CZ451599A3

CZ451599A3 - Způsob snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiálu

Info

Publication number: CZ451599A3
Application number: CZ19994515A
Authority: CZ
Inventors: Johann Eibl; Friedrich Dorner; Noel Barrett; Gerhard PÖLSLER
Original assignee: Baxter Aktiengesellschaft
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1998-06-10
Publication date: 2000-04-12

Abstract

Řešení se týká způsobu snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiálu, obsahujícíhojednu nebo více získávaných biologických substancí, při kterémse biologický materiál smísí s organickýmrozpouštědlem, tento s organickým rozpouštědlemsmísený materiál se uvede do kontaktu s iontoměničem, priěemž se patogeny adsorbují na iontoměniě a alespoňjedna ze získaných biologických substancí nevstupuje nebo pouze nepatrně vstupuje do vzájemného působení s iontoměničema iontoměniě a adsorbovanými patogeny se od biologického materiálu oddělí, přičemž se získá preparát biologické substance se sníženýmobsahem viru.

Description

Způsob snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiálu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiálu, obsahujícího jednu nebo více získávaných substancí.

Dosavadní stav techniky

Výroba terapeutických proteinů a preparátů, obzvláště imunoglobulinu, extrakcí z lidských nebo zvířecích tkání nebo tekutin, jako je krev nebo plasma, jakož i z kontinuálně rostoucích transformovaných buněk savců, je často spojena s risikem potenciální kontaminace patogeny, jako jsou viry, virům podobné částice nebo priony. Musí se tedy provádět opatření k tomu, aby se případně přítomné patogeny napřenášely na lidi.

Lidská krev, popřípadě plasma, může obsahovat například viry, které způsobují onemocnění jako AIDS, hepatitidu B nebo jiná onemocnění hepatitidou. U plasmových proteinů z plasmové banky je risiko přenášení infekčních agens, jako jsou viry, na základě selekce dárců krve nebo plasmy a na základě výrobního postupu velmi nepatrné. Vhodná opatření, jako je vyřazení dárců krve, kteří vykazují zvýšené risiko, z odběrů, jakož i analysy darované krve nebo plasmy, které umožňují zjistit infekční dárce, a odběry dalším dělením vyloučit, sice dovolují většinu infekčních dárců eliminovat, • ·· ·· · *· • · · · β · · β » ·· ·

9 9 9 9 9 9 · · » • · 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 většinou ale nejdou zjistit všichni. Existující testovací systémy pro důkaz unfekčnich virů v biologických materiálech nemohou pochyby o potenciálním přenosu patogenů vždy vyloučit, neboť při širokém spektru infekčních patogenů je nemožné testovat výchozí biologický materiál na všechny viry nebo molekulární patogeny, které mohou být ve vzorku přítomné. K tomu nezjišťuje většina testů virus, ale proti viru vznikající protilátky, takže v období takzvaného diagnostického okna nemůže být proveden důkaz kontaminace. Pro některé skupiny virů kromě toho neexistuje žádná příhodná nebo dostatečně citlivá metoda důkazu. Ačkoliv nově objevené testovací způsoby, obzvláště způsob amplifikace nukleových kyselin, jako například PCR , jsou velmi citlivé a specifické, mohou být použity pouze na patogeny, jejichž sekvence nukleových kyselin je známá. V případech, ve kterých jsou sice lidské patogeny známé, avšak není k disposici žádný citlivý způsob důkazu, zůstává nejistota, že se negativní výsledek získá pouze na základě příliš nepatrného obsahu viru, který leží pod hranicí citlivosti testovacího systému.

Byly proto vyvíjeny pro výrobu farmaceutických a terapeutických produktů specifické postupy odstraňování a/nebo inaktivace pro sníženi obsahu virů, takové, aby v konečném produktu nebylo možno očekávat žádné infekční částice.

Různé inaktivační postupy jsou založené na fyzikálně chemickém zpracování pomocí tepla a/nebo chemikálií. Jako tyto způsoby přichází v úvahu obzvláště tepelné zpracování, pasterisace, zpracování roztoku proteinu β-propiolaktonem a UV-zářením, zpracováním kombinací rozpouštědla a detergentu (takzvaný S/D-postup) nebo ozáření roztoku proteinu

• ·· • · 9	• 9 9 9	© * · 9 9 9 · 9
9 · 9 9	9 9	• Λ · · ·
9 9 9 9	9 9	• 9 9 9 ·

po přídavku fotodynamické látky. Pomocí těchto způsobů bylo dosaženo inaktivace virů až 10^ log-stupňů. Eficience způsobu inaktivace se však může měnit v závislosti na typu viru. Ačkoliv se krevní produkty, zpracované postupem S/D, považují za bezpečné ve vztahu na přenesení HCV, HBV nebo HIV , neinaktivují se tímto způsobem nezapouzdřené viry, jako je HAV nebo parvovirus (Provse C., Vox Sang. 67 (1994), 191 až 196).

Postupy tepelného zpracování se provádějí u biologických produktů výhodně buď v roztoku (EP-0 124 506) , v suchém stavu (EP-0 212 040 nebo VO 82/03871) nebo ve zvlhčeném stavu (EP-0 324 729). Často při tom může docházet ke ztrátám na základě termolability mnoha biologických substancí .

Druh inaktivačního způsobu může mít ale také vliv na produkty a proto je často nutná stabilisace pro minimalisaci ztráty proteinu. K tomu musí po některých inaktivačních postupech následovat čistící kroky, aby se odstranily přidávané chemikálie.

Způsoby snížení obsahu virů zahrnují obzvláště chromatograf ické postupy, filtraci roztoků proteinů přes membránový filtr nebo adsorpci virů na pevné fázi a následující odstranění pevné fáze, jak je popsáno v EP-0 679 405. Bylo však zjištěno, že zpracování s pevnou fází, jako je například Aerosil^R, sice dovoluje udstranění HIV z až 4 log-stupňů z roztoku obsahujícího ímunoglobulin, ztráta IgG však může činit sž 42 % (Gao a kol., Vox Sang 64 (1993),

204 až 209). Pro velkovýrobní použití je pro tyto vysoké hodnoty ztrát takovýto způsob považován za nevhodný.

Dalece rozšířený chromatografický způsob pro isolaci biologických látek je aniontoměničová chromatografie. Také možnost, že se tímto dělícím způsobem může snížit obsah virů, je v literatuře popsaná. Například bylo zkoušené snížení obsahu virů při aniontoměničové chromatografií pro čištění vVF za podmínek, za kterých se na aniontoměnič váže vVF, ale ne virus (Burnouf-Radosevich, Vox Sang 62 (1992), až 11). Důkladným promytím sloupce před eluováním je možno získat vVF - v závislosti na viru - se snížením obsahu viru 1,5 až 5 mocnin čísla deset.

Zolton a kol. (Vox Sang 49 (1985), 381 až 389) zkoušeli hodnotu snížení obsahu viru při aniontoměničové chromatograf ii pro čištění gama-globulinů za podmínek, při kterých se gama-globuliny nevážou na aniontoměnič. Při tomto způsobu se používá jako aniontoměnič DEAE-sepharosa při hodnotě pH 7,5. Infekčnost výchozího roztoku, smíšeného s virem hepatitidy Β , je možno při tom pomocí této aniontoměničové chromatografie odstranit. Pomocí tohoto experimentu se provede snížení obsahu viru hepatitidy B o faktor 3000. Potvrdit hodnotu snížení obsahu jiných virů však nebylo při hodnotě pH 7,5 v žádném případě možné. Je zajímavé, že se při hodnotě pH pod 7,2 vyskytovaly viry v proteklé kapalině aniontoměničem, takže je možno tento způsob považovat v neutrální nebo slabě kyselé oblasti pH v zásadě jako nepoužitelný.

V EP 506 651 je popsán vícestupňový způsob získávání preparátu, obsahujícího IcA , IgG a transferrin, při kterém se během každého jednotlivého pracovního kroku dosáhne redukce titru viru. Během extrakčniho a srážecího kroku s 12% ethylalkoholem je možno dosáhnout redukce viru o faktor 10⁵ . Při adsorpčním kroku jsou vázány proteiny na ionto5 • «· ·» · ·« · · •· » fl · ··· fl ·· · ··· · · · ···» flfl · fl · · · flfl flfl · • flfl flfl fl ···· ··· ·· ·· ··· ·« · · měnič, promyji se a znovu se eluují. Při tom se dosáhne redukce viru okolo faktoru 10 .

V publikaci Dev. Biol. Stand. 81 (1993), 199 až 209 popisuje Burnouf, že se může pomocí aniontoměničového kroku při čištění faktoru VIII snížit obsah parainfluenzaviru a HIV-1 o 4, popřípadě 3 mocniny čísla deset. Při čištění vVF pomocí aniontoměničové chromatografie je popsána hodnota snížení obsahu PRV (porcine pseudorabies virus) log-stupňů.

Mitra a kol. (Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus. 56 (1989), 34 až 43) ukazují, že při čištění IgG z plasmy pomocí schéma frakcionace plasmy podle Cohn-Ocleye je možno v důsledku srážecích kroků za přítomnosti určitých koncentrací ethylalkoholu a definované hodnoty pH za studená (-5 °C) dosáhnout snížení obsahu viru > 5 , popřípadě > 8 log-stupňů u myšího C-viru, popřípadě HIV. V této práci je též uvedeno, že 25% ethanolický roztok může při fyziologické hodnotě pH působit silně virocidně. Spojení zpracování ethylalkoholem s iontoměničovou chromatografii zde však není ani popsáno, ani uvažováno.

Hamman a kol. (Vox Sang 67 (1994), 72 až 77, ukazují, že se pomocí iontoměničové chromatografie při procesu výroby koncentrátu faktoru VIII může dosáhnout snížení virové aktivity, popřípadě koncentrace viru pouze 1 až 2 log-stupv o nu.

Je tedy potřeba průmyslově použitelných metod pro bezpečné oddělení virů z roztoků proteinů, aby se vyloučila risika infekcí u pacientů, kteří jsou ošetřováni farmaceutickými nebo terapeutickými preparáty zvířecího nebo

lidského původu nebo vyrobenými genově technickými postupy z buněčných kultur.

Dále je potřeba proti virům zabezpečených a patogeny neobsahujících produktů, u kterých je již způsobem výroby zabezpečeno, že není přenesen žádný patogen a že způsob je dostatečně šetrný, aby zůstala prakticky neovlivněna biologická aktivita produktů.

Úkolem předloženého vynálezu tedy je dát k disposici zlepšený způsob snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiálu.

Podstata vynálezu

Uvedený úkol byl podle předloženého vynálezu vyřešen vypracováním způsobu výše uvedeného druhu, jehož podstata spočívá v tom, že se biologický materiál smísí s organickým rozpouštědlem, tento s organickým rozpouštědlem smísený materiál se uvede do kontaktu s iontoměničem, přičemž se patogeny adsorbují na iontoměnič a alespoň jedna ze získávaných biologických substancí nevstupuje nebo pouze nepatrně vstupuje do vzájemného působení s materiálem iontoměniče a iontoměnič s adsorbovanými patogeny se od biologického materiálu oddělí, přičemž se získá preparát biologické substance se sníženým obsahem viru.

Překvapivě bylo zjištěno, že za přítomnosti organického rozpouštědla je redukční faktor iontoměničového kroku je ve srovnání s faktorem, popsaným ve stavu techniky, podstatně zvýšen. Tak zjistil Hamman a kol. (supra) redukční faktor pouze 1 log-stupeň při iontoměničovém kroku.

• 9 9 · » · · · 9 9

9 9 9 9 99 · · · · • · · · · β · · « »

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · •·· 99 9 9 999 99 9 9

Nebylo proto možno očekávat, že bude možno dosáhnout při jednostupňovém postupu, totiž adsorpčním způsobu bez další eluce, vysoký redukční faktor. Je rovněž překvapující, že se přítomností rozpouštědla podstatně změní adsorpční specifita iontoměniče, čímž jsou vázány patogeny, zatímco biologické substance, obzvláště proteiny, se v zásadě nevážou. Tak je pomocí způsobu podle předloženého vynálezu možné dosáhnout například pro HAV redukční faktor > 5,95 log-stupňů , což odpovídá úplnému odstranění, zatímco na rozdíl od toho dosahuje Hamman a kol. redukčního faktoru pouze 1 log-stupeň pro HAV pomoci iontoměničového kroku.

Je sice známé, že zpracování pro snížení obsahu se 12% ethylalkoholem může vést k redukci virů, je ale nanejvýše překvapivé, že je organické rozpouštědlo vhodné také k tomu, že se současně se zpracováním iontoměničem použije pro snížení obsahu virů.

V rámci předloženého vynálezu se ukázalo, že se může dosáhnout zvláštních hodnot snížení obsahu pomocí aniontoměničové chromatografie, popřípadě adsorpce na aniontoměniči, výhodně ve spojení s materiály na basi uhlohydrátů nebo R syntetických polymerů, jako je například DEAE-Sephacel , DEAE-Sephadex^R, DEAE-Sepharose CL6B^R, DEAE-Sepharose Fast F1ow^R, QAE-Sephadex^R, Q-Sepharose Fast Flow^R, Q-Sepharose High Performance^R, Q-Sepharose Big Beads^R (vše firma Pharmacia);

DEAE-Tris-Acryl^R, DEAE-Spherodex^R, Q-Hyper-D^R (vše firma Sepracor);

Macroprep DEAE^R, Macroprep Q^R (vše firma BioRad);

DEAE-Toyopearl^R, QAE-Toyopaerl^R, Toyopearl Super-Q^R (vše firma Tosohaas);

Protein PAK DEAE^R (Vaters);

Fractogel EMD-TMAE^R, Fractogel EMD-DEAE^R, Fractogel EMDDMAE^R, Licrospher 1000 TMAE^R, Licrospher 1000 DEAE^R a Licrospher 4000 DMAE^R (vše firma MERCK).

Obzvláště výhodný je, především při zpracování imunoglobulinu, aniontoměnič typu DEAE, obzvláště typu DEAE-Sephadexu.

Patogeny, adsorbované na iontoměnič, se potom odstraní oddělením komplexu iontoměnič/patogen z biologického materiálu. Tím se adsorbát bezprostředně a bez zpracování elučním pufrem z biologického materiálu jednoduchým způsobem oddělí. Komplex se oddělí výhodně penetrací biologického materiálu přes prostupný filtr, obzvláště hloubkový filtr. Oddělení komplexu se může též provést sedimentací, obzvláště odstředěním. Výhodně se provádí oddělování iontoměniče rovněž za přítomnosti rozpouštědla.

Biologickými substancemi se v rámci předloženého vynálezu míní substance biologického původu, které se získávají například z tělesných tekutin, jako je krev nebo plasma, nebo se mohou isolovat z kultivačních tekutin rekombinantních buněk, přičemž tyto biologické substance, které se v rámci předloženého vynálezu získávají, popřípadě jejichž kontaminace viry se má snižovat, se mohou používat obzvláště terapeuticky, profylakticky nebo diagnosticky, popřípadě jako farmaceutické preparáty. U těchto biologických substancí se může jednat například o proteiny/peptidy, uhlohydráty nebo lipidy, obzvláště o biologicky aktivní substance, jako jsou imunoglobulíny nebo krevní faktory.

Pod biologické substance je možno ale také zahrnout i jiné třídy látek, které mohou být tvořené prokaryontickými nebo eukaryontickými buňkami.

Získávání preparátů biologických substancí se sníženým obsahem virů ze supernatantu adsorbátu, popřípadě z filtrátu, se provádí obvykle dalším zpracováním nebo čištěním biologických substancí, popřípadě frakcí biologického materiálu, přičemž se mimo jiné provádí srážení, postupy chromatograf ického čištění, filtrace, diafiltrace a formulování .

Biologický materiál při tom může být v rámci předloženého vynálezu frakce plasmy, imunoglobulin obsahující frakce plasmy, výhodně Cohnova vrakce II+III , plasmový protein obsahující frakce, která obsahuje krevní faktory, jako je faktor II, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, protein C, protein S a vVF , koncentrát obsahující některý z uvedených krevních faktorů, supernatant kultury hybridoma-buněčné linie, supernatant buněčné kultury transformovaných nebo infikovaných buněk savců nebo extrakt zvířecích nebo lidských tkání. Parametry pro provádění způsobu se při tom určí vždy podle druhu a povahy biologického materiálu a podle možných přítomných kontaminujících patogenů. Optimální parametry, jako je hodnota pH, teplota, doba trvání inkubace pro provedení a druh organického rozpouštědla při způsobu podle předloženého vynálezu, jsou pro odborníky zjistitelné na základě jejich všeobecných vědomostí v závislosti na druhu patogenů, specifitě iontoměniče a povaze biologického materiálu (čistota roztoku, koncentrace proteinu v roztoku).

Způsob podle předloženého vynálezu je obzvláště vhodný k odstraňování molekulárních a/nebo virálních patogenů z biologických materiálů, přičemž se efektivně odstraňují virální patogeny jak ze skupiny lipidy zapouzdřených, tak ze skupiny ne lipidy zapouzdřených virů. K těmto se počítají obzvláště viry jako je HAV, HBV, HCV, HGV, HEV, HDV, HIV,

CMV nebo parvovirus.

Pod organickými rozpouštědly se rozumí v rámci předloženého vynálezu obzvláště taková rozpouštědla, která za zvolených podmínek nevyvolávají při smísení s biologickými materiály žádné podstatné denaturační procesy. K těmto patří obzvláště rozpouštědla, jako je methylalkohol, ethylalkohol nebo ostatní biologicky přijatelné alkoholy.

Optimální koncentrace odpovídajícího rozpouštědla může být, stejně jako nepatrné odchylky u optimálních podmínek chromatografie, které mohou být popřípadě způsobené přítomností rozpouštědla, lehce zjištěné každým odborníkem pomocí jednoduchého pokusu. Všeobecně se rozpouštědlo používá v koncentraci 5 až 20 % objemových, výhodně v koncentraci 10 až 15 % objemových a obzvláště v koncentraci 12 až 14 % obj emových.

Výhodně se jako organické rozpouštědlo použije jednomocný nebo vícemocný alkohol, přičemž obzvláště výhodný je ethylalkohol. Obzvláště výhodně ke koncentrace ethylalkoholu podle předloženého vynálezu v rozmezí 12 až 14 % objemových, zvláště v rozmezí 13 až 14 % objemových.

Zpracování iontoměničem se výhodně provádí při nízkých teplotách, přičemž výhodné jsou teploty pod 10 °C nebo pod 5 °C . Jak se ukázalo, je obzvláště výhodné zpracování aniontoměničem při provádění způsobu podle předloženého vynálezu při teplotě v rozmezí 0 °C až -10 °C .

• · • · ·· ·

Ukázalo se také, že se způsob podle předloženého vynálezu může oproti zprávám podle stavu techniky a obzvláště oproti výsledkům Zoltona a kol. (1985) , úspěšně provádět také při hodnotách pH pod 7,5 , popřípadě 7,2 , tedy v neutrální, popřípadě kyselé oblasti.

Výhodná provozní varianta způsobu podle předloženého vynálezu spočívá v tom, že se zpracování biologického materiálu s iontoměničem, obzvláště s aniontoměničem, provádí při hodnotě pH 5,6 až 7,2 , výhodně v rozmezí 6,0 až 6,4, obzvláště při pH 6,2 .

Zpracování vodného roztoku biologického materiálu s aniontoměničem se výhodně provádí v průběhu časového období 1 minuta až 20 hodin, obzvláště během 4 až 8 hodin, přičemž inkubace se může provádět buď batch postupem nebo v průtokovém systému.

Způsobem podle předloženého vynálezu se může získat biologický materiál, který je bezpečně prostý molekulárních a/nebo virálních patogenů, přičemž patogeny jsou v podstatě úplně odstraněny. Tak bylo zjištěno, v závislosti na přidané koncentraci ethylalkoholu, v podstatě úplné odstranění virů. Jednostupňovým způsobem podle předloženého vynálezu se dosáhne redukčního faktoru patogenů výhodně >5,5 logstupně, obzvláště výhodně >7,0 log-stupně.

Optimální adsorpční podmínky při iontoměničové chromatografií mohou odborníci vždy podle získávané biologické substance, popřípadě podle adsorbovaného viru, v závislosti na odpovídajícím organickém rozpouštědle, lehce optimalisovat s využitím podkladů podle předloženého vynálezu.

Předložený způsob je vhodný také ve značné míře pro kombinování s dalšími patogeny inaktivujícími nebo patogeny snižujícími kroky, jako je zpracování teplem a/nebo detergenty, zpracování zářením nebo filtrací, přičemž nanofiltrace podle AT A 780/96 se může obzvláště výhodně kombinovat se způsobem podle předloženého vynálezu.

Způsob podle předloženého vynálezu je obzvláště vhodný pro výrobu imunoglobulinových preparátů, může se ale také specificky použít pro získávání farmaceutických preparátů a krevních faktorů, jako je faktor II, faktor Ila, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein S, protein C nebo vVF .

Vynález je blíže objasněn pomocí následujících příkladů provedení, bez toho, že by měl být na tyto příklady omezen.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Snížení obsahu virů z roztoků, obsahujících IgG (v současné době podle názoru přihlašovatele nej lepší cesta pro provedení vynálezu)

Cohnova frakce II+III , obsahující imunoglobulin, se zpracuje s ethylalkoholem až na konečnou koncentraci 10 % objemových až 14 % objemových a roztok se ochladí na teplotu v rozmezí -3 °C až -1 °C , načež se tento roztok smísí s testovanými viry, uvedenými v tabulce 1 . Na jeden gram proteinu se přidá 0,5 g DEAE-Sephadexu A-50 , hodnota pH se • ·♦ 99 · 99 99 · 9 · · 99 · ♦ · · • · · ·· · · · · ·

9 99* 9 9 «9 ·9 9 • •9 · 9 9 · 9 9 9 •99 99 99 «99 99 99 nastaví na 6,2 ± 0,1 a za míchání se inkubuje při udržování uvedené teploty a hodnoty pH po dobu 6 hodin. Suspense iontoměniče se potom hloubkovou filtrací odstraní a určí se titr viru ve filtrátu. Hodnoty snížení obsahu viru, vyjádřené jako úbytek infekčních virových částic v mocninách čísla deset, jsou shrnuté v tabulce 1 a byly stanovené pomocí titrace viru nebo PCR . Jak je z této tabulky patrné, vede tento způsob - v závislosti na použitém testovaném viru - ke snížení obsahu o 2 až přes 6 mocnin čísla deset. Výtěžek IgG v supernatantu činí > 70 % .

V kontrolních pokusech, ve kterých se prováděla inkubace testovaných virů analogickým způsobem bez přídavku aniontoměniče, nebyl zjištěn žádný virocidní efekt ethylalkoholu za daných podmínek.

• ·· ·* ·· · · · « • · · · « • · ♦ · * 4 • · · · « ··· ·· ··

99

9 ·9

Tabulka

race

o\° T^-1

o\° l> σ\

> 5,40

> 6,27

ti tí .

> 4,35 |

n.d.

d d

n.d. j

ď d

E - Sephadex a filt:

13 %

100 %

> 5,44

n.d.

5,96

2,61

n.d.

d d

n.d.

o\° (N r—1

o\o O O rd

IRF [log]

2,95

> 6,76

5,00

1,80

> 5,32

> 5,95

4,03

> 4,30

> 5,10

v. 0A1 - způsob DEA

11 %

100 %

n.d.

3,73

n.d.

d d

> 3,94

3,91

d tí

n.d.

d d

o\o o H

% 001

n.d.

k£>

n.d.

n.d. i_

n.d.

1 ^n,d'

H o tn H

rH 0 a rcS Λ jj W

Výtezek j

% Pj

H S M [X.

BVDV |

> o K

HAV

> O

ΛΙΗ I

ΛΗΉ

• ·· ·· · ·· ·· • · · · · · · · · ·· · • · · ·· · ···· • · · ·· · · · · · ··· ·· ·· ··· «· ··

Vysvětlení použitých zkratek :

PRV Pseudorabies virus

MVM Minuté Virus of Mice/Parvovirus

FSME virus ranné letní meningoencefalitidy

BVDV boviní diarrhea virus

HCV hepatitis C virus

HAV hepatitis A virus

HGV hepatitis G virus

HIV-1 virus 1 humání imunodeficience

ERV equine rhinopneumonitis virus

n.d. neprováděno

Příklad

Snížení obsahu parvoviru z roztoků, obsahujících IgG

Cohnova frakce III , obsahující imunoglobulin, s obsahem 12 % ethylalkoholu , se smísí s parvovirem B19 analogicky jako je popsáno v příkladě 1 . Celkové zatížení ve

113 výchozím materiálu, smíšeném s B19 , činí 10 ’ DNA-kopií/ml. Adsorpční krok s DEAE-Sephadexem s následující filtrací se provádí stejně jako je popsáno v příkladě 1 . Pomocí PCR , jak je popsáno v AT A 780/96 , se stanoví DNA-kopie ve filtrátu. Ve filtrátu nemohly být dokázány žádné parvovirus-specifické DNA . Za zohlednění hranice důkazu byl pomocí způsobu podle předloženého vynálezu dosažen virus-redukční faktor >7,4 log-stupně .

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiálu, obsahujícího jednu nebo více získávaných biologických substancí, vyznačující se tím, že se

- biologický materiál smísí s organickým rozpouštědlem,

- tento s organickým rozpouštědlem smísený materiál se uvede do kontaktu s iontoměničem, přičemž se patogeny adsorbují na iontoměnič a alespoň jedna ze získávaných biologických substancí nevstupuje nebo pouze nepatrně vstupuje do vzájemného působení s iontoměničem a

- iontoměnič s adsorbovanými patogeny se od biologického materiálu oddělí, přičemž se získá preparát biologické substance se sníženým obsahem viru.
2. Způsob podle nároku 1 , vyznačující se tím, že se jako iontoměničový materiál použije aniontoměnič, výhodně aniontoměnič DEAE-typu, obzvláště DEAE-Sephadex.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 , vyznačující se tím, že se organické rozpouštědlo použije v koncentraci 5 až 20 % objemových (v/v), výhodně v koncentraci 10 až 15 % objemových (v/v), obzvláště v koncentraci 12 až 14 % objemových (v/v).
4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3 , vyznačující se tím, že se jako organické rozpouštědlo použije jednomocný nebo vícemocný alkohol, obzvláště ethylalkohol.

• 9

9 #9 99 9 99 • 9 • 9 9 9 9 • 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 * 9 • 9 • 9 • 9 9 99 99 9 9 9 9 9 9 9
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že se inkubace s iontoměničem provádí při teplotě pod 10 °C , výhodně pod 5 °C a obzvláště v rozmezí 0 °C až -10 °C .
6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5 , vyznačující se tím, že se inkubace s iontoměničem provádí při hodnotě pH v rozmezí 5,2 až 7,2 , výhodně v rozmezí 6,0 až 6,4 a obzvláště okolo 6,2 .
7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6 , vyznačující se tím, že se inkubace s iontoměničem provádí po dobu 1 až 20 hodin, výhodně 4 až 8 hodin, přičemž tato inkubace se provádí buď batch postupem nebo v průtočném systému.
8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7 , vyznačující se tím, že se jako organické rozpouštědlo použije ethylalkohol, výhodně v koncentraci 5 až 20 % , obzvláště 10 až 15 % a obzvláště výhodně 12 až 14 % .
9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8 , vyznačující se tím, že se jako biologické substance získávají imunoglobuliny nebo krevní faktory.
10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9 , vyznačující se tím, že se oddělováni komplexu iontoměnič/patogeny provádí penetrací biologického materiálu přes prostupný filtr.