellema skördades sedan med hjälp av ett specialinstrinnent (Skatron Cell Haives- ter, Skatron, Lier, Norge) och Titertek filterpapper. Resultatet av denna procedur är att DNA i cellema fastnar i filterpappret, medan det 3H-tymidin som inte byggts in i DNA passerar igenom och sköljs ut med tvättvatmet. Radioaktiviteten i filter- pappren är sålunda proportionell till den DNA-syntes som ägt rum under de 4 tim- mama före cellskördningen. Radioaktiviteten i filterpappren mäts i en Packard väts- kescintillationsräknare och tymidininbyggnaden uttrycktes som disintegrationer per minut (dpm) ofta även kallat counts per minute (cpm).

Cflokintester: En annan omgång plattor som preparerats fram som under cellod- lingsprotokoll användes för att mäta cytokiner som frisläppts under inkubations- perioden. Dessa plattor centrifugerades vid 650 g i 10 minuter. Supernatantema testades antingen omedelbart, eller senare efter förvaring vid -20°C.

Här nämns endast upplysningsvis att för det aktuella utförandeexemplet följande kommersiellt tillgängliga kit med angivna tillverkare användes. 10 15 20 25 30 506 533 IL- 1 ß; lL-2: IL-4: Neopterin: IL-6: IL-8: lnterferon-y: sCD8: sIL-2R: TNF: IL-10: 12 Immunotech, Chromgenix Immunotech, Chromgenix R&D Systems Henning Berlin Immunotech, Chromgenix Assay Res. Inc Genzyme T Cell Diagnostics Immunotech Medgenix Medgenix Fabrikantemas instruktioner följdes. Alla dessa tester är enzymimmun- tester (Enzyme Immuno Assays, EIA). Principen är att brunnar i mikrotiterplattor är märkta med cytokinspecifik fångande (capture) antikropp. Om cytokin finns i det prov som satts till en brunn fångas det i brunnens botten. För att kvantitera hur mycket cytokin som har fångats tillsätter man en andra enzyrnmärkt antikropp mot cvtokinet. Efter substrattillsats fås en färgreaktion som kan mätas, och som jämförs med den färgreaktion som fås i en serie standarder med känt cytokininnehåll. Testets bakgmndsvärde fås från brunnar där ingen testsubstans tillsatts både vad gäller tymidininbyggnad och cytokintester. Positiva mätvärden bedöms föreligga när vär- den över 2 SD över bakgrundsvariationen uppmätts.

De tre substansema som inte tidigare testats med föreliggande metod har följande kända egenskaper från kliniska och experimentella erfarenheter: 10 lV.

Plus. 506 533 13 Triton X-100. Detergent med vävnadsirriterande/ vävnadsskadande egenskaper. Löser upp cellembraner.

Husdammskvalsterantigen. Soluprick (ALK, Sverige AB). Detta preparat utgöres av extrakt från husdammskvalster och används kliniskt för att framkalla typ 1 allergisk reaktion vid klinisk s.k. prick i huden på misstänkt allergiska individer.

Nickelklorid. (Sigma St Louis, USA). Denna metall är välkänd för sin förmåga att framkalla fördröjd överkänslighetsreaktion (kontakteksem) hos människa och experimentdjur.

Den positiva indikatom för reaktion i systemet och samtidigt kalibrator för systemet var mitogenet PHA (Sigma, St Louis, USA). -14 o@@N ovw som CNN =mN_ ßußw =Næ_ CNN QNN @N@_ oN« ONQ m=fN CN. owm Now @@@ °«@ WN CN. CNN co. OMN o«N @Nm N oN @@N o__ CN. mw WN mm “__ WN CON Qøw cow omw G «@@=_ =:»~ MN .Esa -æöz Nzh: vd EQ Éum -fiw Na: Nå f: ”EN .à 2 506 555 uOUHWNV fim-w S00 uß> EOm GUZOÜflOX mfluufiåßu CUUÉN/ .uOMmFfiCwE NÉÉOG W EMM* >m wëgßaflm .Üfiv NEZmøÉU ßfiOflnuowflOwfl Cfiäšnïm S00 .ÜGWMOfAO fi fi Hßw GuUHm> fi Zußflw mflâumøufi >m umuk. _ :aaah 10 15 20 25 30 Resultat: IV.

Plus. 506 533 15 Resultaten sammanfattas nedan för utförandeexemplet.

Det högsta värdet järnfört med mediurnkontrollen vid någon av tidpunktema används som analysresultat, och uttrycks i resultattabellen som index av medium som sätts till 100. Det stimulerande effektema för de olika substansema utföll på helt olika sätt.

Triton X-100 inducerade proliferation. Cytokiner av den ospecifika vävnadsskadande typen inducerades, t.ex. IL-1, IL-6 och TNF. Detta visar på positivt för vävnadsirritant.

Kvalsterextralct inducerade ingen proliferation.

Cytokiner som utsöndrades i supematanten var dc ospecifika inflammatoriska IL-1, IL-6 och TNF och immunlymfocytklass IL-2, IL-4, IL-10 och IFNy. Dessutom inducerades Ncoptcrin. typiskt för ett moget svar. En potential för IgE-produktion f orch ggcr Nickelklorid inducerade ett lågt proliferationssvar. Cytokinema som inducerades var de ospecifika inflammatoriska IL-l, IL-6 och TNF och IL-8 samt av immunlymfocytklass IL-2, IL-10 och IFNy men som förtjänar speciell uppmärksamhet, inget Neopterin.

PHA inducerade ett starkt proliferationssvar mätt med 3H-tyrnjdin- inbyggnad och dessutom alla olika cellulära cytokiner. Substanser utsöndrade till supernatantema innefattade de ospecifika inflamrnatoriska IL-1, IL-6 och TNF och IL-8. Cytokiner typiska för specifika immunsvar av både tidig och sen typ såsom Neopterin, IL-Z, IL-4, IL-10 och IFNy inducerades.

Claims (8)

l0 15 20 25 30 506 533 16 Patentkrav
1. l. Förfarande för in vitro utvärdering av potentiellt allergena eller Vävnads- imterande substanser, kännetecknad av att blod är odlat i närvaro av serier av olika spädningar av substansen där den högsta koncentrationen av substansen som inte är toxisk för blodcellema är utgångskoncentration varifrån seriespädning utföres, cell- proliferation och utsöndring av cytokiner mäts varvid: närvaron av ett eller flera alarmcytokiner av Klass 0 är en indikation på vävnads- skadande eller kemiskt toxisk effekt, närvaron av ett eller flera alarmcytokiner av Klass 0 och därutöver en eller flera cytokiner av Klass IV men inte Neopterin är en indikator på fördröjd överkänslig- hetsreaktion såsom cellulär immunitet, fördröjd allergi eller kontakteksem närvaron av ett eller flera alarmcytokiner av Klass 0 och åtminstone Neopterin och därutöver möjligtvis även ett eller flera cytokiner av Klass I är en indikation på snabb typ av överkänslighetsreaktion såsom astma, hösnuva och nässelfeber.
2. 2. Förfarande enligt krav 1, kärmetecknat av att cytokiner av alarmtyp utväljs för indikation av skada på bindväv, fibroblaster, endotelceller, epitelceller och ospecifi- ka inflammatoriska vita blodkroppar, dvs cytokiner IL- l, IL-12, IL-6, TNF. cytokiner av Klass IV utväljs från cytokiner förknippade med cellförmedlad T- cellimmunitet dvs sådana som IL-2,IL-8,IL-10, IFNy, IL-4,IL-5, lösliga produkter som sCD8 och slL-2R, men inte Neopterin, cytokiner av Klass I utväljs från cytokiner förknippade med immunsvar av T- och B-lymfocyter och inflamrnatoriska celler såsom IFNy, IL-2, lL-IO, IL-4, lL-S, lösliga produkter som sCD8 och slL-2R, samt Neopterin. 10 15 20 25 30 506 533 17
3. 3. För-farande enligt krav 1 och /eller 2, kännetecknat av att substansen som skall testas är tillsatt i den högsta koncentrationen som inte är toxisk och därefter i en seriespädning till minst 1: 1000
4. 4. Förfarande enligt Krav 3, kännetecknat av att seriespädning utförs ned till en spädning av minst 1: 10.000 till l:l.000.000.
5. 5. Förfarande enligt Krav 1 och/eller 2, kännetecknat av att blodet spädes serievis från l:l till 1:l000, företrädesvis l.l till 1.100
6. 6. Förfarande enligt Krav 1 och/eller 2, kännetecknat av att helblod behandlas för att inte koagulera och, spädes 1:2-1: 100 i vävnadsodlingsmedium företrädesvis med tillsats av glutamin och/eller antibiotikum samt att en märkt nukleinsyrebyggsten är tillsatt, substansen som skall testas spädes serievis ned till en spädning av 1:l000 till l:100.000 från den högsta koncentrationen av substansen som är icke toxisk för cellema företrädesvis bestämt genom inspektion av cellerna i mikroskop i närvaro av vitalfärgänme och tillsatt i olika koncentrationer avläst efter inkubation vid 25-40oC olika tider mellan 1 timme och 6 dagar genom att säkerställa att proliferation ägt rum företrädesvis genom att uppsamla cellema på filterpapper eller skörda nukleinsyra genom arman kemisk eller mekanisk metod och analysera märkt nukleinsyrebyggsten samt analys av cytokiner genom att mäta närvaro av en eller flera alarmcytokiner av enbart Klass 0 är en indikation på vävnadsskada och kemiska toxisk effekter, närvaro av en eller flera alarmcytokiner Klass 0 och en eller flera cytokiner Klass IV men avsaknad av Neopterin indikerar fördröjd typ av överkänslighetsreaktion som cellulär immunitet, fördröjd allergi och kontakteksem och . fw l0 15 506 533 18 en eller flera alarmcytokiner Klass 0 och minst Neopterin och ytterligare en eller flera cytokiner av Klass 1 indikerar snabb typ överkänslighetsreaktion såsom astma, hösnuva och nässelfeber.
7. 7. Förfarande för in vitro utvärdering av en potentiellt allergen eller Vävnads- irriterande substans kännetecknad av att blod odlas i närvaro av serievis utförda spädningar av substansen och vid påvisande av Neopterin är detta en indikation på snabb typ av överkänslighetsreaktion såsom astma, hösnuva och nässelfeber.
8. 8. Användning av Neopterin som en analytisk substans för att skilja mellan allergisk immunreaktion av typ I och inflammatorisk immunreaktion av typ IV: