CZ451599A3 - Method of reducing content of viral and molecular pathogens in biological materials - Google Patents
Method of reducing content of viral and molecular pathogens in biological materials Download PDFInfo
- Publication number
- CZ451599A3 CZ451599A3 CZ19994515A CZ451599A CZ451599A3 CZ 451599 A3 CZ451599 A3 CZ 451599A3 CZ 19994515 A CZ19994515 A CZ 19994515A CZ 451599 A CZ451599 A CZ 451599A CZ 451599 A3 CZ451599 A3 CZ 451599A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- biological
- pathogens
- virus
- ion exchanger
- organic solvent
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiálu, obsahujícíhojednu nebo více získávaných biologických substancí, při kterémse biologický materiál smísí s organickýmrozpouštědlem, tento s organickým rozpouštědlemsmísený materiál se uvede do kontaktu s iontoměničem, priěemž se patogeny adsorbují na iontoměniě a alespoňjedna ze získaných biologických substancí nevstupuje nebo pouze nepatrně vstupuje do vzájemného působení s iontoměničema iontoměniě a adsorbovanými patogeny se od biologického materiálu oddělí, přičemž se získá preparát biologické substance se sníženýmobsahem viru.The present invention relates to a method for reducing viral a molecular pathogens from biological material, containing one or more derived biological species the substance in which the biological material is mixed with an organic solvent, this with an organic solvent the solvent-mixed material is contacted with an ion exchanger, wherein the pathogens are adsorbed on ion exchange and at least one of the obtained biological substances it does not enter or only slightly enters into reciprocal ion exchange and adsorbed ion exchangers the pathogens are separated from the biological material, taking obtains a biological substance preparation with reduced content virus.
Description
Způsob snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiáluMethod for reducing viral and molecular pathogens from biological material
Oblast technikyTechnical field
Vynález se týká způsobu snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiálu, obsahujícího jednu nebo více získávaných substancí.The invention relates to a method for reducing the content of viral and molecular pathogens from a biological material containing one or more substances obtained.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Výroba terapeutických proteinů a preparátů, obzvláště imunoglobulinu, extrakcí z lidských nebo zvířecích tkání nebo tekutin, jako je krev nebo plasma, jakož i z kontinuálně rostoucích transformovaných buněk savců, je často spojena s risikem potenciální kontaminace patogeny, jako jsou viry, virům podobné částice nebo priony. Musí se tedy provádět opatření k tomu, aby se případně přítomné patogeny napřenášely na lidi.The production of therapeutic proteins and preparations, especially immunoglobulin, by extraction from human or animal tissues or fluids such as blood or plasma, as well as from continuously growing transformed mammalian cells, is often associated with the risk of potential contamination with pathogens such as viruses, virus-like particles or prions . Measures must therefore be taken to ensure that any pathogens present are transmitted to humans.
Lidská krev, popřípadě plasma, může obsahovat například viry, které způsobují onemocnění jako AIDS, hepatitidu B nebo jiná onemocnění hepatitidou. U plasmových proteinů z plasmové banky je risiko přenášení infekčních agens, jako jsou viry, na základě selekce dárců krve nebo plasmy a na základě výrobního postupu velmi nepatrné. Vhodná opatření, jako je vyřazení dárců krve, kteří vykazují zvýšené risiko, z odběrů, jakož i analysy darované krve nebo plasmy, které umožňují zjistit infekční dárce, a odběry dalším dělením vyloučit, sice dovolují většinu infekčních dárců eliminovat, • ·· ·· · *· • · · · β · · β » ·· ·For example, human blood or plasma may contain viruses that cause diseases such as AIDS, hepatitis B, or other hepatitis diseases. For plasma proteins from a plasma bank, the risk of transmitting infectious agents, such as viruses, is very low based on the selection of blood or plasma donors and the manufacturing process. Appropriate measures, such as excluding blood donors with increased risk, from donations, as well as blood or plasma donation analyzes to identify infectious donors and exclude subdivisions, while allowing the elimination of most infectious donors, * · · · · Β · · · · ·
9 9 9 9 9 9 · · » • · 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 většinou ale nejdou zjistit všichni. Existující testovací systémy pro důkaz unfekčnich virů v biologických materiálech nemohou pochyby o potenciálním přenosu patogenů vždy vyloučit, neboť při širokém spektru infekčních patogenů je nemožné testovat výchozí biologický materiál na všechny viry nebo molekulární patogeny, které mohou být ve vzorku přítomné. K tomu nezjišťuje většina testů virus, ale proti viru vznikající protilátky, takže v období takzvaného diagnostického okna nemůže být proveden důkaz kontaminace. Pro některé skupiny virů kromě toho neexistuje žádná příhodná nebo dostatečně citlivá metoda důkazu. Ačkoliv nově objevené testovací způsoby, obzvláště způsob amplifikace nukleových kyselin, jako například PCR , jsou velmi citlivé a specifické, mohou být použity pouze na patogeny, jejichž sekvence nukleových kyselin je známá. V případech, ve kterých jsou sice lidské patogeny známé, avšak není k disposici žádný citlivý způsob důkazu, zůstává nejistota, že se negativní výsledek získá pouze na základě příliš nepatrného obsahu viru, který leží pod hranicí citlivosti testovacího systému.9 9 9 9 9 9 · · »• · 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 Existing test systems for the detection of non-infectious viruses in biological materials cannot always rule out the potential for pathogen transfer, since a wide range of infectious pathogens make it impossible to test the starting biological material for any viruses or molecular pathogens that may be present in the sample. To do this, most tests do not detect virus, but antibodies that are generated against the virus, so that during the so-called diagnostic window, no evidence of contamination can be performed. In addition, for some groups of viruses, there is no convenient or sufficiently sensitive method of proof. Although newly discovered assay methods, particularly nucleic acid amplification methods such as PCR, are very sensitive and specific, they can only be applied to pathogens whose nucleic acid sequence is known. In cases where human pathogens are known but no sensitive means of proof are available, the uncertainty remains that the negative result will only be obtained from too low a virus content that is below the sensitivity of the test system.
Byly proto vyvíjeny pro výrobu farmaceutických a terapeutických produktů specifické postupy odstraňování a/nebo inaktivace pro sníženi obsahu virů, takové, aby v konečném produktu nebylo možno očekávat žádné infekční částice.Therefore, specific removal and / or inactivation procedures have been developed for the production of pharmaceutical and therapeutic products to reduce the virus content, such that no infectious particles can be expected in the final product.
Různé inaktivační postupy jsou založené na fyzikálně chemickém zpracování pomocí tepla a/nebo chemikálií. Jako tyto způsoby přichází v úvahu obzvláště tepelné zpracování, pasterisace, zpracování roztoku proteinu β-propiolaktonem a UV-zářením, zpracováním kombinací rozpouštědla a detergentu (takzvaný S/D-postup) nebo ozáření roztoku proteinuThe various inactivation procedures are based on physicochemical treatment using heat and / or chemicals. Suitable methods are, in particular, heat treatment, pasteurization, treatment of the protein solution with β-propiolactone and UV-radiation, treatment with a combination of a solvent and a detergent (the so-called S / D procedure) or irradiation of the protein solution.
po přídavku fotodynamické látky. Pomocí těchto způsobů bylo dosaženo inaktivace virů až 10^ log-stupňů. Eficience způsobu inaktivace se však může měnit v závislosti na typu viru. Ačkoliv se krevní produkty, zpracované postupem S/D, považují za bezpečné ve vztahu na přenesení HCV, HBV nebo HIV , neinaktivují se tímto způsobem nezapouzdřené viry, jako je HAV nebo parvovirus (Provse C., Vox Sang. 67 (1994), 191 až 196).after the addition of the photodynamic substance. Virus inactivation of up to 10 log-degrees was achieved using these methods. However, the effectiveness of the inactivation method may vary depending on the type of virus. Although S / D-treated blood products are considered safe with respect to the transmission of HCV, HBV or HIV, non-encapsulated viruses such as HAV or parvovirus are not inactivated in this manner (Provse C., Vox Sang. 67 (1994), 191). to 196).
Postupy tepelného zpracování se provádějí u biologických produktů výhodně buď v roztoku (EP-0 124 506) , v suchém stavu (EP-0 212 040 nebo VO 82/03871) nebo ve zvlhčeném stavu (EP-0 324 729). Často při tom může docházet ke ztrátám na základě termolability mnoha biologických substancí .The heat treatment processes are carried out for biological products preferably either in solution (EP-0 124 506), in the dry state (EP-0 212 040 or WO 82/03871) or in the wetted state (EP-0 324 729). Often, this can result in losses due to the thermolability of many biological substances.
Druh inaktivačního způsobu může mít ale také vliv na produkty a proto je často nutná stabilisace pro minimalisaci ztráty proteinu. K tomu musí po některých inaktivačních postupech následovat čistící kroky, aby se odstranily přidávané chemikálie.However, the type of inactivation method may also have an effect on the products and therefore stabilization is often required to minimize protein loss. In addition, some inactivation procedures must be followed by purification steps to remove added chemicals.
Způsoby snížení obsahu virů zahrnují obzvláště chromatograf ické postupy, filtraci roztoků proteinů přes membránový filtr nebo adsorpci virů na pevné fázi a následující odstranění pevné fáze, jak je popsáno v EP-0 679 405. Bylo však zjištěno, že zpracování s pevnou fází, jako je například AerosilR, sice dovoluje udstranění HIV z až 4 log-stupňů z roztoku obsahujícího ímunoglobulin, ztráta IgG však může činit sž 42 % (Gao a kol., Vox Sang 64 (1993),Methods for reducing virus content include, in particular, chromatographic techniques, filtration of protein solutions through a membrane filter or adsorption of viruses on a solid phase and subsequent removal of the solid phase as described in EP-0 679 405. However, it has been found that solid phase processing such as Aerosil R , for example, allows clearance of HIV from up to 4 log-degrees from a solution containing immunoglobulin, but IgG loss may be as high as 42% (Gao et al., Vox Sang 64 (1993),
204 až 209). Pro velkovýrobní použití je pro tyto vysoké hodnoty ztrát takovýto způsob považován za nevhodný.204 to 209). For large-scale applications such a method is considered unsuitable for these high loss values.
Dalece rozšířený chromatografický způsob pro isolaci biologických látek je aniontoměničová chromatografie. Také možnost, že se tímto dělícím způsobem může snížit obsah virů, je v literatuře popsaná. Například bylo zkoušené snížení obsahu virů při aniontoměničové chromatografií pro čištění vVF za podmínek, za kterých se na aniontoměnič váže vVF, ale ne virus (Burnouf-Radosevich, Vox Sang 62 (1992), až 11). Důkladným promytím sloupce před eluováním je možno získat vVF - v závislosti na viru - se snížením obsahu viru 1,5 až 5 mocnin čísla deset.A far-reaching chromatographic method for the isolation of biologicals is anion exchange chromatography. Also, the possibility that virus content can be reduced by this separation method is described in the literature. For example, the reduction of virus content in anion-exchange chromatography for vVF purification has been tested under conditions in which vVF binds to the anion exchanger but not the virus (Burnouf-Radosevich, Vox Sang 62 (1992), 11). By thoroughly washing the column prior to elution, vVF can be obtained - depending on the virus - with a virus content reduction of 1.5 to 5 powers of number ten.
Zolton a kol. (Vox Sang 49 (1985), 381 až 389) zkoušeli hodnotu snížení obsahu viru při aniontoměničové chromatograf ii pro čištění gama-globulinů za podmínek, při kterých se gama-globuliny nevážou na aniontoměnič. Při tomto způsobu se používá jako aniontoměnič DEAE-sepharosa při hodnotě pH 7,5. Infekčnost výchozího roztoku, smíšeného s virem hepatitidy Β , je možno při tom pomocí této aniontoměničové chromatografie odstranit. Pomocí tohoto experimentu se provede snížení obsahu viru hepatitidy B o faktor 3000. Potvrdit hodnotu snížení obsahu jiných virů však nebylo při hodnotě pH 7,5 v žádném případě možné. Je zajímavé, že se při hodnotě pH pod 7,2 vyskytovaly viry v proteklé kapalině aniontoměničem, takže je možno tento způsob považovat v neutrální nebo slabě kyselé oblasti pH v zásadě jako nepoužitelný.Zolton et al. (Vox Sang 49 (1985), 381-389) tested the virus reduction value in anion-exchange chromatography to purify gamma-globulins under conditions in which gamma-globulins did not bind to the anion-exchanger. DEAE-sepharose is used as an anion exchanger at a pH of 7.5. The infectivity of the starting solution mixed with hepatitis virus virem can be eliminated by this anion exchange chromatography. This experiment reduced the hepatitis B virus content by a factor of 3000. However, it was not possible to confirm the reduction in the content of other viruses at pH 7.5. Interestingly, at a pH below 7.2, viruses were present in the flowing liquid through the anion exchanger, so that the process can be considered essentially unusable in the neutral or weakly acidic pH range.
V EP 506 651 je popsán vícestupňový způsob získávání preparátu, obsahujícího IcA , IgG a transferrin, při kterém se během každého jednotlivého pracovního kroku dosáhne redukce titru viru. Během extrakčniho a srážecího kroku s 12% ethylalkoholem je možno dosáhnout redukce viru o faktor 105 . Při adsorpčním kroku jsou vázány proteiny na ionto5 • «· ·» · ·« · · •· » fl · ··· fl ·· · ··· · · · ···» flfl · fl · · · flfl flfl · • flfl flfl fl ···· ··· ·· ·· ··· ·« · · měnič, promyji se a znovu se eluují. Při tom se dosáhne redukce viru okolo faktoru 10 .EP 506 651 discloses a multi-step method for obtaining a preparation comprising IcA, IgG and transferrin, wherein a reduction of the virus titer is achieved during each individual working step. During the extraction and precipitation step with 12% ethanol can be obtained for virus reduction factor of 10 5th In the adsorption step, the proteins are bound to ionto5, flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl flfl fl ·········· «Wash the changer, wash and elute again. This achieves a virus reduction of around factor 10.
V publikaci Dev. Biol. Stand. 81 (1993), 199 až 209 popisuje Burnouf, že se může pomocí aniontoměničového kroku při čištění faktoru VIII snížit obsah parainfluenzaviru a HIV-1 o 4, popřípadě 3 mocniny čísla deset. Při čištění vVF pomocí aniontoměničové chromatografie je popsána hodnota snížení obsahu PRV (porcine pseudorabies virus) log-stupňů.In Dev. Biol. Stand. 81 (1993), 199-209 discloses Burnouf that parainfluenzavir and HIV-1 can be reduced by 4 and 3 squares of number ten, respectively, by an anion exchange step in purifying factor VIII. In anion-exchange chromatography purification of vVF, a reduction in the PRV (porcine pseudorabies virus) content of log-degrees is described.
Mitra a kol. (Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus. 56 (1989), 34 až 43) ukazují, že při čištění IgG z plasmy pomocí schéma frakcionace plasmy podle Cohn-Ocleye je možno v důsledku srážecích kroků za přítomnosti určitých koncentrací ethylalkoholu a definované hodnoty pH za studená (-5 °C) dosáhnout snížení obsahu viru > 5 , popřípadě > 8 log-stupňů u myšího C-viru, popřípadě HIV. V této práci je též uvedeno, že 25% ethanolický roztok může při fyziologické hodnotě pH působit silně virocidně. Spojení zpracování ethylalkoholem s iontoměničovou chromatografii zde však není ani popsáno, ani uvažováno.Mitra et al. (Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus. 56 (1989), 34-43) show that when purifying IgG from plasma using a Cohn-Ocley plasma fractionation scheme, precipitation steps in the presence of certain concentrations of ethanol and a defined pH value are possible cold (-5 ° C) to achieve a virus reduction of> 5 and> 8 log-degrees, respectively, in the mouse C-virus or HIV. It is also stated in this work that a 25% ethanolic solution can have a strong virucidal effect at physiological pH. However, the combination of ethanol treatment with ion exchange chromatography is neither described nor contemplated herein.
Hamman a kol. (Vox Sang 67 (1994), 72 až 77, ukazují, že se pomocí iontoměničové chromatografie při procesu výroby koncentrátu faktoru VIII může dosáhnout snížení virové aktivity, popřípadě koncentrace viru pouze 1 až 2 log-stupv o nu.Hamman et al. (Vox Sang 67 (1994), 72-77) show that a reduction in viral activity or a virus concentration of only 1 to 2 log-grades can be achieved by ion exchange chromatography in the process for the production of factor VIII concentrate.
Je tedy potřeba průmyslově použitelných metod pro bezpečné oddělení virů z roztoků proteinů, aby se vyloučila risika infekcí u pacientů, kteří jsou ošetřováni farmaceutickými nebo terapeutickými preparáty zvířecího neboThus, there is a need for industrially applicable methods for safely separating viruses from protein solutions in order to avoid the risk of infections in patients who are treated with pharmaceutical or therapeutic preparations of animal or
lidského původu nebo vyrobenými genově technickými postupy z buněčných kultur.of human origin or produced by genetic engineering techniques from cell cultures.
Dále je potřeba proti virům zabezpečených a patogeny neobsahujících produktů, u kterých je již způsobem výroby zabezpečeno, že není přenesen žádný patogen a že způsob je dostatečně šetrný, aby zůstala prakticky neovlivněna biologická aktivita produktů.Further, there is a need for virus-safe and non-pathogen-free products in which the manufacturing process already ensures that no pathogen is transferred and that the method is sufficiently gentle to keep the biological activity of the products practically unaffected.
Úkolem předloženého vynálezu tedy je dát k disposici zlepšený způsob snížení obsahu virálních a molekulárních patogenů z biologického materiálu.It is therefore an object of the present invention to provide an improved method for reducing viral and molecular pathogens from biological material.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Uvedený úkol byl podle předloženého vynálezu vyřešen vypracováním způsobu výše uvedeného druhu, jehož podstata spočívá v tom, že se biologický materiál smísí s organickým rozpouštědlem, tento s organickým rozpouštědlem smísený materiál se uvede do kontaktu s iontoměničem, přičemž se patogeny adsorbují na iontoměnič a alespoň jedna ze získávaných biologických substancí nevstupuje nebo pouze nepatrně vstupuje do vzájemného působení s materiálem iontoměniče a iontoměnič s adsorbovanými patogeny se od biologického materiálu oddělí, přičemž se získá preparát biologické substance se sníženým obsahem viru.The object of the present invention is to provide a method of the above-mentioned type, which comprises mixing the biological material with an organic solvent, contacting the organic material mixed with the ion exchanger with the pathogens adsorbed onto the ion exchanger and at least one it does not enter or only slightly interact with the ion exchanger material from the biological substances obtained, and the ion exchanger with the adsorbed pathogens is separated from the biological material to obtain a biological substance preparation with reduced virus content.
Překvapivě bylo zjištěno, že za přítomnosti organického rozpouštědla je redukční faktor iontoměničového kroku je ve srovnání s faktorem, popsaným ve stavu techniky, podstatně zvýšen. Tak zjistil Hamman a kol. (supra) redukční faktor pouze 1 log-stupeň při iontoměničovém kroku.Surprisingly, it has been found that in the presence of an organic solvent, the reduction factor of the ion exchange step is substantially increased compared to that described in the prior art. Thus, Hamman et al. (supra) reduction factor of only 1 log-degree in the ion exchange step.
• 9 9 · » · · · 9 9• 9 9
9 9 9 9 99 · · · · • · · · · β · · « »9 9 9 9 99 · · · · · ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · •·· 99 9 9 999 99 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9
Nebylo proto možno očekávat, že bude možno dosáhnout při jednostupňovém postupu, totiž adsorpčním způsobu bez další eluce, vysoký redukční faktor. Je rovněž překvapující, že se přítomností rozpouštědla podstatně změní adsorpční specifita iontoměniče, čímž jsou vázány patogeny, zatímco biologické substance, obzvláště proteiny, se v zásadě nevážou. Tak je pomocí způsobu podle předloženého vynálezu možné dosáhnout například pro HAV redukční faktor > 5,95 log-stupňů , což odpovídá úplnému odstranění, zatímco na rozdíl od toho dosahuje Hamman a kol. redukčního faktoru pouze 1 log-stupeň pro HAV pomoci iontoměničového kroku.It was therefore not to be expected that a high reduction factor could be achieved in a one-step process, namely an adsorption process without further elution. It is also surprising that the presence of a solvent substantially alters the adsorption specificity of the ion exchanger, thereby binding pathogens, while biological substances, especially proteins, do not bind substantially. Thus, for example, a reduction factor of> 5.95 log-degrees can be achieved with the method of the present invention, which corresponds to complete elimination, whereas Hamman et al. a reduction factor of only 1 log-degree for HAV by means of an ion exchange step.
Je sice známé, že zpracování pro snížení obsahu se 12% ethylalkoholem může vést k redukci virů, je ale nanejvýše překvapivé, že je organické rozpouštědlo vhodné také k tomu, že se současně se zpracováním iontoměničem použije pro snížení obsahu virů.While it is known that a 12% ethanol reduction treatment can lead to virus reduction, it is most surprising that an organic solvent is also suitable for being used to reduce the virus content at the same time as the ion exchange treatment.
V rámci předloženého vynálezu se ukázalo, že se může dosáhnout zvláštních hodnot snížení obsahu pomocí aniontoměničové chromatografie, popřípadě adsorpce na aniontoměniči, výhodně ve spojení s materiály na basi uhlohydrátů nebo R syntetických polymerů, jako je například DEAE-Sephacel , DEAE-SephadexR, DEAE-Sepharose CL6BR, DEAE-Sepharose Fast F1owR, QAE-SephadexR, Q-Sepharose Fast FlowR, Q-Sepharose High PerformanceR, Q-Sepharose Big BeadsR (vše firma Pharmacia);Within the scope of the present invention, it has been shown that particular values of content reduction can be achieved by anion exchange chromatography or anion exchange adsorption, preferably in conjunction with carbohydrate-based or R-based synthetic polymers such as DEAE-Sephacel, DEAE-Sephadex R , DEAE -Sepharose CL6B R , DEAE-Sepharose Fast F1ow R , QAE-Sephadex R , Q-Sepharose Fast Flow R , Q-Sepharose High Performance R , Q-Sepharose Big Beads R (all from Pharmacia);
DEAE-Tris-AcrylR, DEAE-SpherodexR, Q-Hyper-DR (vše firma Sepracor);DEAE-Tris-Acryl R , DEAE-Spherodex R , Q-Hyper-D R (all by Sepracor);
Macroprep DEAER, Macroprep QR (vše firma BioRad);Macroprep DEAE R , Macroprep Q R (all BioRad);
DEAE-ToyopearlR, QAE-ToyopaerlR, Toyopearl Super-QR (vše firma Tosohaas);DEAE-Toyopearl R , QAE-Toyopaerl R , Toyopearl Super-Q R (all by Tosohaas);
Protein PAK DEAER (Vaters);PAK DEAE R Protein (Vaters);
Fractogel EMD-TMAER, Fractogel EMD-DEAER, Fractogel EMDDMAER, Licrospher 1000 TMAER, Licrospher 1000 DEAER a Licrospher 4000 DMAER (vše firma MERCK).Fractogel EMD TMAE-R Fractogel EMD DEAE-R Fractogel EMDDMAE R, Licrospher 1000 TMAE R, Licrospher 1000 DEAE R and Licrospher 4000 DMAE R (all from Merck).
Obzvláště výhodný je, především při zpracování imunoglobulinu, aniontoměnič typu DEAE, obzvláště typu DEAE-Sephadexu.Especially preferred is an anion exchanger of the DEAE type, especially of the DEAE-Sephadex type, especially in the processing of immunoglobulin.
Patogeny, adsorbované na iontoměnič, se potom odstraní oddělením komplexu iontoměnič/patogen z biologického materiálu. Tím se adsorbát bezprostředně a bez zpracování elučním pufrem z biologického materiálu jednoduchým způsobem oddělí. Komplex se oddělí výhodně penetrací biologického materiálu přes prostupný filtr, obzvláště hloubkový filtr. Oddělení komplexu se může též provést sedimentací, obzvláště odstředěním. Výhodně se provádí oddělování iontoměniče rovněž za přítomnosti rozpouštědla.Pathogens adsorbed to the ion exchanger are then removed by separating the ion exchanger / pathogen complex from the biological material. As a result, the adsorbate is readily separated from the biological material immediately and without treatment with elution buffer. The complex is preferably separated by penetration of the biological material through a permeable filter, in particular a depth filter. Separation of the complex can also be effected by sedimentation, in particular by centrifugation. Preferably the separation of the ion exchanger is also carried out in the presence of a solvent.
Biologickými substancemi se v rámci předloženého vynálezu míní substance biologického původu, které se získávají například z tělesných tekutin, jako je krev nebo plasma, nebo se mohou isolovat z kultivačních tekutin rekombinantních buněk, přičemž tyto biologické substance, které se v rámci předloženého vynálezu získávají, popřípadě jejichž kontaminace viry se má snižovat, se mohou používat obzvláště terapeuticky, profylakticky nebo diagnosticky, popřípadě jako farmaceutické preparáty. U těchto biologických substancí se může jednat například o proteiny/peptidy, uhlohydráty nebo lipidy, obzvláště o biologicky aktivní substance, jako jsou imunoglobulíny nebo krevní faktory.Biological substances in the context of the present invention are substances of biological origin which are obtained, for example, from body fluids such as blood or plasma, or can be isolated from culture fluids of recombinant cells, the biological substances which are obtained within the scope of the invention, optionally whose viral contamination is to be reduced can be used particularly therapeutically, prophylactically or diagnostically, optionally as pharmaceutical preparations. These biological substances may be, for example, proteins / peptides, carbohydrates or lipids, in particular biologically active substances, such as immunoglobulins or blood factors.
Pod biologické substance je možno ale také zahrnout i jiné třídy látek, které mohou být tvořené prokaryontickými nebo eukaryontickými buňkami.However, other classes of substances, which may consist of prokaryotic or eukaryotic cells, may also be included in the biological substance.
Získávání preparátů biologických substancí se sníženým obsahem virů ze supernatantu adsorbátu, popřípadě z filtrátu, se provádí obvykle dalším zpracováním nebo čištěním biologických substancí, popřípadě frakcí biologického materiálu, přičemž se mimo jiné provádí srážení, postupy chromatograf ického čištění, filtrace, diafiltrace a formulování .The recovery of virus-reduced biological substance preparations from the adsorbate supernatant or from the filtrate is usually carried out by further processing or purification of the biological substances or biological material fractions, including, but not limited to, precipitation, chromatographic purification, filtration, diafiltration and formulation.
Biologický materiál při tom může být v rámci předloženého vynálezu frakce plasmy, imunoglobulin obsahující frakce plasmy, výhodně Cohnova vrakce II+III , plasmový protein obsahující frakce, která obsahuje krevní faktory, jako je faktor II, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, protein C, protein S a vVF , koncentrát obsahující některý z uvedených krevních faktorů, supernatant kultury hybridoma-buněčné linie, supernatant buněčné kultury transformovaných nebo infikovaných buněk savců nebo extrakt zvířecích nebo lidských tkání. Parametry pro provádění způsobu se při tom určí vždy podle druhu a povahy biologického materiálu a podle možných přítomných kontaminujících patogenů. Optimální parametry, jako je hodnota pH, teplota, doba trvání inkubace pro provedení a druh organického rozpouštědla při způsobu podle předloženého vynálezu, jsou pro odborníky zjistitelné na základě jejich všeobecných vědomostí v závislosti na druhu patogenů, specifitě iontoměniče a povaze biologického materiálu (čistota roztoku, koncentrace proteinu v roztoku).The biological material may be within the scope of the present invention a plasma fraction, an immunoglobulin comprising a plasma fraction, preferably a Cohn's return II + III, a plasma protein comprising a fraction comprising blood factors such as factor II, factor VII, factor VIII, factor IX, factor IX X, Factor XI, Protein C, Protein S and vVF, a concentrate comprising any of said blood factors, a hybridoma cell line culture supernatant, a transformed or infected cell culture supernatant of a mammal, or an extract of animal or human tissues. The parameters for carrying out the process are determined according to the type and nature of the biological material and the possible contaminating pathogens present. Optimal parameters, such as pH, temperature, incubation duration for carrying out, and the type of organic solvent in the process of the present invention, can be determined by those skilled in the art based on their general knowledge depending on the type of pathogen, specificity of the ion exchanger and nature of the biological material. protein concentration in solution).
Způsob podle předloženého vynálezu je obzvláště vhodný k odstraňování molekulárních a/nebo virálních patogenů z biologických materiálů, přičemž se efektivně odstraňují virální patogeny jak ze skupiny lipidy zapouzdřených, tak ze skupiny ne lipidy zapouzdřených virů. K těmto se počítají obzvláště viry jako je HAV, HBV, HCV, HGV, HEV, HDV, HIV,The method of the present invention is particularly suitable for removing molecular and / or viral pathogens from biological materials, effectively removing viral pathogens from both the encapsulated and non-lipid encapsulated viruses. These include viruses such as HAV, HBV, HCV, HGV, HEV, HDV, HIV,
CMV nebo parvovirus.CMV or parvovirus.
Pod organickými rozpouštědly se rozumí v rámci předloženého vynálezu obzvláště taková rozpouštědla, která za zvolených podmínek nevyvolávají při smísení s biologickými materiály žádné podstatné denaturační procesy. K těmto patří obzvláště rozpouštědla, jako je methylalkohol, ethylalkohol nebo ostatní biologicky přijatelné alkoholy.In the context of the present invention, organic solvents are in particular those solvents which, under the selected conditions, do not induce any substantial denaturation processes when mixed with biological materials. These include in particular solvents such as methanol, ethanol or other biologically acceptable alcohols.
Optimální koncentrace odpovídajícího rozpouštědla může být, stejně jako nepatrné odchylky u optimálních podmínek chromatografie, které mohou být popřípadě způsobené přítomností rozpouštědla, lehce zjištěné každým odborníkem pomocí jednoduchého pokusu. Všeobecně se rozpouštědlo používá v koncentraci 5 až 20 % objemových, výhodně v koncentraci 10 až 15 % objemových a obzvláště v koncentraci 12 až 14 % obj emových.The optimum concentration of the corresponding solvent, as well as slight variations in the optimum chromatographic conditions, which may optionally be due to the presence of the solvent, can be readily ascertained by one skilled in the art by a simple experiment. In general, the solvent is used in a concentration of 5 to 20% by volume, preferably in a concentration of 10 to 15% by volume and in particular in a concentration of 12 to 14% by volume.
Výhodně se jako organické rozpouštědlo použije jednomocný nebo vícemocný alkohol, přičemž obzvláště výhodný je ethylalkohol. Obzvláště výhodně ke koncentrace ethylalkoholu podle předloženého vynálezu v rozmezí 12 až 14 % objemových, zvláště v rozmezí 13 až 14 % objemových.Preferably, the organic solvent is a monovalent or polyhydric alcohol, with ethyl alcohol being particularly preferred. Particularly preferably to a concentration of ethanol of the present invention in the range of 12 to 14% by volume, especially in the range of 13 to 14% by volume.
Zpracování iontoměničem se výhodně provádí při nízkých teplotách, přičemž výhodné jsou teploty pod 10 °C nebo pod 5 °C . Jak se ukázalo, je obzvláště výhodné zpracování aniontoměničem při provádění způsobu podle předloženého vynálezu při teplotě v rozmezí 0 °C až -10 °C .The ion exchange treatment is preferably carried out at low temperatures, with temperatures below 10 ° C or below 5 ° C being preferred. As has been shown, anion exchange treatment is particularly preferred in the process of the present invention at a temperature in the range of 0 ° C to -10 ° C.
• · • · ·· ·• · · · · ·
Ukázalo se také, že se způsob podle předloženého vynálezu může oproti zprávám podle stavu techniky a obzvláště oproti výsledkům Zoltona a kol. (1985) , úspěšně provádět také při hodnotách pH pod 7,5 , popřípadě 7,2 , tedy v neutrální, popřípadě kyselé oblasti.It has also been shown that the method according to the invention can be compared to the prior art reports and in particular to the results of Zolton et al. (1985), can also be carried out successfully at pH values below 7.5 or 7.2, i.e. in the neutral or acidic range.
Výhodná provozní varianta způsobu podle předloženého vynálezu spočívá v tom, že se zpracování biologického materiálu s iontoměničem, obzvláště s aniontoměničem, provádí při hodnotě pH 5,6 až 7,2 , výhodně v rozmezí 6,0 až 6,4, obzvláště při pH 6,2 .A preferred operating variant of the process according to the invention is that the treatment of the biological material with the ion exchanger, in particular an anion exchanger, is carried out at a pH of 5.6 to 7.2, preferably in the range of 6.0 to 6.4, especially at pH 6 , 2.
Zpracování vodného roztoku biologického materiálu s aniontoměničem se výhodně provádí v průběhu časového období 1 minuta až 20 hodin, obzvláště během 4 až 8 hodin, přičemž inkubace se může provádět buď batch postupem nebo v průtokovém systému.The treatment of the aqueous solution of the biological material with the anion exchanger is preferably carried out over a period of time of 1 minute to 20 hours, in particular 4 to 8 hours, whereby the incubation can be carried out either in batch process or in a flow system.
Způsobem podle předloženého vynálezu se může získat biologický materiál, který je bezpečně prostý molekulárních a/nebo virálních patogenů, přičemž patogeny jsou v podstatě úplně odstraněny. Tak bylo zjištěno, v závislosti na přidané koncentraci ethylalkoholu, v podstatě úplné odstranění virů. Jednostupňovým způsobem podle předloženého vynálezu se dosáhne redukčního faktoru patogenů výhodně >5,5 logstupně, obzvláště výhodně >7,0 log-stupně.By the method of the present invention, a biological material can be obtained that is safely free of molecular and / or viral pathogens, wherein the pathogens are substantially completely eliminated. Thus, substantially complete virus removal was found, depending on the added ethanol concentration. In a one-step process according to the present invention, the pathogen reduction factor is preferably> 5.5 log steps, particularly preferably> 7.0 log steps.
Optimální adsorpční podmínky při iontoměničové chromatografií mohou odborníci vždy podle získávané biologické substance, popřípadě podle adsorbovaného viru, v závislosti na odpovídajícím organickém rozpouštědle, lehce optimalisovat s využitím podkladů podle předloženého vynálezu.Optimum adsorption conditions in ion exchange chromatography can be readily optimized by the skilled person according to the biological substance to be obtained or the adsorbed virus, depending on the corresponding organic solvent, using the substrates of the present invention.
Předložený způsob je vhodný také ve značné míře pro kombinování s dalšími patogeny inaktivujícími nebo patogeny snižujícími kroky, jako je zpracování teplem a/nebo detergenty, zpracování zářením nebo filtrací, přičemž nanofiltrace podle AT A 780/96 se může obzvláště výhodně kombinovat se způsobem podle předloženého vynálezu.The present method is also suitable to a large extent for combining with other pathogens inactivating or pathogens reducing steps such as heat treatment and / or detergents, radiation treatment or filtration, whereby nanofiltration according to AT A 780/96 can be particularly advantageously combined with the process according to the present invention. invention.
Způsob podle předloženého vynálezu je obzvláště vhodný pro výrobu imunoglobulinových preparátů, může se ale také specificky použít pro získávání farmaceutických preparátů a krevních faktorů, jako je faktor II, faktor Ila, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein S, protein C nebo vVF .The method of the present invention is particularly suitable for the production of immunoglobulin preparations, but can also be used specifically to obtain pharmaceutical preparations and blood factors such as factor II, factor IIIa, factor VII, factor IX, factor X, protein S, protein C or vVF .
Vynález je blíže objasněn pomocí následujících příkladů provedení, bez toho, že by měl být na tyto příklady omezen.The invention is illustrated by the following examples, without being limited thereto.
Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Příklad 1Example 1
Snížení obsahu virů z roztoků, obsahujících IgG (v současné době podle názoru přihlašovatele nej lepší cesta pro provedení vynálezu)Reduction of virus content from IgG containing solutions (currently, in the applicant's opinion, the best way to carry out the invention)
Cohnova frakce II+III , obsahující imunoglobulin, se zpracuje s ethylalkoholem až na konečnou koncentraci 10 % objemových až 14 % objemových a roztok se ochladí na teplotu v rozmezí -3 °C až -1 °C , načež se tento roztok smísí s testovanými viry, uvedenými v tabulce 1 . Na jeden gram proteinu se přidá 0,5 g DEAE-Sephadexu A-50 , hodnota pH se • ·♦ 99 · 99 99 · 9 · · 99 · ♦ · · • · · ·· · · · · ·The Cohn II + III fraction containing immunoglobulin is treated with ethanol to a final concentration of 10% v / v to 14% v / v and the solution is cooled to a temperature between -3 ° C to -1 ° C, then mixed with the test viruses listed in Table 1. 0.5 g DEAE-Sephadex A-50 is added per gram of protein, and the pH is 99.99 99.99.99.99.99.99.99.99.99.99.99.99.99.99.
9 99* 9 9 «9 ·9 9 • •9 · 9 9 · 9 9 9 •99 99 99 «99 99 99 nastaví na 6,2 ± 0,1 a za míchání se inkubuje při udržování uvedené teploty a hodnoty pH po dobu 6 hodin. Suspense iontoměniče se potom hloubkovou filtrací odstraní a určí se titr viru ve filtrátu. Hodnoty snížení obsahu viru, vyjádřené jako úbytek infekčních virových částic v mocninách čísla deset, jsou shrnuté v tabulce 1 a byly stanovené pomocí titrace viru nebo PCR . Jak je z této tabulky patrné, vede tento způsob - v závislosti na použitém testovaném viru - ke snížení obsahu o 2 až přes 6 mocnin čísla deset. Výtěžek IgG v supernatantu činí > 70 % .9 99 * 9 9 «9 · 9 9 • 9 · 9 9 · 9 9 9 • 99 99 99« 99 99 99 is set to 6.2 ± 0.1 and incubated with stirring while maintaining the indicated temperature and pH for for 6 hours. The ion exchanger suspension is then removed by depth filtration and the virus titer in the filtrate is determined. The virus reduction values, expressed as the loss of infectious virus particles in the powers of number ten, are summarized in Table 1 and were determined by virus titration or PCR. As can be seen from this table, this method - depending on the test virus used - leads to a reduction of 2 to over 6 powers of number ten. The IgG yield in the supernatant is> 70%.
V kontrolních pokusech, ve kterých se prováděla inkubace testovaných virů analogickým způsobem bez přídavku aniontoměniče, nebyl zjištěn žádný virocidní efekt ethylalkoholu za daných podmínek.In control experiments in which the test viruses were incubated in an analogous manner without the addition of an anion exchanger, no virocidal effect of ethanol was found under the conditions.
• ·· ·* ·· · · · « • · · · « • · ♦ · * 4 • · · · « ··· ·· ··· 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
9999
9 ·99 · 9
TabulkaTable
• ·· ·· · ·· ·· • · · · · · · · · ·· · • · · ·· · ···· • · · ·· · · · · · ··· ·· ·· ··· «· ··· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · ·· «· ··
Vysvětlení použitých zkratek :Explanation of abbreviations used:
PRV Pseudorabies virusPRV Pseudorabies virus
MVM Minuté Virus of Mice/ParvovirusMVM Minute Virus of Mice / Parvovirus
FSME virus ranné letní meningoencefalitidyFSME virus of early summer meningoencephalitis
BVDV boviní diarrhea virusBVDV bovine diarrhea virus
HCV hepatitis C virusHCV hepatitis C virus
HAV hepatitis A virusHAV hepatitis A virus
HGV hepatitis G virusHGV hepatitis G virus
HIV-1 virus 1 humání imunodeficienceHIV-1 virus 1 human immunodeficiency
ERV equine rhinopneumonitis virusERV equine rhinopneumonitis virus
n.d. neprováděnon.d. not performed
PříkladExample
Snížení obsahu parvoviru z roztoků, obsahujících IgGReduction of parvovirus content from IgG containing solutions
Cohnova frakce III , obsahující imunoglobulin, s obsahem 12 % ethylalkoholu , se smísí s parvovirem B19 analogicky jako je popsáno v příkladě 1 . Celkové zatížení veCohn's fraction III containing immunoglobulin containing 12% ethyl alcohol was mixed with parvovirus B19 analogously to Example 1. Total load in
113 výchozím materiálu, smíšeném s B19 , činí 10 ’ DNA-kopií/ml. Adsorpční krok s DEAE-Sephadexem s následující filtrací se provádí stejně jako je popsáno v příkladě 1 . Pomocí PCR , jak je popsáno v AT A 780/96 , se stanoví DNA-kopie ve filtrátu. Ve filtrátu nemohly být dokázány žádné parvovirus-specifické DNA . Za zohlednění hranice důkazu byl pomocí způsobu podle předloženého vynálezu dosažen virus-redukční faktor >7,4 log-stupně .The 113 starting material mixed with B19 is 10 ' DNA copies / ml. The adsorption step with DEAE-Sephadex followed by filtration is carried out as described in Example 1. DNA copies in the filtrate are determined by PCR as described in AT A 780/96. No parvovirus-specific DNA could be detected in the filtrate. Taking into account the limit of evidence, a virus reduction factor of> 7.4 log-degrees was achieved by the method of the present invention.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19994515A CZ451599A3 (en) | 1998-06-10 | 1998-06-10 | Method of reducing content of viral and molecular pathogens in biological materials |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19994515A CZ451599A3 (en) | 1998-06-10 | 1998-06-10 | Method of reducing content of viral and molecular pathogens in biological materials |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ451599A3 true CZ451599A3 (en) | 2000-04-12 |
Family
ID=5468156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19994515A CZ451599A3 (en) | 1998-06-10 | 1998-06-10 | Method of reducing content of viral and molecular pathogens in biological materials |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ451599A3 (en) |
-
1998
- 1998-06-10 CZ CZ19994515A patent/CZ451599A3/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2337109C2 (en) | PREPARATION OF ANTIBODY IgG AND METHOD OF ITS PRODUCTION | |
| Korneyeva et al. | Enveloped virus inactivation by caprylate: a robust alternative to solvent-detergent treatment in plasma derived intermediates | |
| US7879331B2 (en) | Ultra-high yield intravenous immune globulin preparation | |
| DE3733181C1 (en) | Process for the production of a high-purity, virus-safe, biologically active transferrin preparation | |
| US6465170B2 (en) | Method for depleting viral and molecular pathogens in a biological material | |
| EP1593688B1 (en) | Method for partition and inactivation of viral and prion contaminants | |
| JP2506370B2 (en) | Inactivation of vegetative filterable pathogens | |
| RU2411959C2 (en) | Method of obtaining safe in virus respect biological flowing media | |
| CZ451699A3 (en) | Method of reducing content of viral and molecular pathogens from biological material | |
| US8293242B2 (en) | Ultra-high yield of alpha-1-anti-trypsin | |
| JP3143507B2 (en) | Method for preparing pasteurized iron-free human transferrin and its use | |
| Roberts et al. | Virus reduction in an intravenous immunoglobulin by solvent/detergent treatment, ion-exchange chromatography and terminal low pH incubation | |
| CZ451599A3 (en) | Method of reducing content of viral and molecular pathogens in biological materials | |
| EP0771567B1 (en) | A method of inactivating viruses in proteins | |
| EP0523406A1 (en) | Use of tri(n-butyl) phosphate at low pH in solutions of biologically active proteins for enhanced virucidal activity | |
| JP2012503596A (en) | Methods for removing / inactivating viruses in glycoproteins | |
| EP0234405A2 (en) | Use of an immunoglobulin-containing composition in the prophylaxis and therapy of AIDS of human | |
| JP3735137B2 (en) | Use of azoles as virucidal agents in solutions of biologically active proteins | |
| AU726999B2 (en) | Process for reducing the concentration of viral and molecular pathogens in a biological material | |
| Hosseini et al. | Pasteurization of IgM-enriched immunoglobulin | |
| AT405608B (en) | METHOD FOR INACTIVATING PATHOGENS, ESPECIALLY VIRUSES, IN A BIOLOGICAL MATERIAL | |
| MXPA99011516A (en) | Process for reducing the concentration of viral and molecular pathogens in a biological material | |
| US6881573B2 (en) | Augmented solvent/detergent method for inactivating enveloped and non-enveloped viruses | |
| US5159064A (en) | Preparation of virus-free antibodies | |
| US20020018777A1 (en) | Sterilization of virus infected plasma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |