CZ413097A3 - Rekombinantní adenoviry, jejich využití pro přípravu AAV, komplementární buněčná linie a farmaceutické kompozice, které je obsahují - Google Patents

Rekombinantní adenoviry, jejich využití pro přípravu AAV, komplementární buněčná linie a farmaceutické kompozice, které je obsahují Download PDF

Info

Publication number
CZ413097A3
CZ413097A3 CZ974130A CZ413097A CZ413097A3 CZ 413097 A3 CZ413097 A3 CZ 413097A3 CZ 974130 A CZ974130 A CZ 974130A CZ 413097 A CZ413097 A CZ 413097A CZ 413097 A3 CZ413097 A3 CZ 413097A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
promoter
adenovirus
tetracycline
region
gene
Prior art date
Application number
CZ974130A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ295934B6 (cs
Inventor
Martine Latta
CéCILE ORSINI
Michel Perricaudet
Edouard Prost
Emmanuelle Vigne
Patrice Yeh
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of CZ413097A3 publication Critical patent/CZ413097A3/cs
Publication of CZ295934B6 publication Critical patent/CZ295934B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10344—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Předkládaný vynález se týká nových virových vektorů, jejich přípravy a jejich využití. Rovněž se týká farmaceutických kompozic, které tyto virové vektory obsahují.
Dosavadní stav techniky
Genová terapie spočívá v korigování deficience nebo anomálie (mutace, aberantní exprese, atd.) zavedením genetické informace do buňky nebo napadeného orgánu. Tato genetická informace může být zavedena buď in vitro do buňky vyjmuté z daného orgánu, přičemž modifikovaná buňka se zavede zpět do organismu, nebo přímo in vivo do vhodné tkáně. V tomto druhém případě se používá různých technik, zejména pak různé techniky transfekce implikující komplexy DNA a DEAE-dextran (Pagano et al. , J.Virol. 1 (1967) 891), DNA a nukleárních proteinů (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), DNA et lipidů (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), použití liposomů (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255(1980) 10431), atd.
Později se používání virů jakožto vektorů pro přenos genů objevilo jako slibná alternativa těchto fyzikálních technik přenosu. V tomto ohledu byla provedena testace různých virů se zaměřením na zjištění jejich schopností infikovat určité buněčné populace. Zejména šlo o retroviry (RSV, HMS, MMS,atd.), virus HSV a adeno-přidružené viry a adenoviry.
Pokud se týká adenovirů, jedná se o viry mající dvouvláknovou lineární DNA s velikostí asi 36 kb. Jejich genom obsahuje sekvenci obrácené repetice (ITR) na každém konci, enkapsidační sekvenci, rané a pozdní geny (viz obr. 1) . Hlavní rané geny jsou obsaženy v oblastech El, E2, E3 a E4 . Z nich pak jsou geny obsažené v oblasti El (Ela a Elb) nezbytné pro virovou replikaci. Na příklad oblasti E4 a L5 jsou implikovány do virové propagace a hlavní pozdní geny jsou obsažené v oblastech LI až L5. Genom adenoviru Ad5 byl zcela sekvencován a je přístupný v příslušné databázi (viz zejména Genová banka - Genebank - M73260). Sekvencovány byly stejně tak části, dokonce celý genom adenovirů různých serotypů (Ad2, Ad7, Adl2, atd.) . Tyto virové vektory, které vykazují poměrně široké spektrum hostitelů, jsou schopné infikovat kiescentní buňky, nepronikají do genomu infikované buňky a nebyly do dnešního dne zmiňovány v humánní patologii. S přihlédnutím k jejich vlastnostem již však byly použity pro přenos genů in vivo. Za tím účelem byly připraveny vektory odvozené z adenovirů, inkorporující různé geny (β-gal, OTC, α-1ΑΤ, cytokiny, atd.).
Je jisté, že soubor těchto virových vektorů zahrnuje i četné virové geny, jejichž exprese není naopak žádoucí v genové terapii. Je nutné kontrolovat in vivo neexpresi divokých virových genů a/nebo proteinů z nich odvozených, které jsou schopné indukovat pro ošetřený organismus nežádoucí nebo dokonce neblahou imunitní a/nebo zánětovou reakci.
Za tímto účelem jsou konstrukce virových vektorů navrhované v současné době modifikovány takovým způsobem, aby znemožnily uvedeným vektorům replikovat se nezávislým způsobem v cílové buňce. Nazývají se defektivní viry. Genom defektivních virů je tedy zbaven alespoň sekvencí nutných pro replikaci zmíněného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být buď eliminovány (cele nebo částečně) , nebo znefunkčněny či nahrazeny dalšími sekvencemi, zejména pak sekvencí kódující molekulu terapeutického významu. Defektivní virus si uchovává nicméně sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci částic viru.
Ve specifickém případě rekombinantních adenovirů jsou popsané konstrukce všeobecně vzato adenoviry s delecemi oblastí El (Ela a/nebo Elb) a případně E3, na jejichž úrovni jsou vloženy sekvence heterologní DNA (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, Gosh-Choudhury et al. , Gene 50 (1986) 161) . Další konstrukce zahrnují deleci na úrovni oblasti El a nepodstatné části oblasti E4 (WO 94/12649). Tyto defektivní rekombinantní adenoviry mohou být připraveny různými způsoby při využití vhodné buněčné linie či nikoliv, která bude schopna doplnit všechny defektivní funkce důležité pro replikaci rekombinantního adenovirů. V současné době vektory odvozené z adenovirů jsou všeobecně vzato produkovány v doplňkové linii (linie 293), do které byla integrována část genomu adenovirů. Přesněji, linie 293 obsahuje levý konec (asi 11 - 12 %) genomu adenovirů serotypu 5 (Ad5) obsahující levou ITR, oblast enkapsidace a oblast El zahrnující Ela, Elb a část oblasti kódující protein pIX. Tato linie je schopna transkomplementovat defektivní rekombinantní adenoviry pro oblast El, to znamená zbavené cele nebo částečně oblasti El, nutné pro replikaci.
V žádném případě však není možné při produkci těchto defektivních virových vektorů vyloučit možnost rekombinací generujících replikativní části virů nebo transkomplementace in vivo buněčnými funkcemi typu El. Je zřejmé, že toto je zcela neslučitelné s jejich následným využitím v genové terapii. Přítomnost replikativních částí viru in vivo může mít velmi neblahé důsledky, jako na příklad vyvolání šíření virů a nekontrolovaného roznášení spolu s rizikem zánětů, rekombinace, atd.
Souběžně s tím je nutné předcházet in vivo expresi odpovídajících virových proteinů. I když nepředstavují nutně toxickou hrozbu pro buňku, jsou zcela nežádoucí, protože jsou schopné indukovat reakce imunitního systému, jako záněty a/nebo horečky, které mohou být velmi nebezpečné pro ošetřovaný organismus (D.Y. Schwarz, (1995), P.N.A.S 92, 1401
- 1405, J.F. Engelhardt, (1994), Human Gene Therapy, 5, 1217
- 1229 a (1994) P.N.A.S. 91, 6196 - 6200, Y. Yang, (1994), IMmunity, 1, 433 - 442, (1995) J. Virol. , 69, 2004 - 2015 a ’ Nátuře Genetics, (1994) 7, 362 - 369) .
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález doporučuje řešení umožňující čelit těmto nedostatkům aje vhodné zejména pro přípravu skupin virů typu adenovirů vykazujících zvýšenou bezpečnost, protože jsou zbaveny především replikativních částí viru.
Proti očekávání přihlašovatel prokázal, že je možné za pomoci původního promotorového systému účinným způsobem kontrolovat expresi virových genů, expresi, která je efektivní in vitro během virové produkce, ale naopak neefektivní později, in vivo, během terapeutického využití uvedených rekombinantních virů.
Přesněji řečeno, předkládaný vynález se týká rekombinantního adenovirů, u kterého exprese alespoň jednoho genu virového původu, homologního či heterologního, je kontrolována induktibilním promotorem.
* Ve smyslu předkládaného vynálezu se rozumí pod pojmem induktibilní promotér jakýkoliv promotor, jehož aktivita je iniciována přítomností chemického činidla a/nebo vnějšího činidla biologického, činidla, které v rámci předkládaného vynálezu vykazuje kromě jiného omezenou či nulovou toxicitu.
• ·
Pod pojmem vnější se rozumí, že chemické a/nebo biologické činidlo přirozeně neexistuje v buňkách ošetřených požadovaným adenovirem.
Jako induktibilní promotory schopné využití podle předkládaného vynálezu je možno uvést promotory klasické, jako na příklad ty, které odpovídají těžkým kovům (CRC Boča Raton, FL (1991), 167 - 220, Brinster et al. Nátuře (1982), 296, 39 - 42), tepelným šokům, hormonům, (Lee et al. P.N.A.S. USA (1988), 85, 1204 - 1208, (1981), 294, 228 - 232, Klock et al. Nátuře (1987), 329, 734 - 736, Israel a Kaufman, Nucleic Acids Res. (1989) , 17, 2589 - 2604) nebo chemickým činidlům typu glukózy, laktózy, galaktózy nebo antibiotikům.
Nedávno byl popsán promotér indukovatelný tetracyklinem, mimořádně výhodný v rámci předkládaného vynálezu.
Tento promotor, nazývaný promotor indukovatelný tetracyklinem, obsahuje minimální promotor vázaný operačně na jednoho či více operátorů tetracyklinu. To je vazba, na sekvence operátorů tetracyklinu, proteinu nazývaného aktivátor transkripce, vazba, která se utváří pouze za přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu, která umožňuje aktivaci minimálního promotoru a tedy transkripci jednoho či více asociovaných virových genů.
Pokud se týká zejména proteinu nazývaného aktivátor transkripce je třeba říci, že se vyznačuje schopností vázat se za přítomnosti tetracyklinu na sekvence operátorů promotoru indukovatelného tetracyklinem a schopností aktivovat minimální promotor. Jedná se o protein tvořený dvěma polypeptidy, jedním, který se váže na operátorové sekvence tet za přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu a druhým, jehož funkce spočívá v aktivaci zmíněné transkripce. První polypeptid proteinu nazývaného aktivátor transkripce je supresor tetracyklinu upravený takovým způsobem, aby
4 *
444
4 44 projevoval reakci inversní k reakci supresoru divokého, to znamená, že se váže na operátorové sekvence tet pouze v přítomnosti tetracyklinu a nikoliv v jeho nepřítomnosti. Pokud se jedná o druhý polypeptid, jde o oblast aktivace proteinu 16 viru Herpes Simplex.
V případě, že použitý induktibilní promotor bude ku příkladu indukovatelný glukózou nebo galaktózou, je možno zvážit použití aktivátoru transkripce konstruovaného podle tohoto modelu, to znamená na příklad Glu-VP16 nebo Gal4-VP16.
Podle předkládaného vynálezu je použitý induktibilní promotor indukovatelný tetracyklinem nebo jeho analogy, jak je popsáno výše.
Ve smyslu předkládaného vynálezu obsahuje promotor indukovatelný tetracyklinem minimální promotor vázaný operačně na sekvenci regulace obsahující alespoň operátor tetracyklinu tet operátor nebo jeho analogu.
Pod pojmem analog tetracyklinu chápeme jakoukoliv .sloučeninu vykazující strukturální homologie s tetracyklinem a schopnou vázat se na jeho receptor vázaný na oblast transaktivace proteinu nazývaného aktivátor transkripce a zmíněného výše, s Ka alespoň o 106 M'1. Pokud jde o analogy, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu, je možno uvést především doxycyklin, chlortetracyklin a anhydrotetracyklin.
Pod pojmem minimální promotor chápeme každou promoční sekvenci, která sama není schopna zajistit účinným způsobem transkripci sekvence DNA, která je jí asociována. Aktivita takovéhoto promotoru je zcela závislá na vazbě proteinu aktivátoru transkripce na sekvenci regulace a to v přítomnosti tetracyklinu. Úkolem tohoto minimálního promotoru je orientovat transkripci. Za tím účelem je povětšinou situován před virovou sekvencí, takže s ní vytváří kontinuální nukleotidovou sekvenci.
Tento minimální promotor může být odvozen od ihned raného promotoru lidského cytomegaloviru a povětšinou se pohybuje mezi nukleotidy +75 až -53 nebo +75 až -31. Ovšem stejně tak je možné použít podle vynálezu minimální promotor odvozený z konvenčního promotoru, jako na příklad promotoru aktivujícího transkripci genu kódujícího thymidin-kinázu.
Konvenční promotor může být minimalizován jednou či několika genetickými mutacemi, které mu znemožní zajistit účinným způsobem transkripci asociovaného genu. V rámci předkládaného vynálezu může být rovněž využit minimální promotor odvozený přímo z promotoru přirozeně odpovědného za expresi daného virového genu.Také je možno zvažovat použití promotoru nazývaného TATA-less, jak ho popsal E. MARTINEZ et al. (EMBO Journal, (1994), 13, č. 13, 3115 - 3126), aby se získalo co nejbazálnější šumové pozadí za neindukované situace.
Tento minimální promotor je uložen před nukleotidovou sekvenci, jejíž expresi kontroluje jako náhrada či nikoliv jejího přirozeného promotoru. Vlastní promotor nukleové sekvence může být i nadále přítomen, ale ve formě inaktivované nebo znefunčknělé různými technikami, které jsou odborníkům dobře známy, zejména pak supresí, delecí a/nebo adicí jedné či více bází.
Podle vynálezu je minimální promotor odvozen z minimálního promotoru thymidin-kinázy viru Herpes Simplex (Mc Knight et al. (1984) Cell 37:253 - 262). Pak se označuje Tk.
Je představován cele nebo částečně jednou ze sekvencí uvedených v SEQ ID č. 1 neb č. 2 nebo jednoho z jejich • · derivátů .
Ve smyslu předkládaného vynálezu označuje termín odvozený každou sekvenci získanou genetickou a/nebo chemickou modifikací daných sekvencí při zachování sledované aktivity. Genetickou a/nebo chemickou modifikací rozumíme jakoukoliv mutaci, substituci, deleci, adici a(nebo modifikaci jedné či více nukleových kyselin.
Tzv. regulační sekvence obsahuje alespoň jeden operátor tetracyklinu nebo jeho analogu. Operátor je rozeznán aktivátorem transkripce v přítomnosti tetracyklinu a umožňuje tedy z toho důvodu aktivaci minimálního promotoru.
Sekvence tet operátor, které mohou být využity, mohou být zvoleny ze sekvencí popsaných Hillenem a Wissemannem (Protein-Nucleic Acid Interaction, Saeger a Heinemann, eds. , Macmillan, London, (1989), 10, 143 - 162), Waters et al. (Nucleic Acids Res. (1983), 11, 525 - 539), Stueber et al. (P.N.A.S. USA, (1981), 78, 167 - 171), Unger et Al. (Nucleic Acids Res. (1984), 12, 7693 - 7703) a Tovar er al. (Mol Gen. Genet. (1988), 215, 76 - 80).
Regulační sekvence může obsahovat jedinou operátorovou sekvenci tet nebo naopak několik operátorových sekvencí tet, jejichž počet může dosáhnout až 10 sekvencí podle toho, chceme-li či nikoliv zvýšit regulaci transkripce. Podle speicifckého způsobu realizace předkládaného vynálezu využívá regulační sekvence dvou operátorových sekvencí tet. Je označena jako 0p2.
Regulační sekvence je reprezentována cele nebo částečně jednou ze sekvencí uvedenou v SED ID č. 3 nebo 4 nebo jedním z jejich derivátů.
Tato regulační sekvence je operačně vázána dopředně, to znamená na konec 5' minimálního promotoru takovým způsobem,
Φ ···· · · · ·· · · • · · · · · ··· ·· ······· ·· · aby byla umožněna transkripce genu virového původu za přítomnosti komplexu tvořeného aktivátorem transkripce a jeho tetracyklinového ligandu. Následně máme tedy v orientaci od 5' až po 3' regulační sekvenci, vázánou přímo či nepřímo na minimální promotor, dále minimální promotor a gen virového původu. Nicméně je možné rovněž zvážit možnost umístit tuto regulační sekvenci, v rámci minimálního promotoru, za nukleotidovou virovou sekvenci určenou k transkripci, to znamená, na její konec 3'. Pak by byl ve smyslu 5' a 3' Následující sled : minimální promotor, virový gen a regulační sekvence.
Podle předkládaného vynálezu promotor indukovatelný tetracyklinem přidružuje k minimálnímu promotoru tymidin-kinázy označovanému jako Tk regulační sekvenci představovanou regulační sekvencí 0p2. V tomto specifickém případu je identifikován jako 0p2/Tk. Induktibilní promotor použitý podle předkládaného vynálezu je představován cele nebo částečně sekvencí SEQ ID č. 5 nebo jedním z jejich derivátů.
Tento promotor indukovatelný tetracyklinem Op2/Tk a zejména pak promotor představovaný cele nebo částečně sekvencí SEQ ID č. 5 nebo jedním z jejich derivátů tvoří rovněž jeden z předmětů předkládaného vynálezu.
V důsledku toho pak je exprese jednoho či více virových genů vázaných operačně v nárokovaném adenoviru na induktibilní promotor cele podřízená fixaci komplexu tvořeného aktivátorem transkripce a tetracyklinem na regulační sekvenci daného promotoru.
Tato fixace je efektivní pouze za přítomnosti tetracyklinu. V jeho nepřítomnosti nebo v nepřítomnosti jednoho z jeho analogů, neexistuje žádní vazba mezi regulační sekvencí a aktivátorem transkripce. Důsledekm je nulová ·99 9 transkripce virové sekvence vázané na minimální promotor. Navíc pak činidlo indukující transkripci nemusí být průběžně přítomné.
Jeden z předmětů předkládaného vynálezu se týká adenoviru obsahujícího alespoň jeden homologní , to znamená adenovirální gen, jehož exprese je kontrolována induktibilním promotorem a především pak promotorem indukovatelným tetracyklinem. Předmětem předkládaného vynálezu je rekombinantní adenovirus, jehož alespoň jedna genomová oblast podstatná pro replikaci a/nebo šíření virů je cele nebo částečně pod kontrolou promotoru induktovatelného tetracyklinem. Oblast podstatná pro replikaci a/nebo šíření virů podle předkládaného vynálezu je výhodně zvolena z celku nebo části oblasti E4, E2, oblasti IVa2 a/nebo oblasti L5, atd.
Podle předkládaného vynálezu obsahují rekombinantní adenoviry jako sekvence nezbytné pro replikaci a/nebo šíření všechny nebo jen funkční část oblastí E2 nebo E4. Pokud se jedná o oblast E4 důležitými geny jsou geny ORF3, ORF6 a ORF6/7.
Oblast E2 je implikována do regulace virové DNA. Tato oblast E2 je tvořena dvěma transkripčními podjednotkami E2A a E2B.
Oblast E4 se podílí na regulaci exprese pozdních genů, na stabilitě pozdních jádrových RNA, na tlumení exprese protéinú hostitelské buňky a účinnosti replikace virové DNA. Mutanti zbavení oblasti E4 nejsou schopni se šířit. Oblast E4 tak představuje oblast podstatnou pro virovou propagaci. Tato oblast E4 má 7 otevřených čtecích fází označené ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 a ORF6/7 (obr. 2). Z nich pak ORF3 a ORF6 jsou dva geny podstatné pro šíření virů. Každý z těchto genů je schopen indukovat virovou propagaci, přičemž 0RF6 • · 4 · · ·
- 11 *r zde hraje nicméně důležitější roli než ORF3 (Huang a Hearing (1988), J. Virol 63, 2605).
V rámci určitého specifického způsobu je pak ve vektorech podle předkládaného vynálezu kontrolována promotorem indukovatelným tetracyklinem celá sledovaná oblast. Ve specifickém případě oblasti E2 se může jednat o fragment odpovídající kyselině cDNA odvozené z 72K, kyselině cDNA polymerázy odvozené z 14 0 K nebo kyselině cDNA preterminálního proteinu odvozené z 87K. Pokud jde o oblast E4, může se jednat především o fragment Taql-Bgl2 odpovídající nukleotidům 35576 - 32490.
V rámci jiného specifického způsobu je kontrolována exprese pouze jedné funkční části těchto oblastí, to znamená části umožňující šíření virů. V případě oblasti E4 tato část zahrnuje alespoň funkční gen ORF3 nebo ORF6. Funkční část oblasti E4 je tvořena v podstatě genem ORF6. Pro příklad uveďme, že zlomek Bgl2 situovaný mezi polohami 34115 až 324 90 a obsahující sekvence genů ORF6 a ORF7 adenoviru Ad5 může být vložen za induktibilní promotor, jak je uvedeno v předkládaném vynálezu.
V rámci dalšího jiného specifického způsobu podle předkládaného vynálezu je podstatná oblast tvořena oblastí kódující protein IVa2 a na příklad jeho cDNA. V jiném realizačním postupu je oblast kódující protein IVa2 obsažena ve zlomku BglII-Nrul odpovídajícím nukleotidům 3328 až 6316 na sekvenci divokého adenoviru Ad5, ve fragmentu Dral-NlalII odpovídajícím nukleotidům 4029 až 5719 nebo ve fragmentu Dral Xhol odpovídajícím nukleotidům 4029 až 5788.
V rámci preferovaného postupu podle předkládaného vynálezu jsou promotory oblastí podstatných pro šíření virů nahrazeny ve virovém genomu induktibilním promotorem, povětšinou pak promotorem indukovatelným tetracyklinem.
·· ♦ ♦··
V rámci prvního specifického způsobu realizace nesou rekombinantní adenoviry podle vynálezu deleci celku nebo části genu El a mají oblast E4, cele nebo částečně, pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem, povětšinou typu Op2/Tk.
V rámci dalšího uvedeného způsobu realizace nesou rekombinantní adenoviry podle vynálezu deleci celku nebo části genu El a mají oblast E2 cele nebo částečně pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem, ponejvíce typu Op2/Tk.
Rekombinantní adenoviry podle vynálezu v rámci upřednostněného způsobu realizace vynálezu nesou deleci celku nebo části genů El a E2 a mají oblast E4 cele nebo částečně pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem, ponejvíce typu Op2/Tk.
V rámci mimořádně výhodné varianty nesou rekombinantní adenoviry podle vynálezu deleci celku nebo části genů El a E4 a maj í oblast E2 cele nebo částečně pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem, ponejvíce typu Op2/Tk.
Rekombinantní adenoviry podle vynálezu obsahují výhodně kromě jiného i heterologní sekvenci nukleových kyselin obsahující jeden či více terapeutických genů, u kterých se snažíme o přenos do buňky, orgánu nebo organismu a jejich expresi v těchto subjektech.
Terapeutické geny, které tak mohou být transferovány jsou všechny geny, jejichž transkripce a případně tradukce do cílové buňky generuje produkty s terapeutickým účinkem.
Zejména se může jednat o geny kódující proteinové produkty s terapeutickým účinkem. Proteinový produkt takto kódovaný může být protein, peptid, atd. Tento proteinový produkt může být homologní s cílovou buňkou (to znamená •· 9 99 9 produkt, který je normálně vyjádřen v cílové buňce, pokud tato nevykazuje žádné patologické příznaky). V takovémto případě umožňuje exprese proteinu například čelit nedostatečné expresi v buňce nebo expresi inaktivního nebo v důsledku modifikace nedostatečně aktivního proteinu nebo expresi takovéhoto proteinu výrazně zvýšit. Terapeutický gen může rovněž kódovat mutant buněčného proteinu se zvýšenou stabilitou, modifikovanou aktivitou, atd. Proteinový produkt může být rovněž heterologní s cílovou buňkou. V takovém případě může vyjádřený protein doplnit deficientní aktivitu v buňce, což jí umožní bojovat proti patologickým jevům.
Z terapeutických produktů ve smyslu předkládaného vynálezu je možno uvést zejména enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny ; interleukiny, interferony, TNF, atd (FR 9203120), faktory ovlivňující růst, neurotransmitory a jejich prekusory nebo syntézní enzymy, trofické faktory : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, atd., dále apolipoproteiny : ApoAI, ApoAIV, ApoE, atd. (FR 93 05125), dystrofin nebo minidystrofin (FR 9111947), geny potlačující tumory : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev. , atd. (FR 93 04745), geny kódující faktory ovlivňující koagulaci : faktory VII, VIII, IX, atd., sebevraždené geny : thymidin-kináza, cytosin-desamináza, atd. ne celek či část přírodního nebo umělého imunoglobulinu (Fab, ScFv, atd.), atd.
Terapeutický gen může být rovněž antimediátorový gen nebo sekvence, jehož či jejíž exprese v cílové buňce umožňuje kontrolovat expresi genů nebo transkripci buněčných RNAm jako ribozomy. Takovéto sekvence mohou být ku příkladu přepsány v cílové buňce na komplementární RNA k buněčným RNAm a blokovat tak jejich přeměnu na protein způsobem popsaným v patentu EP 140 308.
Terapeutický gen může být rovněž gen kódující antigenový
9 ·· • · ♦ • 4 • 4 · 4
• 4 4 4 • 4 · 4 4 4 •
4 4 4 • · • 4 •
• «44 4 • 4 4 • 4 4 •
• · 4 4 • •
• 44 4« •44 ···· ·· •
peptid, schopný generovat u člověka imunitní reakci. Při takovémto specifickém způsobu využití vynález umožňuje realizaci očkovacích látek, které zajistí člověku imunitu , zejména proti mikroorganismus nebo virům. Může se jednat především o antigenové peptidy specifické pro virus Epsteina a Barrové, virus HIV, virus hepatitidy B (EP 185 573), virus pseudovztekliny nebo pro tumory (EP 259 212).
Všeobecně platí, že heterologní sekvence nukleových kyselin obsahuje rovněž promoční oblast funkční transkripce do infikované buňky, jakož i oblast nacházející se v 3' zainteresovaného genu specifikující signál ukončení transkripce a místo polyadenylace. Soubor těchto prvků tvoří expresní kazetu. Pokud jde o promoční oblast, zde se může jednat o promoční oblast přirozeně odpovědnou za expresi sledovaného genu, je-li tato schopna fungovat v infikované buňce. Může se rovněž tak jednat o oblasti různého původu (odpovědné za expresi dalších proteinů, dokonce syntetických). Může se také jednak o promoční sekvence eukaryotických nebo virových genů. Na příklad se může jednat o promoční geny pocházející z genomu buňky, kterou chceme infikovat. Rovněž tak se může jednat o promoční sekvence pocházející z genomu viru, včetně použitého adenovirů. Z tohoto hlediska je možno uvést na příklad promotory genů E1A, MLP, CMV, RSV, atd. Kromě jiného, tyto promoční oblasti mohou být modifikovány adicí aktivačních nebo regulačních sekvencí nebo sekvencí umožňujících tkáňově specifickou nebo majoritní expresi. Ostatně, jestliže heterologní kyselina nukleová neobsahuje promoční sekvence, může být vložena do genomu defektivního viru za takovouto sekvenci.
Heterologní sekvence nukleových kyselin může rovněž obsahovat, zejména před terapeutickým genem, signální sekvenci řídící syntetizovaný terapeutický produkt v sekrečních cestách cílové buňky. Tato signální sekvence může
být přirozenou signální sekvencí terapeutického produktu, ale může se rovněž jednat o jakoukoliv jinou funkční signální sekvenci nebo signální sekvenci umělou.
Tato sekvence nukleových kyselin bývá povětšinou na úrovni oblastí El, E3 nebo E4 jako náhražka nebo doplněk sekvencí odstraněných delecí.
Předkládaný vynález má jako druhý hlavní předmět adenovirus obsahující alespoň heterologní gen virového původu, jehož exprese je kontrolována induktibilním promotorem, především promotorem indukovatelným tetracyklinem.
Podle způsobu využití preferovaného vynálezem je heterologní gen virového původu odvozen z genu genomu viru AAV nebo jeho funkčních homologů.
AAV jsou viry mající DNA a relativně malou velikosti, které se integrují do genomu buněk, které infikují a to stálým a pro dané místo specifickým způsobem. Jsou rovněž schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by indukovaly jakýkoliv vliv na růst, morfologii nebo diferenciaci buněk. Ostatně, jak se zdá, nejsou implikovány v patologických jevech u člověka. Genom virů AAV byl klonován, sekvencován a charakterizován. Obsahuje 4680 bází a má na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) zhruba se 145 bázemi pro replikaci viru. Zbytek genomu je rozdělen do 2 podstatných oblastí majících enkapsidační funkce : levé části genomu obsahující gen rep implikovaný ve virové replikaci a expresi virových genů pravé části genomu obsahující gen cap kódující kapsidační proteiny viru. Byly zde lokalizovány tři promotory a pojmenovány podle své přibližné polohy v kartografických jednotkách p5, pl9 a p40. Čtyři proteiny jsou alespoň syntetizovány počínaje oblastí rep a pojmenovány podle své zjevné molekulové hmoty Rep78, Rep68, Rep52 a Rep40. Obě mRNA přepsané z promotoru p5 se používají pro syntézu Rep78 a • 4 4444
- 16 Rep68. Rep52 a Rep40 jsou syntetizovány z mesažerů pocházejících z promotoru pl9 . Pokud jde o gen cap, tento kóduje proteiny kapsidy viru (VP1, VP2 a VP3). VP3 je majoritní kapsidační protein a jeho aminokyselinová sekvence je obsažena v kapsidách obou největších , ale méně hojných proteinů VP1 a VP2 charakterizovány a odborné literatuře (viz schéma) . Tyto geny rap a cap jejich příslušné (Srivastava et byly sekvence popsány v
Virol.45 (1983)
J.
Použití vitro a in především
139, 941,
WO
EP vektorů odvozených vivo bylo
91/18088,
488 528) .
pro odborné
ΑΑΆ přenos genů in literatuře (viz popsáno
WO 93/09239, US 4,
Všeobecně vzato,konstrukce použité v
797, 368, US 5, genové terapii obsahují deleci genů rep a/nebo cap, které jsou nahrazeny zainteresovaným genem.
Pro úspěšnou replikaci potřebují AAV přítomnost pomocného viru (helper) schopného transkomplementovat funkce nezbytné pro jejich replikaci. Múze se jednat především o adenovirus, virus herpesu nebo virus vakcíny (v nepřítomnosti takovéhoto pomocného viru zůstávají AAV v latentní formě nadále obsažené v genomu infikovaných buněk, ale nemohou se replikovat a produkovat tak částečky virů).
Rekombinantní
AAV j sou tedy produkovány kotransfekcí, buněčné linii infikované lidským pomocným virem (na příklad adenovirem), plazmidu obsahujícího zainteresovaný gen lemovaný dvěma oblastmi inversní repetice (ITR) daného AAV a plazmidu nesoucího enkapsidační geny (gen rep a cap) daného AAV. Koinfekce adenovirem spustí sled dějů vyúsťujících v produkci zvýšených titrů virů AAV a snižujících podstatným způsobem produkci adenovirů. Tento sled je uveden do pohybu syntézou produktu genu Ela, který indukuje transkripci z promotorů p5 a pl9 a vede k syntéze malého množství proteinů Rep. Jeden či více proteinů Rep syntetizovaných z p5 indukuje « «« ·· ···· *·«««· · ··« · ·»·» * ··« · · ♦ ♦ ♦·· · • · · ♦ · · *·· ·· «······ ·· ♦ tedy syntézu s výraznějším množstvím RNAm ze 3 promotorů na úrovni podstatně vyšší a výrazně koordinovaným způsobem. V nepřítomnosti adenoviru je genom viru AAV buď ztracen nebo integrován do chromosomu hostitele. Jiné geny adenoviru než E1A jsou rovněž nezbytné pro účinnou expresi genů viru AAV.
Předkladatel prokázal, že je možné umístit účinně alespoň expresi jednoho z virových genů viru AAV pod kontrolu promotoru indukovatelného v adenoviru a kontrolovat expresi enkapsidančích funkcí virů AAV, zejména pak expresi genů rep a/nebo cap nebo každého homologního funkčního genu.
Funkční homolog odpovídá každému genu získanému modifikací (mutace, potlačení, přidání, atd.) genů rep nebo cap a vykazujících aktivitu stejné povahy. Takovéto funkční homologové geny mohou být rovněž geny získané hydridizací z bank nukleových kyselin pomocí sond odpovídajících genům rep nebo cap. Pokud jde o upravený gen rep, který může být kontrolován podle vynálezu, je možno uvést především jeho mutant inll77 popsaný v publikaci Y. Yang et al. , (1992) Journal of virology, 6058 - 6069) odvozený ze serinů vložených mezi kodóny 286 a 287.
Podle preferovaného realizačního postupu vynálezu je využívaný induktibilní promotor promotorem indukovatelným tetracyklinem , jak je definován výše.
Takovýto adenovirus je výhodný z několika hledisek : z hlediska manipulace výrazně zjednodušuje proces přípravy zásobních šarží virů AAV. V tomto specifickém případě se využívá pouze zmíněný adenovirus obsahující geny rep a cap pod kontrolou induktibilního promotoru, rekombinantní virus AAV a adekvátní buněčná linie. Požadované koncentrace viru AAV z takovéhoto adenoviru převyšují, jak se zdá, koncentrace získané klasickým způsobem.
• · · · · ·
Induktibilní promotor může být vložen jako náhrada jednoho z promotorů řídícího expresi sledovaného genu či sledovaných genů, zejména pak jako náhrada promotoru p5, pl9 nebo p40. Vzhledem k tomu, že promotor p5 se zdá být nejvíce implikován v procesu spouštění sledu dějů vedoucích k produkci viru, dochází preferenčně k jeho nahrazení promotorem indukovatelným tetracyklinem, povětšinou typu Op2/Tk. Výhodou je, že takováto konstrukce umožňuje blokaci exprese genů rep a cap v nepřítomnosti tetracyklinu.
Enkapsidační funkce viru AAV pod kontrolou induktibilního promotoru mohou být zavedeny do různých oblastí genomu nárokovaného adenoviru. Výhodou je, že enkapsidační funkce jsou vloženy do oblasti nenarušující schopnost viru transkomplementovat viry AAV. Rovněž je možné vložit enkapsidační funkce do funkční oblasti genomu zmíněného adenoviru, když tato oblast je vložena do polohy trans buď plazmidem nebo použitou buněčnou linií. Na příklad je možné vložit gen rep, gen cap nebo geny rep a cap na úrovni oblastí El nebo E3 jakožto náhradu nebo doplněk sekvencí odstraněných delecí.
Pro eliminaci transkripčního úniku podmíněného blízkostí oblasti ITR-psi je možno kromě jiného vložit sekvenci nazývanou sekvence negativní regulace. Takováto sekvence vložená zejména mezi levou ITR a sekvenci psi požadovaného adenoviru na jedné straně a sekvenci kódující promotor indukovatelný tetracyklinem umožňuje omezit veškerou parazitní transkripční aktivaci rep a cap indukovanou v takovém případě zesilovačem transkripce nacházejícím se v levé ITR adenoviru a sekvenci psi. Pokud jde o negativní sekvence, které mohou být podle vynálezu použity, je možno uvést především sekvence identifikované v promotoru vimentin (Salvetti at al. , (1993), Mol Cell. Biol., 1676 - 1685) v promotoru interferon (Whitemore et al. (1990), P.N.A.S., 87, φφ • · φ φ • φ • φ
7799 - 7803), v genu 2. lehkého řetězce kardiálního myozinu (Ruoquian-Shen et al. (1991), Mol. Cell. Biol. , 1676 - 1685) a v myším albuminním promotoru (Herbst et al. (1990), Mol.
Cell. Biol., 3896 - 3905).
Podle preferovaného realizačního způsobu se předkládaný vynález týká rekombinantního adenovirů nesoucího expresní kazetu Op2/Tk-rep-cap.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž využívání těchto adenovirů integrujících virovou sekvenci původu AAV pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem pro přípravu virů AAV.
Adenoviry, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, obsahují sekvence obrácené repetice (ITR) a jednu sekvenci umožňující enkapsidaci. Tyto adenoviry mají kromě jiného i nefunkční oblast El.
Sekvence obrácené repetice (ITR) jsou zdrojem replikace adenovirů. Jsou lokalizovány na koncích 3' a 5' virového genomu (viz obr. 1), odkud mohou být snadno izolovány klasickými metodami molekulární biologie známými všem odborníkům. Nukleotidová sekvence sekvencí ITR lidských adenovirů (především serotypů Ad2 a Ad5) je popsána v odborné literatuře, stejně jako psí adenoviry (především CAV1 a CAV2). Pokud jde na příklad o adenovirus Ad5 odpovídá levá sekvence ITR oblasti obsahující nukleotidy 1 až 103 genomu.
Podle obzvláště výhodného postupu je v rekombinantních adenovirech podle předkládaného vynálezu oblast El inaktivována delecí fragmentu PvuII-BglII zasahující od nukleotidu 454 po nukleotid 3328 na sekvenci adenovirů Ad5. Tato sekvence je zmiňována v odborné literatuře a rovněž je zjistitelná z databáze (viz zejména genová banka Genebank č.
·· 9999
- 20 M73260). V jiném preferovaném způsobu realizace je oblast El inaktivována delecí fragmentu HinfII-Sau3A zasahující od nukleotidu 382 po nukleotid 3446.
Adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny z adenovirů různého původu. Existuje skutečně celá řada různých serotypů adenovirů, jejichž struktura a schopnosti se poněkud odlišují, ale které vykazují srovnatelné genetické uspořádání.
Adenoviry podle vynálezu mohou být lidského, živočišného nebo kombinovaného původu (lidské a živočišné). Pokud jde o adenoviry lidského původu, přednostně se využívají adenoviry zařazené do skupiny C. Z různých serotypů lidských adenovirů se přednostně využívá v rámci předkládaného vynálezu adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad2 nebo Ad5).
Jak je uvedeno výše, adenoviry podle vynálezu mohou být rovněž živočišného původu nebo obsahovat sekvence pocházející z adenovirů živočišného původu. Předkladatel skutečně prokázal, že adenoviry živočišného původu jsou schopné infikovat podstatně účinněji lidské buňky a že se nedokáží šířit v lidských buňkách, ve kterých byly testovány (viz WO 94 / 26914) . Předkladatel rovněž prokázal, že adenoviry živočišného původu nejsou nijak transkomplementovány adenoviry lidského původu, rekombinace nebo propagace adenovirů, což může vést
Použití adenovirů nebo oblastí což vylučuje in jakékoliv riziko vivo v přítomnosti lidského utvoření infekční částečky, adenovirů živočišného původu je tedy obzvláště výhodné, protože rizika související s použitím virů jakožto vektorů v genové terapii jsou ještě menší.
Adenoviry živočišného původu využitelné v rámci předkládaného vynálezu mohou být původu psího, bovinního, myšího (na příklad Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990)
- 21 81) , ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího (příklad .· SAV) . Z ptačích adenovirú je možno uvést serotypy 1 až 10 nacházející se ve sbírce ATCC, jako ku příkladu kmeny Phelps (ATCC VR - 432), Fontes (ATCC VR - 280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) nebo kmeny ATCC VR-831 až 835. Z bovinních adenovirú je možno použít různé známé serotypy a zejména serotypy disponibilní v ATCC (typy 1 až 8) pod odkazem ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 a 769. Rovněž je možno uvést myší adenoviry FL (ATCC VR-550) a E20308 (ATCC VR-528), ovčí adenovirus typu 5 (ATCC VR-1343) nebo typu 6 (ATCC VR-1340), dále pak adenovirus prasečí (5359) nebo opičí adenoviry, jako viry uvedené v ATCC pod označením VR-591-594, 941-943, 195-203, atd.
Z různých adenovirú živočišného původu se využívá v rámci vynálezu adenovirú nebo oblastí adenovirú psího původu a zejména všech kmenů adenovirú CAV2 (ku příkladu kmen manhattan nebo A26/61 /ATCC VR-800). Adenoviry psího původu byly již dříve předmětem četných strukturálních studií. Již dříve byly popsány kompletní restrikční mapky adenovirú CAV1 a CAV2 (spibey at al. , J. Gen. Virol. 70 (1989) 165) a geny Ela, E3 a sekvence obrácené repetice byly (ITR) klonovány a sekvencovány (viz Spibey et al. , Virus Res. 14 (1989) 241, Linné, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91 / 11525).
Předkládaný vynález se vztahuje kromě jiného i na postup vhodný pro přípravu AAV. Přesněji řečeno, předmětem předkládaného vynálezu je proces přípravy AAV vyznačující se tím, že zahrnuje kotransfekci, v přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu, buněčné linie obsahující ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce s adenovirem obsahujícím alespoň gen původu AAV pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem a buď rekombinantní virus odvozený z AAV nebo plazmid nesoucí transgen mezi ITR a AAV.
w· • «
·· ···« • * ··· ·
Povětšinou se jedná o adenovirus obsahující jako heterologní virové geny geny rep a cap.
Postup podle vynálezu využívá schopnosti indukovat expresi těchto genů rep a cap vložených pod kontrolu promotoru indukovatelného tetracyklinem uvnitř adenoviru za přítomnosti dostatečného množství tetracyklinu a transkripčního aktivátoru.
Jak bylo uvedeno výše, tento postup má tu výhodu, že manipulace je zde v porovnání s klasickým způsobem zjednodušena. V daném případě se využívá pouze koinfekce buněčné linie adenovirem podle nároku a rekombinantním virem odvozeným z AAV.
Kromě adenoviru transformovaného podle vynálezu využívá tento postup buněčné linie obsahující ve svém genomu expresní kazetu proteinu nazývaného aktivátor transkripce. Tento aktivátor je tvořen prvním polypeptidem,který je schopen se vázat za přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogů na regulační sekvenci induktibilního promotoru přítomného v adenoviru přidruženého k druhému polypeptidu, který aktivuje transkripci.
Pokud jde o protein nazývaný aktivátor transkripce, ten se vyznačuje schopností vázat se v přítomnosti tetracyklinu na regulační sekvenci a schopností aktivovat minimální přidružený promotor. Jedná se o protein tvořený dvěma polypeptidy, prvním , který se váže na operátorové sekvence tet za přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu a druhým, jehož funkce spočívá v aktivování transkripce.
Podle vynálezu je první polypeptid proteinu nazývaného aktivátor transkripce supresor tetracyklinu mutovaný tak, aby vykazoval reakci opačnou k reakci divokého supresoru, to znamená, že se na operátorové sekvence tet váže pouze v ·· • · přítomnosti a ne v nepřítomnosti tetracyklinu. Tento typ mutace může být realizován klasickými biologickými postupy typu mutagenéze. Rozdíl v aminokyselinách mezi divokým supresorem a supresorem mutovaným podle vynálezu může spočívat v náhradě, deleci a/nebo přidání jedné nebo několika aminokyselin. Tím jsou do takto transformovaného supresoru vloženy dvě funkční schopnosti : dokáže se vázat na regulační sekvenci zpodobnenou tetracyklinovými operátory analogicky k divokému supresoru. Naproti tomu je regulován inversním způsobem tetracyklinem.
Četné skupiny divokých supresoru tetracyklinu byly popsány v odborné lieratuře, z nichž uveďme zejména skupiny A, B, C, D, E. Zejména je možno zmínit supresor nazývaný Tn 10, který patří do kategorie B. Podle vynálezu používaný supresor je odvozen z tohoto divokého supresoru TnlO. Přesněji řečeno, jedná se o supresor TnlO mutovaný alespoň v aminokyselinu lokalizovanou v polohách 71, 95, 101 nebo 102.
Obsahuje cele nebo částečně sekvenci amnikoyselin zobrazenou v SEQ ID č. 8. Označuje se TetR.
Pokud jde o druhý poplypeptid přítomný v proteinu nazývaném aktivátor transkripce, může se jednat o jakoukoliv již známou oblast aktivace transkripce. Podle vynálezu se jedná o oblast aktivace proteinu 16 viru herpes simplex, zejména 130 aminokyselin terminálního konce C proteinu VP16 a 11 aminokyselin tohoto terminálního konce proteinu VP16 nebo šarže peptidů terminální části C proteinu VP16 (Sceipel K. et al. EMBOJ. 1992, 13, 4961 - 4968) nebo derivátů.
V případě postupu výroby nárokovaného AAV je expresní kazeta tohoto aktivátoru transkripce integrována do genomu buněčné linie 293.
Podle předkládaného vynálezu je exprese tohoto aktivátoru transkripce rovněž vložena, v buněčné linii, pod kontrolu promotoru indukovatelného tetracyklinem nebo jeho analogy, jak bylo uvedeno výše. Jedná se o buněčnou linii 293 integrující ve svém genomu kazetu Op2/Tk-TetR-VP16.
Předmětem vynálezu je rovněž buněčná linie obsahující ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce obsahující či nikoli induktibilní promotor, jak bylo definováno podle vynálezu. Jedná se o buněčnou linii integrující ve svém genomu kazetu Op2/Tk-TetR-VP16.
Vynález se rovněž týká použití tohoto typu buněčné linie pro produkci adenovirů nebo AAVs podle vynálezu.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob přípravy adenovirů obsahujících alespoň jeden z jejich genů, jejichž exprese je pod kontrolou promotoru indukovatelného tertracyklinem.
Defektivní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny různými způsoby.
První z nich spočívá v přenosu DNA defektivního rekombinantního viru připraveného in vitro (ligací nebo ve formě plazmidu) do příslušné buněčné linie, to znamená nesoucí v poloze trans veškeré funkce nutné pro komplementaci viru a aktivátor transkripce. Tyto funkce jsou integrovány do genomu buňky, což zabraňuje riziku rekombinace a zajišťuje buněčné linii vyšší stabilitu.
Vektory, které se rozmnožily v přítomnosti dostatečného množství tetracyklinu nebo jeho analogů, jsou získány, purifikovány a amplifikovány klasickými metodami molekulární biologie.
Podle jedné varianty využití je možné připravit in vitro, buď ligací, nebo ve formě plazmidu, DNA defektivního rekombinantního viru nesoucího přizpůsobené delece, jeden či několik virových genů pod kontrolou promotoru induktibilního tertracyklinem a jeden nebo několik terapeutických genů. Suprese jsou povšechně realizovány na DNA defektivního rekombinantního viru digescí za pomoci přizpůsobených, vhodných restrikčních enzymů, nebo ligací, podle metod molekulární biologie, jak dokreslují uvedené příklady. Virové nebo terapeutické geny a induktibilní promotor mohou být následně vloženy do této DNA štěpením enzymů, pak ligací a to na úrovni zvolených oblastí a ve zvolené orientaci. Takto získaná DNA nesoucí vhodné delece, jeden nebo několik virových genů pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem a jeden nebo několik terapeutických genů umožňuje generovat přímo nárokovaný rekombinantní adenovirus.
Také je možno připravit rekombinantní virus v následných etapách umožňujících postupnou introdukci heterologních genů a induktibilního promotoru. DNA prvního rekombinantního viru nesoucí vhodné delece (nebo jejich část) a induktibilní promotor, jako ku příkladu Op2/Tk, je získána ligací nebo ve formě plazmidu. Tato DNA je pak použita pro získání prvního rekombinantního viru nesoucího zmíněné delece s induktibilním promotorem. DNA tohoto prvního viru je pak izolována a kotransferována s druhým plazmidem nebo s DNA druhého defektivního rekombinantního viru nesoucí vhodné delece, zejména deleci v oblasti El, oblast umožňující homologní rekombinaci a případně terapeutický gen. Tato druhá etapa tedy generuje, podle vynálezu, rekombinantní virus.
Předkládaný vynález se týká rovněž jakékoliv farmaceutické kompozice obsahující jeden či několik rekombinantních adenovirů, jak je uvedeno výše. Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány za účelem podávání topickou, orální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární, transdermální cestou.
Farmaceutická kompozice obsahuje farmaceutická vehikula přijatelná pro injikovatelnou formulaci. Může se jednat zejména o solné roztoky (dihydrogenfosforečnan sodný , hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draslo, vápník nebo hořčík, atd., nebo směsi těchto solí), sterilní isotonické, nebo o suché kompozice, zejména lyofilisované, které přidáním sterilizované vody nebo fyziologického séra, umožňují vytvoření injikovatelných tekutin.
Dávky viru použitelné pro injikování mohou být upraveny podle různých parametrů, zejména v závislosti na aplikovaném způsobu podávání, patologii, genu, který má být exprimován nebo v závislosti na časové délce ošetřování. Všeobecně vzato, rekombinantní adenoviry podle vynálezu jsou formulovány a podávány ve formě dávek v rozsahu od 104 do 1014 pfu/ml, povětšinou od 106 do 1O10 pfu/ml. Termín pfu (plaque forming unit) odpovídá infekční schopnosti virového roztoku a je určen infekcí vhodné buněčné kultury a změřením, všeobecně po 5 dnech, počtu pláží infikovaných buněk. Metody určování koncentrace pfu virového roztoku jsou v odborné literatuře dobře zdokumentovány.
Adenoviry podle vynálezu mohou být použity pro ošetření nebo prevenci různých patologií. Obzvláště výhodné jsou pro ošetřování hyperproliferativních patologií (rakovina, restenóza, atd.) injikováním přímo do napadaného místa. Z tohoto hlediska se týká předkládaný vynález také metody ničení proliferativních buněk obsahující infikování zmíněných buněk nebo jejich části adenovirovým vektorem, jak je popsáno výše. V případě, že sebevražedný gen je genem předávajícím citlivost terapeutickému činidlu, metoda destrukce podle vynálezu zahrnuje následně ošetření buněk zmíněným terapeutickým činidlem. Pro využití této metody jsou předmětem vynálezu produkty obsahující rekombinantní adenovirus, ve kterém sebevražedný gen je gen, který předává citlivost terapeutickému činidlu a toto činidlo je pak, jakožto produkt kombinace, využito pro souběžné, oddělené nebo časově rozložené ošetření hyperproliferativních patologií. Sebevražedný gen je gen thymidin-kinázy a terapeutické činidlo je gancyklovir nebo acyclovir nebo jeho analog.
Rekombinantní vektory výhodné vlastnosti pro využití kombinují výrazné schopnosti přenášet geny.
Předkládaný vynález je následných příkladů a obrázků, podle v
vynálezu mají mimořádně genové terapii. Tyto vektory infikovat, zabezpečovat a uceleněji popsán pomocí které je třeba chápat jako ilustrativní a nikoliv limitativní.
Popis obrázků
Obrázek 1 : Genetická organizace adenoviru Ad5. Kompletní sekvence Ad5 je k dispozici v databázi a umožňuje odborníkovi selektovat nebo vytvořit jakékoliv místo restrikce a izolovat tak jakoukoliv oblast genomu.
Obrázek 2 : Genetická organizace oblasti E4
Obrázek 3 : Genetická organizace AAV.
Běžné metody molekulární biologie
Klasické metody běžně používané v molekulární biologii, jako přípravné extrakce plazdimické DNA, odstřeďování plazmidické DNA v gradientu chloridu cesia, elektroforéza na agarozovém nebo akrylamidovém gelu, čištění fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo
fenolchloroformem, precipitace DNA v solném prostředí etanolem nebo isopropylalkoholem, transformace na Escherichia coli, atd... jsou odborníkům dobře známé a dostatečně v odborné literatuře popsané (Maniatis T. et al. , Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel F.M. et al. (eds) ,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and
Sons, New York, 1987 ) .
Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy serie M13 jsou
komerčního původu (Bethesda Research Laboratories).
Pokud jde o ligace, fragmenty DNA mohou být odděleny podle své velikosti elektroforézou v agarozovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, vysráženy etanolem a pak inkubovány za přítomnosti DNA ligace fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.
Plnění proeminentních konců 5' může být provedeno fragmentem Klenow DNA polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podle upřesnění dodavatele. Zničení proeminentních konců 3' se uskuteční v přítomnosti DNA polymerázy fágu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Zničení proeminentních konců 5' se uskuteční ošetřením nukleázou Sl.
Mutagenéze řízená in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být uskutečněna metodou vyvinutou Taylorem et al. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764) za použití sady dodávané Amershamem. Enzymová amplifikace fragmentů DNA technikou nazývanou PCR (Polymérase-catalyzed Chain Reaktion, Saiki R.K. et al. , Science 23 0 (1985) 1350 1354, Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335 - 350) může být provedena za použití DNA thermal cycler (Perkin Elmer Cetus) podle upřesnění výrobce.
• ·
Ověření nukleotidových sekvencí může být uskutečněno metodou vyvinutou Sangerem et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 - 5467) za použití sady distribuované
Amershamem.
Použité buněčné linie
V následně uvedených příkladech mohou být použity tyto buněčné linie:
- lidská embryonální renální linie 293 (Graham et al. , J.
Gen. Virol. 36 (1977) 59). Tato linie obsahuje zejména levou část genomu lidského adenoviru Ad5 (12 %) integrovanou do svého genomu.
linie lidských buněk KB : tato linie, pocházející z lidského epidermálního karcinomu, je dosažitelná v ATCC (ref. CCL17), stejně jako podmínky umožňující její pěstování.
linie lidských buněk Hela : tato linie, pocházející z karcinomu lidského epitelu, je dosažitelná v ATCC (ref. CCL2), stejně jako podmínky umožňující její pěstování.
- linie psích buněk MDCK : podmínky pěstování buněk MDCK byly popsány Macatneyem et al., Science 44 (1988) 9.
- linie buněk gm DBP6 (Brough et al. , Virology 190 (1992)
624) . Tato linie je tvořena buňkami Hela nesoucími gen E2 adenoviru pod kontrolou sekvence LTR od MMTV.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce adenoviru nesoucího svoji oblast E4 pod kontrolou promotoru Op2-Tk • Λ
Konstrukce plazmidu pIC20H/Op2-Tk
Tento plazmid nese sekvenci minimálního promotoru Tk, kterému předcházejí dvě sekvence tetracyklinového operátoru. Tyto sekvence jsou rozeznány tetracyklinovým supresorem, je-li fixován tetracyklinem.
Za tím účelem jsou plazmid pIC20H (Marsh et al. , Gene 32 (1984) 481) digerovaný subjektem Clal-BamHI a sekvence SEQ ID č. 5 obsahující dva operátory tetracyklinu před minimálním promotorem thymidin-kinázy vloženy mezi tato dvě místa.
Konstrukce plazmidu pIC20H/lTR-Op2-Tk
Tento plazmid se získává digescí Clal plazmidu pIC20H/Op2-Tk a vložením fragmentu Hpa2 s obsahem ITR adenoviru Ad5 (koordináty : 1/+122).Tento fragment pochází z komerčního vektoru pSL1180 (Pharmacia) digerovaného enzymem Hind3, což je místo, do kterého je vložena ITR získaná reakcí PCR s místy enzymu Hind3 po obou stranách amplifikováného fragmentu. V následném pořadí se získá : ITR-0p2-TKprom.
Konstrukce plazmidu pIC20H/ITR-Op-2Tk-E4
Tento plazmid odpovídá plazmidu pIC20H/ITR-Op2-Tk digerovanému enzymem Hind3, což je místo, do kterého je vložen fragment Nhe-Xbal PY6 obsahující oblast E4 adenoviru 5. Plazmid pPYS se získává následovně:
Plazmid pPY2 se připraví z plazmidu pIC20H. Tento plazmid pPY2 odpovídá klonování fragmentu Avr2-Sall (asi 1.3 kb s obsahem promotoru subjektu MMTV) plazmidu pMSG (Pharmacia) mezi místy Xbal a Sall plazmidu pIC20H připraveného z kontextu E. coli dam+. Plazmid pPY4 je odvozen z plazmidu pPY2 delecí fragmentu o velikosti 35 pb po vyštípnutí subjektem BamHl a Bgl2 a následné religaci. Plazmid pPY5 odpovídá plazmidu pIC20H, ve kterém fragment Taql-Bgl2 obsahující oblast E4 adenovirů typu 5 umístěnou mezi polohami 35576 (Taql) a 32490 (Bgl2) byl klonován mezi místy Clal a BamHl. Oblast E4 plazmidu pPY5 je tedy vložena do fragmentu EcoRV-Sphl, který se klonuje po částečné digesci mezi místy Smál a Sphl plazmidu pPY4, v důsledku čehož se generuje plazmid pPY6.
Konstrukce plazmidu pIC20H/ITR-Op2-Tk-E4-L5
Tento plazmid se získá digesci plazmidu pIC20H/ITR-Op-2Tk-E4 enzymem Kpnl a Xbal a vložením fragmentu enzymu Kpnl - Xbal o velikosti 3,1 Kb adenovirů Ad5 (koordináty : 33595-30470) obsahujícího celou oblast 5.
Konstrukce plazmidu pYG4-EP
Plazmid pIC20H/ITR-Op2-Tk-E4-L5 je digerován enzymem Xbal a Nrul, aby se získal odpovídající fragment, který ponese v následujícím pořadí ITR, Op2, promotor Tk, E4 a L5. Tento fragment je vložen v místech Xbal a Nrul plazmidu pYG4, který obsahuje celou sekvenci adenovirů od místa Xbal až po místo Sphl. Tento plazmid pYG4-EP je vektor pIC20H, ve kterém je fragment Sphl-Xbal adenovirů Ad5 (koordináty : 25095 - 28590) vložen mezi místa Sphl a Xbal.
Tento vektor pYG4-EP, s delecí adenovirové oblasti E3, obsahuje dostatečné množství adenovirových sekvencí mezi Sphl a Xbal pro doplňkovou rekombinaci adenovirů za účelem produkce rekombinantního adenovirů.
• · · · · • · · · · · ·
9 9 9
9999999 9 9 9
Konstrukce rekombinantního adenovirů
Je realizována kotransfekcí buněk 293/TetR-VP16 připravených podle níže uvedeného příkladu 3 s plazmidem pYG4 linearizovaným digescí Sphl a s adenovirem RSV-pgal nebo s adenovirem nesoucím transgen, lineareizovaným digescí SrFl za přítomnosti či nepořítomnosti tetracyklinu. Dále se pak postupuje podle klasických metod virologie pro selekci a amplifikaci rekombinantního adenovirů.
Příklad 2
Konstrukce rekombinantního adenovirů nesoucího geny rep - cap adeno-přidruženého viru pod kontrolou promotoru Op2/Tk :
Konstrukce intermediárního plazmidu pXI2630
Tento intermediární plazmid umožňuje vložit místo EcoRI za Op2-Tk. Přítomnost místa restrikce v této poloze je významná ze dvou důvodů. Slouží k vložení tohoto promotoru před rep-cap po předcházejícím potlačení promotoru p5 a rovněž umožňuje vložit tento hybridní promotor před TetR-VP16 za účelem přípravy buněčné linie 293 transformované jak je popsáno v níže uvedeném příkladu 3.
Za tím účelem je plazmid pIC20H/Op2-Tk, získaný podle protokolu popsaného v příkladu 1, digerovaný subjektem BamHI, ošetřený DNA polymerázou odvozenou z T4 za účelem uvolnění konců, pak znovu digerovaný subjektem EcoRV a fragment pocházející z této digesce a nesoucí promotor Op2-Tk je pak vložen do místa EcorRV komerčního plazmidu pBSSK+. Orientace fragmentu je zvolena se zaměřením na přítomnost místa EcoRI za promotorem.
« · ··· ·
Vložení místa EcoRI na úrovni +1 transkripčního promotoru
Pro potlačení promotoru p5 se vkládá místo EcoRI na úrovni +1 transkripčního promotoru p5 před sekvenci kódující Rep78 metodou PCR na plazmidu pAV2 (Laughlin C., Gene (1983), 23, 69 - 73) . Tato rerakce byla realizována pomocí oligonukleotidů :
SEQ ID č. 6 (sek 5269)
GAATTCTTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCG 3
EcoRI
SEQ ID Č. 7 (sek 5039) 'CTCCATGTACCTGGCTGA 3
Takto generovaný plazmid byl vložen do pCRII (Invitrogen),aby se získal plazmid pMA4 . Nukleotidová sekvence tohoto fragmentu pak byla ověřena.
Konstrukce plazmidu pMA6 s vazbou Op2-Tk-rep-cap :
Tento intermediární plazmid umožňuje vazbu induktibilního promotoru s rep. Fragmenty Sáli-EcoRI odvozené z pXL2630 a fragmenty EcoRI-Nrul odvozené z pMA4 jsou vloženy do míst Xhol (slučitelné s Sáli) a Nrul subjektu pIC20R (Marsh et al., Gene 32 (1984) 841) za účelem získání plazmidu pMA6.
Konstrukce plazmidu pCOl (obr. 7 EX94008) obsahujícího levou část adenoviru Ad5 až po místo Hinfl (382), multimísto klonování a fragment Sau3A (3446)
Nrul (6316) adenoviru
Ad5 .
5-a/ Konstrukce plazmidu pCE
Fragment ECoRI-Xbal odpovídající levému konci genomu ·· ···· adenoviru Ad5 byl nejdříve klonován mezi místy EcoRI a Xbal vektoru pIC19H (Marsh et al. , Gene 32(1984) 481). Tím byl generován plazmid pCA. Tento plazmid pCA pak byl následně vyštípnut enzymem Hinfl,jeho proeminentní konce 5'byly naplněny fragmentem klenow odvozeným z DNA polymerázy I z E. coli, který pak byl vyštípnut subjektem EcoRI. Takto generovaný fragment plazmidu pCA, který obsahuje levý konec genomu adenoviru Ad5, byl následně klonován mezi místy EcoRII a Smál vektoru pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481). Tím byl generován plazmid pCB. Tento plazmid pCB byl pak následně vyštípnut subjektem EcoRII, jeho proeminentní konce 5' byly naplněny fragmentem klenow odvozeným z DNA poymerázy I z E. coli, aby pak byl následně vyštípnut subjektem BamHI. Takto generovaný fragment plazmidu pCB, který obsahuje levý konec genomu adenoviru Ad5, pak byl následně klonován mezi místy Nrul a BglII vektoru pIC20H. Tím je generován plazmid pCE, který se vyznačuje tím, že má 382 prvních párů bází adenoviru Ad5 následovaných multimístem klonování.
5-b/Konstrukce plazmidu pCD'
Fragment Sau3A (3346) - Sstl (3645) a fragment Ssrl (3645) - Bari (5519) genomu adenoviru Ad5 byly nejdříve podrobeny ligaci a klonování mezi místy Clal a BamHI vektoru pIC20H, čímž byl generován plazmid pPY53. Fragment Sall-Taql plazmidu pPY53 připraveného z kontextu dam- s částí genomu adenoviru Ad5 situovanou mezi místy Sau3A (3346) a Taql (5207) byl pak klonován mezi místy Sáli a Clal vektoru pIC20H, čímž byl generován plazmid pCA'. Fragment Taql (5207) - Narl (5519) genomu adenoviru Ad5 připraveného z kontextu dam- a fragment Sall-Taql plazmidu pCA'pak byly podrobeny procesu ligace a byly klonovány mezi místy Sáli a Narl vektoru pIC20H. Tím byl generován plazmid pCC . Fragment
Narl (5519) - Nrul (6316) genomu adenoviru Ad5 připraveného z kontextu dam- a fragment Sall-Narl plazmidu pCC^pak byly podrobeny procesu ligace a klonovány mezi místy Sáli a Nrul vektoru pIC20R. Tím byl generován plazmid pCD'.
5-c/ Konstrukce plazmidu pCOl
Částečná digesce enzymem Xhol a následná kompletní digesce subjektem Sáli plazmidu pCD^generuje fragment restrikce s obsahem sekvence adenoviru Ad5 z místa Sau3A (3446) do místa Nrul (6316) . Tento fragment byl klonován v místě Sáli plazmidu pCE. Tím byl generován plazmid pCOl.
Konstrukce plazmidu pMA7 a pMA8
Fragment EcoRV-SnaBI odvozený z MA6 s Op2-Tk-rep-cap-poly A+ z AAV (až po místo SnaBl polohu 4495 na sekvenci viru AAV) je vložen do místa EcoRI z pCOl v obou orientacích v poměru k ITR adenoviru. Takto získané plazmidy jsou označeny pMA7 (orientace kazety v inversním směru ITR adenoviru) a pMA8 (stejná orientace).
Konstrukce rekombinantního adenoviru nesoucího kazetu 0p2-Tk-rep-cap :
Tato část popisuje konstrukci detektivního rekombinantního adenoviru nesoucího kazetu 0p2-Tk-rep-cap-polyA+ adenoviru AAV. Tento adenovirus je získán kotransfekcí plazmidu pMA7 nebo pMA8 s deficientním adenovirovým vektorem v buňkách helper (linie 293) vkládajících do polohy trans funkce kódované oblastmi El (E1A a E1B) daného adenoviru. Adenoviry AdMA7 a AdMA8 byly připraveny homologní rekombinací in vivo mezi adenovirem AdRSVPgal a plazmidy pMA7 a pMA.8 podle následujícího ·· *··· protokolu : plazmid pMA7 nebo pMA8 linearizovaný subjektem Ndel a adenovirus AdRSVBgal linearizovaný subjektem Clal jsou kotransfektovány do linie 293 za přítomnosti fosforečnanu vápenatého za účelem rekombinace. Rekombinantní adenoviry takto generované jsou selektovány purifikací na desce. Po izolování je rekombinantní adenovirus amplifikován do buněčné linie 293, což vede k vytvoření supernatantu kultury s obsahem nepurifikovaného rekombinantního defektivního adenovirů, který má titr asi 1010 pfu/ml. Pro účely purifikace jsou virové částečky odstředěny na gradientu chloridu cesia běžně známou technikou (viz zejména Graham et al., Virology 52 (1973)456).
Adenovirus AdMA7 nebo AdMA8 je konservován při -80° C ve 20 % glycerolu.
Konstrukce rekombinantního adenovirů nesoucího Op2 / Tk rep-cap polyA+AAV v oblasti E3 :
Tato část popisuje konstrukci rekombinantního adenovirů eliminovaného delecí pro El nesoucího Op2/Tk rep-cap polyA+AAV v oblasti E3.
Plazmid pMA28 obsahuje celou sekvenci adenovirů Ad (E1-, E3-) nesoucího 0p2 / Tk rep-cap polyA+AAV v oblasti E3. Byl konstruován rekombinací v E. Coli vložením plazmidu pMA24 na příklad do kmene C2110 (pXL2638) (E1-, E3-) popsaného v přihlášce PCT/FR96/00215.
8.1 Konstrukce intermediárního plazmidu pMA22 :
Fragment Xbal- Xbal odvozený z plazmidu pMA7 nesoucího kazetu Op2 / Tk rep-cap polyA + AAV byl vložen do místa Xbal subjektu pYG4-EP místo oblasti E3 tak, že 0p2 / Tk rep-cap polyA + AAV je v opačné orientaci k orientaci oblasti E3.
- 37 Takto konstruovaný plazmid je označen pMA22.
8.2 Konstrukce plazmidu pMA24 užívaného pro rekombinaci v E. coli :
Fragment Nhel-Spel odvozený z plazmidu pMA22 nesoucího kazetu 0p2 / Tk rep-cap polyA + AAV lemovanou sekvencemi
27082 - 28593 a 3471 - 31509 adenoviru byl vložen do kompatibilního místa plazmidu pXL2756 za účelem generování plazmidu pMA24 nesoucího oblasti nezbytné pro rekombinaci zahrnující kazetu Op2 / Tk rep-cap polyA + AAV, gen sacB s B. subtilis a gen rezistence proti kanamycinu.
8.3 Konstrukce rekombinantního adenoviru s Op2 / Tk rep-cap polyA + AAV v oblasti E3 :
Konstrukce byla provedena rekombinaci v E. coli elektroporací plazmidu pMA24 do kmene C2110 (pXL2688) nebo C2110 (pXL2789) při volbě druhé operace rekombinace v prostředí LB, sukrózy, tetracyklinu. Tak se získá kmen C2110 nesoucí plazmid pMA28. Tento plazmid pak byl transfektován do buněk 293 po digesci subjektem PacI.
Příklad 3
Konstrukce linie produkující 293 Op2 - Tk - TetR-VP16 :
Tato část popisuje konstrukci linie 293 nesoucí ve svém genomu integrovanou kazetu hybridního transaktivátoru TetR-VP16 pod kontrolou promotoru Op2-Tk. Za tím účelem byl plazmid pMA2 konstruován pro vytvoření linie kotransfekcí plazmidu pMA2 s plazmidem pMSCV (Hawley et al. J.Exp.Med. (1993), vol76, 1149 - 1163) nesoucím gen rezistence proti ·· «··· neomycinu pod kontrolou promotoru PGK (fosfoglycérat-kináza). Plazmid pMA2 je konstruován tak, že se vloží fragment Sal-EcoRI se subjektem pXL2630 mezi kompatibilní místa Xhol-EcoRI plazmidu pUHD17.1. Ten obsahuje sekvence kódující mutovaný supresor tetracyklinu operačně vázaný na sekvenci VP16. Tento vektor je odvozen od vektoru pUHD15.1 (H. Bujard, P.N.A.S. U.S.A. 1992, 89, 55476 - 5551), který obsahuje sekvenci divokého tetracyklinového supresoru přidruženého 130 aminokyselinám terminálního konce C viru herpes simplex VP16. Fragment Xbal-Eco47III s 399 páry bází odpovídajících aminokyselinám 3 - 135 mutovaného supresoru tetracyklinu je zaměněn za odpovídající fragment omezení s UHD15.1 , aby se získal vektor pUHD17.1.
Linie 293 Op2-Tk-TetR-VP16 vynálezu byla konstruována kotransfekcí buněk zvolených v přítomnosti fosforečnanu vápenatého plazmidy pMA2 a pMSCV a konstrukcí kódující receptor s obsahem glukokortikoidů. Přesněji, buňky linie 293 ve schránkách o průměru 5 cm byly transfektovány prostřednictvím 1-5 ptg plazmidu pMA2.
Selekce klonů rezistentních vůči geneticinu
Po transfekci jsou buňky promyty, je přidáno prostředí kultury (MEM, Sigma) doplněné fetálním telecím sérem (7 %) a buňky jsou po dobu 20 hodin inkubovány. Příštího dne se buňky selektují v přítomnosti geneticinu G418 (Gibco-BRL, Life Technologies) v koncentraci 400 mg/1. Geneticin se mění každé tři dny a selektovatelné klony se objeví zhruba po 3 týdnech. Jakmile jsou všechny netransfetované buňky mrtvé, přežívají pouze buňky s vloženým genem odolnosti a ty se pak dělí kvůli generování buněčných klonů. Když jsou buněčné klony dostatečně velké, aby mohly být postřehnutelné pouhým okem, jsou individuálně transferovány do kulturových otvorů desky ··· · ·* · · • · • · • ·
·· «··· • · » · ··· otvorů. Každý klon je potom postupně amplifikován v přítomnosti geneticinu zprvu v otvorech kulturové desky 12 otvorů, pak 6 otvorů a pak je amplifikován v buněčných kulturových schránkách. Každý buněčný klon je tedy konservován zmrazením v kapalném dusíku.
Určitý počet klonů byl izolován, amplifikován a selektován se zaměřením na jejich schopnost exprimovat reportérový gen na příklad lacZ pod kontrolou promotéru Op2-Tk po přidání přiměřené koncentrace tetracyklinu. Použitým plazmidem je pMA9 vytvořený vložením fragmentu StuI-BamHI odvozeného z pRSVgalIX nesoucího sekvenci kódující β-galaktoidázu E.coli a signál jádrové lokalizace v plazmidu pMA2 předběžně linearizovaným prostřednictvím subjektu EcoRI, ošetřeným prostřednictvím DNA polymerázy bakteriofágu T4 za účelem uvolnění jeho konců a digesce prostřednictvím BamHI.
Z těchto klonů pak byly klony umožňující podmíněnou expresi rep-cap nesených adenovirem popsaným výše a umožňujícím produkci AAV se zvýšenými titry použity jakožto produkční linie.
• ·
SEZNAM SEKVENCÍ
INFORMACE O SEQ ID č. 1 :
Charakteristika sekvence :
(A) Délka : 61 párů bází
(B) Typ : nukleotid
(C) Počet vláken : jedno
(D) Konfigurace : lineární
Typ molekuly : cDNA
Popis sekvence : SEQ ID č. 1 :
GATCCGGTCG CTCGGTGTTC GAGGCCACGC
GTCACCTTAA TATGCGAAGT
GGACCTCGGA
INFORMACE O SEQ ID č. 2
Charakteristika sekvence :
(A)
Délka : 64 párů bází nukleotid (C)
Počet vláken : jedno (D)
Konfigurace : lineární
Typ molekuly : cDNA
Popis sekvence : SEQ ID č. 2
AGATCTGCGG TCCGAGGTCC ACTTCGCATA
TTAAGGTGAC
CGTGGCCTCG
ACACCGAGCG
ACCG
INFORMACE 0 SEQ ID č. 3 :
Charakteristika sekvence :
(A) Délka : 67 párů bází
(B) Typ : nukleotid
(C) Počet vláken : jedno
(D) Konfigurace : lineární
Typ molekuly : cDNA « · ··· · • · ·
Popis sekvence : SEQ ID č. 3
CGATACTTTT CTCTATCACT GATAGGGAGT
GGTCTCGAGA
CTTTTCTCTA
CACTGATAGG
GAGTGGT
INFORMACE O SEQ ID č. 4
Charakteristika sekvence :
(A)
Délka párů bází (B) nukleotid (C)
Počet vláken : jedno (D)
Konfigurace : lineární
Typ molekuly : cDNA
Popis sekvence : SEQ ID č. 4
CGCAGATCTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG
AGAAAAGTCT
CGAGACCACT
CCCTATCAGT
GATAGAGAAA AGTAT
INFORMACE O SEQ. ID č. 5
Charakteristika sekvence :
(A)
Délka : 141 párů bází (B) nukleotid (C)
Počet vláken : jedno (Konfigurace) : lineární
Typ molekuly :
cDNA
Popis sekvence SEQ
ID č.
ATCGATACTT
TTCTCTATCA
CTGATAGGGA
GTGGTCTCGA
GACTTTTCTC
TATCACTGAT
AGGGAGTGGT
AGATCTGCGG
TCCGAGGTCC
ACTTCGCATA
TTAAGGTGAC
GCGTGGCCTC
GAACACCGAG CGACCGGATC C
120
141
INFORMACE O SEQ ID č. 6 :
Charakteristika sekvence :
(A) Délka : 31 párů bází
(B) Typ : nukleotid
(C) Počet vláken : jedno
(D) Konfigurace : lineární
Typ molekuly : cDNA
Popis sekvence : SEQ ID č. 6 :
GAATTCTTTTCGAAGCGGGAG GTTTGAACGC G 31
INFORMACE O SEQ č. 7 :
Charakteristika sekvence :
(A) Délka : 18 párů bází (B) Typ : nukleotid (C) Počet vláken : jedno (D) Konfigurace : lineární
Typ molekuly : cDNA
Popis sekvence : SEQ ID č. 7 :
CTCCATGTAC CTGGCTGA 18
INFORMACE 0 SEQ. ID č. 8 :
Charakteristika sekvence :
(A) Délka : 206 aminokyselin (B) Typ : aminokyseliny (C) Počet vláken : jedno (D) Konfigurace : lineární
Typ molekuly : protein
Popis sekvence SEQ ID Č. 8 :
Met Ser Arg Leu Asp Lys Ser Lys Val Ile Asn Ser Ala Leu Glu Leu
1 5 10 1 5
Leu Asn Glu Val Gly Ile Glu Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gin
20 25 30
Leu Leu Gly Val Glu Gin Pro Thr Leu Tyr TrD His Val Lys Asn Lvs
40 * ' 45
Arg Ala 50 Leu Leu Asp Ala Leu 55 Ala
His 65 Phe Cys Pro Leu Lys 70 Gly Glu
Asn Ala Lys Ser Phe 85 Arg Cys Ala
Lys Val His Ser 100 Glu Thr Arg Pro
Glu Asn Gin 1 1 5 Leu Ala Phe Leu Cys 1 20
Ala Leu 1 30 Tyr Ala Leu Ser Ala 1 35 Val
Leu i 145 Glu Asp Gin Glu His 1 50 Gin. Val
i j Tnr Thr Asp Ser Met 1 65 Pro Pro Leu
Asp His Gin Gly 180 Ala Glu Pro Ala
Ile Cys Gly 195 Leu Glu Lys Gin Leu 200
43 - 4 • 4 • 4 • 4 4 4 4 4 4 • · 4 44 • » «4 • · • 4 4 • 4 4 4 4 • 4 · 4 4 4 444444 4 4 4 4 4 4 4« • 4 44« · • 4 4 4 4 4 ·
Ile Glu Met Leu 60 Asp Arg Hus Thr
Ser Trp Gin 75 Asp Phe Leu Arg As r 80
Leu Leu 90 Ser His Arg Asn Gly 95* Ala
Thr 105 Glu Lys Gin Tyr Glu Thr 1 10 Leu
Gin Gin cly Phe Ser 1 25 Leu Glu Asn
Gly His Phe Thr 1 40 Leu Giv Cys Val
Ala Lys Glu 1 55 Glu Arg Glu Thr Pro 1 60
Leu Arg 170 Gin Ala Ile Glu Leu 1 75 Phe
Phe 185 Leu Piis Gly Leu Glu Leu 1 90 Ile
Lys Cys Glu Ser Gly 205 Ser

Claims (67)

1. Rekombinantní adenovirus, ve kterém je exprese alespoň jednoho genu virového původu, homologního či heterologního, pod kontrolou induktibilního promotoru.
2. Rekombinantní adenovirus podle nároku 1 vyznačující se tím, že induktibilní promotor je zvolen z promotorů reagujících na těžké kovy, tepelné rázy, hormony nebo tetracyklin.
3. Adenovirus podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se jedná o promotor induktovatelný tetracyklinem nebo jeho analogy.
4. Adenovirus podle nároku 3, vyznačující se tím, že promotor indukovatelný tetracyklinem obsahuje minimální promotor sdružený operačně s regulační sekvencí obsahující alespoň operátor tetracyklinu.
5. Adenovirus podle nároku 4, v y z n a č u j í c í se tím, že regulační sekvence obsahuj e alespoň dva operátory tetracyklinu. 6 . Adenovirus podle nároku 4 nebo 5, v y z n a č u j í c í
se tím, že regulační sekvence je cele nebo částečně zobrazena sekvencí SEQ ID č. 3, SEQ ID č. 4 nebo jedním z jejich derivátů.
7. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že minimální promotor je odvozen z lidského CMV.
8. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 7, vyznačující se tím , že minimální promotor odpovídá oblasti situované mezi nukleotidy +75 až -53 nebo +75 až -31 promotoru odvozeného z lidského CMV.
9. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 4 až 6, vyznačující se tím , že promotorem je homologní nebo heterologní promotor virového genu mutovaný tak, aby nebyl schopen zajistit sám transkripci genu virového původu, který kontroluje.
10. Adenovirus podle nároku 9, tím, že minimální promotor v y je znač odvozen ící se homologního promotoru daného virového genu.
11. Adenovirus podle nároku 9, tím , že minimální promotor thymidin-kinázy viru Herpes Simplex.
v y je nač odvozen c í se promotoru
12. Adenovirus podle nároku 11, v c í se tím, že minimální promotor je částečně sekvencí
SEQ ID
č. 1 nebo reprezentován
SEQ ID č. 2 nebo jejich cele nebo deriváty.
13 .
Adenovirus podle znač umístěn u j í c í před virový gen j ednoho tím určený k nároků 4 až 12, v y , že minimální promotor je transkripci náhradou za jeho vlastní promotor.
14. Adenovirus podle jednoho z značující se tím nároků 4 až 13, v y že obsahuje kromě již zmíněného minimálního promotoru vlastní promotor daného virového genu, avšak v inaktivované nebo nefunkční formě.
φ· φφφφ
- 46
15. Adenovirus podle značující se umístěna před minimální j ednoho z tím , promotor.
nároků
4 až
14, že regulační sekvence y je
16. Adenovirus podle značující se umístěna za daný virový j ednoho tím nároků 4 až že regulační
14, v sekvence y je
17. Adenovirus podle nároku 16, tím, že regulační sekvence je daný virový gen.
vyznačuj přímo vázána či nikoli na
18. Adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že induktibilní promotor je reprezentován subjektem Op2/Tk.
19. Adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 6 nebo 9 až 18, vyznačující se tím , že induktibilní promotor je reprezentován cele nebo částečně sekvencí SEQ ID č. 5 nebo jedním z jejich derivátů.
20. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 19, vyznačující se tím , že obsahuje alespoň homologní gen, jehož exprese je pod kontrolou induktibilního promotoru.
21. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 20, vyznačující se tím , že obsahuje alespoň homologní gen, jehož exprese je pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem nebo jeho analogy.
22. Rekombinantní adenovirus podle nároků 20 nebo 21, vyznačující se tím, že se jedná o celek nebo • · část genomové oblasti daného adenoviru, podstatnou pro jeho replikaci a/nebo propagaci.
23 .
Rekombinantní adenovirus podle nároku 22 značující se tím , že oblast podstatná pro jeho replikaci a/nebo propagaci je zvolena z celku nebo části oblasti E4, E2 oblasti IVa2 a/nebo oblasti L5.
24. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23, vyznačující se tím, že oblast E2 je reprezentována fragmentem zvoleným z fragmentů odpovídající cDNA odvozené z 72K, cDNA polymerázy odvozené ze 14OK a cDNA preterminálního proteinu odvozené z 87 K.
25. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23, vyznačující se tím, že oblast E4 je reprezentována fragmentem Taql-Bgl2 odpovídajícím nukleotidům 35576 - 32490.
26. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23, vyznačující se tím, že oblast E4 je reprezentována alespoň fází kódující ORF6.
27. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23 nebo 25, vyznačující se tím , že oblast E4 je reprezentována fragmentem Bgl2 situovaným mezi polohami 34115 a 32490 se sekvencemi ORF6 a ORF7.
28. Rekombinantní adenovirus podle nároku 23, vyznačující se tím, že oblast kódující subjekt IVa2 je tvořena fragmentem zvoleným z fragmentů BglII-Nrul s nukleotidy 3328 až 6316, fragmentů Dral- NlalII odpovídajících nukleotidům 4029 až 5719 a fragmentů Dral-Xhol odpovídajících fragmentu 4029 až 5788 na sekvenci adenoviru • · · · · ·
Ad5 .
29. Rekombinantní adenovirus a 25 až 27, vyznačuj deleci celku nebo části genu podle jednoho z nároků 1 až 23 ící se tím, že nese El a má oblast E4, cele nebo částečně, pod kontrolou induktibilního promotoru Op2/Tk.
30. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 24, vyznačující se tím , že nese deleci celku nebo části genu El a má oblast E2, cele nebo částečně, pod kontrolou induktibilního promotoru Op2/Tk.
31. Rekombinantní adenoviry podle nároků 1 až 27 a 29, vyznačující se tím, že nesou deleci celku nebo části genů El a E2 a má oblast E4, cele nebo částečně, pod kontrolou induktibilního promotoru Op2/Tk.
32. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 27 a 30, vyznačující se tím, že nese deleci celku nebo části genů El a E4 a má oblast E2, cele nebo částečně, pod kontrolou induktibilního promotoru Op2/Tk.
33. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 20 až
32, vyznačující se tím , že oblast pod kontrolou promotoru Op2/Tk je zbavena svého vlastního promotoru.
34. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 20 až
33, vyznačující se tím, že obsahuje také sekvenci nukleových kyselin kódující jeden či více terapeutických genů.
35. Rekombinantní adenovirus podle nároku 34, vyzná • · · · · · čující se tím, že zmíněná sekvence nukleových kyselin je přítomna na úrovni oblastí El, E3 nebo E4 jako náhrada nebo doplněk sekvencí eliminovaných delecí.
36. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 19, vyznačující se tím , že obsahuje alespoň heterologní gen virového původu, jehož exprese je pod kontrolou induktibilního promotoru.
37. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 19 a 36, vyznačující se tím , že obsahuje alespoň heterologní gen virového původu, jehož exprese je pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem nebo jeho analogy.
38. Rekombinantní adenovirus podle nároku 36 nebo 37, vyznačující se tím, že gen je odvozen z genu genomu viru AAV nebo jeho funkčních homologů.
39. Rekombinantní adenovirus podle nároku 38, vyznačující se tím, že se jedná o gen představující enkapsidační funkce viru AAV.
40. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 36 až 39, vyznačující se tím , že obsahuje expresi genů rep a/nebo cap viru AAV nebo jeden z jeho homologů pod kontrolou induktibilního promotoru.
41. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 36 až
40, vyznačující se tím, že nese expresní kazetu Op2/Tk-rep-cap.
42. Rekombinantní adenovirus podle nároku 41, vyzná
50 čující se tím že promotor Op2/Tk nahrazuje původní promotor p5.
43. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 36 až 42, vyznačující se tím , že heterologní gen virového původu a induktibilní promotor jsou přítomny na úrovni oblasti El genomu zmíněného viru jako náhrada nebo doplněk sekvencí eliminovaných delecí.
44. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 43, vyznačující se tím, že obsahuje své ITR a sekvenci umožňující enkapsidaci.
45. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 44, vyznačující se tím , že je v něm alespoň oblast El nefunkční.
46. Rekombinantní adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 45, vyznačující se tím, že genom adenovirů je lidského, živočišného nebo kombinovaného původu.
47. Rekombinantní adenovirus čující se tím, že zvoleny z adenovirů skupiny C 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad5).
podle nároku 46, vyznáadenoviry lidského původu jsou a to výhodně z adenovirů typu
48. Rekombinantní adenovirus podle nároku 47, vyznačující se tím, že adenoviry živočišného původu jsou vybrány z adenovirů psího, bovinního, myšího, ovčího, prasečího, ptačího nebo opičího původu.
49. Použití rekombinantního adenovirů s obsahem alespoň genu původu AAV pod kontrolou promotoru indukovatelneho ·· • · ··· · ·· · tetracyklinem pro přípravu AAV.
Způsob přípravy AAV, vyznačuj ící tím, že zahrnuje v přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogů kotransfekci buněčné linie obsahující ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce s adenovirem obsahujícím alespoň gen původu AAV pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem a buď rekombinantní virus odvozený z AAV nebo enkapsidační plazmid nesoucí transgen mezi ITR daného AAV.
51. Způsob podle nároku 50, vyznačující se tím, že adenovirus obsahuje geny rep a kap pod kontrolou promotoru idukovatelného tetracyklinem.
52. Způsob podle nároku 50 nebo 51, vyznačuj ící se t í m , že produkce viru AAV je indukována přítomností dostatečného množství tetracyklinu nebo jeho analogů.
53. Způsob podle nároků 50 až 52, vyznačující se t í m , že transformovaná buněčná linie je odvozena z linie 293.
54. Způsob podle nároku 53, vyznačující se tím, že se jedná o buněčnou linii 293 obsahující ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce tvořeného prvním polypeptidem schopným se vázat za přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogu na regulační sekvenci induktibilního promotoru přítomného v adenoviru sdruženého s druhým polypeptidem aktivujícím transkripci.
55. Způsob podle nároku 54, vyznačující se tím, že první polypeptid je divoký supresor tetracyklinu ·· ···· mutovaný tak, aby mu předal schopnost vázat se na regulační sekvenci uvedeného induktibilního promotoru výlučně v přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogů.
56. Způsob podle nároku 55, vyznačující se tím, že mutací je zde delece, substituce a/nebo delece alespoň aminokyseliny sekvence kódující divoký supresor tertracyklinu.
57. Způsob podle nároku 55 nebo 56, vyznačuj ící se tím, že mutovaný supresor tetracyklinu je divoký supresor TnlO mutovaný alespoň v jednu ze svých aminokyselin lokalizovaných v polohách 71, 95, 101 nebo 102.
58. Způsob podle jednoho z nároků 54 až 57, vyznačující se tím , že se jedná o supresor tetracyklinu představený cele nebo částečně v sekcenci SEQ ID
č. 8 .
59. Způsob podle jednoho z nároků 54 až 58, vyznačující se tím, že druhý polypeptid obsahuje oblast aktivace transkripce proteinu
60 .
Způsob podle nároku 59, vyznačující tím, že se jedná o protein virion 16, VP16, subjektu HSV.
61. Způsob podle jednoho z nároků 50 až 60, vyznačující se tím , že expresní kazeta zmíněného aktivátoru transkripce obsahuje promotor indukovatelný tetracyklinem nebo jeho analogy.
62. Způsob podle jednoho z nároků 50 až 61, vyznačující se tím , že využívá buněčnou linii 2 93
4 4 4·4· integrující ve svém genomu expresní kazetu Op2/Tk-TetR-VP16.
63. Buněčná linie, vyznačující se tím, že se jedná o linii 293 integrující ve svém genomu expresní kazetu aktivátoru transkripce, jak je uvedeno v nárocích 54 až 60 .
64. Buněčná linie podle nároku 63, vyznačuj ící se tím, že integruje ve svém genomu expresní kazetu > Op2/Tk-TetR-VP16.
65. Použití buněčné linie podle nároku 63 nebo 64 pro produkci adenovirus nebo AAV.
66. Způsob produkce adenoviru podle jednoho z nároků 1 až
35, vyznačující se tím , že zahrnuje kotransfekci buněčné linie nesoucí v poloze trans funkce nezbytné pro doplnění adenoviru a aktivátor transkripce, jak je uvedeno v nárocích 54 až 60, první DNA obsahující levou část genomu zmíněného adenoviru s delecí v oblasti El a druhou DNA obsahující alespoň pravou část genomu zmíněného adenoviru s oblastí důležitou pro jeho replikaci pod kontrolou promotoru indukovatelného tetracyklinem a část společnou části první DNA v přítomnosti tetracyklinu nebo jeho analogů, kdy dochází k zpětnému nabytí adenovirů
produkovaných rekombinaci. 67. Způsob podle nároku 66, vyznačující se tím , že první nebo druhá DNA nese kromě jiného zainteresovanou heterologní sekvenci DNA.
68. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň rekombinantní adenoviru podle nároků 1 až 35.
69. Farmaceutická kompozice podle nároku 68, vyznačující se tím , že obsahuje farmaceuticky přijatelné vehikulum pro injikovatelnou formulaci.
70. Promotor indukovatelný tetracyklinem, vyznačující se tím, že se jedná o sekvenci Op2/Tk.
71. Promotor podle nároku 70, vyznačující se tím, že sekvence Op2/Tk je reprezentována cele nebo částečně sekvencí SEQ ID č. 5.
CZ19974130A 1995-06-23 1996-06-20 Rekombinantní adenoviry, jejich využití pro přípravu AAV, komplementární buněčná linie a farmaceutické kompozice, které je obsahují CZ295934B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9507570A FR2735789B1 (fr) 1995-06-23 1995-06-23 Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ413097A3 true CZ413097A3 (cs) 1998-03-18
CZ295934B6 CZ295934B6 (cs) 2005-12-14

Family

ID=9480335

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19974130A CZ295934B6 (cs) 1995-06-23 1996-06-20 Rekombinantní adenoviry, jejich využití pro přípravu AAV, komplementární buněčná linie a farmaceutické kompozice, které je obsahují

Country Status (16)

Country Link
US (3) US6420170B1 (cs)
EP (1) EP0833896A1 (cs)
JP (1) JP3821846B2 (cs)
KR (1) KR100514070B1 (cs)
AU (1) AU716508B2 (cs)
BR (1) BR9608965A (cs)
CA (1) CA2222270A1 (cs)
CZ (1) CZ295934B6 (cs)
FR (1) FR2735789B1 (cs)
HU (1) HU224679B1 (cs)
IL (2) IL122710A (cs)
MX (1) MX9709549A (cs)
NO (1) NO975953D0 (cs)
SK (1) SK174297A3 (cs)
WO (1) WO1997000947A1 (cs)
ZA (1) ZA965306B (cs)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2222140C (en) * 1995-06-15 2010-11-23 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US6783980B2 (en) 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US6265212B1 (en) 1995-06-15 2001-07-24 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
FR2737222B1 (fr) * 1995-07-24 1997-10-17 Transgene Sa Nouveaux vecteurs viraux et lignee pour la therapie genique
US5891718A (en) * 1996-03-27 1999-04-06 Vical Incorporated Tetracycline inducible/repressible systems
JP2001500015A (ja) * 1996-09-06 2001-01-09 トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ｔ７ポリメラーゼを利用する組換えアデノ随伴ウイルスの誘導可能な製造方法
EP0860445A1 (en) * 1997-02-18 1998-08-26 Hoechst Aktiengesellschaft New nucleotide sequences for the cell cycle regulated expression of structural genes
EP0859008A3 (en) * 1997-02-18 2000-04-05 Hoechst Aktiengesellschaft Nucleic acid construct for the cell cycle regulated expression of structural genes
US6696423B1 (en) 1997-08-29 2004-02-24 Biogen, Inc. Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta
US6670188B1 (en) 1998-04-24 2003-12-30 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
WO2000016799A1 (en) * 1998-09-23 2000-03-30 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of treating chronic pain
CA2347369A1 (en) * 1998-10-19 2000-04-27 Powderject Vaccines, Inc. Minimal promoters and uses thereof
CN1074459C (zh) * 1998-11-25 2001-11-07 马丁 重组腺病毒－胸苷激酶构建体及其获得方法和用途
EP1083230A1 (en) * 1999-09-10 2001-03-14 Academisch Medisch Centrum Amsterdam Viral replicons and viruses dependent on inducing agents
US7115391B1 (en) * 1999-10-01 2006-10-03 Genovo, Inc. Production of recombinant AAV using adenovirus comprising AAV rep/cap genes
GB0027088D0 (en) * 2000-11-06 2000-12-20 Glaxo Group Ltd DNA expression vectors
JP2004536572A (ja) * 2001-02-23 2004-12-09 セル・ジェネシス・インコーポレイテッド 新規ベクター構築物
KR100432953B1 (ko) * 2001-09-01 2004-05-28 김주항 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스
US7569217B2 (en) * 2001-09-24 2009-08-04 University Of Saskatchewan Porcine adenovirus E1 and E4 regions
CA2369985A1 (en) * 2002-01-18 2003-07-18 Duke University Generation of recombinant adeno-associated viral vectors by a complete adenovirus-mediated approach
KR100697245B1 (ko) * 2005-03-28 2007-03-21 한국생명공학연구원 중금속 유도성 프로모터와 이의 생물공학적 활용
WO2013052915A2 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genelux Corporation Method for detecting replication or colonization of a biological therapeutic
WO2013138522A2 (en) 2012-03-16 2013-09-19 Genelux Corporation Methods for assessing effectiveness and monitoring oncolytic virus treatment
WO2013158265A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Genelux Corporation Imaging methods for oncolytic virus therapy
US20140140959A1 (en) 2012-10-05 2014-05-22 Aladar A. Szalay Energy Absorbing-Based Diagnostic and Therapeutic Methods Employing Nucleic Acid Molecules Encoding Chromophore-Producing Enzymes
WO2015103438A2 (en) 2014-01-02 2015-07-09 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
ES2753391T3 (es) 2014-10-14 2020-04-08 Halozyme Inc Composiciones de adenosina desaminasa 2 (ADA2), variantes de la misma y métodos de uso de las mismas
CN110088126A (zh) 2016-04-15 2019-08-02 高山免疫科学股份有限公司 Icos配体变体免疫调节蛋白及其用途
CA3019202A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3491013A1 (en) 2016-07-28 2019-06-05 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3515504B1 (en) 2016-09-20 2023-07-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Canine adenovirus vectors
EP3515481A1 (en) 2016-09-20 2019-07-31 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH New ehv insertion site orf70
CN109790550B (zh) 2016-09-20 2024-02-09 勃林格殷格翰动物保健有限公司 新颖的启动子
BR112019005415A2 (pt) 2016-09-20 2019-10-22 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh nova vacina contra influenza suína
KR20190099194A (ko) 2016-10-20 2019-08-26 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 분비가능한 변이체 면역조절 단백질 및 조작된 세포 치료
WO2018148462A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and compositions and methods thereof
US11732022B2 (en) 2017-03-16 2023-08-22 Alpine Immune Sciences, Inc. PD-L2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
PT3596116T (pt) 2017-03-16 2023-12-04 Alpine Immune Sciences Inc Proteínas imunomoduladoras de pd-l1 variante e suas utilizações
BR112019018747A2 (pt) 2017-03-16 2020-05-05 Alpine Immune Sciences Inc proteínas imunomoduladoras variantes de cd80 e usos das mesmas
CN111712515A (zh) 2017-10-18 2020-09-25 高山免疫科学股份有限公司 变体icos配体免疫调节蛋白及相关组合物和方法
EP3801584B1 (en) 2018-06-04 2023-09-27 Calidi Biotherapeutics, Inc. Cell-based vehicles for potentiation of viral therapy
US11505782B2 (en) 2018-06-04 2022-11-22 Calidi Biotherapeutics, Inc. Cell-based vehicles for potentiation of viral therapy
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11242528B2 (en) 2018-08-28 2022-02-08 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
EP3876951A1 (en) 2018-11-06 2021-09-15 Calidi Biotherapeutics, Inc. Enhanced systems for cell-mediated oncolytic viral therapy
CN113891934A (zh) 2018-11-21 2022-01-04 因达普塔治疗公司 扩增天然杀伤（nk）细胞子集的方法以及相关组合物和方法
AU2019389151A1 (en) 2018-11-30 2021-06-10 Alpine Immune Sciences, Inc. CD86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2020176809A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
US12024709B2 (en) 2019-02-27 2024-07-02 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
JP2023523429A (ja) 2020-04-22 2023-06-05 インダプタ セラピューティクス インコーポレイテッド ナチュラルキラー（ｎｋ）細胞組成物およびそれを生成させるための方法
WO2021242664A1 (en) * 2020-05-26 2021-12-02 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Recombinant p5 promoter for use in reducing dna contamination of aav preparations
WO2022147480A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Ansun Biopharma, Inc. Oncolytic virus encoding sialidase and multispecific immune cell engager

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU680459B2 (en) * 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
US5814618A (en) * 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5866755A (en) * 1993-06-14 1999-02-02 Basf Aktiengellschaft Animals transgenic for a tetracycline-regulated transcriptional inhibitor
PT667912E (pt) * 1993-07-13 2008-10-15 Centelion Vectores adenovirais deficientes e utilização em terapia génica
FR2707664B1 (fr) * 1993-07-13 1995-09-29 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
US6686200B1 (en) * 1993-08-31 2004-02-03 Uab Research Foundation Methods and compositions for the large scale production of recombinant adeno-associated virus
US5698443A (en) * 1995-06-27 1997-12-16 Calydon, Inc. Tissue specific viral vectors
FR2716682B1 (fr) * 1994-01-28 1996-04-26 Centre Nat Rech Scient Procédé de préparation de virus adéno-associés (AAV) recombinants et utilisations.
FR2716893B1 (fr) * 1994-03-03 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants, leur préparation et leur utilisation thérapeutique.
US5639661A (en) * 1994-03-23 1997-06-17 The University Of Iowa Research Foundation Genes and proteins for treating cystic fibrosis
US5756283A (en) * 1995-06-05 1998-05-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy
AU5253998A (en) * 1996-11-13 1998-06-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Diminishing viral gene expression by promoter replacement

Also Published As

Publication number Publication date
FR2735789A1 (fr) 1996-12-27
SK174297A3 (en) 1998-09-09
AU716508B2 (en) 2000-02-24
BR9608965A (pt) 1999-06-29
CZ295934B6 (cs) 2005-12-14
KR100514070B1 (ko) 2005-12-21
ZA965306B (en) 1997-01-24
HUP9900050A3 (en) 2001-08-28
US20030039634A1 (en) 2003-02-27
CA2222270A1 (fr) 1997-01-09
KR19990028307A (ko) 1999-04-15
NO975953L (no) 1997-12-18
WO1997000947A1 (fr) 1997-01-09
FR2735789B1 (fr) 1997-07-25
JPH11507835A (ja) 1999-07-13
AU6363996A (en) 1997-01-22
IL122710A0 (en) 1998-08-16
HUP9900050A1 (hu) 1999-04-28
NO975953D0 (no) 1997-12-18
US20020098165A1 (en) 2002-07-25
HU224679B1 (hu) 2005-12-28
US7033826B2 (en) 2006-04-25
JP3821846B2 (ja) 2006-09-13
IL122710A (en) 2006-10-05
EP0833896A1 (fr) 1998-04-08
MX9709549A (es) 1998-03-31
US6420170B1 (en) 2002-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ413097A3 (cs) Rekombinantní adenoviry, jejich využití pro přípravu AAV, komplementární buněčná linie a farmaceutické kompozice, které je obsahují
ES2310924T3 (es) Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica.
US5789390A (en) Method for preparing recombinant adeno-associated viruses (AAV), and uses thereof
EP1226264B1 (en) Cell lines and constructs useful in production of e1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
SK99097A3 (en) Cells for the production of recombinant adenoviruses
KR20120139672A (ko) 원숭이 아데노바이러스 벡터의 증식 방법
US6200798B1 (en) Defective recombinant adenoviruses with inactivated IVa2 gene
MXPA97001766A (en) Defective recombinant adenovirus with a vat iva2 inactiv
EP1291434A2 (en) Efficient generation of adenovirus-based libraries by positive selection of adenoviral recombinants through ectopic expression of the adenovirus protease
EP1045919A1 (en) Novel promoter elements for persistent gene expression
Morsy et al. Helper-dependent adenoviral vectors as gene delivery vehicles

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20070620