CZ416197A3

CZ416197A3 - Vícevrstevný reagenční testovací proužek

Info

Publication number: CZ416197A3
Application number: CZ974161A
Authority: CZ
Inventors: Joel Douglas; Ernest Kiser; Michael F. Tomasco; Remedios Dato; Edward G. Rice; Deborah P. Tuohy; Mark Maxson; Zbigniew Witko; Scott Segelke
Original assignee: Lifescan, Inc.
Priority date: 1996-12-31
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 1998-09-16
Also published as: PL323889A1; PL189236B1; CN1135388C; RU2198406C2; AU4530797A; MX9709995A; BR9705636A; IS2046B; NO976137D0; DE69728637D1; SG74031A1; CA2226069A1; DK0852336T3; TR199701726A2; KR100496218B1; PT852336E; HK1009180A1; IL122601A0; NO976137L; CZ296121B6

Description

(57) Anotace:

Vícevrstevný regenční testovací proužek pro měření koncentrace analytu v kapalném vzorku, který se na tento proužek aplikuje. Vzorek se rozvede do určitého počtu oblastí, uspořádaných podél proužku, ve kterých analyt reaguje s reakčním činidlem a způsobí tak barevnou změnu. Každá testovací oblast rovněž obsahuje inhibitor reakce, způsobující barevnou změnu. Koncentrace inhibitoru v po sobě Jdoucích testovacích oblastech postupně roste, takže počet oblastí, které změní barvu je mírou koncentrace analytu. Testovací proužek Je zvláště přizpůsoben pro měření glukózy ve vzorku kompletní krve. U výhodného provedení se vzorek vede do testovacích oblastí po dráze, tvořené slisovanými oblastmi matrice, a testovacími oblastmi jsou nelisované oblasti matrice.

i l

Vícevrstevný reagenční testovací'proužek *

Oblast techniky

- ¹ ^L Vynález^se ťyk‘á suclTého indikačního testovacího proužku pro měření koncentrace analytu v biologické tekutině, zejména testovacího proužku, který měří koncentraci analytu přímo, bez potřeby měřícího přístroje.

Dosavadní stav techniky

Pro měření koncentraceurčitých analytu v biologických tekutinách byla vyvinuta celá řada vizuálních testovacích zařízení. Taková zařízení byla například navržena pro měření hladiny glukózy, cholesterolu, proteinů, ketonů, fenylalaninu nebo enzymů v krvi, moči nebo'· slinách.

Suché reagenční proužky, ve kterých jsou zabudovány kompozice na bázi enzymů, se používají ve velkém rozsahu v klinických laboratořích, lékařských ordinacích, nemocnicích a domácnostech pro stanovení koncentrace glukózy ve vzorcích biologických tekutin. Ve skutečnosti se reagenční proužky staly každodenní nezbytností pro několik miliónů diabetiků. Diabetes způsobuje nebezpečné anomálie v krevní chemii, může přispívat- ke ztrátě zraku, poškození ledvin a může způsobit další vážné zdravotní následky. S cílem minimalizovat tato rizika, musí být většina diabetiků periodicky testována a následně je nutné upravovat koncentraci glukózy v krvi, například pomocí dietní stravy a/nebo pomocí inzulínových injekcí. Někteří pacienti musí

...sledovat i .čtyřikrát denně, . nebo· dokonce*^ častěji/-, koncentraci , glukózy ve své krvi. - - - Pro diabetiky, kteří musí sledovat svou stravu a regulovat přísun cukru a/nebo pro uživatele inzulínových injekci a. pro ty, kteří jsou nuceni se často podrobovat “ ' testům, zaměřeným na zjištěni koncentrace glukózy v krvi, | jsou zvláště důležité reagenčni proužky, které umožní í rychlé, levné a přesné stanoveni koncentrace glukózy.

Je známo, že reagenčni proužky obsahuji indikátor, který mění v závislosti na koncentraci glukózy v biologické tekutině, která se aplikuje na proužek, barevný odstín. Ačkoliv některé z těchto proužků používají redukční chemii, většina z nich zahrnuje oxidovat.elné barvivo nebo dvojici barviv. Některé proužky -zahrnuji enzym, například glukózooxidázu, která je schopna oxidovat glukózu na kyselinu glukonovou a peroxid vodíku. Rovněž obsahují oxidovatelné barvivo a látku, která má peroxidačni účinnost, a která je schopna selektivně katalyzovat oxidaci oxidovatelného barviva v přítomnosti peroxidu vodíku. (Viz například patent US 5,306,623 udělený 26. dubna 1994, Kiserovi a kol.) .

i í Patent US 3,964,871, udělený 22. června 1976 ’ (Hochstrasserovi), popisuje jednorázově použitelný indikační proužek pro přímé měření látek, například glukózy, v biologických tekutinách. Indikátor, který registruje koncentraci látky, zahrnuje jak indikační reakční činidlo, které se zoxiduje a změní barvu, pokud zreaguje s měřenou látkou, a „antagonizujicí činidlo, které určitým způsobem, zabraňuje akumulaci zoxidovaného indikátoru dokud nebude zcela·spotřebován.

.. <_r. Palmer. a ,, kol. popisuji „digitální?! •'.kvantitativní testovací, systém... pro stanoveni glukózy 'a-dalších analytů v evropské patentové .přihlášce 0 317 070, publikované 24.· května 1989 (viz rovněž patent US 5,036,000, udělený 30. července 1991). Tento systém měří koncentraci organické sloučeniny v biologické tekutině nejprve oxidací sloučeniny oxidázovým enzymem, specifickým pro substrát, za vzniku peroxidu vodíku. Systém zahrnuje chromogen, což je redukční činidlo peroxidu vodíku a redukční činidlo peroxidu- vodíku stabilní na vzduchu, které má vyšší redukční potenciál, vyšší redukční potenciál pozdrží detekovatelnou barevnou změnu chromogenu až do okamžiku, kdy se spotřebuje první redukční činidlo peroxidu vodíku, které je stabilní na vzduchu. Takže pokud peroxid vodíku, který má být měřen, neklesne pod předem stanovenou hladinu, která odpovídá koncentraci redukčního činidla peroxidu, stabilního na vzduchu, nedojde k barevné změně. Výsledkem tohoto systému je to, že měří koncentraci kvantitativně, nezávisle na intenzitě barevné změny.

Englemannův patent US 4,738,823, udělený 19. dubna 1988, popisuje testovací proužek pro stanovení analytu, který má nosný člen s absorpčním materiálem pro odstranění přebytečného množství vzorku, aplikovaného na proužek. Tento proužek může rovněž obsahovat krycí vrstvu s otvory, skrze které lze zavést vzorek.

Burkhardt a kol. popisují v patentu US 4,810,470, uděleném 7. března 1989, zařízení pro měřeni koncentrací analytů v kapalných vzorcích. Toto zařízení zahrnuje jednu nebo několik savých matric, pokrytých povlakem nebo fólií nepropustných pro kapalinu. Vzorek je uložen na části savé matrice a měřen na matrici chromatograficky. Vzlínáním se . λ- ^vzorekdopraví do , testované ^-oblastikterá'·* · obsahuje

- reagenční činidlo pro daný analyt. . ’ - - '·

Daffern a kol. popisují v patentu US 4,9.94,238, uděleném 19. února 1991, chemické analytické testovací zařízení, které obsahuje absorpční vrstvu, vodě odolnou bariérovou vrstvu a reagenční vrstvu, která má omezený objem. Vzorek se aplikuje na reagenční vrstvu skrze řadu < otvorů, provedených v překrývající se absorpční nebo bariérové vrstvě.

Pokud se test provádí doma, v lékařské ordinaci, na klinice nebo v nemocnici, je maximálně důležité, aby poskytoval přesná a reprodukovatelná stanovení glukózy. V případě barevně indukujícího reagenčního proužku je žádoucí, aby byla barevná změna zřetelná a necitlivá ke změnám, které se týkají ostatních složek biologické tekutiny.. V případě vizuálně odečitatelného reagenčního proužku, bude zvláště důležité, aby diabetici, kteří mohou mít poškozený zrak, měli proužek, který bude vykazovat podstatnou změnu barvy v závislosti na koncentraci glukózy, i když barevná změna, která je dána změnou absorbance při dané vlnové délce, je rovněž důležitá pro přesnost proužků odečítaných měřícím zařízením.

' Protože barevná změna zahrnuje řadu chemických reakcí, nemusí nastat okamžitě. Uživatel tedy musí určitou dobu, zpravidla minutu nebo kratší dobu, čekat, dokud reakce neproběhnou. Pokud je proužek odečítán pomocí měřícího zařízení, může časový obvod poskytnout signál, který oznámí ukončení reakcí. Nicméně pokud je proužek odečítán vizuálně, bez měřícího přístroje, potom může uživatel odečíst testovací proužek ještě před uplynutím doby, která je potřebná na to, aby proběhly všechny reakce způsobující

I • · « v barevnou .- změnu,-.a získat ₇..tak -nesprávný výsledek; Alternativně.· může. mít uživatel pocit, že aby - zajistil dostatek času pro ukončení všech potřebných reakcí, musí čekat příliš dlouho a může mít pocit, že ho toto čekání zdržuje. Z výše uvedené diskuze vyplývá, žé je třeba opatřit proužek „chemickým časovačem, t j. prvkem na proužku, který bude měnit barvu bez ohledu na koncentraci glukózy (nebo dalšího sledovaného analytu) ve vzorku, ale bude měnit barvu po uplynutí doby dostatečné pro ukončení reakcí, vedoucích ke změně barvy ve vzorku.

Podstata vynálezu

Jak již bylo uvedeno, vynález se týká podlouhlého vicevrstevného reagenčního testovacího proužku' pro měření koncentrace analytu ve vzorku biologické tekutiny, která se aplikuje na proužek, přičemž tento proužek zahrnuje

a) spodní vrstvu s průchozím otvorem pro příjem vzorku;

b) vrstvu membrány mající stranu, která přijde do‘ kontaktu se vzorkem, orientovanou ke spodní vrstvě, a testovanou stranu, protilehle orientovanou k první straně, a podél celé své délky množinu diskrétních savých testovacích oblastí, vzájemně oddělených nesavou oblastí, přičemž tato vrstva membrány obsahuje reakční. činidlo, které může reagovat s analytem a vyvolat tak barevnou změnu a které obsahuje:

i) první složku, která vzájemně reaguje s analytem za vzniku peroxidu vodíku;

·· « »« «

... >. ii) .druhou . slo.-žk-u, která vzájemně reaguje· s peroxidem- vodíku- a podléhá'barevné změně; · a iii) třetí složku, která inhibuje barevnou změnu druhé složky;

c) mezilehlou vrstvu, uspořádanou mezi spodní vrstvu'a membránovou vrstvu; a

d) distribuční prostředek pro distribuci vzorku podél proužku, přičemž- tento distribuční prostředek zahrnuje kanálek pro dopravu tekutiny, vytvořený v mezilehlé vrstvě, a pro vedení vzorku po povrchu matrice k savým testovacím oblastem;

přičemž koncentrace inhibitoru roste předem stanoveným způsobem s rostoucí vzdáleností od prvního konce proužku, takže pokud má vzorek způsobit barevnou změnu, musí obsahovat odpovídajícím způsobem zvýšenou koncentraci analytu, přičemž jakmile se vzorek aplikuje na testovací proužek, může dojít k barevné změně jedné nebo několik testovacích oblastí, přičemž oblast, ve které dojde ke změně barvy a která je nejvzdálenější od prvního konce, označuje koncentraci analytu ve vzorku.

Způsob měření koncentrace analytu ve vzorku biologické tekutiny zahrnuje:

(a) aplikaci vzorku na reagenční testovací proužek, který zahrnuje:

(i) spodní vrstvu s průchozím otvorem pro příjem vzorku, (ii) vrstvu membrány, mající stranu, která přijde do kontaktu se vzorkem, . orientovanou ke • « · 9 • · · · · ·*·«» * ··· · · ··· · * «· • · · · · · · ··*· * * · · · fr·«*

J ···· ··· 4* ··t« w- -w ...spodní _s vrstvě, a_j:· -kteráž·--obsahuj-e> množinu ,»· .> .· ·. savých testovacích oblastí, 'které: změní svou barvu, jakmile se dostanou do styku s tekutinou, obsahující alespoň předem stanovené _: množství analytu, které je větší než množství analytu způsobující barevnou změnu · testovaných oblastí, uspořádaných blíže k prvnímu konci proužku, a (iii) distribuční prostředek pro distribuci vzorku z průchozího otvoru po předem určené nesavé dráze do všech testovaných oblastí; a (b) určení koncentrace analytu stanovením testovanéoblasti, která změní barvu, a která se nachází nejdále od prvního konce proužku.

Tento typ proužku poskytuje viditelnou indikaci koncentrace analytu, který je obsažen v biologické tekutině aplikované na „vzorkovou stranu proužku. Viditelná indikace se objeví na opačné (nebo-li „testovací) straně proužku.

Chemické složení testovacího proužku samozřejmě závisí na kombinaci analytu a biologické tekutiny, která má být měřena. Lze navrhnout testovací proužky pro detekování analytu, jakými jsou například glukóza nebo další cukry, alkohol, cholesterol, proteiny, ketony, kyselina močová, fenylalanin nebo enzymy v biologických tekutinách, jakými jsou například krev, moč a sliny, a rovněž ve vodě. Z důvodu zjednodušení pochopení vynálezu budou v části, věnované podrobnému popisu vynálezu, popsány reagenční proužky, určené pro detekování glukózy v krvi. Odborníci v daném oboru mohou snadno přizpůsobit informace, získané v

9 w-tomtQ popisu-,, «u detekci dalších^ kombinací -ana-1'yt.ů * a> biologických tekutin. · - .

Testovací proužek podle vynálezu umožní relativně jednoduché a rychlé stanovení koncentrace glukózy v neodměřeném vzorku krve. Tento proužek obsahuje spodní vrstvu s průchozími otvory, kterými lze vzorek přivést k „vzorkové straně porézní matrice', jejíž protilehlou stranou je testovací strana. Matrici zpravidla tvoří membrána a v’ případě popisu vynálezu a v přiložených patentových nárocích jsou tyto dva výrazy použity zaměnitelně. Testovací reakční činidlo se aplikuje na .matrici a větší, či menší měrou se impregnuje do pórů matrice. Pro zjednodušení bude v následujícím popisu a v přiložených patentových nárocích v některých případech reakční činidlo na matrici označeno jako „povlak.

Mezilehlá vrstva leží mezi spodní vrstvou a membránou. U jednoho provedení jsou v mezilehlé vrstvě provedeny výřezy, které, jsou zarovnané s ňesavými oblastmi membrány a jejichž úkolem je vést vzorek do řady Savých testovacích oblastí, které jsou uspořádány podél proužku. (Výrazem „savý, jak . je použit v tomto popisu a přiložených patentových nárocích, se rozumí středně absorbující). Řada výřezů, provedená v mezilehlé vrstvě tak, že obklopuje prostor okolo a nad testovacími plochami, směruje proud vzorku do těchto oblastí. U dalšího provedení v podstatě kolmá štěrbina, provedená v mezilehlé vrstvě, vede vzorek do- řady savých ploch, které jsou od sebe' odděleny nesavou oblastí.

Fixovaný objem vzorku, zpravidla krve, která obsahuje jak červené krvinky tak glukózu je tedy směrován na vzorkovou stranu membrány do řady testovacích oblastí.

• · ··«· ·

• ·♦·

F- ·>γ •r*’··*. Poréznost... matrice umožňuje tekutině,* například v-důsledku .· ' , kapilární., elevace, -procházet - z' vzorkové strany -matricesměrem k.testovací straně. Takže testovací reakční činidlo může reagovat s glukózou v krvi-a způsobovat barevnou změnu na testovací straně nebo v její blízkosti. Protože sytě zbarvené, červené krvinky mohou ztížit detekci barevné změny, je matrice výhodně anisotropní, přičemž velikost pórů se směrem od vzorkové strany k testovací straně postupně zmenšuje a matrice tak zachytí červené krvinky ještě před tím, než dosáhnou testovací strany. Pro jednotlivé složky testovacího proužku a časovače podle vynálezu lze použít celou řadu materiálů. Některé z nich jsou popsány v patentech US 5,306,623 a 5,418,142, udělených 2.6. dubna 1994, resp. 23. května 1995 Kiserovi a kol. .

Testovací reakční činidlo obsahuje složku pro převedení glukózy na peroxid vodíku, například glukózooxidázu; jednu nebo několik složek pro detekování peroxidu vodíku, vznikajícího v důsledku zmíněné konverze glukózy ve vzorku; a inhibitor. Složkami pro detekování peroxidu vodíku mohou být peroxidáza, výhodně peroxidáza z křenu polního, společně s „indikátorem, který v průběhů reakce změní barvu. Indikátorem může být oxidovatelné ’ barvivo nebo dvojice barviv. Peroxidáza katalyzuje oxidaci indikátoru v přítomnosti peroxidu vodíků. Konečným prvkem •reakčního činidla je inhibitor, který zpomaluje oxidaci indikátoru, způsobující změnu barvy tohoto indikátoru.

Proužek je podél své délky segmentován tak, že sousední membránové segmenty mají rozdílné koncentrace inhibitoru. Každý prvek má savou testovací plochu, která mění barvu pouze pokud je přítomno dostatečné množství glukózy, nejprve pro spotřebování veškerého inhibitoru a • 9 9 9··

9

9 9 9 • «9 • «999 · 99 • · 9 9 • · 99

9 « • ·9 ··99 následně. pro zoxidováni ^indikátoru, -které < vyvolá'·'..-i., charakteristickou, barevnou změnu.'Barevná změna' v-příslušné oblasti tedy- naznačuje určitou mezní koncentraci glukózy v původním krevním vzorku. Každý následující ' segment na proužku, uvažováno v jednom směru, má krokově zvýšenou koncentraci inhibitoru, která odpovídá krokovému zvýšení prahové koncentrace glukózy. Indikátor koncentrace je pro všechny segmenty stejný. Další změny rovnováhy mezi inhibitorem a indikátorem jsou v podstatě rovněž možné.

membrány leží ve vhodném rozmezí pro příslušný testovací proužek, potom vzájemně sousedící testovací oblasti reagují s analytem tak, že se jedna oblast zbarví a sousední oblast zůstane beze změny. Výsledek naznačuje, že koncentrace glukózy ve vzorku dosahuje alespoň prahové koncentrace potřebné pro změnu barvy jedné oblasti, ale již nedosahuje koncentrace, potřebné pro změnu barvy v sousední oblasti.

Pro monitorování krevní glukózy případný časovači povlak obsahuje kromě prvků indikačního proužku, t j . porézní matrice, na které je naneseno testované reagenční činidlo, také glukózu. V suchém stavu není chemie reakčního činidla glukózou aktivována, ale pokud se na proužek aplikuje vzorek, dojde k hydrataci časovacího povlaku a glukózy v tomto povlaku, která po předem určené době způsobí barevnou změnu indikátoru. Glukóza je v časovači výhodně přítomna .v přebytku oproti množství, které je potřebné pro vyvolání barevné změny inhibitoru. V tomto případě se požadovaná doba prodlouží nebo zkrátí v závislosti na tom, zda je přítomno vyšší či nižší množství inhibitoru. Barevné změny na indikačním proužku a na ·· ···· ·· ···· ·. · * · · · časovači lze pozorovat buď přímým pohledem nebo přes optický přístroj, který detekuje změny činitele odrazu.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje perspektivní pohled na matrici přímo odečitatelného řeagenčního testovacího proužku podle vynálezu;

obr. 2 znázorňuje spodní rovinný pohled na vzorkovou stranu přímo odečitatelného řeagenčního testovacího proužku podle vynálezu v řezu;

obr. 3 znázorňuje zvětšený perspektivní pohled, částečně v řezu, na vnitřní uspořádání části testovacího proužku, znázorněného na obrázku 2;

obr. 4 znázorňuje řez proužkem, znázorněným na obrázku 2, vedený rovinou 4-4;

obr. 5 znázorňuje spodní rovinný pohled na testovací proužek, znázorněný na obr. 2;

obr. 6 znázorňuje půdorysný pohled na testovací stranu testovacího proužku, znázorněného na obr. 5;

obr. 7 znázorňuje proužek, znázorněný na obr. 6 po aplikaci vzorku;

obr. 8 znázorňuje perspektivní pohled, částečně v řezu, na další provedení testovacího proužku z obr. 2;

obr. 9 znázorňuje spodní rovinný pohled na testovací proužek z obr. 8;

i

4 4	····	• 0
4 0	•	0 4
•	004	0 4
•	• ·	0 0
4	0	0 4
		0 4

··* 00 ·· * *000 ·♦· · a ·* • · *·· a · « · · *·· 44

... obr.., 10.»-znázorňuje· půdorysný pohleď -na-s? testovací proužek.z obr. 8; a . obr. 11 znázorňuje řez proužkem z obr. 10, vedený rovinou 11-11.

Předmětem vynálezu ' je přímo odečitatelný reagenční testovací proužek pro měření koncentrace analytu v biologické tekutině. Klíčovým prvkem tohoto testovacího proužku je porézní matrice, ve které je zabudované, testovací reakční činidlo, podléhající barevné změně' v odezvě na aplikaci vzorku biologické tekutiny, obsahující analyt na tento proužek. Matrice může mít jednotné složení nebo může být potažena substrátem a může být isotropní nebo anisotropní. Matrice má vzorkovou stranu, na kterou se aplikuje vzorek a testovací stranu, ze které se odečítá barevná změna. Matrice je výhodně' tvořena anisotropní membránou, výhodněji anisotropní membránou, mající široké rozmezí velikostí pórů. Velikost pórů se může například zvětšovat při průchodu membránou, přibližně z 0,1 μτη. do 150 μιη. Na straně velkých pórů se velikost pórů pohybuje v rozmezí přibližně od 30 μπι do 40 μιη. Na straně membrány, kde jsou póry nejmenší, je relativně málo volného prostoru a materiál membrány je zpravidla poměrně hustý uvnitř vrstvy, která může zpravidla tvořit až 20 % tloušťky membrány. Uvnitř této vrstvy se velikost pórůvýhodně pohybuje v rozmezí přibližně od 0,1 do 0,8 μη, přičemž nominální velikost pórů představuje výhodně 0,3 μπι. Pokud se na vzorkovou stranu aplikuje biologická tekutina, vzorek postupně, při pronikáni membránou, dosahuje postupně se

• to	toto#·	··	··*·	• to	toto
9 to	<	•	to	«	• to	to- ·
•	• ··	•	•	toto·	• ·	^: · to
		• 1	•	« 9	© · to	• ·
•	•	• to • to	• • to*	• toto	• · ··

... zmenšují čich pórů. Pevné částice,^.· jakými»· jsou ^například -« ^červené krvinky, dosáhnou, v membráně- určité . polohy a ' nemohou pronikat dále. Vyvážený vzorek, který stále obsahuje rozpuštěnou glukózu, proniká-membránou k testovací straně. Anisotropní povaha membrány a/nébo použití separační složky (bude diskutována níže) umožní relativně rychlé proudění membránou i za současně probíhající filtrace pevných látek.

Při průchodu vzorku matricí způsobí reakce s reakčním činidlem vytvoření nebo rozklad barviva, absorbujícího světlo ve volném prostoru v blízkosti testovací strany, čímž se podstatným způsobem ovlivní odrazovost matrice..

Vhodnými příklady ’ matricových materiálů jsou polysulfony a polyamidy (nylony). Rovněž lze použít další polymery, které vykazují srovnatelné vlastnosti. Polymery lze modifikovat zavedením dalších funkčních skupin, které . poskytnou struktury s nábojem, takže povrchy matrice, mohou být neutrální, kladné nebo záporné.

Výhodným způsobem přípravy porézního materiálu, který tvoří matrici, je odlévání polymeru bez nosného jádra. Takovou matricí je například anisotropní polysulfonová membrána od společnosti Memtec, lne., Timonium, MD. Zpravidla se používá matrice, jejíž tloušťka je menši než přibližně 200 μτη, přičemž výhodnou je matrice s tloušťkou přibližně 115 až 155 μπι. Nejvýhodnější je. tloušťka přibližně 130 až 140 pm a to zejména v případě, kdy je _ | J r- I 1*1.....lil matrice tvořena nylonem nebo anisotropním polysulfonem.

Membránu lze ošetřit testovacím reakčním činidlem tak, že se ponoří do směsi těchto složek, čímž dojde k nasycení membrány. Výhodně se alespoň část složek aplikuje na φ · · · · φ membránu,.postupně.. Přebytek reakcníhočinidla-4 ze odstranit * ^-mechanickými prostředky,, například - pneumatickým - nožem,- ’ lékařskou břitvou nebo .skleněnou tyčí. Membrána se následně vysuší. Reakční činidlo má tendenci koncentrovat se v' . blízkosti testovací strany (strany s malými póry) membrány.

Testovací reakční činidlo obsahuje (i) složku pro převedeni glukózy na peroxid vodíku, (ii) složku pro detekováni peroxidu vodíku a (iii) složku pro inhibováni složky (ii) pro detekci peroxidu vodíku. Reakční činidlo může případně dále obsahovat separačni složku,- která způsobí zachycení pevných látek, například červených krvinek v matrici, a tím účinně odstraní pevné látky z biologické tekutiny. Reakční činidlo může rovněž obsahovat další složky, které budou popsány níže a v příkladech' vynálezu.

Výhodnou složkou pro převedení glukózy na peroxid vodíku je například glukózooxidáza, enzym, který se zpravidla získává z Aspergillu niger nebo penicilínu. Glukózooxidáza reaguje s glukózou a kyslíkem za vzniku glukonlaktonu a peroxidu vodíku. Optimální koncentrace glukózooxidázy závisí na složeni indikačního systému. Pokud je indikačním systémem například MBTHSB-ANS (který bude popsán níže), potom se koncentrace glukózooxidázy pohybuje zpravidla v rozmezí přibližně od 500 do 10 000 U/ml. Výhodnější- je koncentrace přibližně od 700 do 2 000 U/ml a nej výhodnější je koncentrace přibližně 1 000 U/ml. Vyšší koncentrace glukózooxidázy zpravidla způsobí, že reakce proběhne rychleji a nižší koncentrace glukózooxidázy způsobí, že reakce proběhne pomaleji.

Takto vzniklý peroxid vodíku reaguje se složkou pro detekci peroxidu vodíku, která obsahuje pěroxiaázu, » ··*· selektivně .katalýzující ,r,eakce -mezi peroxidem vodíku- a ........

indikátorem. Peroxidáza používá peroxid vodíku -jako oxidační činidlo, které je schopno odstranit vodíkové atomy z různých substrátů. Vhodná peroxidáza může obsahovat ferriprotoporfyrin, což je Červené krevní barvivo, získané z rostlin. Rovněž vhodné jsou peroxidázy, získané ze štítných žláz zvířat. Zvláště výhodnou součástí složky pro detekci peroxidu vodíku je peroxidáza z křenu polního (HRPO).

Peroxid vodíku, výhodně katalvzovaný peroxidázou,reaguje bud přímo nebo nepřímo za rozkladu indikačního barviva, které absorbuje světlo předem stanovené vlnové délky. Indikační barvivo výhodně silně absorbuje světlo jiných vlnových délek než testované reakční činidlo. Zoxidovaná forma indikátoru, která vyvolává barevnou změnu testované strany matrice, může být slabě zbarvena nebo bezbarvá. Testovací reakční činidlo tedy může naznačovat přítomnost analytu ve vzorku obarvením plochy, která byla bezbarvá, nebo alternativně vybělením barevné plochy.

Indikátory, které lze použít v rámci vynálezu zahrnují (a) 3-methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid (MBTH) spolu s kyselinou 3-dimethylaminobenzoovou (DMAB); (b) MBTH spolu s kyselinou 3,5-dichloro-2-hydroxybenzensulfonovou (DCHBS); (c) 4-aminoantipyren (4-AAP) spolu s kyselinou 5oxo-1-(p-sulfofenyl)-2-pyrazolin-3-karboxylovou (OPSP); (d) 4-AAP spolu s N-(m-tolyl)-diethanolamin (NDA); (e) kyselinu 2,2'-azino-di(3-ethylbenzthiazolin)sulfonovou (ABTS); (f)

-* * Mi.· ..... - --— ----- =

4-AAP a 4-methoxynaftol; (g) pyrogallolovou červeň (PGR);

(h) bromopyrogallolovou červeň (BPR); (i) zeleň „acid green

25” (AG); a (j) monosodný[3-methyl-2-benzothiazolinonhydrazon]N-sulfonylbenzensulfonát (MBTHSB) spolu s

4 4 0 ·· 4 4 4 0·· ♦ · · ···4*·· •4*4 0 4000 4044 • 000 0 00 40444

440 0044

4Φ04440 00 444 ···· , .,amonnium-8-Ťanilino-l-naftalensulfonovou ^kyselinou-- (ANS)·. Výhodná, je kombinace ..MBTHSB-ANS.. Další informace, týkající se MBTHSB-ANS lze nalézt v patentu US 5,563,031, uděleném

8. října 1996.

Inhibiční složka retarduje reakci mezi peroxidem vodíku a indikátorem, například, redukci peroxidu vodíku, nebo redukcí zoxidovaného indikátoru. V podstatě existuje několik různých způsobů, kterými inhibitor pracuje. Prvním způsobem je soupeření s indikátorem, které zpomalí rychlost, kterou probíhá barevná změna v indikátoru. V druhém případě by se měl veškerý inhibitor spotřebovat před tím, než dojde k barevné změně indikátoru, přičemž tento posledně jmenovaný způsob provozu inhibitoru je výhodný pro inhibitory podle vynálezu.

Vhodnými inhibitory jsou kyselina 2,3,4-trihydroxybenzoová, propylgallát, kyselina 3,4-dihydroxyskořicová, 3,4-dihydroxybenzaldehyd, kyselina gallová, 5,6diaminouracil, kyselina askorbová a kyselina isoaskorbová. Kyselina askorbová je výhodná, ale oxiduje v roztoku a musí být stabilizována, aby bylo možné nanést reakční činidlo na matrici. Výhodnými stabilizátory jsou primární alkoholy, například methanol, ethanol. nebo propanol. Výhodným stabilizátorem je ethanol, zejména jeho koncentrované roztoky, tj. 50% roztoky nebo koncentrovanější.

I když anisotropní membrána, kterou je výhodně matrice filtrující červené krvinky a zabraňující těmto pevným -*** ''látkám· v dosaženi* testovací stranymůže testovací'reakční* činidlo případně obsahovat separační složku. Separační složka by měla být schopna vytvořit z tekutiny obsahující červené krvinky, například v krvi jako takové, zachycením červených krvinek v matrici . relativně čirou, bezbarvou • · · φ · · <

tekutinu.. Separačními složkami, použitelnými' v rámci vynálezu, mohou být například polyethylenglykol, póly(methylvinyletheru/ anhydrid kyseliny maleinové), polypropylenglykol, kyselina polystyrensulfonová, kyselina polyakrylová, polyvinylalkohol a kyselina polyvinylsulfonová, přibližně při pH 4 až 8. Tyto separační složky jsou v matrici přítomny v množstvích,, která se budou lišit v závislosti na jejich náboji a molekulové hmotnosti a rovněž v závislosti na dalších složkách zabudovaných v matrici, na pH hodnotě matrice a velikosti pórů a na zbytkové vlhkosti v matrici po vysušení. Tyto parametry může odborník v daném oboru snadno stanovit. Pokud se například polypropylenglykol použije jako separační složka (například PPG-410 od společnosti BASF, Wyandotte, MI) je výhodné, aby představoval přibližně 2 až 30 hm.% (hm./obj.) a výhodněji 8 až 10 hm.% (hm./obj.). Ostatní separační složky lze použít přibližně v koncentraci 2 až 30 hm.% (hm./obj.). Polymerní separační složky mohou být impregnovány nebo zapouzdřeny v matrici, nebo odlity'spolu s matricí během výroby této matrice.

Separaci krve mohou rovněž způsobit některé vodou rozpustné soli. Mezi soli, vhodné pro separaci krevních složek lze zařadit citráty, formiáty a sulfáty a rovněž určité kyseliny, například aminokyseliny, kyselinu citrónovou, kyselinu listovou a kyselinu, jablečnou (viz například patent US 3,552,928, udělený 5. ledna 1971, M.C. Fetterovi). Výhodou použití separační složky je to, že z biologické^.tekutiny v podstatě ·· odstraní -pevné—látky,· jakými jsou například červené krvinky, které by jinak zabarvily pozadí , v testovaném místě, a tyto pevné látky tedy nezastíní změnu barvy, způsobenou testovacím reakčním činidlem.

·· <·«· «· ·♦·»

I

Do -matrice -lze zapouzdřit další složky, které zviditelní obarveni a usnadní odečítání z reageričnich proužků a podpoří zachování integrity matrice. Testovací reakční činidlo může zahrnovat soli a/nebo pufry, které pomohou separovat barvivo v matrici. Tyto pufry mohou například obsahovat citrát, přítomný v 0,01M až 1,OM roztoku a výhodně přibližně v O,1M roztoku. Rovněž lze použít další pufry.

Rovněž lze použít sloučeniny, které činí .matrici hydrofilní nebo sloučeniny, které mohou působit jako stabilizační činidla, například hydrolyzované proteiny. Tyto sloučeniny zahrnují neomezujícím způsobem albumin bovinního séra, polypeptidy a protein s nízkou molekulovou hmotností, dostupný jako Crotein ΞΡΑ (CRODA, lne., New York, N.Y.). Tyto sloučeniny se používají například v koncentracích 1 mg/ml až 100 mg/ml.. V případě Croteinu je výhodnou koncentrací přibližně 30 mg/ml.

Rovněž lze do povlaku, nanášeného na matrici, zahrnout další stabilizátory a konzervační činidla. Například lze použít kyselinu ethylendiamintetraoctovou (EDTA), kyselinu diethylentriaminpentanovou (DTPA) a odvozené sloučeniny při koncentracích přibližně 0,01 mg/ml až 10 mg/ml. Jedním z úkolů konzervačních činidel je pomoci při stabilizaci inhibitoru.

Některé indikátory (např. BPR) mají nežádoucí tendenci migrovat do matrice. Pokud sé použij e__ takový^indikátor^.je, třeba rovněž použít činidlo tvořící iontový pár s tímto indikátorem, které zabrání jeho migraci. Iontové zpárování mezi indikátorem a dalšími substituenty matrice umožní ·· ··*· ·· ···· «· *· ··« · · · ♦ · · · 1 ·*··»··*···«· • ·· · · · ···« · • ·«· · · ♦ · ··· ··· ·· ·*· ·· ·· 19 . . .„^...například polyethylenglykolové deriváty·, -.komerčně- dostupné.'* '^ϋ„ od společnosti Polyquart(H) (Henkel, -lne·., Ambler, -‘PA)-.

Pokud se přítomnost analytu indikuje zbarvením (např. MBTHSB-ANS),. lze pro zjasnění barev a zvýšení kontrastu mezi barvou a bezbarvým okolím přidat povrchově aktivní činidla.

V rámci vynálezu lze při formulování testovacího reakčního činidla pro matrici rovněž použít organická činidla, samozřejmě za předpokladu, že budou slučitelná s matricí a kompozicemi testovacího reakčního činidla. Potenciálně vhodnými organickými rozpouštědly jsou například chloroform, aceton, alkoholy, methylenchlorid, diethylethery a petrolethery, acetonitrily a jejich směsi. V rámci vynálezu je výhodný zejména 70% ethanol ve vodě.

Testovací reakční činidlo, které je naneseno na matrici nebo kterým je matrice napuštěna, nemá na celém povrchu testovacího proužku stejnou koncentraci. Reakční činidlo se výhodně na matrici aplikuje v řadě paralelních pásů nebo „segmentů, které probíhají přes matrici v. příčném směru. U kompozic v sousedících segmentech se postupně krokově zvyšuje koncentrace inhibitoru. Každý segment má savou testovací plochu. V místě těchto savých testovacích ploch způsobí reakce glukózy v krvi s testovacím reakčním činidlem barevnou změnu za předpokladu, že je koncentrace glukózy dostatečná na to, aby přesáhla koncentraci inhibitoru v této testovací ploše. Takže každá ——následující testovací plocha vyžaduje *k'tomu, ‘aby v jejím místě došlo k barevné změně, krokově vyšší koncentraci glukózy ve vzorku.

φφ ΦΦΦΦ • φ ._y -..^^e4?^a Z; -testovacích, .oblasti· je případně--uzpůsobena ..tak, ž.e slouží jako časovač, který ukazuje, že již uplynula· dostatečná doba, potřebná pro zreagováni reakčního činidla s glukózou ve všech testovacích oblastech. Časovačům segmentem matrice je matrice, potažená- nebo napuštěná kompozicí, která je tvořena testovacím reakčnim činidlem a glukózou. Protože úkolem testovacího reakčního činidla je změna barvy, způsobená přidáním glukózy, vyžaduje smísení těchto dvou složek určitou opatrnost, aby nedošlo k barevné změně reakčního činidla. Množství inhibitoru, které je potřebné pro časovači funkci musí být takové, aby kompenzovalo výše popsaný efekt. Je třeba řídit rychlost sušeni časovacího segmentu po aplikaci roztoku, obsahujícího glukózu na matrici. V praxi- se membrána nejprve potáhne roztokem obsahujícím pufry, stabilizační činidlo a enzymy, a tento povlak se vysuší za vzniku první vrstvy. Na tuto vrstvu se následně aplikuje druhý povlak ve formě roztoku obsahujícího indikátor,- inhibitor a.glukózu. Parametry, jakými jsou rychlost -odvíjení matrice, teplota pece a proudění vzduchu v peci a množství potahových roztoků ukládaných na matrici, se nastaví předem a příslušná regulace se provede změnou koncentrace- inhibitoru a/nebo glukózy. Méně výhodným řešením oproti přímé aplikaci druhého povlaku je vytvoření druhého povlaku na-samostatném pásu a jeho následné umístění na první vrstvu.

Jakmile se vzorek aplikuje na testovací proužek, umožní hydratace kompozice časovacího segmentu aby proběhla ._^*_reakce,. ..vedoucí—ke. vzniku barvy. - Čas, •potřebný-’pro-změnu-* barvy časového segmentu, se následně stanoví na základě teploty a vlastností testovacího reakčního činidla, zejména koncentrace inhibitoru, množství glukózy a rychlosti hydratace a difúze kyslíku.

«« *»♦* * φ «··* lí ·<, .Časovač .. může být 'závislý- na- koncentraci glukózy ^tsVe vzorku nebo může být na této koncentraci nezávislý. Zabudováním velkého přebytku glukózy do časovače se barevná změna časovače stane v podstatě nezávislou na koncentraci glukózy ve vzorku. Při zabudování menšího množství glukózy do časovače se barevné změna časovače stane závislou na glukóze ve vzorku, tj. Časovač změní barvu rychleji, pokud bude koncentrace glukózy ve vzorku vyšší. Výhodnou koncentrací glukózy v časovači je koncentrace vyšší než přibližně 1 500 mg/dl, která činí časovač v podstatě nezávislým na koncentraci glukózy ve vzorku, pokud se tato koncentrace pohybuje v rozmezí přibližně od 40 do 400 mg/dl. Kompozice časového segmentu obsahuje nadbytečná množství složky (například glukózooxidázy), která převádí glukózu na peroxid vodíku, a glukózy. Kompozice časovače by měla potom obsahovat alespoň takové množství inhibitoru, aby poskytla výsledný segment, který bude mít nejvyšší koncentraci inhibitoru (která odpovídá nejvyŠŠímu odečtu glukózy) nebo vyšší množství.

Časovač rovněž představuje důležitou kvalitativní kontrolu funkce testovacího proužku, protože jeho zabarvení před použitím pro měření ukáže, že testovací proužek byl vystaven vlhkosti a neposkytuje tedy přesná měření. Testovací proužek musí zůstat suchý až do okamžiku· použití, protože složky, které převádějí glukózu na peroxid' vodíku (zpravidla enzymy) mají tendenci v důsledku působení vlhkosti degradovat. Vystavením proužku vlhkosti se tento •testovací proužek tedy ničí. Toto 'poškození*' 'testovacíhčT** proužku nemusí uživatel postřehnout a při jeho použití tedy může získat nesprávné výsledky. Avšak pokud tento proužek zahrnuje časovači segment, vystavení proužku vlhkosti způsobí barevnou změnu časovače, což upozorní uživatele na

4444 • 4 ·4« 4

444 4

4 4 4 4 4 · 44

4 4 4 4 V 4 · V 4 44 4 • · 4 4 · 4 4 4 4 4 44

4*4 444«

444440 0 4 0444· 44 skutečnost:, .že', proužeky-bylpoškozen·; a. >nemůže ^'být dále~ -tí použit.

.Další informace, týkající se časovače, lze nalézt v související patentové přihlášce US 08/706,753, podané

3. září 1996. Kromě matrice obsahující reakční činidlo reagenční proužek podle vynálezu zahrnuje spodní vrstvu, která nese matrici. Spodní vrstvu tvoří výhodně termoplastická fólie, výhodná je polyesterová fólie s tloušťkou zpravidla přibližně 0,05 až 0,2 mm, která má v sobě proveden otvor, kterým lze aplikovat vzorek na vzorkovou stranu matrice. Z tohoto otvoru se krevní vzorek distribuuje matricí v. podélném směru. Pokud je tato spodní vrstva neprůhledná, potom může být ve vhodné vzdálenosti od otvorů pro zavádění vzorku umístěn jeden nebo více průhledů a vzhled vzorku v těchto průhledech potvrdí, že se na vzorek aplikoval odpovídající vzorek.

Distribuce krve z otvoru pro vzorek do testovacích oblastí zahrnuje mezilehlou vrstvu, která leží mezi spodní vrstvou a membránou, a která případně k oběma těmto vrstvám přilne. Mezilehlou vrstvu výhodně tvoří termoplastická fólie, výhodně polyester, zpravidla o tloušťce 0,05 až 0,2 mm. U jednoho provedení vedou výřezy v mezilehlé vrstvě vzorek po délce proužku po nesavých drahách membrány a směrují vzorek do jednotlivých testovacích oblastí. Výřezy v mezilehlé vrstvě se kryjí s testovacími plochami, takže každá testovací plocha je v podstatě obklopena stěnami mezilehlé vrstvy. U dalšího provedení má mezilehlá vrstva podlouhlou, v podstatě kolmou štěrbinu, která vede vzorek přes povrch membrány k testovacím plochám. Šířka štěrbiny se zpravidla pohybuje v rozmezí přibližně od 0,5 do 3 mm.

φφ φφφφ • Φ «φφ · ·· * · • φ φ φφφ φφφφ • φφφ · φ φφφ φ φ φφ φ φ φ · φ φφ φφφφφ φ φφφ φ φφφ «φφφφφ ·· ♦ ♦· φφ «φ ,,τ -Výhodná struktura.mes.avých' drah ína^membrán.ě - se . vytvoří

- .- '-zničením membránové -por-ézní. struktury. Toho-lze dosáhnou buď přímým zahřátím nebo použitím laseru nebo ultrazvuku, výhodně za působení tlaku. Nicméně výhodným způsobem je lisování. Membrána se tedy lisuje tak, že se stane nesavou (ale stále hydrofilní) všude, s výjimkou testovacích ploch.

. U jednoho provedení, vynálezu se membrána lisuje mezi plochými deskami pomocí raznice, která chrání testovací oblasti před slisováním. Výhodným tlakem je přibližně alespoň' 80 000 kPa. Lisovací desky mohou být případně ohřátý, přibližně alespoň na 110°C. Výhodné tlaky a teploty samozřejmě závisí na lisovacím mechanizmu# době odplynění a celkové době lisování, a rovněž na parametrech membrány. Optimální hodnoty lze zjistit běžným experimentálním měřením. Provedení, u kterého se membrána lisuje tímto způsobem, poskytuje testovací plochy, které probíhají ke spodní vrstvě a použijí se spolu s mezilehlou vrstvou opatřenou výřezy již popsaným způsobem.

Pro přesnost měření je výhodné, aby byl objem krve, který přijmou jednotlivé- testovací plochy, reprodukovatelný. Pokud budou výřezy, provedené v mezilehlé vrstvě zcela obklopovat testovací plochy, potom, za předpokladu, že je mezi mezilehlou vrstvou a jak spodní • vrstvou tak slisovanou membránou kapalinotěsný spoj, by byla každá testovaná plocha vymezena uzavřeným (válcovým) prostorem, jehož stěny jsou tvořeny mezilehlou vrstvou a jeho horní a spodní stěna jsou tvořeny membránou a spodní vrstvou*.·'- Nicméně-distribuční kanálek 'probíhá-podél^proužku***· a přivádí vzorek do všech testovacích oblastí. Spodní vrstva má výhodně větrací otvory, které jsou v zákrytu s testovacími plochami a umožňují rovnoměrné plnění kanálku a testovacích oblasti. Vysoká přesnost vyžaduje, aby ♦9 1#»·

4$»« ή rtfr—ιτ distribuční.· kanálek-poskytl· každé* testovací-‘Obiasti'· pouze ^;’’ '. pevně stanovený objem vzorku a dále, - ale’spoň ne v- době .určené pro začínaj icí testovacím měření, trvající přibližně sekund po aplikaci krve, oblastem další množství až 2 minuty a již neposkytoval vzorku. Protože počáteční absorpční objem vzorku je proměnlivý vrstva na obou koncích membrány je výhodné, aby odváděla přebytek vzorku z konců distribučního kanálku. Absorpční vrstvy na koncích kanálku rovněž zvyšují vzlínavost vzorku v podélném směru testovacího proužku. Výhodnými absorpčními vrstvami mohou být v daném oboru známé, netkané textilie.

U dalšího provedeni vynálezu jsou membrána a krycí fólie lisovány mezi válci. Krycí fólie má otvory, které pozičně odpovídají testovacím plochám, které se při průchodu válci zalisují do uvedených otvorů a zachovají si svou původní podobu (tj. nejsou slisovány). U tohoto provedení není potřebná raznice a lisování sé výhodně realizuje pomocí válců, při aplikaci lisovací síly alespoň přibližně 4 450 N. Je třeba poznamenat, že testovací plochy u tohoto provedení vybíhají v opačném směru, než v případě předchozího provedení. Vzhledem k tomu, že· vzorek se šíří, směrem k horní vrstvě orientované ven není třeba spodní vrstvu opatřovat odvzdušňovacími- otvory. Toto provedení se používá v kombinaci s mezilehlou vrstvou, která má v podstatě . kolmou štěrbinu, vedoucí vzorek do testovacích oblastí. Protože toto provedení má otvor pro vzorek umístěný blízko konce testovacího proužku, na kterém se nachází testovací oblasti s vysokým· obsahem^-glukózy/ -je* třeba použit pouze jednu absorpční vrstvu, která bude uspořádána v blízkosti protilehlého konce testovacího proužku.

·* *·« • « • « ·· .χ-··ν -.Barevná;* «..zrněná,·* způsobená·.- -glukózou přítomnou -·* v .u ·« . - testovaném vzorku, se objeví na.testovací straně membrány.

U provedení, u kterého testovací oblasti vybíhají směrem ke spodní -vrstvě,. je běžně testovací strana membrány překryta horní vrstvou, opatřenou otvory, které se překrývají s testovacími oblastmi. Tyto otvory umožňuji sledovat barevné změny a umožňují kyslíku dosáhnout reakčních míst. Pokud testovací oblasti vybíhají v protilehlém směru, potom otvory v horní vrstvě definují v průběhu lisování výše popsaným způsobem místa, ve kterých se vytvoří testovací oblasti. V obou případech horní vrstvu tvoří výhodně termoplastická fólie, výhodně polyesterová fólie, jejíž tloušťka se zpravidla pohybuje v rozmezí přibližně od 0,05 do 0,2 mm. Horní vrstva může být přichycena k membráně například pomocí adheziva. Veškeré adhezivo je výhodně aplikováno pouze na nesavé plochy membrány v případě, že by mohlo zasahovat do reakcí měřici koncentrace glukózy. Avšak pokud toto adhezivo nezasahuje do reakci, nemusí být jeho aplikování takto omezeno.

Protože testované plochy podléhají,, v případě že obsahují výhodné reakční činidlo, po exponování světlem nebo kyslíkem pozvolné barevné změně a protože případný časovač je citlivý na vlhkost, jsou tyto testovací proužky výhodně baleny v neprůsvitném obalu, nepropustném pro kyslík a vlhkost, jakým je například zavařený fóliový obal. Pokud jsou testovací proužky baleny jednotlivě, potom může proužek v průběhu použiti zůstat v obalu, který se otevře *-*^Odtr žením/' * - * *- ^{: ;} - — - - ~ ·—-**

Dále bude následovat podrobný popis provedení vynálezu, znázorněných na přiložených obrázcích. Obr. 1 znázorňuje matrici 10 podle vynálezu pro měřeni množství

	9 9	>··*	»9	• 9
• 9 ·	9	9		* 9	9		•
* «99	9	9	9*9	9 9		* 9
• 9 9		•	* 9	999	•		9
9 9	•	9	9	9	•		•
		9 9	9*9	99		9 9

..analytu·.' v- biologické.- tekutině. ·.Ačkoliv -ujeý znázorněna^ v.·

..ohnuté poloze, je tato matrice -10- pružná- a při použití zpravidla rovná. Matrice zahrnuje vzorkovou stranu 12, na kterou se aplikuje vzorek biologické tekutiny a testovací stranu 14, na které, nebo v blízkosti které, barevná změna indikuje přítomnost analytu. Barevná změna je důsledkem barevné reakce analytu s reakčním činidlem, napuštěným v

pórech 16	Pro	měření koncentrace glukózy	v krvi je
výhodné,	pokud	j sou	v blízkosti vzorkové	strany 12
relativně	velké	Póry	a jejich velikost se	směrem k
testovací	straně	14'	zmenšuje. Gradient velikosti' pórů

slouží k zachycení červených krvinek v blízkosti vzorkové strany 12, takže jejich barva nemůže ovlivňovat viditelnost barevné změny, která naznačuje přítomnost analytu ve vzorku.

Obrázek schematicky znázorňuje tři paralelní segmenty a, bac. Každý následující segment· má krokově vyšší koncentraci inhibitoru než předcházející. U výhodného provedení se membrána po aplikování reakcniho činidla na membránu v paralelních segmentech, které jsou znázorněny, slisuje., s výjimkou oblastí testovacích ploch, ve kterých probíhá její reakce mezi analytem a reakčním činidlem. Jedno provedení vzoru rozmístěni savých testovacích ploch je znázorněno na obr. 2. a ve zvětšeném perspektivním pohledu na obr. 3. U tohoto vzoru je na každém paralelním segmentu umístěna jedna savá testovací plocha a zbylou část membrány tvoří nesavá, slisovaná plocha.

w** .filin^ <' —- HK w—· · ιιιΟ» - ’ * ’ n‘Pl» I^KH· ! —·

Obr. 2 znázorňuje spodní pohled, částečně v řezu, na vzorkovou stranu 12 membrány IQ a absorpční vrstvy 20 a 22, překryté mezilehlou vrstvou 24 a spodní vrstvou 26. Membrána 10 a absorpční vrstvy 20 a 22 jsou výhodně neseny «« ··»· ·· ·· • · · · • ♦ ·>· ·> · · · ·· • ·· ··9 ♦ _? . horní . vrstvou., lnění znázorněno)- AbsorpčnL··.·vrstv.y^žO; a 2-2

T- se. výhodně nacházejí· na. koncích membrány- (pod. přerušovanou čárou A a B) a absorbují krevní vzorek, představující přebytek proti objemu, potřebnému pro měření. Tento objem musí být dostatečný pro poskytnutí vzorku všem testovacím oblastem a, pokud je přítomna, oblasti časovače. Testovací proužek, který má méně testovacích ploch, nevyžaduje zpravidla příliš mnoho vzorku, ale umožňuje měřit užší rozsah koncentrací glukózy a/nebo neposkytuje, tak přesné měření. Obr. 2 znázorňuje devět savých vrstev, z nichž osm představuje testovací plochy, označené vztahovými značkami 1 až 8 a devátá plocha představuje časovač (T), které umožňují měřit odpovídající rozmezí a poskytují- poměrně velkou přesnost, ale nevyžadují nepřijatelně velké objemy >

vzorku. Mezilehlá vrstva 24 má výřezy 28, které jsou zarovnány s otvorem 30 pro vzorek, provedeném na spodní vrstvě 26. Roztok je zaváděn otvorem 30 pro vzorek a směřován v důsledku kapilární elevace středovým kanálkem 32 . ..

mezilehlé vrstvy 24 do jednotlivých testovacích oblastí a časovači oblasti, přičemž veškerý přebytečný vzorek se absorbuje v absorpčních vrstvách 20 a 22. To, že je vzorek vidět skrze opticky čirá okénka 34 a 35 potvrzuje, že se na testovací proužek aplikovalo dostatečné množství vzorku- pro měření. Mezilehlá vrstva 24 výhodně tvoří se vzorkovou vrstvou 12 matrice 10 spoj a vzorek tedy nemůže proudit přímo mezi vzájemně sousedící testovací plochy.

Obr. 3 znázorňuje zvětšený perspektivní pohled na část _ ^.testovacího .proužku, který ukazuje .část^-tří^testovacích·. ploch 6, 7 a 8, viditelných přes spodní vrstvu 26 a oddělených výběžky mezilehlé vrstvy 24. Opticky adhezivní vrstvy 24a spojují mezilehlou vrstvu 24 se spodní vrstvou a matricí 10. Větrací otvory 40 ve spodní vrstvě 26

«« ♦»··	9 ·	9···	9 9	♦ 9
• 9 9	*	•	9	9 9	9		•
• ·♦·	•		9 9 9	9 ·		99
9 · 9	9	9	9	9 · · ·	9		•
9 ·	9	9	9	•	•		•
		9é	4 « ·	9 9		9 9

-s umožňují .v-zorku. proudit^dov test-ovaciho-í-proužku·.-Otvory .38 ..v»®'» - - horní vrstvě 36, které jsou v zákrytu-se savými -plochami, · umožňuji sledovat barevnou změnu v libovolné savé oblasti a rovněž umožňují přístup kyslíku, který je potřebný pro reakce, způsobující barevnou změnu. Případná adhezní vrstva 36a spojuje horní vrstvu 36 s testovací stranou matrice 10.

vedený

Obr. 4 znázorňuje řez rovinou 4-4, který testovacím proužkem z obr.

kromě vrstev, znázorněných

2, na obr. 2, ukazuje horní vrstvu 36.

Odvětrávací otvory £0 s testovacími oblastmi a ve spodní oblastí časovače a usnadňují zavádění vzorku do prostoru, obklopujícího jednotlivé oblasti. Prostory, které mají být naplněny, jsou ohraničeny matricí 10, mezilehlou vrstvou 24 a spodní vrstvou 26. Je třeba zmínit, že válcová testovací plocha 3 vybíhá směrem ke spodní vrstvě 26 a minimální odsazení mezi testovací plochou a spodní 'vrstvou je zpravidla pouze přibližně 12 pm. Odsazení na obrázku je pro přehlednost záměrně zvětšeno.

Obr. 5 znázorňuje spodní pohled na testovací proužek podle vynálezu, který ukazuje otvor 30 pro zavedení vzorku a značky, které směrují uživatele k zavedení vzorku do tohoto otvoru. Jakmile je vzorek spatřen přes čirá okénka 34 a 35, bylo na vzorek, aplikováno odpovídající množství vzorku.

Obr. 6 znázorňuje půdorysný pohled na horní vrstvu 36 testovacího proužku, . která je kalibrovaná pro měření koncentrace glukózy.

Obr. Ί znázorňuje testovací proužek z obr. 6 po aplikaci vzorku do otvoru 30 (obr. 2), kdy se vzorek rozšířil středovým kanálkem 32 a glukóza ve vzorcích

··		• 9	«•«a	• a	• 9
• »	a	a	•	9	• a	a	9
	··*	a	9	···	a a	99
9	< ·	a	9	9	a éaa	a	9
•	a	9	a	9	a	a	9
			»«	♦ 9·	9 «	99

-u.·... λ. zreag.oyala s r.eakčním činidlem sv -testovacích^oblastech.' · .· Spodní- testovací. oblast, která - obsahuje- nejmenší koncentraci inhibitoru, se zbarvila jako první. Potom se zbarvila druhá a následně třetí plocha’.· Horní kolečka nezměnila barvu, protože ve vzorku bylo·, příliš málo glukózy. Oblast 42 časovače po uplynutí dostatečné doby změnila barvu a proužek mohl být odečten.' Výsledek, znázorněný na obr. 7 tedy ukazuje,· že koncentrace glukózy ve vzorku je alespoň 120 mg/dl, ale méně než 150 mg/dl·. Odečet lze provést kdykoliv potom, co plocha časovače 42 změní barvu. V případě provedení, znázorněného na obr. 7, došlo v důsledku reakce s glukózou k barevné změně z bílé na barevnou. Systém by však mohl pracovat rovněž s indikačním barvivém, které by se v důsledku . oxidace vyvolané glukózou zničilo, což odpovídá barevné změně z barevné na bílou.

Obr. 8 znázorňuje perspektivní pohled·, „částečně v řezu, na další provedení proužku podle vynálezu. Spodní, vrstva 126 má otvor 130 pro zavádění krevního vzorku. Na rozdíl od provedení znázorněného na obr. 2, u kterého je otvor 30 pro zavádění vzorku umístěn v blízkosti středu proužku, nachází se otvor 130 výhodně v blízkosti konce testovacího proužku, kde se nacházejí testovací plochy pro indikaci vysoké koncentrace glukózy a případně časovač. Umístěni tohoto otvoru na konci testovacího proužku má dvě výhody. První výhodou je to, že se čas potřebný pro měření glukózy zkrátí o zkrácený čas, který krev potřebuje pro dosažení- - -testovacích oblastí·, určených-—pro*-'měření“* nejvyšších koncentrací glukózy. Druhou výhodou je redukovaná variabilita časovače, protože vzorek se v podstatě -aplikuje přímo na časovač, čímž se eliminuje variabilita doby potřebné pro to, aby krev dosáhla • * ··« • · · ΦΦΦ · · · « • φ Φ· φ φ · Φ· φ ΦΦΦ

Φ ΦΦΦ Φ «φ ··· I φ « ΦΦΦ φ ΦΦΦ

ΦΦΦ» ··· ·· ··· ·· ··

- . .časovače·.-r.Mezilehlá .vrstva 1-2-4. má ..podélnou·’-¹ štěrbinu .1.3=2/ & která- .probíhá -testovacím· proužkem v podélném směru -od·’ * výřezu,. který je zpravidla v zákrytu s otvorem 130 pro zavádění vzorku. Štěrbina vede krevní vzorek přes matrici 110 v podélném směru směrem k absorpční vrstvě 120. Při šíření vzorku přes matrici 110 se část tohoto vzorku umístí v časovači Τ' a v každé z osmi testovacích ploch (označených vztahovými značkami 101 až 108) . Testovací plochy a plochu časovače lze sledovat'otvory,'provedenými v horní vrstvě 136, které jsou s těmito plochami zarovnány. Spatření krve v čirém okénku 135 potvrzuje, že již bylo aplikováno dostatečné množství vzorku pro měření.

Obr. 9 znázorňuje spodní pohled na testovací proužek.z obr. 8, který nebyl opatřen značkami (znázorněným například na obr. 5), které mají směrovat uživatele k zavedení vzorku skrze otvor 130, provedený ve spodní vrstvě (a otvor 128, provedený v mezilehlé vrstvě a kryjící se s otvorem 130).

Obr. 10 znázorňuje rovinný pohled na horní vrstvu 136 a znázorňuje grafiku časovače a kalibraci testovacích oblastí.

Obr. 11 znázorňuje řez testovacím proužkem znázorněným na obr, 10. Řez je veden rovinou 11-11. a ukazuje horní vrstvu 136, matrici 110, mezilehlou vrstvu 124 a spodní vrstvu 126. Šipka znázorňuje směr zavádění vzorku do otvoru 130 ve spodní vrstvě 126 a zarovnaného otvoru 128 v mezilehlé vrstvě 124. Je třeba poznamenat,, že. válcová 'oblast* Τ' časovače vybíhá směrem nahoru, k odpovídajícímu . otvoru 138,· a výhodně dosahuje tohoto otvoru, který je v zákrytu s oblastí T' časovače, a který je jedním z devíti otvorů v horní vrstvě 136, ležících v zákrytu s odpovídající oblastí časovače a testovacími oblastmi.

• * ···t l

.Vynález-! >se stanem '«zřejmějším po ' -prostudování ? <

následujících příkladů provedení- vynálezu. Je třeba' upozornit, že tyto příklady provedení vynálezu mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezuji rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1 - BPŘ indikátor

V tomto příkladu se připravil následující roztok:

Destilovaná voda 1% (hm./hm.) EDTA Na₂ Kyselina akonitová NaOH (pevný)	83,5 g 23,8 g 6,0 g 2,2 g
Crotein SPA	4,2 g
Imidazol	0,6 g
Mannitol	3, 0 g
5%' (hm./hm.) Surfactol Q1	3,0 g
pH nastavena na 4,80
Ethylalkohol	40,0 g
PPG-410	5,6 g
Enzymový roztok	28,0 g

- Enzymový roztok

0,2M kyseliny akonitové 27,0 g Glukózooxidáza 165,000 U HRPO ' 340,000 U • 0 « · ΐ ./!? %> λ»-ιζ Membrána. Memtec-BTSH 55.:Ξθ'ponořila., do -tohoto? roztoku,·*;

> -- - * ' čímž se opatřila povlakem· a přebytek materiálu -se Odstranil' pomocí skleněné tyče. Potažená membrána se vysušila v proudové sušárně při teplotě 82,2°C' za mírného proudění vzduchu, takže membrána byla během dvaceti sekund v podstatě suchá. Získaná membrána se svinula a následně použila při potahování druhým povlakem.

Potom se připravily následující roztoky:

Askorbát (inhibitor) zásobní roztok	Ředidlo
1 ---- «1 _ liiu vana vuvici	-i λ r·» 13U	9	370	g
1% EDTA Na₂	55	9	107	g
BPR	0,36	9	0,71	g
PolyQuart H	6	9	11,8	g
PPG-410	14,2	g	27,8	9
Kyselina askorbová	1,37	g		—
Ethylalkohol	243	g	477	g

Roztok časovače

Ředidlo (vztaženo na výše def. formuli) 120g

Kyselina askorbová 0,885g

Glukózový roztok* 17,25g * glukózový roztok, který tvoří 16,0 g/dl roztoku glukózy ve vodě se nechal mutarotovat po dobu 24 hodin a následně se skladoval v lednici.·

Provedla se následující naředění zásobního roztoku: 0,0405:1, 0,108:1, 0,236:1, 0,369:1, 0,569:1 a 1,260:1.

-*Totokrokové -zvýšení koncentrace- inhibitoru»—odpovídá*** krokovému zvýšení koncentrace glukózy, kterou lze odečíst z testovacích oblastí. Tyto roztoky se spolu s roztokem časovače nanesly vedle' sebe na stranu membrány napuštěné enzymy, na které se nacházejí větší póry, takže se uložily přibližně 1,2 x 10“⁴ ml těchto roztoků na 1 mm³ membrány. Membrána se přibližně po patnácti sekundách sušila stejným způsobem jako v případě potahování enzymem. Výsledky ukázaly, že časovač reagoval přibližně 70 sekund, přičemž přibližně 95 % výsledků leželo v rozmezí od 64 do 79 sekund.

Příklad 2 - MBTHSB-ANS indikátor

V tomto příkladu se připravil následující roztok:

HPLC voda	1 500	ml
Kyselina citrónová	16, 92	9
Citrát sodný	20,88	9
Mannitol	15	9
Disodný EDŤA	1,26	9
Gantrez S95	6,75	9
Crotein SPA	36	9
Glukózooxidáza	1, 69	MU
HRPO	1,5	MU
Carbopol 910*	⁷⁵	ml
Citrát disodný**	225	ml

* 11% roztok v acetonitrilu ** 0,lM, pH 5,0

Membrána Memtec BTS 35 se potáhla tak, že se povrch s velkými póry uvedl do styku s potahovacím roztokem a přebytek roztoku se odstranil'jako v předcházejícínrpřipadě pomočí skleněných tyčí. Membrána se vysušila a navinula na cívku, jako v příkladu 1. Potom se připravily následující roztoky:

·· *«·· τ

Roztok A (indikátor)
70% (obj./obj.) ethanol	2 819 ml
ΜΒΤΗΞΒ .	2,98 g
(nh)₄ans	25,83 g
Roztok B	205 ml
2% DTPA	51,25 ml

Roztok Β (smáčecí činidlo)

Maphos 60A 41 g

70% (obj./obj.) ethanol 205 ml

Roztok C (zásobní askorbát)

Voda 115 ml

Kyselina askorbová 4,58 g

Ethanol 267 ml

Roztok D (časovač)

Voda

Kyselina askorbová

Ethanol

Objem zavedený do 175 ml

70% EtOH

Glukózový roztok ml

8,75 g 123. ml

40,5 ml

Pro každý roztok inhibitoru se použilo 263 ml roztoku A. V případě jednotlivých testovacích ploch se poměr.//0% .EtOH ku. roztoku C měnil od 58,9 do. 0,200- tak, ^že·** .objem 70% EtOH a roztoku C, přidaného do roztoku A, činil u všech roztoků inhibitoru 87,5 ml. To účinně ovlivnilo pouze koncentraci inhibitoru v jednotlivých roztocích. Roztoky, obsahující krokově se zvyšující koncentraci inhibitoru a ^roztoku časovače (roztoku D) , se nanesly ve formě povlaku, vedle . sebe na stranu membrány s velkými póry. Rychlost . ukládáni inhibitoru byla nastavena tak, že se dosáhlo koncentrace inhibitoru na membráně, která odpovídala přibližně 8 x 10'⁵ ml inhibitoru na 1 mm² membrány. Membrána se sušila výše popsaným způsobem s tou výjimkou, že prodleva mezi potahováním a sušením činila přibližně 1,6 minut. Výsledky ukázaly, že časovač zreagoval přibližně za 60 sekund, což bylo částečně způsobeno (z 30· až 55 %) krevním hematokrytem nebo glukózou, jejíž koncentrace se pohybovala od 78 do 420 mg/dl.

Claims

PATENT 0-V É NÁROKY

1. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek pro měření koncentrace analytu ve vzorku biologické tekutiny, která se aplikuje na proužek, vyznačený tím, že zahrnuje

a) spodní vrstvu s průchozím otvorem pro příjem vzorku;

b) vrstvu matrice mající stranu, která přijde do kontaktu se vzorkem, orientovanou ke spodní vrstvě, a testovací stranu, protilehle orientovanou k.první straně, a podél celé své délky množinu diskrétních savých testovacích oblastí, vzájemně oddělených nesavou oblastí, přičemž tato vrstva matrice obsahuje reakční činidlo, které může reagovat s analytem a vyvolat tak barevnou změnu a které obsahuje:

i) první složku, která vzájemně reaguje s analytem za vzniku peroxidu vodíku;

ii) druhou složku, která vzájemně reaguje s peroxidem vodíku a podléhá barevné změně; a iii) třetí složku, která inhibuje barevnou změnu druhé složky;

c) mezilehlou vrstvu, uspořádanou mezi spodní vrstvu a matricovou vrstvu; a ···»

a.·' ·,τ- d) ιdistribuční prostředek· pro distribuci’ vzorku·- podéle . · - proužku, přičemž tento distribuční - prostředek zahrnuje kanálek pro dopravu tekutiny, vytvořený v mezilehlé vrstvě, a pro vedení vzorku po povrchu matrice k savým testovacím oblastem;

koncentrace inhibitoru roste předem prvního konce proužku, barevnou přičemž způsobem s rostoucí vzdáleností od takže pokud má vzorek odpovídáj ícím přičemž jakmile může dojít obsahovat způsobit způsobem stanoveným změnu, musí

ΑΠΛ 1 vťll '— — — J - ~f proužek, testovacích oblastí, koncentraci ί*ι ττγ-τλλλαΙOC V C Λ.

na testovací nebo několik změně barvy a která označuje koncentraci zvýšenou aplikuj e k barevné změně jedné přičemž oblast, ve které dojde ke je nej vzdálenější od prvního konce, analytů ve vzorku.
2. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že analytem je glukóza.
3. Podlouhlý vícevrstevný podle nároku 1, vyzná biologickou tekutinou je krev.

reagenční testovací proužek čený tím, že
4. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek,, rtMfr·· --dáli· An—V — -4,-· !·'· :-¹ » podle nároku 1, vyznačený tím, že spodní vrstvu tvoři termoplastická fólie.

I • · » .---.
5., Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací «proužek-· po.dle nároku 4, vyznačený tím, že ^;spodní vrstva je vyrobena z polyesteru.
6. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený t.ím, že spodní vrstva dále obsahuje množinu průchozích otvorů, které jsou v zákrytů s testovacími oblastmi.
7. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že spodní vrstva má transparentní část umístěnou v předem stanovené vzdálenosti od otvoru přijímajícího vzorek pro zajištění odpovídajícího množství vzorku.
8. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1,· vyznačený tím, že matricová vrstva obsahuje anisotropní porézní membránu s póry, které jsou větší v blízkosti vzorkové strany a menší v blízkosti testovací strany.
9. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 8, vyznačený , tím, že _{u e} >· Trtdř ··· ί Ι·4ι'^“Mlír^· biologickou'tekutinou je kompletní kr.ev, obsahující červené krvinky.

.*· · « · a · · · · a · * · a a

V · 9 9 9 9 9 9 99

9 999 9 a ·♦ · a »· • · · » « 99 99999 a a a a a♦ a « aaaa aaa ♦· ··· Φ» aa ,:..1,0. Podlouhlý -vícevrstevný-reagenční^ testovací proužekpodle nároku 9, -v y z n. a č-e n ý tím, že se velikost pórů zvolí tak, že se červené krvinky vzorku kompletní krve zachytí v membráně.
11. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 8, vyznačený tím, že membrána obsahuje polysulfon.
12. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že kanálek pro přepravu tekutiny je v podstatě pravoúhlý.
13. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený .tím, že první složka obsahuje glukózooxidázu.
14. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že druhá složka obsahuje peroxidázu a indikační barvivo nebo dvojici barviv, které, jakmile se zoxiduji, změní barvu.

'
15? Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 14, vyznačený tím, že peroxidázou je peroxidáza z křenu polního.

4» *··» ·· 4« «44 · * ♦ • ♦ 4 4 • 4*4 · • 4*4 4 4 • 4 • ♦ · w i • • 4*4 • * • · · • 4 4 • o * 4 * · • 4 4-4

$ -
16. Podlouhlým vícevr.stevný reagenční testovací proužek podle nároku 14, vyz-načený- ^:tím, že indikačním barvivém nebo dvojící barviv je monosodný[3methyl-2-benzothiazolinonhydrazon] N-sulfonylbenzensulfonát v kombinaci s kyselinou amonnium-8-anilino-lnaftalensulfonovou (MBTHSB-ANS).
17. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že třetí složka obsahuje kyselinu askorbovou.
18. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že reakční Činidlo dále obsahuje separačni složku zvolenou, ze skupiny zahrnující polyethylenglykol, póly(methylvinylether/ anhydrid kyseliny maleinové) , polypropylenglykol, kyselinu polystyrensulfonovou, kyselinu polyakrylovou, polyvinylalkohol a kyselinu polyvinylsulfonovou.
19. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že mezilehlá vrstva obsahuje termoplastickou fólii.

· ' - 20.’ Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že mezilehlá vrstva obsahuje polyester.

44 ··*· *« ««·· 4«4«

4*4 · 4 · 4 · ·4

9 0 44 0 4 4 40 φ 444 * · 0 Ir 4 · ♦ «4 Φ ·*

0 · b · »'040 *000 00* 04 400 »·0*

- .2,1-;· Podlouhlý vicevrstevný reagenčni testovací·-proužek, podle nároku 1,. vy. značený tím,- že savé oblasti a nesavé oblastí tvoří nelisované, resp. slisované oblasti matricové vrstvy.
22. Podlouhlý vicevrstevný reagenčni testovací proužek podle nároku 21,· vyznačený tím, že nelisované savé oblasti jsou v podstatě válcovité a každá z těchto oblastí má základnu v matrici a konec protilehlý k této základně sousedí se spodní vrstvou.
23. Podlouhlý vicevrstevný reagenčni testovací proužek podle nároku 21, vyznačený tím, že nelisované savé oblasti jsou v podstatě válcovité a každá z těchto oblastí má základnu v matrici a konec protilehlý k této základně sousedí s horní vrstvou.
24. Podlouhlý vicevrstevný reagenčni testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že dále obsahuje horní vrstvu, která přiléhá k hornímu povrchu matricové vrstvy a má v sobě provedeny průchozí otvory, které jsou zarovnány s testovacími oblastmi.

* —*
25?*Podlouhlý vicevrstevnýreagenčni testovací proužek podle nároku 24, vyznačený tím, že matricová vrstva je přilepena k horní vrstvě.

»·♦· ·♦ • ·· ·· • * * « * • * • • • *·· • · 9 · « ·, · Φ · · · · • « » * * V Φ ♦ ·'
26. -.'Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací- proužek podle nároku 25, vyznačený tím, že matricová vrstva je přilepena k horní vrstvě pomocí adheziva, které je omezeno na nesavou oblast matricové vrstvy.
27. Podlouhlý vícevrs.tevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že dále obsahuje absorpční vrstvu, která je v kontaktu s koncem matrice, který je nejblíže prvnímu konci proužku.
28. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že dále zahrnuje absorpční vrstvy,, které kontaktují oba konce matricové.vrstvy.
29. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 30, vyznačený tím, že se průchozí otvor pro příjem vzorku nachází v blízkosti konce proužku, který je vzdálenější od prvního konce.
30. Podlouhlý vícevrstevný reagenční testovací proužek podle nároku 1, vyznačený tím, že- dále obsahuje časovači prvek, který zahrnuje testovací oblast,

.... ... , ,* - ·. - ' .......... iWH.t··· — která kromě reakčního činidla obsahuje množství glukózy způsobující barevnou změnu uvedené oblasti v předem určeném časovém okamžiku po aplikaci vzorku na testovací proužek.

·· »««· ·♦ Ib· ·* • · · • • ♦ • • •«· · · ··· * ·♦ « « < ·· · v • * • · · 9 » * *♦< 99 ··
31. Způsob měření koncentrace analytu ve vzorku biologické tekutiny, vyznačený tím, že zahrnuje:

(a) aplikaci vzorku na reagenční testovací proužek, který zahrnuje:

(i) spodní vrstvu s průchozím otvorem pro příjem vzorku, (ii) vrstvu matrice, mající stranu, která přijde do kontaktu se vzorkem, orientovanou ke spodní vrstvě, a která obsahuje množinu savých testovacích oblastí, které změní svou barvu, jakmile se dostanou do styku s tekutinou, obsahujících alespoň , předem stanovené množství analytu, které je větší než množství analytu způsobující barevnou změnu testovaných oblastí, uspořádaných blíže k prvnímu konci proužku, a (iii) distribuční prostředek pro distribuci vzorku z průchozího otvoru po předem určené nesavé dráze do všech testovaných oblastí; a (b) určení koncentrace analytu stanovením testované oblasti, která změní barvu, a která se nachází nejdále od prvního konce proužku.