CZ40998A3 - Použití antagonisty anb5 pro výrobu prostředků, schopných inhibovat angiogenezi v tkáních - Google Patents

Použití antagonisty anb5 pro výrobu prostředků, schopných inhibovat angiogenezi v tkáních Download PDF

Info

Publication number
CZ40998A3
CZ40998A3 CZ98409A CZ40998A CZ40998A3 CZ 40998 A3 CZ40998 A3 CZ 40998A3 CZ 98409 A CZ98409 A CZ 98409A CZ 40998 A CZ40998 A CZ 40998A CZ 40998 A3 CZ40998 A3 CZ 40998A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
angiogenesis
antagonist
peptide
tissue
compound
Prior art date
Application number
CZ98409A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Brooks
David A. Cheresh
Martin Friedlander
Original Assignee
The Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Scripps Research Institute filed Critical The Scripps Research Institute
Publication of CZ40998A3 publication Critical patent/CZ40998A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/03—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C311/06—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to acyclic carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by carboxyl groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/421—1,3-Oxazoles, e.g. pemoline, trimethadione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C279/04—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
    • C07C279/08—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being further substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/10—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of a saturated carbon skeleton containing rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings
    • C07D263/08—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D263/16—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D263/18—Oxygen atoms
    • C07D263/20—Oxygen atoms attached in position 2
    • C07D263/24—Oxygen atoms attached in position 2 with hydrocarbon radicals, substituted by oxygen atoms, attached to other ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2602/00—Systems containing two condensed rings
    • C07C2602/36—Systems containing two condensed rings the rings having more than two atoms in common
    • C07C2602/42—Systems containing two condensed rings the rings having more than two atoms in common the bicyclo ring system containing seven carbon atoms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Použití antdgonisty anbi, pro výrobu prostředků,
ÍJC5— inhibovat angiogenesi v tkáních.
Oblast techniky
Vynález se obecně týká medicíny a přesněji způsobů inhibice a přípravků pro inhibici ανβί zprostředkované angiogeneze tkání s využitím antagonistíi vitroncctinového receptoru av[k Tento vynález byl učiněn Národním Institutem Zdraví a Národním Institutem Rakoviny s podporou vlády podle smlouvy č CA45726 a CA50286 Vláda má v tomto vynálezu určitá práva
12fisayadnj_st a v techniky
Integriny jsou skupinou extracelnlárních receptorů, známých tím, že váží extracelulární matricové proteiny a tím zprostředkovávají interakce buňka-buňka a buňka-extracelulární matrice, o nichž se obecně mluví jako o případech buněčné adhczc. Ačkoliv jsou v literatuře popsány mnohé integriny a jejich odpovídající ligandy, biologické funkce mnoha integrmů zůstávají nejasné. Integrinové receplory tvoří rodinu proteinů se společnými strukturními charakteristikami vitroncctmovéni receptoru, nazvaném podle jeho originálního charakteristického přednostního vázáni k viretroncctmu, je v současnosti známo, že má vztah ke třem různým integrinůni označovaným jako σ.νβι, o.jh a ogjk llorton, Int. .1. Exp PathoL 71. 741-750 (1990)
σ.νβι váže fibionectin a vitionectin ανβ, váže velké množství ligandů včetně fibrinu, íibrniogenu, lamiiunu, thrombospondinu, vitronectinu, von Willcbrandova faktoru, osteosponiinu a kostního sialoproteinu I σ.ν(Τ váže vitroncctin. Specifické role, které v buněčné adhezi hraji tylo tíi integriny v mnoha ccluiárnich interakcích ve tkaních, jsou stale předmětem výzkumu Je však zřejmé, že jsou lo tři rozdílné integriny s rozdílnými biologickými funkcemi a že různé integriny a subjednotky mají společné biologické specifity
Důležitým rozpoznávacím místem pro mnohé integriny v ligandu je tripejitidová sekvence arginin-glycin-asparlaniová kyselina (RGD). RGD se nachází ve všech ligandcch identifikovaných výše jako hgandy integrmů s vitroncctinovýin rcccptorem. foto RGD rozpoznávací místo může být napodobeno polypeptidy („peptidy'1). které obsahují RGD sekvenci a tylo RGD peptidy jsou známými inhibitory integrinových funkcí. Je však důležité poznamenat, že v závislosti na sekvenci a struktuře RGD peptidu, specifita inhibice může být pozměněna tak, aby jejich cílem byly určité integriny.
Diskusi RGD rozpoznávacích míst viz. Pierschbacher et al., Nátuře, 309: 30-33 (1984), Pierschbacher et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (JSA, 81: 5985-5988 (1984). Různé RGD polypeptidy s rozdílnou integrinovou specifitou byly také popsány v Grant et al., Cell, 58: 933-943 (1989), Cheresh et al., Cell, 58: 945-953 (1989), Aumailley et al., FEBS Letíš., 291 50-54 (1991), Pfaff et al.,./. /W. Chem., 269: 20233-20238 (1994), US Patent No; 4,517,686, 4,578,079, 4,589,881, 4,614,517, 4,661,111, 4,792,525, 4,683,291, 4,879,237, 4,988,621, 5,041,380 a 5,061,693.
Angiogeneze, o které sc někdy také mluví jako o neurovaskularizaci, je proces tkáňové vaskularizace, který zahrnuje růst nově se vyvíjejících krevních cév do tkáně. Proces je zprostředkován infiltraci buněk endolheha a buněk hladkého svalstva Má se za to, že k procesu dochází jednou ze tri cest: 1) Cesty mohou pučet z již existujících krevních cest; 2) Vývoj nových cest „de novo“ z buněk prekurzoru (vaskulogeneze); 3) Již existující malé krevní cesty mohou zvětšit svůj průměr Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032: 89-118 (1990). Jc známo, že buňky vaskulárního endothelia obsahuji nejméně pět RGD-závislých mtegrinů, včetně vitronektmového receptoru (ανβ3 nebo ανβί), receptory kolagenu typ 1 a Π (αφι), lamininový reccptor (α,β,), fibronectin/laminin/kolagenový reccptor (α?βι) a fibronektinový receptor (αφι). Davis et al., J. Cell. Biochem., 51: 206-218 (1993). O buňkách hladkého svalstva je známo, že obsahují nejméně šest RGD-závislých mtegrinů, včetně α.φι, ανβι a ανβγ
Angiogeneze je důležitým procesem v neonatálním růstu, ovsem je také důležitá při hojení ran a v pathogenezi celé rady klinicky důležitých nemocí, včetně popálenin tkáni, arthritidy, psonázy, rakoviny, diabetické retinopatie, makulární degenerace a dalších neurovaskulárních nemoci. O těchto klinických projevech spojených s angiogenezí se hovoří jako o angiogenických nemocích. Folkman et al., Science, 235: 442-447 (1987). Angiogeneze obecně není přítomna v dospělých nebo zralých tkáních, ačkoliv se vyskytuje při léčení ran a v růstovém cyklu žlutého tělíska. Viz. např. Moses et al., Sdence, 248: 1408-1410 (1990).
Inhibice buněčné adheze in vitro, s využitím monoklonálních protilátek imunospecifických pro různé integriny a nebo β subjednotek, zahrnuje vitronektinový receptor α.νβ3 v buněčné adhesi mnoha buněčných typů, včetně rnikrovaskulárních buněk endothelia. Davis et al., J. Cell. Biol., 51: 206-218 (1993) Kromě toho Nicosia et al., Am. J. Pathol., 138: 829-833 (1991) popsal • v • · · · · · • ·
-Γ použiti RGD peptidu, GRGDS, k in vňro inhibici vzniku „mikrocév“ z krysí aorty kultivované v kolagenovém gelu.
In vftro inhibice vzniku „mikrocév“ v kultuře kolagenového gelu ovšem není modelem pro inhibici angiogeneze v tkáních, protože není dokázáno, že struktury mikrocév jsou ty samé jako kapilární cesty nebo že vznik mikrocév v kolagenové kultuře je stejný jako neurovaskulární prorůstání do neporušené tkáně, jako třeba artritické tkáně, nádorové tkáně nebo nemocné tkáně, kde je inhibice angiogeneze žádoucí.
Role (Xv|k v angiogenezi byla nedávno potvrzena Viz. Brooks et al., Science, 264: 569571 (1994) Bylo dokázáno, že integnn je expnmován v krevních cestách lidské tkáně v poraněních, ovsem ne v normální tkáni. Monoklonálni protilátky proti ajl·, receptoru mhibují angiogenezi vyvolanou růstovými faktoiy (cytokiny), základním fibroblastickým růstovým faktorem (bFGF) a faktorem a nádorové nekrózy (THF-α), stejně jako fragmenty mclanomu.
□všem antagonisté pouze mhibují nové a nikoliv již existující cesty. Kromě toho bylo dokázáno, že určité lineární a cyklické peptidy obsahující RGD, také mhibují neovaskuiarizaci
Bylo navrženo, že inhibice angiogeneze by byla užitečnou terapií pro omezení nádorového růstu Inhibice angiogeneze byla navržena pomoci (1) inhibice uvolňování „angiogemckých molekul“ jako jsou bFGF (záklaldní fibroblastický růstový faktor), (2) neutralizací angiogenických molekul, jako třeba využitím anti-bFGF protilátek, (3) inhibici odezvy buněk endothelia na angiogenické stimuly. Tato (třetí) strategie získala pozornost a Folkman et al., Cancer Biology], 3: 89-96 (1992) popsal několik inhibitorů odezvy buněk endothelia, inhibitorů základní fluktuace membrán, angiostatických steroidů, inhibitorů angiogeneze odvozených od hub, destičkový faktor 4, thrombospondin, léky na arthritidu jako třeba D-pemcilamin a thiomalát zlalitý, analoga vitaminu D3, alfa-interferon a další, které mohou být použity jako inhibitory angiogeneze. Další navržené inhibitory angiogeneze viz Blood et al., fíioch. Biophy.s. Acta., 1032 89-118 (1990),
Moses et al., Science, 248: 1408-1410 (1990), Ingber et al., Lob Invert., 59. 44-51 (1988) a US
Patenty 5,092,885, 5,112,946, 5,192,744 a 5,202,352.
Role integrinu oups v angiogenezi ovšem až dosud nebyla identifikována a am žádný z inhibitorů angiogeneze, popsaných v předešlých referencích, nebyl směřován na ανβ5. Kromě toho ani žádné jiné reference nezahrnuji roli ανβί integrinu v neurovaskularizaci, zvláště pak v té, vyvolané růstovými faktory, růstovým faktorem vaskulárního endothelia (VEGF), transformačním růstovým faktorem-α (TGF-a) a epidermálním růstovým faktorem (EGF).
««*·«* · · · ♦ · · * • · · · · · ♦ · · · *«····· · · · · _ L ···«·« «··· · ♦·· ♦ · ' ‘ »«««··· * · · ·« · ♦ ·· · ·· · ·
Ačkoliv množství růstových faktorů, zahrnutých do řízení angiogeneze, je limitováno, existuji různé úrovně kontroly procesu konverze klidového stavu do stavu neurovaskulárního. Viz. D’Amore, Investigative Ophthal. Visual Sci., 35: 3974-3979 (1994). Zatímco některé růstové faktory, zúčastněné na angiogenezi, jsou regulovány na úrovni syntézy, další jsou regulovány ve stavu aktivace. K těmto buněčným pochodům dochází když cévy v klidovém stavu podléhají neurovaskulanzaci následkem poraněni nebo iscbémie.
Má se za to, že obzvláště VEGF je hlavním mediátorem angiogeneze v primárních nádorech a v ischemických nemocích. Přehled viz. Folkman, Nátuře Mediáne, 1: 27-31 (1995). VEGF je homodimer o hmotnosti 46 kilodalton (kDa), který je specificky angiogenický pro buňky endothelia (Ferrara et af, Endocrin. Rev., 13: 18-32 (1992)) a je vasopermeabilnim faktorem (Senger el al., Cancer Res., 46: 5629-5632 (1986)), který se váže na vysoce afinitni receptory s tyrosmkinázovou aktivitou vázané v membráně (Jakeman et al., J. Clin. /nvesí., 89’ 244-253 (1992)).
V současné době bylo prokázáno, že aktivace tyrosinkmázových receptoru zvyšuje migraci mtegrin-závislých buněk v v extracelulárnich matricových proteinech. Obzvláště Klemke et al, J. Cell. Biol., 127: 859-866 (1994) zahrnul EGF receptor (EGFR.) tyrosinkinázy do zvýšeni buněčné molility ovšem ne již do adheze FG buněk lidského pankreatického karcinomu na vitronectin s wužitím (Ύ.,βί inteprinu Aiilon nndah nrímé důkazv o tnin že. ohsazení EGFR s EGF lipandem g - - -J · - ..... - -------- - f f....... , ............................ — vyvolává tyrosinkinázovou aktivaci EGFR, což nakonec stimuluje reakční cestu závislou na protcinkináze C (PKC), vedoucí k vyvoláni migrace ajK-závislých buněk vitroncctinového substrátu, na němž nejsou za normálních podmínek buňky schopné migrovat Klemke et al tak poskytli důkazy pro korelaci přítomnosti cytokinů, zvláště EGF, s integrinovou aktivitou při buněčné migraci. Bylo ukázáno, že aktivace PKC je zapojena do regulace angiogeneze v modelovém systému kuřecí chorioalantoické membrány Viz Tsopanoglou et al., J. Vose. Res., 30’ 202-208 (1993) Autoři identifikovali specifické aktivátory a inhibitory PKC, které stimulují popr. inhibují angiogenezi v modelovém systému
Ani Klemke et al ani Tsopanoglou et al. ovšem nepopsali roli cytokinů a exprese popř. aktivace integrinu pro zvýšení angiogeneze za různých podmínek a stavů nemoci, ani jejich mhibici pomoci av[K-specifických antagonistů
Nedávné experimenty na opičím modelu „eye disease“ prokázaly, že retinálni ischémie vyvolaná okluzí retináiních žil vede k rychlému růstu VEGF ve vodních komorách oka tento nárůst se časově kryje s neurovakularizací duhovky, která byla pozorována, viz. Miller et al., Am.
• i » · · · • ·
I • · ·· • « · · · · · • · · · ♦ « • « · • · « β
J. Path., 145: 574-584 (1994), Další data z myšího modelového systému proliferativní retinopathie, ve které byla vyvolána hypoxie, ukázala, že informační RNA VEGF se zvýšila během 6-12 h relativní hypoxie a zůstala zvýšena dokud se nevyvinula neurovaskularizace. Následkem úbytku nových krevních cest docházelo k VEGF expresi jak bylo popsáno Pierce et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 92: 905-909 (1995).
NejnovějŠi data, tak jak bylo demonstrováno na zvířecích modelech íschémie, korelují s indukcí VEGF u těch ischémií, které jsou následovány neurovaskularizací. VEGF stejně jako další růstové faktory byly také popsány v dalších podmínkách a stavech nemocí, které zahrnují neurovaskularizací, viz. souhrn Folkman, Nátuře Medicine, 1:27-31 (1995).
Folkman et al také shrnuje současné klinické přístupy používané ke kontrole nechtěných angiogenezí. Pacienti při klinických pokusech dostali terapeutickou léčbu s angiogenickými inhibitory, včetně destičkového faktoru 4, derivátu fumagilinu, karboxyaminotriazolu a pod Žádná ze současných terapeutických referencí ovšem nekoreluje expresi avps s angiogenezí, obzvláště s těmi, které jsou vyvolány VEGF. Až do tohoto vynálezu tedy nikdo nepopsal ani nevyužil terapeutický postup s ανβ5 antagonisty pro kontrolu angiogeneze ve tkáni podléhající angiogenezí, související s přítomností a aktivací ανβ$.
Přihlašovatelé si tedy nejsou vědomi žádné jiné studie ανβ< a vztahu roštových faktorii
I· 1 r i-w-1 X + A n ^«nrn-ιλ ττ+z-k r-t rt t <1 I' »5 ΛΊ »A <4 í r~\ Λ»νΐ /4Λ L· 'Ί TI 1 TO ř
K AJUJIJC LC^ μνψΛίΙΙΙί/ V lAJllJLV pdlVJJLU, divjliv icm JIWVUJ v uunacu, r.v uy angiogcnze mohla být inhibována ve tkáních s využitím inhibitorů buněčné adheze zprostředkovávané s pomocí ανβν Obzvláště pak nebylo nikdy předtím prokázáno, že funkce ανβ5 je vyžadována pro angiogenezí ve tkáních nebo že antagomsté α.νβ·ί mohou inhibovat angiogenzi vc tkáních, zvláště v očních neurovaskulárních chorobách.
Podstata vynálezu
Předložený vynález demonstruje, že kromě reakční cesty vyžadující α„β3 pro angiogenezí tkání, existuje také nová odlišná cesta závislá na ανβ; Vynález tedy popisuje inhibitory ανβ5, které mohou inhibovat angiogenezí. Vynález dále popisuje fakt, že a^-mediovaná aktivita v propagaci angiogeneze souvisí s růstovým faktorem (cytokinem) vyvolanou aktivaci receptoro růstového faktoru tyrosinkinázy a proteinkinázy C (PKC) Růstové faktory (cytokiny), které fungují tímto způsobem, zahrnují růstový faktor vaskulárního endotelu (VEGF), transformující roštový faktor a (TGF-a), epidermální růstový faktor (EGF) a pod
PodsLata vynálezu
Vynález popisuje použití antagonistů anb& , které mohou inhibovat angiogenoz i .
Vyná1ez dále popisuje fakt, že ante med i ováná akt i v i ta v propagaci ang i ogeneze soliv i s í růstovým f aktorem (cytok i nem) vyvo1anou akt i vac í receptorů růstového f aktoru tyrosinkinázy a proteink i názy ( PKC)
Růstové faktory (cytokiny), které funguj í tímto púsobem, zahrnuj i růstový fak Lor vaskulárního endotel u (VEGF). transformující růstový f akLor a (TGF a), cpidermálni růsLový faktor1 (EGF) apod.
která má být léčena, muže být libovolná tkáň, u požadována i nhibice angiogeneze, jako třeba u nemocné tkáně probí ha j ící neurovaskularizací.
Příklady tkání zahrnuj očn í tkáň podléhající neurovasku1 ar izaci popalenou tkáň, pevné nádory, metastázy, tkáň podléhající re st j noze a podo b né tkáně.
V preferovaném provedení vynálezu neurovasku1 ar izacc spoj ená expresí anb*> je výsledkem cxpoz růstovým faktorům. VEGF,
TGF a a EGF.
preferováno pouz zamořené na inhibicí
VEGF indukované vaskulari zace
V F· ti k .Ú ΙΊ 1 arig iogeneze ruzvi nula v nemoc, včetně diabetické retinopalhic (zvané také prolifcralivní diabetická re t nopat hi u tkání se stařeckou makulární degonei u přcdpuk 1 ádune ιη.ίί i itrlinopalhie a neurovasku 1 árn í ho glauk»>mu.
provedení vynálezu je použití zaměřeno na ínhibici angi uyL íl t:
liách, dc>«;hás í v korneálních nourovasku 1 árn í · h pot uc ke k t e r
které zahrnuj i transpl ant.ace roliuvky , I n? i pc-1 i <;k u í\ v?
1 L i 1 á 1;či at i 11 da , pter/g i um. 7u.c,-_ i 1 á i ní re .
o }»<, u. 2. 1 V á Γ i i m kontaktních <_uu . i i ! <_f Cj L_J £ j i S L <-.i
j t í j e s' •hopen váz-it a(1bs i 1- .ΤΓ1 i ; I u inhi bovat
anbtj v a a t se na přírodní v i l.. . o iek L i i lovy 1 i gand. P
učí ‘jun I o ta vykizuje specií itu pro a n tu., oproti
. i. L i.· g i . 1 i Ůlíl * u L o v 1 ..*s t e ρ r c.· í e r uvuném pr oveden í vynálezu
aJu iista vázání ví t r· ’nek t i .u : I i Cb o j i noho
ovsem
1 Jdk
i.
; · Ily pro _>< - hopnou t ředrwbtně . t. atrii m inhi bu j οΙ i gandu ýznamně inhi buje vázáni
9 ·
9 9
9 9 9 • 9 · « « «4
příprav • ·« • 99
9·
99
9*♦· • 9«
9 9· • 9 9 9 9* • 99
999 ^popisuje metody inhibice angsogeneze~vlEániíEh/ obsahující množství avp5 antagonisty inhíbující angiogenezL·
Tk^ní, která má být léčena, může být libovolňá-fíkáp tfoíž .je^jíóijádována ínhjbice angiogenezcýjako třeba u nemocné tkáně š probíhající^neurovaskulanzácí. Poklady tkání žahl buj i oční tkáň podléhající neurovasíčulárizáci/ppiíalenou tkáň évné nádory, metastázy, k pobTéltaHCřrestihóze a podobné tkáěm provedení vyiíálezu néurovaskulári:ai spojenáxs.exprcsi fíkem expozice růstovým faktorům. VJIÍGF, TGF-α a EGF.
Obzvláště preferovány jsouíerapeutické metody zaměřeríc na inhibici VEGF-mdukqvanc vaskularizaceve tkáni; já^ortřéoa u oka kde se angiogeneze rozvinula v nemoc, včetně diabetické retinopathie (zvané také/ nakulární degenerací; u přepokládanéOční rcúnopathie a neurovaskulárního glaukomu. V dalším. preferovaném provedéhí vynálezu jsoi/ těrapeutickéxmetSdy zaměřeny na inhiiici neurovaskiilárníeh /porucbách, které zahrnuji 'transplantace rohovky, hérpetická kerátitida/luetická kératitida, ptcrygium, neovaskulárni panus spojený s používáním kontaktních čoček 4 pod ανβ5 antagonista pro použití zjíodle této inhibovat schopnost ανβ5 vázat vykazuje specifitu pro ανβ5 oproti ostatní
:áň ce
oliferativní diabetická retinopáthie), dále třeba u tkání se stařeckou
.giogeheze, ke/ které dochází vxkorneálnk y je/i léktini
nijak významně inhibuje váza může bv vynálezu in libuje cu$5 antagonista vázání/viti etody je/schopen vázat avp5 a kompetitivně na pnrodá\vitroňéktinóvý ligand. Přednostně antagonista ínte^ťinům V obzvláště preferovaném^prove[ení bsahem RGI) k ttvPs ovšen antagonista
lineární nebo cýkli bsahem RGI
/ x / / I í vjtronektmu\k avp3 nebo k α^β/ Preferovaný ανβί cký polypeptid, monoklonální p/otilatka nebo jejich což sé také nazývá
funkční fragthent,/popr. orgjmická molek ala, která miinikuje\vp5 ligám emřvsecliny specificky interagují s a.,pk
Podávání ανβί antagonistů podle tohoto vynálezu zahrnuje in /transdcrmální, ititrasynoviální, intramuskuíární a orální podávání. V další provedších je podávání koordinováno společne^s,chénioterapeutickým poštupěi kontfoly tumorigencze a rakovinné mětastáze.
organomi melik
kulami, intrávenpzní, i preferovaných
Stručný popis obrázků
V obrázcích, které jsou součástí tohoto vynálezu najdeme:
Obrázek 1 A-ID ilustruje inhibici čytokinem vyvolané corneální ángiogeneze u králíka pomocí protilátkových antagonistů av integrinu. Indukce ángiogeneze působením buď bFGF nebo VEGF
v iLronekLi nu k anb3 nebo k může být i neární nebo proti 1átka nebo její ch moleku1 a, k Lerá m i mikug e organomi meL ika ,
Použ11 i an b·, intraoku1arn í, i ntramuskulárni proveden í ch : i t>eč . . . .« a* a···· »···· ···« · · · · · •4 ·· ·· ♦ ·♦♦· aiibb3 Preferovaný anbs antagonisla cyklický polypeptid, monoklonální funkční fragment, popř organická anbc ligand, coě se také nazývá přičemž všechny specificky int.eraguji anlagonistů i nLravetiózn í a orální podle tohoto vynálezu zahrnuje transdermá1ní, inlranynoviálni, použití, V dalších prcforovaných pouií i l í spo I ečno s chemoterapeutickým pučjtím za a rakovinné molast. á^ť
9999 ··
9 · 9 9 9
9 9 9 *«9 •9 »99 ««999
9 9 9 9 «
9999 99 ·
-1* 9 9 9
9 9 a účinky působeni protiiátkóvých antagonistů av integrinu, P1F6 (ανβθ a LM609 (ανβ3) jsou popsány v Příkladu 4. ÓD a OS Označuji pravé a levé oko. experimentálního králíka. Velké šipky označuji kořneální angiogenězi s otokem, zatímco malé Šipky ukazují normální konjuktivrií lifnbální cévy. Obrázky 1A a 1B ukazují indukci angiogeneze sbFGF, obrázky 1C a ID znázorňuji totéž s VEGF. Rohovka králíka v Obrázku 1A a 1C ukazuje působení P1F6, zatímco Obrázek JB a 10 ukazují působení LM609
Obrázky 2A a 2B jsou histogramy, ukazující střední neurovaskulární plochu v mm2 +/standardní odchylka (n = 8 pro každou že dvou sérií) po indukci s bFGF nebo VEGF, následovanou působením mAb s P1F6 nebo LM6Ó9. Výsledky jsou diskutovány v Příkladu 4.
Obrázky 3A-3F fotograficky ilustrují efekt působení antiintegrinové protilátky na kuřecí CAM preparát. Výsledky jsou popsány v Příkladu 6A. Angiogeneze jé indukována s bFGF nebo s VEGF, následovaným intravenóznim podáním slaného fosfátového pufru (PBS) jako kontroly nebo P i F6 popř. LM609 monóklonáJnich protilátek popsaných v legendě k Obrázku 1. Působeni bFGF na CAM je zobrazeno na Obrázku 3 A, 3C a 3E, .působení VEGF na CAM je ukázáno na Obrázku 3B, 3D a 3F. Kontrolní CAM, který obdržel intravenózní injekci PBS, je na Obrázku 3A a 3B. Protilátka PIF6 byla použita k působení na CAM na Obrázku 3C a 3D, protilátka LM609 na Obrázku 3E a 3F.
Obrázky 4A a 4B ukazují v histogramovém formátu kvantitativní výsledky zaznamenané na Obrázcích 3A-3F. Index angiogeneze je vynesen na ý-ose proti kontrolnímu působení a působení protilátek. Obrázky 4A a 4B ukazují bFGF-indukovanou angiogenězi popř. angiogenězi vyvolanou VEGF. Výsl edky jsou diskutovány v P rikladu 4.
Obrázky 5A-5F fotograficky ilustrují účinky působení syntetického peptidu na kuřecí CAM preparát jak je popsáno v Přikladu 6. Angiogeneze je vyvolána buď pomocí bFGF nebo VEGF, následovaném intravénózním podánímslaného fosfátového pufru (PBS) jako kontroly, nebo pomocí syntetických cyklických peptidu RGDfV (SEQ ID NO 4) nebo RAD fV (SEQ ID NO 5). CAM, na který bylo působeno s bFGF, je ha obrázku 5Ά, 5C a 5É, působení VEGF je ukázáno na obrázcích 5B, 5D a 5F Kontrolní působení iňtravenózní injekcí PBS je ukázáno na Obrázcích 5A a 5B. Působení peptidu RDGfV je znázorněno na Obrázku 5C a 5D, na Obrázcích 5E a 5F je zobrazeno působení peptidu RADfV na CAM.
Obrázky 6A a 6B ukazuji v histogramovém formátu kvantitativní zpracování výsledků z Obrázku 5A-5F Index angiogeneze je vynesen na ose y .proti kontrolnímu působení a působení protilátkami. Obrázky 6A a 6B ukazují angiogenězi indukovanou s bFGF a VEGF. Výsledky jsou diskutovány v Příkladu 6.
is ·♦·· • · • ·· • · ·· • · ··«· · • ·· • · ·
Obrázky 7A-7E ukazují účinky anti-mtegrinových monokionálních protilátek na CAM angiogenezi, indukovanou jednotlivými cytokiny, bFGF, ΤΝΕά, VRGF a TGF-α. Bylo také vyhodnoceno PMA. Určování a výsledky jsou popsány v příkladu 6 Výsledky jsou nakresleny v histográmovém formátu, kde index angiogeneze je vynesen na y-ose a kontrola popř. inhibitory na ose x. Obrázky 7A-7E ukazují angiogenezi indukovanou popořadě bFGF, TNF-α, VEGF, TGF-aaPMA.
Obrázek 8 je histogram, ukazující účinky působení protilátek na růst nádoru CS1 melánomu v kuřecím embryu zkušebního CAM, provedené podle Příkladů 50 a 6D. Hmotnost nádorů v miligramech (mg) je vynesena na ose y proti různým působením, vyznačených na ose x. CSAT je kontrolní protilátka specifická pro β ΐ subjednotku integrinu' LM609 a P1F6 byly popsány dříve
Obrázek 9 je histogram působeni kontroly versus av05peptidový antagonista, značeny peptid 189 (SEQ ID NO 9). na růst nádoru melánomu, měřeném jako objem nádoru v mm3 vynesených na ose y.
Obrázek 1Ó znázorňuje syntézu sloučeniny 7, popsanou v příkladu 10A-G.
Obrázek 11 ilustruje syntézu sloučeniny 9, popsanou v příkladu ΙΌΑ-C, H-I.
Obrázek 12 ukazuje syntézu sloučeniny 10, popsanou v příkladu Í0J.
Obrázek 13 znázorňuje syntézu sloučeniny 12 a 14, jak jsou popsány v příkladech 10K-L a 1ΌΜ-Ν.
Obrázek 14 ukazuje chemické struktury sloučenin 15, 16, 17 a 18. Detailní syntéza zmíněných sloučenin je popsána v Příkladu 1ÓO-R.
Detailní popis vynálezu
A) Definice
Aminokyselinový 2bytek: Aminokyselina se tvoří chemickým trávením (hydrolýzou) polypeptidu na jeho peptidových vazbách. Aminokyselinové zbytky zde popsané jsou přednostně v „L“ formě. Zbytky v ,;D“ izomerní formě mohou však být použity, pro výměnu kteréhokoliv Lámínokysélinového zbytku, pokud jsou Zachovány potřebné funkční vlastnosti polypeptidu. NHj označuje Volnou amiňoskupinu, přítomnou na amino-kónci polypeptidu COÓH označuje volnou karboxylovou skupinu přítomnou na karboxy-konci polypeptidu. V souhlase se standardní nomenklaturou polypeptidu (popsanou v.J. Biol. Cheríi., 243: 3552-59 (1969) a přijatou v 37 CFR $1 822(b) (2)) jsou v následující Tabulce uvedeny zkratky aminokyselinových zbytků:
··♦· *·
Tabulka odpovídajících zkratek
Svmbol Aminokyselina
1-písmeno 3-písmena
Y -Tyr Tyrosin
G Gly Glycin
F Phe Fenylalanin
M Met Methionin
A Ala Alanin
S Ser Šerm
ϊ lle Jsoleucin
L Leu Leuciň
T Thr Threonin
.V Val Valin
P Pro Prolin
K Lys Lys
H His Histidin
Q Gin Glutamm
E Cílu Glutamová kyselina
Z Glx Glu a/nebo Gin
W Trp Tryptofan
R Arg Arginin
D Asp Aspartampvá kyselina
N Asn Aspáragin
B Ašx Asn a/nebo Asp
C Cys Cystein
X Xaa Neznámá nebo jiná kyselina
Následující zkratky mají tento význam:
BOC terč, butyloxykarbonyl
DČCI dicyklohexylkarbodiimid
DMF dimethylformamid
OMe methoxy
HOBt 1-bydroxybénzotriazól
-70Jé třeba poznamenat, že sekvence všech aminokyselinových zbytků jsou v tomto vynálezu reprezentované vzorci,, jejichž orientace zleva do pravaje v souladu s konvenčním směrem ód amino-konče ke karboxy-koncj. Mimo to je třeba se zmínit o tom, že přerušovaná čárá na začátku nebo konči aminokyselinové sekvence označuje peptid, vázaný k další sekvenci jednoho nebo více am inokyselino vých zbytků.
Polypeptid: Lineární rada aminokyselinových zbytků spojených navzájem peptidovými vazbami mezi alfa-aminoskupinou a karboxylovou skupinou dvou sousedních aminokyselinových zbytků.
Peptid: Lineární řada ne více než 50 aminokyselinových zbytků spojených navzájem jako v polypeptidu.
Cyklický peptid: Cyklický peptid, o němž se říká, že nemá žádný N- ani C-koňec, a který jc odvozen ód příslušného lineárního peptidu tak, že N-konec tvoří amidickou vazbu s Ckoncovým karboxylátem zmíněného lineárního peptidu.
Protein: Lineární řada více něž 50 aminokyselinových zbytků, spojených dohromady stejně jako v polypetidu.
Syntetický peptid: Chemicky vyrobený řetězec aminokyselinových zbytků, spojených dohromady peptidovými vazbami, který neobsahuje proteiny vyskytující se v přírodě ani jejich fragmenty.
B. Obecné úvahy
Tento vynález se obecně vztahuje k objevu, že angiogeneze je zprostředkována určitým vitronektinovým receptorem av35 a že inhibice funkce a$5 ínhibuje angiogenezi.
Tento objev je důležitý, vzhledem k roli, kterou angiogeneze hraje v mnoha chorobných procesech. Inhibováním angiogeneze můžeme zakročit při nemoci, zlepšit symptomy a v některých případech nemoc vyléčit.
V případech, kde je růst nových krevních.čest zapříčiněn patologickou nemoci nebo tam, kde tato nemoc k růstu alespoň přispívá, inhibice angiogeneze budésniŽovát zhoubné následky nemoci. Příklady zahrnují reumatickou artritidu, diabetickou retinopathii, zánětlivé nemoci, restenózu a pod Tam, kde je růst nových krevních cest žádoucí pro podporu růstu zhoubné tkáně, inhibice angiogeneze bude snižovat krevní zásobování tkáně a tím přispívat ke snížení hmotnosti tkáně, založené na požadavcích zásobování; Příklady zahrnují růst nových krevních cest jako odezvu na ischemii, což vede k angiogenezi indukované růstovým faktorem, růst
-Wnádorů, kde je neustále vyžadována neurovaskularizace pro růst nádoru na tloušťku více než několika milimetrů a pro vznik tuhých nádorových metastáz.
Metody podle tohoto vynálezu jsou účinné částečně, protože terapie je vysoce selektivní pro angiogenezi a ne pro jiné biologické procesy. Jak je ukázáno v Příkladech, pouze růst nových krevních cest obsahuje podstatné množství ανβί, takže terapeutické metody naopak neovlivňují zralé cévy
Odhaleni, že mhibice samotné ανβ<; bude efektivně inhibovat angiogenezi dovoluje vývoj terapeutických přípravků s potenciálně vysokou specifitou, a tím i relativně nízkou toxicitou Ačkoliv vynález popisuje použiti peptidových činidel, která mají schopnost inhibovat jeden nebo více integrinů, lze navrhnout další činidla, jež by inhibovala aJU selektivněji. Proto nemají některá peptidová činidla žádné vedlejší účinky na inhibici jiných biologických procesů než lěch, mediovaných pomoci a,.[T.
Například, jak ukazují současné objevy, je možné připravit monokionálni protilátky vysoce selektivní pro imunoreakci s cxvp5, ale ne s ανβι, αυβ? nebo αιπ,β?,, které jsou podobně selektivní pro inhibici funkce ajk Kromě toho mohou být navrženy peptidy obsahující RGD tak, aby byly selektivní pro inhibici ανβ5, jak je popsáno dále.
Před objevy popsanými v tomto vynálezu nebylo známo, že angiogeneze a jakýkoliv z procesů závislých na angiogenezi, mohou být inhíbovány in vivo s využitím činidel, která jsou antagonisty biologické funkce (ϊνβ5.
C. Způsoby inhibice angiogeneze
Vynález poskytuje způsob inhibice angiogeneze ve tkám, a tím inhibici tkáňových dějů, závislých na angiogenezi. Obecně metoda zahrnuje podání přípravku do tkáně, obsahujícího množství ανβί antagonisty inhibujícího angiogenezi.
Cílová tkáň použitá k uplatňování metod podle tohoto vynálezu je definována jako tkáň obsahující ανβ<, jež je charakteristická přítomností detekovatelného množství αυβ; integrinového reecptoru. Jinými slovy, tkáň obsahující ανβ5, je definována přítomnosti ανβί reecptorového komplexu v buněčných membránách. Takovéto tkáně zahrnují buňky odvozené od epitelu a mesenchymu. Přítomnost receptoru může být určena mnoha způsoby, včetně imunoreaktivity receptom s protilátkou anti- ανβί integrinového receptoru, kde je imunoreakce detekována ve tkáni pomocí mikroskopu, popř. imunoprecipitace, kompetici ligandového vázání a podobnými technikami. Preferované protilátky pro použití v detekci výskytu ανβ? ve tkaních jsou popsány
-1?-
···» ·♦ ·· · ·· » ♦ · · • a · · ♦ · ♦ • a a a ♦··♦·· • a · · a a a *· ·· ♦· a níže a v příkladu 1. Například, určení distribuce ανβί vtkáni ledvin, kůže nebo oka s pomocí imunofluóřescence je popsána v Příkladu 2.
V souvislosti s metodami podle tohoto vynálezu, tkáně obsahující ανβ,5 je charakterizována jako tkáň mající znaky angiogeheže. Jak bylo popsáno drive, angiogeneže představuje množství procesů zahrnujících neuřovaskularizace tkání včetně rašení“, vaskulogénezi nebo rozšiřování cév, přičemž všechny tyto angiogenezní procesy jsou zprostředkovány a jsou závislé na expresi ανβ5. S výjimkou traumatického hojení ran, vzniku žlutého tělíska a embryogeneze se má za to, že většina angiogenezních procesu je Spojena •tS· Chorobnými procesy a použiti současných terapeutických metod je tedy selektivní vůči némocém a nemá zhoubné vedlejší účinky.
Je mnoho nemocí, u nichž se má za to, že angiogeneže je důležitá. Tyto nemoci se označuji jako angiogenezní nemoci a zahrnují (výčet není úplný) zánětlivé poruchy jako třeba imunní a neimunní zánět, chronický artikulární revmatismus a psoriáza, poruchy spojené, s nepatřičnou nebo nevhodnou invazí cév jako jsou restenóza, kapilární proliferáce vaterosklerotických plátech a ósteoporéza, poruchy spojené s rakovinou, jako třeba tuhé nádorové metastázi, angiofibřomy, retrolentální fibroplazié, hemápgiomy, Kaposiho sarkom a podobné rakoviny, kterc vyžadují neurovaskularizaci k podpoře nádorového růstu.
Oční nemoci Charakteristické neovaskularizací představují obzvláště preferovaný cíl pro terapii. Neovaskularizace oka je něj běžnější pathológickou změnou, pozorovanou ve velké většině očních nemocí, které vyúsťuji do katastrofické ztráty zraku Růst nových krevních cešt z již existujících chorůidálních, retinálních nebo paralimbálníčh cév může vést k edému, krvácení nebo vzniku fibrovaskulární membrány, což vede k porušení nirmálních anatomických vztahů uvnitř oka a souběžně ztrátě normálních zrakových funkcí.
Oční choroby charakterizované angiogěnezí zahrnují kotneálni neovaskuláhní poruchy, hermetickou keratitidu, pterygium, neovaskulámí panůus spojený š používáním kontaktních Čoček a pod. Další Oční nemoci také zahrnují diabetickou retinopatii (DR), makulární degenerace vyvolané věkem (ARMD), domnělá okulárni histoplasmóza (POHS), ranná retinopáthie (ROP), neovaskulární glaukom a pod. Zatímco inhibiče angiogeneže v těchto nemocech by nezbytně neléčila samotné nemoci, vedla by k významné redukci s ní spojené choroby zráku.
Například, 90% ze 300 000 osob majících, cukrovku po dobu delší než 25 let bude mít
Určitou formu DR, která je retinální nemocí charakterizovanou prosakováním a/nebo prudkým růštem krevních cév. Třicet procent těchto pacientů bude skutečně mít později zmíněné podmínky (prudký růst cév), které lze zlepšit pomocí terapeutických metod podle tohoto vynálezu. Pokud
• 444 • 4 • »9 «4
• • • ♦ ' 4 • 4 4 • ·
4 • • • 4 4 · 4 4 44
• • · * · 4 4444 4 ·· 4 • 4
• 4 ♦ • • 4 • ♦ 4 4
β · ♦ · 4 · 4 • 4 • 4
jde o ARDM, 25% populace přes 65 let, přibližně 630 000, má nějakou formu této nemoci s tím, že se očekává, že kolem roku 2030 bude mít tuto nemoc (ARDM) 6,3 miliónu lidí. Díky tomu má schopnost inhibovat ángiogenezi spojenou s ανβ<, pomočí přípravků a metod podle tohoto vynálezu, velký význam v medicíně.
Metody inhibicé arigiogeneze v nemocných tkáních tedy zlepšují symptomy nemocí á v závislosti ná druhu nemoci mohou přispívat k vyléčeni nemoci. Jedno z provedení vynálezu uvažuje inhibici angiogenéze v tkáních samu o sobě. Stupeň angiogeneze vc tkáni a tedy i stupeň dosažené íňhibíce pomočí metod tohoto vynálezu, může být vyhodnocen množstvím metod, jako třeba těch, popsaných v Příkladech provedení vynálezu pro detekci avpó-imůnopozitivních vznikajících a nedospělých cévních struktur pomocí imunohistochemie.
Jak je zde popsáno, libovolná tkáň nebo orgány složené z organizovaných tkání, mohou podporovat ángiogenezi za chorobných podmínek včetně kůže, svalů, střeva, spojovacích tkáni, kloubů, kostí a podobných tkání- do kterých mohou krevní cévy proniknout při angiogenických stimulech.
Způsoby inhibice a přípravky ανβ5 antagomstů podle tohoto vynálezu jsou terapeuticky zvláště užitečné pro iiihibici arigiogeneze, která byla indukována růstovými faktory, někdy také nazývanými cytokiny. Za fyziologických podmínek je arigiogeneze vysoce regulována á jak bylo již dříve ukázáno (Brooks ét al., Science, 264: 569-5761 (1994)), je aktivována specifickými angiogenňimi molekulami jako jsou základní fibróblastický růstový faktor (bFGF). Negativní regulátory angiogeneze byly také popsány. Angiogeneze je tedy regulována složitou rovnováhou mezi lokálními štimulátory a inhibitory. Viz. D:Amore, Invesiigative Ophlhcil. Visual Scí, 35: 3974-3979 (1994).
Je-li fyziologická rovnováha angiogenických stimulátorů a inhibitorů, těsně kontrolujících normální klidové kapilární cévy, porušena, jak se stává při určitých chorobných stavech, je indukován prudký růst buněk kapilárního endothelu, buňky migrují a nakonec diferencují ža vzniku nových krevních cév.
Ángiogeňěze je charakterizována jako kaskádový děj, mající soubor ranných dějů následovaných souborem pozdějších událostí, jak bylo shrnuto v LeibÓvich, „Roleof C.ytokinesin the Přoceas of Tumor Angiogenesis“, v „Human Cytokines: Their Role in Diseáse and Therapy“, eds. Aggarwal and Puri, kapitola 35, Blackwell Science, lne. (1995). Ranné děje jsou předcházeny dodávkou angiogenických růstových faktorů a cvtokinů, doručených z éxtravaskulárního zdroje. Ranné děje poté probíhají v cílové mikrovaskulatuře s rozbitím inteřcelulárních spojek, indukcí exprese aktivačních antigenů buněk endothelu a proteolytick.ého • « · · • * ·«
• · « · · ·♦ ♦· • · 9 «· ♦ fenotypu a iniciací směrové migrace buněk endóthelu. Posledně zmíněné děje jsou charakterizovány autokrinní a parakrinní expresí růstového faktoru a genů cytokinu v buňkách, buňkách endotelu, pericytech a buňkách hladkého svalstva vyvíjejícího se kapilárního pupenu. Tyto buňky pak moduluji interakce) buněk s extracelulární matricí, , což vede ke vzniku nových funkčních kapilárních kliček z již existujících zralých cév.
Ják je diskutováno v tomto vynálezu, literární odkázy popisují spojení mezi objevením se růstových faktoru, včetně těch spojených se zvýšenou ανβ5 expresi, jmenovitě VEGF, TGF-α a EGF, á mezi expanzí nádorové hmoty a začátkem angiogeneze vprudkém růstu neovaskulámích očních nemoci, a to jak u lidí tak u pokusných zvířat.
VEGF, EGF, TGF-α jsou kromě mnoha dalších uvažované růstové faktory, charakterizované jejich schopnostmi stimulovat buněčný růst. Růstové faktory jsou proteiny, vylučované buňkou, kterc působí na vylučovací nebo i jiné buňky. Jejich schopnost působit je závislá na přítomnosti receptářů růstových hormonů, kterými jsou obvykle transmembránni proteiny. Růstové faktory jako VEGF jsou také obecně nazývány cytokiny, jež jsou definovány jako polypeptidové hormony vylučované buňkou, které ovlivňují růst a metabolismus buď té same (autokrinní) nebo jiné buňky (parakrinní). Termín cytokin se neomezuje na molekuly produkované buňkami imunitního systému a modifikátorů biologické odezvy stejného systému. Termín cytokin je tedy široká kategorie, jejíž jedna z podkategorií založená na typu biologické odezvy, je stimulační růstový faktor nebo zesilovač, jako třeba VEGF, bFGF. EGF, TGF-α a pod. Souhrn viz. Aggarwal et al., „Common and Ihicomman Features of Cytokineš and Cytokme Receptorš: An Qverwíev“, v „Human Cytókihes: Theiř Role in Diséáse and Therapy“, ,eds. Aggarwal and Puti, Kapitola 3, Blackwell Science, lne. (1995).
V tomto vynálezu jsou pro inhibici angiogeneze ve tkáních zamýšleny av05 antagonisté angiogeneze á nikoliv antagonisté růstových faktorů jako třeba protilátky proti VEGF. V preferovaném provedení jsou zde popsané ανβ5 antagonisté užitečné pro iííhibiči angiogeneze vyvolané růstovými faktory, ve které jé indukována exprese receptoru ανβ5 integrinu. Preferované růstové faktory jsou v tomto kontextu VEGF, EGF, TGF-α a pod.
Jak je probráno v Současném stavu techniky, je b růstových faktorech EGF a VEGF známo, že se. oba váží k jejich buněčným receptórům, které působí jako tyrosinkynázy. Jak bylo dále ukázáno, aktivace EGF receptoru souvisí s aktivací proteinkiňázy C, což vede k aktivaci ανβ? a ke vzniku migrace určitých buněk na vitronektinovém substrátu. Mechanismus akce mezi expozicí cytokiny nebo růstovými faktory a koordinovanou odezvou integrinové exprese nebo
-71aktivaceje složitý biologický proces. Jak je ukázáno v tomto vynálezu (viz. Příklad 6A), působení cytokinu VEGF na tkáně v modelovém králičím oku nebo v kuřecím chorioalantoickém modelu, vede k angiogenezi působením ανβ<., což je závislé na aktivaci proteinkinázy C.
Ve zvláště preferovaném provedení tento vynález předpokládá použiti ανβ5 antagomstů pro mhibici angiogeneze v libovolné tkáni, ve které byla angiogeneze indukována s VEGF Například se ukázalo, že ischemie duhovky u různých živočišných modelových systémů vede k přeregulování VEGF, vylučovaném z Mullerových buněk a jehož produkce následně indukuje neurovaskularizaci tkáni v oku. Viz Miller et al., Am. Path., 145: 574-585 (1994) a Pierce et al, Proč. Nati. Acad. Sci., USA. 92. 905-909 (1995).
V tomto vynálezu je tedy tkání, která má být léčena, retinální tkáň pacienta s diabetickou retinopatií, makulární degenerací, neovaskulárním glaukomem nebo s podobnou nemocí jak bylo diskutováno dříve, přičemž angiogeneze, která má být inhibována, je angiogeneze retinální tkáně tam kde je neovaskuiar ozacc retinální tkáně. Příklady tkání zahrnuji korncálni tkáně z pacientů s podmínkami okulárni naovaskularizace nebo s nemocemi popsanými zde a v Příkladech provedení vynálezu Vzorový příklad modelového systému podle tohoto vynálezu pro stanovení účinků αν.β? antagomstů na léčeni retinální angiogeneze na myším modelovém systému retinální neovaskulanzace je popsán v Příkladu 9.
V dalším příbuzném provedení vynálezu je tkáni, která má být léčena, zánětlivá tkáň a nagiogenezí, jež má být léčena, je angiogeneze záněthvé tkáně, tam kde jde o neovaskularizaci zánčtlivé tkáně V této skupině metoda předpokládá mhibici angiogeneze artritických tkání, jako třeba u pacientů s chronickým artikulárním revmatismem, v imunních nebo neimunních zánětlivých tkáních, v psonatických tkáních a pod.
U cytokinu, interleukinu 1 a faktoru a nádorové nekrózy se má za to, že jsou spojeny s revmatickou artritidou pomocí jejich přímé role při destrukci spojek, založené na indukci exprese adheze molekul v buňkách endotelu a na uvolňováni enzymu. Viz. Arend ct al , Arthritis rť Rheumatism, 38: 151-160 (1995). Byly navrženy terapeutické režimy pro blokování cytokinů s citokin-specifickými inhibitory stejně jako režimy cílené k molekulám buněčné adheze, které jsou exprimovány za daných podmínek. Viz. Haskard et al., Cell Adhesiori Coinm., 2: 235-238 (1994) lnhibice angiogeneze v artritických podmínkách, s terapií zaměřenou na zahrnutí ανβ? adhezních molekul, je tedy dalším preferovaným provedením tohoto vynálezu
V dalším příbuzném provedení je léčenou tkání nádorová tkáň pacienta s pevným nádorem, metastázami, rakovinou kůže, rakovinou prsu, hemangiomem nebo angioiibromem a
* « »· 4 · ·
podobnou rakovinou, přičemž inhibovanou angiógenezí je angiogenéže nádorové tkáně, kde jde. o její neovaskularizaei. Typický , pevný nádor, léčitelný podlé tohoto vynálezu, zahrnuje plíce, pankreas, prsa, tlusté střevo, hrtan, vaječník á podobné tkáně.
Role složité sítě cytokinů, existující v lidských nádorech, je předmětem review Leek et al., ; J. Léukoeyte Biol, 56: 423-435 (1994), jejíž závěry jsou zde zahrnuté jako reference. Má še za to, že množství cytokinů, včetně VEGF, kyselého a bazického FGF (bFGF), TGF-a a-β, EGF, TNF-α, růstového faktoru buněk endothclu odvozených od destiček, angiogcninu, intérferoňu a a y, interieukinu 1, 6 a 8 a dalších, má vliv na různé buněčné mechanismy angiogeneze v maligních tkáních a buněčných řadách. Například bylo nedávno zjištěno, že je VEGF, kromě jeho výskytu v různých druzích tumorů, spojen s angiógenezí v prsním karcinomu, jak bylo popsáno v Brown et al., HumanPath., 26: 86-91 (1995).
Nádory vylučující různé eytokiny á tím také indukující lokální angiógenezí coby odpověď, v tomto patentu přesněji VEGF, TGF-d a EGF a vzniklá «^-zprostředkovaná angiogeneze, jsou identifikovatelné pomocí screeningu vzorků nádorové tkáně s anti-cytokinovými protilátkami. Tyto metody jsou známé odborníkům v daném oboru pro kultivované vzorky nádorových tkání nebo pro vzorky získané biopsií .Protilátky proti výše popsaným cytokinům jsou komerčně dostupné od Oňcogene Seiences (Uniondale, NY) nebo od Upstáte Biotéch Incorporated (Lake Placid, NY). Screéning vybraných nádorových tkání pomočí těchto metod tedy dovoluje určit potenciál inhibiční aktivity ανβ3 antagonistů podle tohoto vynálezu vůči angiógenezí.
Příklady angiogeneze nádorových tkání a její inhibice jsou popsány v Příkladech provedení.
Inhibice angiogeneze nádorových tkání je dalším preferovaným provedením tohoto vynálezu, vzhledem k důležité roli, kterou neovaskularizače hraje v růstu nádorů. Při absenci . neovaskularizače v nádorové tkáni nedostává tkáň potřebně živiny, zpomaluje se růst, ustává další růst, dochází k regresi a konečně k nekróze vedoucí ke zničení nádoru.
Jinými slovy řečeno, tento vynález poskytuje způsob inhibice nádorové neovaskularizače • inhibicí nádorové angiogeneze podle zde popsaných metod. Podobně vynález zajišťuje metodu inhibóvání nádorového růstu aplikací metod inhibujících angiogenezi.
Metody jsou také obzvláště účinné proti vzniku métastáž protože (1) jejich vznik vyžaduje vaskiilarižaci primárního nádoru, aby metastázové rakovinné buňky mohly opustit primární nádor a (2) jejich vznik v sekundárním stavu vyžaduje neovaskularizaei k podpoře růsru metaStáz. V podobném provedeni vynález zamýšlí aplikaci metody ve spojení. s terapiemi, jako jsou
V «ι«ι ♦· * · · • · 4 • l 4 · • · · · • · · konvenčni chemoterapie zaměřená proti pevným nádorům a na kontrolu vzniku metastáz Podávání inhibitorů angiogeneze je typicky prováděno během chemoterapie nebo po ní, i když se upřednostňuje inhibice angiogeneze po režimu chemoterapie, v době kdy nádorová tkáň odpovídá na toxický útok indukováním angiogeneze, aby se obnovilo zásobování krve a výživy do nádorové tkáně. Kromě toho je preferováno vykonávat metody inhibice angiogeneze po chirurgickém zákroku, při kterém byl pevný nádor vyjmut, jako profylaxi proti metastázim.
Tak jak lze aplikovat metody tohoto vynálezu na inhibici nádorové neovaskularizace, mohou být také aplikovány na inhibici růstu nádorových tkání, na inhibici vzniku nádorových metastáz a k potlačeni již vzniklých nádorů. Pokud jde o posledně zmíněnou aplikaci, zmenšeni nádorové hmoty je vyhodnocováno na modelovém králičím oku, jak je popsáno v tomto vynálezu nebo s modelovým systémem, založeným na modelové kombinaci myš:člověk, ve které je myši kůže, mající SC1D (severe combined immunodeficiency), nahrazena lidskou neonatální pokožkou, viz. popis v Yen et al., .7. Clm. Jnvesí., 91: 986-996 (1993), který je zde zařazen jako reference. Tento model představuje další w vivo model ke zkoumání angiogeneze a její inhibice metodami podle tohoto vynálezu. Příklady s králičím nádorovým modelem a ανβ5 antagomsty podle tohoto vynálezu jsou popsány v Příkladu 5C a 6D, zatímco příklady inhibice angiogeneze v SC1D myším modelu jsou popsány v Příkladu 8.
Restenóza je proces migrace buněk hladkého svalstva (SMC) a jejich proliferace na místě perkutánni translununární koronární angioplastiky, který narušuje úspěšnost angiopiastiky.Migrace a proliferace SMC během restenózy může být považováno za proces angiogeneze, který je inhibován zde popsanými metodami. Vynález proto takc uvažuje inhibici restenózy inhibováním angiogeneze metodami podle vynálezu u pacientů po angioplastickém zákroku. Pro inhibici restenózy se podává αυβ; antagonista typicky po angioplastické proceduře po dobu 2 až 28 dnů, výhodněji po dobu prvních 14 dnů po zákroku.
Pacientem, léčeným podle tohoto vynálezu, je s výhodou člověk, ačkoliv by mělo být jasné, že principy tohoto vynálezu naznačují, že vynález je účinný na všechny savce, které tedy můžeme zahrnout do terminu „pacient“ V této souvislosti termín savec zahrnuje libovolný druh savců, obzvláště zemědělských nebo domácích druhů, u kterých je hledáno léčení nemoci pomocí metod podle tohoto vynálezu
Metoda inhibování angiogeneze ve tkáni, a tím také vykonávání způsobů léčení nemocí se vztahem k angiogenezi, zahrnuje kontakt tkáně, ve které je výskyt angiogeneze nebo která je z výskytu angiogeneze podezřelá, s přípravkem obsahujícím terapeuticky účinné množství α,.β^ ««V· · VV Ρ· · fc · · * * * · · ·Λ ··· · ♦ · ···>· « · « · « · ·4·« * ··· «· « » · 4 · · · · «· ·· *· «· · ·· ·· antagonisty, schopného inhibovat vázání ανβ? na jeho přirozený ligand. Metoda tedy zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství fyziologicky tolerovaného přípravku, obsahujícího ανβ5 antagonistu podle vynálezu.
Dávka pro podávání ανβ5 antagonisty závisí na jeho formě a jeho síle, jak je dále popsáno, přičemž jde o dostatečně velké množství, schopné vytvořit požadovaný účinek, ve kterém se zlepšuje angiogeneze popř. symptomy nemoci vyvolané angiogenezí Dávka by neměla být tak velká, aby způsobila nepříznivé efekty jako je syndrom hyperviskozity, pulmonárni edem, kongestivni srdeční selhání a pod. Obecně se bude dávka lišit podle veku, podmínek, pohlaví a rozsahu nemoci u pacienta a může být určena odborníkem v oboru. Dávka může být také v případě jakékoliv komplikace přizpůsobena osobním lékařem.
ανβ<· antagomsta je molekula, blokující nebo inhibující fyziologii nebo farmakologickou aktivitu ανβ·ί tím, že inhibuje vazebnou aktivitu receptorů k ligandu, jmenovitě vitronektinu. Prefeerovanými ανβί antagonisty mohou být monoklonální protilátky, peptidy nebo organická molekula mimikujici ανβ5 ligand.
Terapeuticky účinné množství je takové množství ανβ5 antagonisty, schopné vytvořit měřitelnou inhibici angiogeneze v léčené tkáni, ío znamená množství inhibující angiogenezí Inhibice angiogeneze může být měřena in siíu imunohistochemií, jak je zde popsáno nebo jinou metodou známou odborníkům v obora.
Jelikož ανβ5 antagonista muže mít formu organické látky napodobující ανβ5 ligand, peptidu obsahujícího R.GD, anti-ot^s monoklonální protilátky nebo jejich fragmentů nebo látky napodobující ανβί receptor, mělo by býl oceněno, že sila a tím exprese „terapeuticky účinného“ množství se může měnit. Ovšem jak je ukázáno ve zde popsané metodě zkoušení, odborník v oboru může snadno vyzkoušet silu kandidáta αυβί antagonisty podle tohoto vynálezu.
Sila avps antagonistymůže být měřena mnoha způsoby, včetně inhibice angiogeneze při CAM stanovení, v králičím oku v in vivo měření a měřením inhibice vázání přirozeného ligandu k αυβ5, tedy zde popsanými nebo podobnými metodami.
Preferovaný ανβ? antagonista má schopnost značně inhibovat vázání přírodního ligandu jako je vitronektin k ανβ5 v roztoku při koncentracích antagonisty nižší než 0,5 mikromolární (pM), přednostně nižší než 0,1 pM a ještě výhodněji nižší než 0,05 pM. „Značně“ znamená, že v přítomnosti ανβ5 antagonisty je pozorováno nejméně 50% snížení inhibice vázáni vitronektinu a 50% inhibice je zde popisována jako hodnota lC?o.
-Ί19 9 · · · ·
Ještě výhodněji ανβ? antagonista vykazuje vyšší selektivitu pro ανβ5 než pro ostatní integriny. Takže preferovaný αυβ5 antagonista značně inhibuje vázání ανβί, ale významně neinhíbují vázání vitronectínu k jiným integrinům, jako jsou ανβι, αν03 nebo otutfyv Zvláště preferovaný je ανβ^ antagonista vykazující 10-ti až 100-násobně nižší IC5o aktivitu pn mhibici vitronektinového vázání k ανβ-; ve srovnáni s IC« aktivitou při inhibici vázání vitronektinu k jiným integrinům. Příklady měřeni 1C5O aktivity při inhibici vitronektmového vázání k integnnu je popsán v Příkladech provedeni.
Terapeuticky účinné množství ανβ5 antagomsty podle tohoto vynálezu ve formě monoklonální protilátky je v typickém případe takové množství látky, které, je-li podáno ve fyziologicky tolerovaném přípravku, postačí pro dosažení koncentrace v plasmě od 0,01 mikrogramu (pg) na mililitr (ml) do 100 pg/ml, výhodněji od as 1 pg/ml do 5 pg/ml a obvykle kolem 5 mg/ml. Jinak řečeno, dávka se může lišit od asi 0,1 mg/kg do asi 300 mg/kg, výhodněji od 0,2 mg/kg do 200 mg/kg, nej výhodněji od 0,5 mg/kg do asi 20 mg/kg, v jedné nebo více denně podávaných dávkách, jeden nebo několik dní.
Je-li antagonista ve formě fragmentu monoklonální protilátky, množství může být snadno nastaveno na základě relativního poměru hmoty fragmentu a celé protilátky. Preferovaná molární koncentrace protilátkového antagonisty v plasmě je od asi 2 mikromolárni (pM) do přibližně 5 milimolární (mM) a přednostně kolem 100 pM až 1 mM.
Terapeuticky účinné množství ανβ5 antagonisty podle tohoto vynálezu ve formě polypetídu nebo jiné molekuly podobné velikosti, napodobující ανβί ligand, je v typickém případě takové množství polypetídu, které, je-li podáno ve fyziologicky tolerovaném přípravku, postačí pro dosažení koncentrace v plasmě od 0,1 mikrogramu (pg) na mililitr (ml) až do 200 pg/ml, s výhodou, od 1 pg/ml do asi 150 pg/ml U polypeptidu majícího hmotu kolem 500 gram na mol je preferovaná molární koncentrace peptidového antagonisty v plasmě od 2 mikromolárni (pM) do asi 5 milimolární (mM) a přednostně kolem 100 pM až I mM. Jinak řečeno, dávka na hmotnost těla se může pohybovat od asi 0,1 mg/kg až do 300 mg/kg, výhodněji od 0,2 mg/kg do 200 mg/kg, v jedné nebo více denně podávaných dávkách, jeden nebo několik dní
Monoklonální protilátky, polypetidy nebo organická mimetika podle tohoto vynálezu mohou být podávána parenterálně injekcí nebo postupnou dlouhodobou infiizí. Ačkoliv tkáně, určené k léčeni, mohou být obvykle dosaženy v těle systematickým podáváním a proto jsou nejčastěji léčeny intravenózním podáním terapeutických prostředků, byly uvažovány jiné způsoby podání, u cílových tkání, kde je pravděpodobné, že tkáň obsahuje cílovou molekulu Tak třeba φ · φ monoklonálni protilátky, polypeptidy nebo organická mimetika podle tohoto vynálezu mohou být podávána intraokulárně, intravenózně, intrapentoneálně, intramuskulárně, subkutánnČ, intrakavitně, transdermálně a mohou být také dodány penstaltickými prostředky.
Terapeutické přípravky obsahující ανβ? antagonistu podle tohoto vynálezu jsou konvenčně podávány intravenózně, jako například injekcí jednotkové dávky. Termín jednotková dávka“ označuje ve spojeni s terapeutickým přípravkem podle tohoto vynálezu fyziologicky diskrétní jednotku vhodnou jako jednotkovou dávku pro subjekt, přičemž každá jednotka obsahuje předem stanovené množství aktivní látky, spočtené tak aby vyvolalo požadovaný terapeutický efekt ve spojení s požadovaným ředidlem, to jest nosiče nebo přísady
Přípravky jsou podávány způsobem, odpovídajícím složeni dávky a terapeuticky účinnému množství. Podávané množství a načasování podávání závisí na léčeném subjektu, schopnosti systému využít aktivní složku a stupni požadovaného terapeutického efektu. Přesné množství aktivní složky vyžaduje, aby bylo podáváno na základě rozhodnutí obsluhujícího lekaře a je pro každého individuální. Vhodné rozpětí dávky pro systematické aplikace, popsané v tomto vynálezu, závisí na způsobu podávání. Vhodný režim podávání je také proměnlivý, je ale typický počátečním podáním, následovaným opakovanými dávkami v jednohodinových nebo několikahodinových intervalech s následnou injekcí nebo dalším podáváním. Alternativně jsou uvažovány kontinuální intravenozní infuze, postačující k udržení koncentrace v krvi v rozsahu specifikovaném pro in vivo terapie
D. Terapeutické přípravky
Tento vynález se zabývá terapeutickými prostředky vhodnými pro provádění terapeutických metod, popsaných v tomto vynálezu Terapeutické přípravky podle tohoto vynálezu obsahuji fyziologicky tolerovaný nosič společně se zde popsanými ανβ·> antagonisty, rozpuštěné nebo dispergované jako aktivní složka. V preferovaném provedeni vynálezu není terapeutický prostředek ανβ5 antagomsty imunogením, je-li podáván savcům nebo lidskému pacientu z terapeutických důvodů
Zde používané termíny „farmaceuticky akceptovatelný“, „fyziologicky tolerovaný (tolerovatelný)“ a jejich gramatické variace jsou v souvislosti s přípravky, nosiči, ředidly a reagenty navzájem zaměnitelné a znamenají, že materiály jsou schopně podávání savcům bez vzniku nežádoucích fyziologických následků jako je zvracení, závratě, zvedáni žaludku a pod
Příprava farmaceutického přípravku, obsahujícího rozpuštěnou nebo dispergovanou aktivní složku, je odborníkům velmi dobře známa a není omezována složením. V typickém
- případě jsou takové přípravky vyráběny jako injektovatelné kapalné roztoky nebo suspenze, které mohou být připraveny v kapalině až před podáním. Přípravky mohou být také emulgovány
Aktivní složka může být smíchána s excipienty, které jsou farmaceuticky akceptovatelné a v množstvích vhodných pro použiti v terapeutických metodách popsaných v tomto vynálezu Vhodné excipienty jsou například voda, solný roztok, dextroza, glycerin, ethanol a pod, popř. jejich kombinace Kromě toho, je-li to vyžadováno, přípravek může obsahovat malé množství pomocných látek, jako jsou smáčedla nebo emulgátory, pH pufry a pod, které zesiluji účinnost aktivní složky.
Terapeutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat farmaceuticky akceptovatelné soli komponent. Farmaceuticky akceptovatelné soli zahrnuji adični soli kyselin (vytvořené s volnými ammoskupinami polypetidu), které jsou tvořeny anorganickými kyselinami jako třeba chlorovodíkovou nebo fosforečnou kyselinou nebo organickými kyselinami, jako třeba kyselina octová, vinná, mandlová a pod. Soli vytvořené s volnými karboxylovýnn skupinami mohou být také odvozené od anorganických bází jako třeba hydroxid sodný, draselný, amonný nebo železitý, popř. s organickými bázemi jako je isopropylaniin, triethylamin, 2ethylaminoethanol, histídin, prokain a pod.
Obzvláště preferována je sůl kyseliny chlorovodíkové, je-h užita pro přípravu cyklických polypeptidových avp5 antagonistů
Fyziologicky tolerované nosiče jsou odborníkům dobře známé, příklady kapalných nosičů jsou sterilní vodné roztoky, neobsahující žádný jiný materiál kromě aktivní složky a vodu, nebo obsahující pufr jako třeba fosforečnan sodný při fyziologických hodnotách pH, fyziologický solný roztok popř. obojí, jako třeba fosfáty pufrovaný solný roztok. Kromě toho mohou vodné nosiče obsahovat více než jednu sůl pufru, stejně tak soli jako třeba chlorid sodný a draselný, dextrózu, polyethylenglykol a další rozpuštěné látky.
Kapalné přípravky mohou také obsahovat kapalné fáze, a to buď společně s vodou nebo namísto ní. Příklady dalších kapalných fází jsou glycerín, rostlinné oleje jako třeba bavlníkový olej a vodně-olejové emulze.
Terapeutické přípravky obsahují angiogenezi inhibující množství ανβ5 antagonisty podle tohoto vynálezu, jsou v typickém případě formulované tak , aby obsahovaly nejméně 0,1 hmotnostních procent antagonisty na celkovou hmotnost terapeutického přípravku. Hmotnostní procento je poměi mezi hmotností inhibitoru a celkové hmotnosti přípravku. Hmotnostní procento 0,1 tak například znamená, že ve 100 gramech přípravku je 0,1 g inhibitoru.
~ € l ’ • · ♦
E. Antagonisté mtegrinu ανβ} άνβί antagonisté jsou používány, v metodách popsaných v tomto vynálezu, kinhibování angiogeneze ve tkáních a mohou mít mnoho forem, které zahrnují látky iňteragující s ανβί takovým způsobem, že jsou narušeny funkční interakce s ,přirozeným i ανβ<. ligandy. Příklady antagonistů zahrnují analoga ανβ5 mimetic, odvozená od vazebných míst ligandůav35, mimetika přirozených liganďů ανβ5, která imitují strukturní oblast zapojenou do vazebných interakcí ou$5 ligandu, polypeptidy,mající sekvenci odpovídající funkční vazebné doméně přírodního ligandu specifického pro α,,β5. Obzvláště odpovídajícího RGD-vazebné doméně přirozeného ligandu ανβ5 a protilátky,, přičemž všechny vykazují antagonistickou aktivitu podle definice v tomto vynálezu.
1. Polypeptidy
V jedriom ž provedení uvažuje tento vynález ανβ< antagonisty ve formě polypeptidů. Polypeptidový (peptidový) ανβ< antagonista může mít sekvenci charakteristickou pro přirozený ligánd α,νβί nebo pro samotný ανβ5 v oblasti zahrnující ανβ’-Íigand interakce a vykazuje ανβ5 antagonistickou aktivitu podlé popisu v tomto vynálezu. Preferovaný peptidový ανβ5 antagonista obsahuje RGD tripeptid a odpovídá sekvenci přirozeného ligandu v Oblasti obsahující RGD
Preferované polypeptidy obsahující RGD mají sekvenci odpovídající sekvenci aminokyselinových zbytků u přirozeného ligandu ανβ.ν v oblasti s RGD, jako třeba u vitronektinu, u něhož jé sekvence velmi dobře známa.
Obzvláště výhodný αυβ5 peptidový antagonista .přednostně inhibuje ανβ$ vázání k jeho přirozenému ligandu ve srovnání sjinými iňtegriny, jak bylo ppsáno výše. Tyto ανβ5 specifické peptidy jsou obzvláště preferovány přinejmenším proto, že specifíta na ανβί snižuje výskyt nežádoucích vedlejších účinků jako je třeba inhibice jiných integrinů. Identifikace preferovaných ανβ}, peptidových antagonistů, majících selektivitu pro ανβ<, může být snadno identifikována v typické zkoušce inhibice vázání, jako je např. zkouška ELIS A, popsaná y Příkladech provedení.
V dalším provedení polypeptid podlé vynálezu obsahuje ne více než asi 1Θ0 aminokyselinových zbytků, přednostně ne více než 60 zbytků, ještě výhodněji ne více než asi 30 zbytků. Peptidy mohou být lineární nebo cyklické, ačkoliv obzvláště preferované jsou cyklické peptidy, Preferované peptidyjsou popsány v Příkladech provedení.
Mělo by být chápáno, že polypeptid nemusí být identický s aminokyselinovou sekvencí ανβί přirozeného ligandu, pokud zahrnuje sekvenci nezbytnou pro potlačení vázání α»β5 ligandu . k σ,νβί a je schopen fungovat jákó'av§5 antagonista při zkouškách, které zde byly popsány.
• · · · 4 « • ·
Polypeptid zahrnuje libovolný fragment nebo chemický derivát polypeptidu, jehož aminokyselinová sekvence je zde ukázána, pokud je polypeptid ανβ5 antagonista Polypeptid proto může být podroben různým změnám, substitucím, inzercím a odštěpením, pokud tyto změny zajistí určité výhody při jeho použití V tomto ohledu, ανβ; polypeptidový antagonista podle tohoto vynálezu spíše odpovídá (než aby byl identický) sekvenci zmíněného peptidu, kde je provedena jedna nebo dvě změny a kde ;e zachována schopnost působit jako ανβ? antagonista v jednom nebo více zkoušek definovaných v tomto vynálezu.
Polypeptid tedy může být v jakékoliv z forem peptidových derivátů, které zahrnují amidy, konjugáty s proteiny, cyklizované peptidy, chemicky modifikované peptidy a podobné deriváty
Termín „analog“ zahrnuje libovolný polypeptid, mající sekvenci aminokyselinových zbytků v podstatě identickou se sekvenci zde specificky uvedenou, ve které byl jeden nebo více zbytků konzervativně nahrazen funkčně podobným zbytkem a který vykazuje αυβ< antagonistickou aktivitu jak je popsáno v tomto vynálezu Příklady konzervativních substitucí zahrnují substituci jednoho nepolárního (hydrofobniho) zbytku jako je izoleucm, valin, leucin nebo methionin za jiný, substituce jednoho polárního (hydrofilniho) zbytku za jiný, jako třeba mezi argininem a lysinem, mezi glutaminem a asparaginem, mezi glycinem a serinem, výměna jednoho bazického zbytku jako třeba lysin, arginin nebo histidin za jiný nebo vzájemná substituce jednoho kyselého zbytku jako je aspartamová nebo glutamová kyselina za druhý
Termín „konzervativní substituce“ také zahrnuje užití chemicky denvatizovaných zbytků namísto ncderivatizovaných, za předpokladu, že takový' polypeptid vykazuje potřebnou inhibiční aktivitu.
„Chemický derivát“ označuje polypeptid, mající jeden nebo více zbytků chemicky denvatizovaný reakci funkční skupiny v postranním řetězci Takto derivatizované molekuly zahrnují například ty, v nichž jsou volné aminoskupmy derivatizovány za vzniku aminhydrochloridů, p-toluensulfonylové skupiny, karbobenzoxy skupiny, terč, butyloxykarbonylové skupiny, chloracetylové skupiny nebo formylové skupiny. Volné karboxylové skupiny mohou být denvatizovány za vzniku solí, methyl nebo ethylesterů nebo jiných typů esterů či hydrazidů. Volné hydroxylové skupiny mohou být denvatizovány za vzniku O-acyl nebo 0alkylderivátů. Imidazolový dusík v histidinu může být derivován za vzniku N-im-benzylhistidinu. Peptidy, obsahující jeden nebo více derivátů přirozeně se vyskytujících 20 standardních aminokyselin, jsou také zahrnuty mezi chemické deriváty. Například: 4-hydroxyprohn může být náhradou za prolin, 5-hydroxylysin může být substituován namísto lysinu, 3-methylhistidin může • · být namísto histidinu, homoscrin může být náhradou za šeřin a lysin může být nahražen ornithinem Polypeptidy podle tohoto vynálezu také zahrnují libovolný polypeptid, mající jeden nebo více přidaných a/nebo vypuštěných zbytků ve srovnání se sekvencí polypeptidu, který je uveden v tomto vynálezu, pokud je zachována požadovaná aktivita.
Termín „fragment“ označuje libovolný polypeptid, mající sekvenci aminokyselinovyc zbytků kratší než je sekvence polypeptidu uvedeného v tomto vynálezu.
Má-li polypeptid podle tohoto vynálezu sekvenci, která není identická se sekvenci ανβ5 přirozeného ligandu, to je v typickém případě tehdy, kdy byla provedena jedna nebo více konzervativních substituci, není obvykle substituováno více než 30 % aminokyselinových zbytků a výhodněji ne více než 10 % aminokyselinových zbytků. Další zbytky mohou být přidány na libovolném konci polypeptidu podle tohoto vynálezu, za účelem vytvoření „spojovacího článku“ (linkers), kterým jsou polypeptidy vhodně připojené ke značce nebo pevné matrici nebo nosiči
Značky, pevné matrice nebo nosiče, které mohou být použity s polypeptidy podle tohoto vynálezu jsou popsány níže.
Aminokyselinovým spojovacím Článkem (linkers) je obvykle alespoň jeden zbytek a může jim být 40 nebo více zbytků, častěji 1 až 10 zbytků, ovšem netvoří epitopy ανβ? ligandu. Typické aminokyselinové zbytky použité pro spojování jsou tyrosin, cystein, lysin, glutamová a aspartamová kyselina a pod Kromě toho se může zmíněný polypeptid lišit, není-li jinak specifikováno, od přirozené sekvence ανβί ligandu tím, zeje sekvence modifikována koncovou NH acylací, např acetylaci nebo amidací thioglykolové kyseliny, termmální karboxyamidací, např. s amoniakem, methylaminem a podobnou terminálni modifikací. Jak je dobře známo, terminálni modifikace jsou užitečné pro snížení citlivosti vůči trávení proteinázou, a líni slouží k prodloužení poločasu rozpadu poiypetidu v roztoku, obzvláště pak biologických kapalinách, kde mohou být přítomny proteázy. V tomto kontextu je také užitečná cyklizace polypeptidů coby terminálni modifikace a je také obzvláště preferována, protože cyklizaci vznikají stabilní struktur/ a také díky zde popsané biologické aktivitě cyklických peptidů.
Libovolný peptid podle tohoto vynálezu může být použit ve formě farmaceuticky akceptovatelné soli. Vhodné kyseliny, které jsou schopné tvorby solí s peptidy podle tohoto vynálezu, zahrnují anorganické kyseliny jako třeba trifluoroctová kyselina (J FA), chlorovodíková kyselina (HCI), bromovodíková kyselina, chloristá kyselina, kyselina dusičná, thiokyanatá kyselina, kyselina sírová, fosforovaná kyselina octová, propionová kyselina, glykolová kyselina, kyselina mléčná, kyselina pyrohroznová, kyselina Šťavelová, kyselina malonová, kyselina b » · * · 1 t ' ‘ 1 · « «
- ? i' ♦ ·***!* k * ♦ «4 * t t · « jantarová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina anthranilová, kyselina cinnamová, naftalensulfonová kyselina, kyselina sulfanilová a pod Soli HC1 jsou obzvláště preferovány.
Vhodné báze schopné tvorby soli s peptidy podle tohoto vynálezu, zahrnuji anorganické báze jako třeba hydroxid sodný, hydroxid amonný, hydroxid draselný a pod., a organické báze jako např mono-, di- a tri-alkyl a arylaminy (např. triethyiamin, diisopropylamin, methylamin, dimethylamin a pod.) a volitelně substituované cthanolaminy (např.· ethanolamin, diethanolamin a pod).
Peptid podle tohoto vynálezu, zde také popisovaný jako polypeptid, může být syntetizován libovolnou technikou známou odborníkům v oboru, včetně rekombinantních DNA technik Techniky syntetické chemie, jako třeba Mcrrificldova syntéza v pevné fázi, jsou preferovanými technikami z důvodů větší čistoty, antigenní specifity, nepřítomnosti nechtěných vedlejších produktů, snadné, výroby a pod. Vynikající souhrn mnoha dostupných technik lze nalézt v Steward et al. „Solid Phase PepUde Synthesis“, W H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky et al., „Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, Second Edition, 1976; J. Meienhofer, „Hormonal Proteins and Pepiides“, Vol. 2, p. 46, Academie Press (New York), 1983; Merrifield, Adv. Enyzmol32, 221-96, 1969; Fieids et al., lni. J. PepUde protein Res., 35: 161214, 1990 a U S. Patent 4,244,946 pro syntézu peptidů v pevné fázi a Schroeder et al., „ The Pepfides, Vol. 1, Academie Press (New York), 1965 pro klasickou syntézu v roztoku, všechny jsou zde zahrnuty jako reference. Vhodné chrániči skupiny použitelné v těchto syntézách jsou popsány ve výše zmíněných textech a také v J. F W McOmie, „Pmteclive Groups in Organic ('hemistry, Plenům Press, New York, 1973, které jsou zde zahrnuty jako reference
Obecně řečeno, syntetické metody na pevné fázi zahrnuji postupné přidávání jednoho nebo více aminokyselinových zbytků nebo vhodně chráněných aminokyselinových zbytků k rostoucímu řetězci peptidu Normálně je ochráněna buď aminoskupina nebo karboxylová skupina prvního aminokyselinového zbytku pomoci vhodné selektivně odstranitelné chránící skupiny. Jiné selektivně odstranitelné skupiny jsou použity pro aminokyseliny obsahující reaktivní skupiny v postranním řetězci, jako třeba lysin.
Máme-li syntézu v pevné fázi coby příklad, chráněná a derivatizovaná aminokyselina je připojena k inertnímu pevnému nosiči pomocí její nechráněné karboxylové skupiny nebo aminoskupiny Chránící skupina ammoskupiny nebo karboxylu se pak selektivně odstraní a je přidána další aminokyselina v sekvenci, mající komplementární vhodně ochráněnou (amino nebo karboxyskupinu), a nechá se reagovat za podmínek vhodných pro vznik amidické vazby se zbytkem již připojeným k pevnému nosiči. Chránící skupina amino- nebo karboxylové skupiny je
4 ~ZC4··4 44 ·
poté z nově připojeného aminokyselinového zbytku odstraněna a je přidána následující vhodně chráněná aminokyselina, postup se dále opakuje. Poté co jsou připojeny všechny požadované aminokyseliny v určeném pořadí, zbývající koncová chránící skupina stejně jako chránící skupiny v postranních řetězcích (a také pevný nosič) jsou postupně nebo najednou odstraněny za vzniku výsledného lineárního polypeptidu.
Připravený lineární polypeptid, např. podle výše popsaného postupu, se může nechat reagovat za vzniku odpovídajícího cyklického peptidu Příklady cyklizačních metod jsou popsány vZimmer et al., Peptides 1992, pp. 393-394, ESCOM Science Publishers, Β V., 1993. V typickém případě se methylester peptidu, chráněný terč. butoxykarbonyJovou skupinou, rozpustí v methanolu a přidá se roztok hydroxidu sodného, přičemž směs se nechá reagovat při 20 °C, aby byla hydrolyticky odstraněna methylesterová chránící skupina. Po odpaření rozpouštědla je terč, butoxykarbonylderivát peptidu extrahován s ethylacetátem z okyseleného vodného roztoku. Terč, butoxykarbonylová chránící skupina je poté odstraněna za jemných kyselých podmínek s použitím dioxanu jako rozpouštědla. Takto získaný nechráněný lineární peptid s volným amino- a karboxy-koncem je převeden na odpovídající cyklický peptid reakcí ředěného roztoku lineárního peptidu ve směsi dichlormethan a dimethylformamid s dicyklohexylkarbodiimidem v přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu a N-methylmorfolinu Vzniklý cyklický peptid je poté Čištěn chromatograficky.
Obzvláště preferované metody syntézy cyklických peptidu jsou popsány vGurrath et al., Eur. Biochem., 210: 911-921 (1992) a jsou popsány v Příkladech provedení. Zvláště preferované peptidy pro použiti ve tkáních primárně vykazujících angiogenezí spojenou s ανβί podle zde popsaných metod, jsou zaznamenány v Příkladech provedení a zahrnují polypeptidy uvedené v. SEQ ID No: 4, 6, 7, 8 a 9.
2. Monoklonální protilátky
Tento vynález v jednom ze svých provedení popisuje ανβ5 antagonisty ve formě monoklonálních protilátek, které imunoreaguji s ανβί a inhibují ανβ5 vázání kjeho přirozenému ligandu, jak bylo popsáno výše. Vynález také popisuje buněčné linky, produkující protilátky, způsoby přípravy buněčných linek a metody produkce monoklonálních protilátek.
Monoklonální protilátka podle tohoto vynálezu zahrnuje protilátkové molekuly, které 1) imunoreaguji s izolovaným ανβί a 2) inhibují vázání vitronektinu k ανβ5. Preferované
U!.UIL 11 * · · · · · · ··· • · ·♦ · · · ·« ·« monoklonálni protilátky, které se přednostně váži k ανβ$, zahrnují monoklonálni protilátky mající imunoreakční charakteristiky mAb P1F6 a mAb P5H9, jež jsou popsány v Příkladech provedeni.
Termín „protilátka nebo protilátková molekula“ v různých gramatických formách, který se používá v tomto textu, je obecný výraz označující populaci imunoglobulinových molekul a/nebo imunologicky aktivní část imunoglobulinových molekul, to jest molekul, obsahujících kombinační místo protilátky nebo paratop.
„Kombinační místo protilátky“ je strukturní část molekuly protilátky, zahrnující těžký a lehký řetězec ve variabilní a hypervariabilní oblasti, které specificky váží antigen.
Příklady protilátek podle tohoto vynálezu jsou neporušené imunoglobulinové molekuly, téměř neporušené imunoglobulinové molekuly a jejich Části, obsahující paratop, včetně částí známých jako Fab, Fab’, F(ab’)2 a F(V), které jsou také nazývány protilátkovými fragmenty
V dalším preferovaném provedení vynález uvažuje zkrácené imunoglobulinové molekuly obsahující Fab fragment, odvozené od monoklonálni protilátky podle tohoto vynálezu. Fab fragment, postrádající Fc receptor, je rozpustný a nabízí terapeutické výhody při životnosti v séru a diagnostické výhody pří způsobu použití rozpustného Fab fragmentu Příprava rozpustného Fab fragmentu je obecně známa v imunologických kruzích a může být provedena mnoha způsoby.
Například, I;ab a F(ab’)j části (fragmenty) protilátky jsou připravovány proteolytickou reakci papainu popř. pepsinu s téměř neporušenou protilátkou dobře známými způsoby. Viz např.: U. S Patent 4,342, 566 (Theofilopolous and Dixon) Fab’ část protilátky je také velmi dobře známa a připravuje se z F(ab’)? části následnou redukcí disulfidických vazeb, spojujících dvě části těžkých řetězců, např. s merkaptoethanolem, a poté následnou alkylací vzniklého proteinového merkaptanu s činidly jako je třeba jodacetamid. Protilátky obsahující neporušené molekuly nnunoglobulinu jsou preferovány a jejich využití je ilustrováno v tomto vynálezu.
Termín „monoklonálni protilátka“ v různých gramatických formách označuje populaci molekul protilátky obsahující pouze jedno kombinační místo protilátky, schopné imunoreakcc s určitým epilopem. Monoklonálni protilátka tak typicky vykazuje jedinou vazebnou afinitu pro libovolný epitop, se kterým je imunoreaktivní. Monoklonálni protilátka tedy může obsahovat molekuly protilátky, mající více kombinačních míst protilátky, každé z meh imunospecifické pro různý epitop, např. bispecifické monoklonálni protilátky
Monoklonálni protilátka je typicky složena z protilátek, produkovaných klony jediné buňky, nazývané hybridom, které vylučují (produkují) pouze jeden druh molekul protilátky. Buňka hybrídomu |e vytvořena fůzí buňky produkující protilátku s myelomem nebo jinou sebeopakující buněčnou linií. Příprava těchto protilátek byla poprvé popsána v Kohler and Milstein, • · · · * ·
Nátuře. 256: 495-497 (1975), jejíž popis je zde zahrnut jako reference. Další metody jsou popsány v Zola, Monocional Antibodie.v. A Manual of Techniques, CRC Press, lne. (1987) Takto připravený hybridom se pak zkoumá, zda obsahuje molekuly protilátky, imunoreagující s α.νβ5 a zda inhibuje vázání ανβ5 k přirozeným ligandům.
Krátce, k vytvoření hybrídomu, ze kterého se vyrábí přípravek obsahující monoklonální protilátku, myelom nebo jiná sebc-opakujíci buněčná linie je fúzován s lymfocyty, získanými ze sleziny savců, hyperimumzovaných zdrojem ανβί
Upřednostňuje se to, aby buněčná linie myelomu, použitá pro přípravu hybridomu, byl ze stejného druhu jako lymfocyty. V typickém případě je preferovaným savcem myš kmene 129 G1X’ Vhodné myší myelomy pro použití podle tohoto vynálezu zahrnují hypoxanthinaminopterin-thymidin citlivou (HAT) buněčnou linii P3X63-Ag8 653 a Sp2/0-Agl4, která je dostupná od Američan Type Culture Collection, Rockvilie, MT) pod označením CRL 1580 popř CRL 1581.
Splenocyty jsou typicky fúzovány s buňkami myelomu za použiti polyethylenglykolu (PEG) 1500. Fúzované hybridy jsou vybrány podle jejich citlivosti na HAT. Hybridomy produkující monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu jsou identifikovány s použitím enzyme Imked ímmunosorbent assay (EL1SA), jejíž varianty jsou popsány v Příkladech provedení
Monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu mohou být také vyrobeny iniciací monoklonální hybridomové kultury, zahrnující živné médium obsahující hybndom, který vylučuje molekuly protilátky s odpovídající specifitou. Kultura je udržována za takových podmínek a tak dlouho, aby hybndom mohl vyloučit molekuly protilátky do média. Médium obsahující protilátky je pak sebráno a molekuly protilátky jsou dále izolovány dobře známými technikami.
Média vhodná pro přípravu těchto přípravků jsou velmi dobře známá v oboru, jsou komerčně dostupná a zahrnují syntetická kultivační média, narozené myši a pod. Příkladem syntetických médií je Dulbecco’s minima! essential medium (DMEM, Dulbecco et al., Viroí, 8 396, 1959) doplněné 4,5 gm/l glukózy, 20 mM glutaminu a 20% sérem telecího plodu. Příkladem narozených myši je kmen Balb/c.
Další metody výroby monoklonální protilátky, buněk hybridomu nebo kultury hybridomových buněk jsou také dobře známy Viz. například metody izolace monoklonálních protilátek z imunologického repertoáru podle popisu Sastry et al., Proč. Naíl. Acad. Sci., USA, 86: 5728-5732 (1989) a Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989)
Tento vynález také uvažuje buňky hybridomu a kultury, obsahující buňky hybridomu, které produkuji monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu Obzvláště preferovaná je buněčná * * linie hybridomu, která vylučuje monoklonálni protilátku mAb P1F6 a mAb P5H9, jejichž příprava je popsána v Příkladech provedení.
Vynález v jednom svém provedení uvažuje monoklonálni protilátku, která má imunoreakční charakteristiky mAb P1F6 nebo mAb P5H9.
Je také možné bez velkého experimentování určit, zda monoklonálni protilátka má stejnou (to jest ekvivalentní) specifitu (imunoreakční charakteristiky) jako monoklonálni protilátka podle tohoto vynálezu, a to zjištěním, zda prvně zmíněná protilátka brání protilátkám podle vynálezu ve vázání k předem vybraným cílovým molekulám. Soutěží-li testovaná monoklonálni protilátka s monoklonálními protilátkami podle tohoto vynálezu ve standarní kompetiční zkoušce na vázání k cílové molekule, je-li přítomna v pevné fázi, je pravděpodobné, že se dvě monoklonálni protilátky váží k témuž epitopu nebo k epitopu velmi blízkému.
Další cesta k určení, zda monoklonálni protilátka má specifitu monoklonálni protilátky podle tohoto vynálezu, je inkubace monoklonálni protilátky podle tohoto vynálezu s cílovou molekulou, která je normálně reaktivní, a poté je přidána testovaná monoklonálni protilátka, přičemž se zjišťuje, zda je ínhibováno vázání testované monoklonálni protilátky k cílové molekule. Je-li testovaná monoklonálni protilátka inhibována, pak je pra\'děpodobné, že má stejnou nebo funkčně ekvivalentní epitopickou specifitu jako monoklonálni protilátka podle tohoto vynálezu
Další cesta k určení, zda monoklonálni protilátka má specifitu monoklonálni protilátky podle tohoto vynálezu, je zjištění aminokyselinové sekvence CDR oblasti zkoumaných protilátek Molekuly protilátky mající identickou nebo funkčně ekvivalentní aminokyselinou sekvenci CDR oblasti máji stejnou specifitu vázání. Metody sekvencování polypeptidů jsou v oboru velmi dobře známé.
Imunospecifita protilátky, její schopnost vázat cílovou molekulu a afinitu, kterou daná protilátka vykazuje pro epitop jsou definovány epitopem, s nímž protilátka imunoreaguje. Epitopická specifita je alespoň částečně definována aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce imunoglubulinu protilátky a Částečně aminokyselinovou sekvencí variabilní oblasti lehkého řetězce.
Použiti termínu „mající vazebnou specifitu k“ naznačuje, že ekvivalentní monoklonálni protilátky vykazují stejnou nebo podobnou imunoreakční (vazebnou) charakteristiku a soutěži při vázáni na předem vybranou cílovou molekulu.
Humanizované monoklonálni protilátky nabízí obzvláštní výhody před myšími monoklonálními protilátkami, zvláště pokud mohou být terapeuticky využity v lidské medicíně.
··
9 9 • 9 99
Přesněji, lidské protilátky nejsou vylučovány z krevního oběhu ták rychle jako „cizí“ antigeny. Kromě toho, lidské protilátky neaktivuji imunitní systém stejným způsobem jako cizí antigeny a cizí protilátky. Způsoby přípravy „lidských“ protilátek jsou obecně žňámé v.oboru a mohou být snadno aplikovány na protilátky podle tohoto vynálezu.
Vynález tedy uvažuje, v jednom ze svých provedení, monoklonální protilátku podle tohoto vynálezu, která je· humanizována transplantací, aby byly zavedeny složky lidského imunitního systému bez podstatné interference se schopnosti protilátky vázat antigen.
3. a,.[fy-specificka mimetika
Tento vynález demonstruje, že avps antagonisté mohou být obecně použity v tomto vynálezu. Antagonisté mohou zahrnovat polypeptidy, protilátky a dálší molekuly označované jako „mimetika“, které mají Schopnost interferovat s funkcí av$s Zvláště preferovány jsou antagonisté, kteří specificky interferují S funkcíajfy a neiňterferují s funkcemi ostatních integnnů.
V tomto kontextu jc ceněn fakt, že pro použití podle popsaných metod může být vhodné množstvíjěinidel, pokud tato činidla vykazují požadovanou biologickou aktivitu .Tato činidla jsou obecně popisována jako mimetika, vzhledem k tomu, že vykazují schopnost „mimikovat (napodobovat)“ ανβ5 ligand, zúčastněný ve funkčních interakcích receptoru a ligandu, blokováním vázací domény receptoru a tím rušením (to jest iňhib ováním) normální funkce. V alternativním provedení může být avp5 antagonista mimetikem receptoru spíše než jeho ligandu.
Mimetikem je libovolná molekula, jiná než protilátka nebo peptid odvozený od . ligandu, vykazující výše popsané vlastnosti. Může to být syntetický analog peptidu, sloučenina tvarovaná jako vazebná kapsa výše popsané vazebné domény; nebo jiná molekula. Preferovaná mimetika podle tohoto vynálezu jsou organické molekuly a proto še o nich mluví jako o organických mimetikách. Zvláště preferované molekuly organických mimetik, fungujících jako α.νβ? antagonisté, tím že napodobují ligand ανβ5, jsou Sloučeniny 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 a 18 podle popisu v Příkladu 10.
Design ανβ5 mimetik může být proveden libovolnou variantou metod strukturní analýzy pro design léku, která je známa vdaném oboru, včetně molekulárního modelování, dvoudimenziónáiních nukleárně magnetických rezonančních riietod (2-D NMR), x-ray krystalografie, náhodným screeningem peptidů, peptidoyých analogů nebo jiilýčh knihoven chemických polymerů popř. podobnými metodikami návrhu léků.
-3,1Se zřetelem k rozsáhlým strukturním důkazům předložených v této specifikaci, ukazujících, že ανβί antagonisté mohou být malé polymery, monoklonální protilátky nebo organické molekuly s velmi rozdílnými chemickými strukturami, sdílejícími společnou funkční vlastnost selektivní inhibice ανβί, nemusí být struktura těchto α,.βί antagonistů užitečných podle tohoto vynálezu omezena na vyjmenované struktury, ale zahrnuje libovolné ομβ? mimetikum podle zde uvedené definice
F. Metody identifikace antagomstů ανβί
Vynález také popisuje způsoby zkoušení identifikace kandidátů ανβ< antagomstů pro použití podle zde popsaných metod. Ve způsobech zkoušení případných molekul je vyhodnocována jejich schopnost inhibice vázání ανβ^ k přirozeným hgandům a dále je vyhodnocována jejich schopnost inhibice angiogeneze ve tkáních
První metoda měří angiogenezi v kuřecí chonoallantoické membráně (CAM) a je nazývána CAM zkouška. CAM zkouška byla detailně popsány jinými autoiy a dále byla použita k měřeni jak angiogeneze tak i neovaskularizace tumorových tkání Viz. Ausprunk et al , Am. J. Paíhol., 79: 597-618 (1975) a Ossonski et al, Cancer Pes., 40: 2300-2309 (1980)
CAM zkouška je dobře prozkoumanou modelovou zkouškou pro m vivo angiogenezi, protože dochází k neovaskulanzaci celé tkáně. Krevní ccvy kuřecího embrya rostou do CAM nebo do tkáně rostoucí na CAM.
Jak jc zde ukázáno, CAM zkouška ilustruje inhibici neovaskularizace založenou jak na množství tak na stupni nůstu nových cév. Kromě toho, je snadné monitoroval růst libovolné tkáně, transplantované na CAM, jako třeba tkáně nádorové. Konečně, zkouška je obzvláště užitečná kvůli tomu, zeje zde interní kontrola toxicity zkoušeného systému. Kuřecí embryo je vystaveno všem testovaným činidlům Zdraví embrya je tedy jako takové indikátorem toxicity.
Druhou zkouškou, která měří angiogenezi je in vivo model králičího oka, který je nazýván zkouškou králičího oka. Tato zkouška byla detailně popsána jinými autory a byla dále používána jak k měření angiogeneze tak i neovaskularizace v přítomnosti inhibitorů angiogeneze, jako třeba lhalidomidu. Viz. D’Amato, et al. Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 91: 4082-4085 (1994)
Zkouška králičího oka je velmi dobře uznávaný zkušební model pro in vivo angiogenezi, protože neovaskularizační proces, který je znázorněn růstem králičích krevních cév z okraje směrem do rohovky, je snadno viditelný přes přirozeně průhlednou rohovku králičího oka Kromě ···♦»9 • · ;
• ♦ ·9 ·· ·· ·· · ·· ·· • · · · · · • · · ·*9· • «··» > «·* φ» ··· 9 ·· ·♦ · 99·» toho, jak množství tak i stupeň stimulovaní inhibice neovaskutarizace nebo regrese neovaskularizace může být v čase snadno monitorován.
Konečně, králík je vystaven všeiíi testovaným činidlům a jeho zdraví je jako takové ukazatelem toxicity testované látky.
Třetí zkouška měří inhibici přímého vázání přírodního ligandu vitronektinu k ανβ5 a preferované provedení vynálezu je detailně popsáno v Příkladech provedení. Zkouška typicky měří stupeň inhibice vázání přirozeného ligandu, jako je vitronektin, k izolovanému ανβ5 v pevné fázi pomocí EL1SA, jehož inhibice je zprostředkována c^Ps-specifickou inhibici.
Zkouška také může být použita pro identifikaci sloučenin, které vykazují, specifitu pro ανβ5 a nemhibují přirozené ligaňdy při vázání ostatních integriny Zkouška, spécifity je prováděna paralelními EL1SAstanoveními, kde jsou v oddělených komorách zkoumány ανβ5 a jiné integriny na jejich příslušné schopnosti vázat přirozený ligand a kde se hledá kandidát sloučeniny pro inhibici příslušných schopností integrinů, vázat se k předem vybranému ligandu. Preferované způsoby screéningu pn zkouškách jsou popsány v Příkladech provedení .
4 . ' *
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady vztahující se k tomuto vynálezu jsou pouze ilustrativní a nelze je Samozřejmě brát jako výčet limitující vynález. Kromě toho, takové variace vynálezu (hyni známé nebo vyvinuté později), které by byly zřejmé odborníkům v oboru, je třeba brát tak, že spadají do rozsahu působnosti níže uvedených nároků tohoto vynálezu.
I. Příprava av3}-spccifických monoklonálních protilátek
Monoklonálni protilátky PI F6 a P5H9 byly vyrobeny s použitím metod standardního hybřidomu imunizací na RBF/DnJ myši s buňkami rakoviny plic A549 podle popisu Wayner et al.,
J. Cell. BioL, 143: 919-929 (1991), který jé zde zahrnut jako reference. Z imunizované myši byla odejmuta slezina a fúzována s buňkami myelomu Ns-l/FOX-NY. Hybridomy produkující protilátku směřovanou do rakovinných buněk vitronektinových receptorů byly podrobeny sereeningu specifickou inhibici UCLA-P3 adheze k povrchům pokrytým vitronéktiňem, jak je popsáno v Wayner et ál., a byly klonovány omezeným ředěním na thymocytových živných vrstvách.
Bylo Ukázáno, že jak monoklonálni protilátka PÍF6 tak i P5H9 specificky imunoreagují s α,νβί komplexem a nereagují s av subjednotkou, s β5 subjednotkou nebo s jinými integriny
-22»··· *4 *4 4 »« **· · 4 · * Φ Β · • 4 · Φ 4 Φ Φ · · Β· ♦ · Β · Φ 4 ΦΦΦ· · ··· Β * * · Β · φ φ Β Β « φ· 44 ·· 4 44 β·
Monoklonální protilátka Ρ1F6 je komerčně dostupná od Gibco BRL (Life Technologies, Ihc., Gaithersburg, MD) a monoklonální protilátka P5H9 je dostupná od Dr. E. Wayner a Fred ' Hutchinson Cancer Research Institute, Seattle, WA.
Jiné ctvpj monokloriálni protilátky pro použití v tomto vynálezu jsou derivovány a charakterizovány podle zde uvedeného popisu. Kromě toho jsou ανβ< monoklonální protilátky produkovány fúzí sleziny, izolované zmysí, které byly imunizovány s ανβ? receptářem buď v surovém nebo přečištěném stavu. Čistění Ονβί je velmi dobře známá procedura pro normálně vzdělané odborníky v oboru integrinovc biologie a byla také popsána v Smith et al., J. Biol. Chem., 265: 11008-11013 (1990), což je zde zahrnuto jako reference. Jakmile je přečištěn, izolovaný receptor jé připraven jako imunogen pro imunizaci myší podle popisu v Sekci E2 a je v podstatě připraven podlé popisu v Kohler a Milsťein, Nátuře, 256: 495-497 (1975), které jsou zde zahrnuté jako reference. Vzniklé hybridomové klony jsou podrobeny screeningu na reaktivitu s imunogenem a jsou poté charakterizovány podle popisu v následujících příkladech.
2. Charakterizace specifity ariti-av05. monpklonálnich protilátek a použití v mapování distribuce tkání při avps expresi
A Specifita na vitronektin
Wayner et al:, J. Cell. Biol, 113: 919-929 (1991) ukázal, že P5H9 monoklonální protilátka připravená v Příkladu 1 blokuje připojení rakovinných buněk UCLA-P3 k vitronectinu, přičemž neovlivňuje spojení buftěk s kolagenem nebo fibronektinem. Bylo ukázáno, žé stejné buňky obsahuji pouze θνβ5 vitronektinový receptor a nikoliv receptář s Ονβί spécifitou, způsobují imunipreeipitaci heterodimeru, skládajícího se ζ ά řetězce (160 kD) a β řetězce (95 kD) s neredukujícimi podmínkami. Bylo také ukázáno, že ανβ5 receptor detekovaný pomocí P5H9, zprostředkovává ádhezi buněk melanomu M21 a buněk karcinomu H2981 k vitronektiriu. Monoklonální protilátka P1F6 má stejný profil imunoreaktivity.
B. Iraunofluorescence s protilátkami anti-integrninového receptorů
Během hojení se zranění základní membrány krevních cév exprimují několik adhesivních proteinů, včetně von Willebrandova faktoru, fibronektinu a fibrinu. Kromě toho je expům o ván o několik Členů integrinOvé rodiny adhezních receptářů ná povrchu^kultivovaných buněk hladkého svalstva a endothelu Viz. Cheresh, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 84: 6471 (1987); Janat et al., J. Cell. Physiol., 151: 588 (1992)a Cheng et al., J. Cell Phyšiol., 139: 275(1989).
444444 • * « · « * · • · · · 4 444
4 4 4·· 4 «444* • · · · ♦4 • 4 4 4·«·
Kromě stiuktury a funkce integrinové βί subjednotky byla popsána v Pasqualini et al, J. Cell. Sel, 105. 101-111 (1993) distribuce subjednotky ve tkáních mapováním s ostatními anti-05 monoklonálnimi protilátkami, přičemž je zde zahrnut jako reference.
Specifické monoklonáiní protilátky β5 podjednotky, podobné těm, které jsou popsány v Příkladu I, byly vylučovány z hybridomů, připravených za použití splenocytů z myši, která byla imunizována s buněčnou limílidskou rakovinnou plic A549 Hybndomy byly vybrány pozitivním povrchovým barvením buněk A459 s kulturou hybridomů a imunoprecipitací ανβ5 komplexů z povrchově značeného extraktu A549. Monoklonáiní protilátky byly poté použity k mapováni distribuce β<, subjednotky ve tkáních normálního lidského thymu, kůže a ledvin Čtyři mikrony široké řezy byly odříznuty ze zmrzlých bloků tkáně na kryostatovém mikrotomu pro následné streptavidin-biotinové, imunoperoxidázové barveni s protilátkami specifickými pro βί integnny, což bylo provedeno stejně jako v popisu Pasqualth et al.
Barveni řezů ze Štítné žlázy ukázalo distribuci β5 v krevních cévách, Hassalově tělísku, kortikáfních a medulárních stromálních buňkách a základních membránách. Řezy z kůže ukázaly [K v bazálni vrstvě epidermu a na stěnách některých dermálních krevních cév. Řezy z ledvin ukázaly zabarvení glomerulárních oblastí, rovnovážného aparátu, proxnnální konvoluční trubice a sběrných trubic Distribuce β5 je tedy heterogenní pro různé buněčné typy a pro buňky kapilárního endothelu, jejichž zabarvení bylo konsistentní se zabarvením kultivovaných endothelových buněk žíly pupeční šňůry.
C. lniunofluorescencc tkáně lidské sítnice od pacienta s oční chorobou s protilátkami integnnového receptoru
Oční neovaskularizace je nejběžnější patologickou změnou pozorovanou ve velké většině případů očních nemocí, které vedou ke katastrofické ztrátě vidění. Růst nových krevních cév z již existujících choroidálních, retinálních nebo paralimbálních cév může vest k otokům, krvácení nebo vzniku fibrovaskulární membrány, vedoucí k narušení normálních anatomických vztahů oka a tím ke ztrátě normálních zrakových funkcí.
Za fyziologických podmínek je angiogeneze vysoce regulována a bylo ukázáno, že je aktivována specifickými angiogenickými cytokiny, jako jsou růstový faktor základního fibroblastu (bFGF) a faktor a nádorové nekrózy (TNF-α). Jak bylo popsáno vBrooks et al, Science, 264: 569-571 (1994), bylo ukázáno, že monoklonáiní protilátky proti av[h blokují bFGF- a TNF-otindukovanou angiogenezi v modelovém systému zahrnujícím níže popsaný CAM model. Jak je nepopsáno v Příkladech 4-6, monoklonálni protilátky proti α„βί blokují samostatnou reakční cestu angiogeneze, přesněji tu, která je indukována růstovým faktorem vaskulárniho endothelu (VEGF), transformačním růstovým faktorem-α (TGF-ct) a epídermálním růstovým faktorem (EGF).
Jak je tedy popsáno zde v souvislosti s tímto vynálezem, dvě reakční cesty angiogeneze jsou definovány různými integriny ανβ3 a ανβ?. Aby bylo možné zkoumat expresi a úlohu těchto integnnů v lidské oční nemoci, byla získána en hloc vitrektomií epiretinální neovaskuJární membrána a subretmálni naovaskulárni membrána od pacientů s proliferativní diabetickou retinopathií (PDR). Tito pacienti byli klinicky sledováni a byli vybráni pro histologické stanovení na základě přítomnosti aktivní proliferativní neovaskulární nemoci, dokumentované klinickými zkouškami a základní fluorcsceinovou angiografií. Získaná tkáň byla ihned zmražena v Tissue Tek kryopreservátoru a byla rozřezána na řezy.
Když byla zkoumána tkáň z tohoto pacienta pomocí imunofluorescence, krevní cévy byly pozitivní na integnn ανβ3 jak bylo indikováno imunoreaktivitou s myší monoklonálni protilátkou LM609. Distribuce mtegrinů se zdá být omezena na krevní cévy a shoduje se zbarvením pomocí značky krevních cév, Willebrandova faktoiu, jak bylo zmapováno s králičí protilátkou tohoto faktoru. Místa imunoreaktivity byla zviditelněna buď s anti-myším imunogiobulinem konjugovaným s rhodammem nebo s anti-králičím imunogiobulinem konjugovanym s fluoresceinem, jejichž použiti dovoluje společnou lokalizaci rozmístění integnnů a protilátek specifických pro krevní cévy.
Vzorky získané z normálních očí nebo z pacientů s atrofickými membránami bez aktivně proliferujicich krevních cév byly při imunofluorescenci negativní na integnn ανβ3.
Zároveň byly stejné tkáně analyzovány imunohistochemicky na přítomnost a distribuci otJE pomoci anti-a.vp3 monoklonálni protilátky P1F6, připravené v Přikladu 1. Zbarveni odhalilo, že α,νβ? byl přítomen v krevních cévách, kde jsou lokalizovány společně s Willebrandovým faktorem. Nevaskulární tkáně ovšem také vykazují omezenou fluorescenci s P1F6 protilátkou, což indikuje širší distribuci ανβν To bylo v kontrastu s výskytem ανβ3, který je omezen na krevní cévy.
Když bylo imunofluorescenčni zabarvení membrán srovnáno mezi cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-Val) a α.νβ5 s odpovídajícími protilátkami LM609 a P1F6, charakter zabarveni stěn krevních cév byl vlastně identický, což naznačuje, že jak ανβ3 tak i ανβ< jsou rozprostřeny na povrchu nově proliferujicich lidských krevních buněk v neovaskulárních očních nemocech, jako je třeba diabetická retinopatic.
Zde popsané výsledky tedy ukazují, že receptor ανβί integrinu je selektivně exprnnován v určitých typech tkání, ve kterých dochází k angiogenezí, například takových, které nacházíme v neovaskulárních membránách u pacientů, majících aktivní proliferativní neovaskulární onemocnění. Tyto tkáně, společně s tkáněmi vystavenými určitým růstovým faktorům podle níže uvedeného popisu v Příkladech 4-6 tedy poskytují ideální cíle pro terapeutické aspekty tohoto vynálezu
3. Příprava syntetických peptidu
Cyklické polypeptidy použité v prováděni metod podle tohoto vynálezu byly syntetizovány s použitím standardních syntetických technik na pevné fázi, jako třeba metody popsané v Merrifield, A/i’. EnzymoL, 32: 221-296 (1969) a Fields, G. B a Noble, R. L., lni. Pepíide Protein Res. ,35161-214(1990).
Dva gramy (g) BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phc-Val-OMe (SEQ ID No I) byly rozpuštěny v 60 ml methanolu a bylo přidáno 1,5 ml 2 N roztoku NaOH za vzniku směsi. Směs pak byla míchána 3 h při 20 °C. Po odpařeni byl zbylek rozpuštěn ve vodě, okyselen s ředěnou HC1 na pH 3 a extrahován s ethylacetátem. Extrakt byl sušen nad Na2SO4, opět odpařen a vzniklý BOC-Arg-GlyAsp-D-Phe-Val-OH (SEQ ID No 2) byl míchán 2 h při 20 °C s 20 ml 2N HC1 v dioxanu. Vzniklá směs byla odpařena za vzniku H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH (SEQ ID No 3), který byl následně rozpuštěn ve směsi 1800 ml dichlormethanu a 200 ml dimethylformamidu (DMF) a ochlazen na 0 °C. Poté bylo postupně za míchání přidáno 0,5 g dicyklohexylcarbodnmidu (DCC1), 0,3 g 1hydroxybenzotriazolu (HOBt) a 0,23 ml N-methylmorfoiinu.
Vzniklá směs byla míchána dalších 24 h při 0 °C a poté dalších 48 h při teplotě 20 °C Roztok byl zakoncentrován a nechán reagovat s iontoměmči, aby se odstranily soli Po odstraněni vzniklých pryskyřic filtrací byl vyčištěný roztok odpařen a zbytek byl čištěn chromatografií za vzniku cyklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (také popisován pomoci pismenného kódu jako cRGDfV) (SEQ ID NO 4). Malá písmena v názvu peptidu indikují D formu aminokyseliny a nikoliv L formu, která je označena velkými písmeny.
Cyklický kontrolní peptid, cyklo(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (také popisován jako RSDfV) (SEQ ID No 5) byl připraven podle výše uvedeného popisu. O cyklickém peptidu c-RADfV (SEQ ID No 5) bylo již dříve ukázáno, že inhibuje vázání fibrinogenu k integrinu ανβ? a že nemhibuje i 1
-2'Λ vázání fibrinogenu k integnnům a α^βι (PfafT, et al., 7. Biol. Chem., 269: 20233-20238, 1994).
Další peptidy, které jsou specifickými inhibitory vázání přirozených ligandu k jsou připraveny podobně pro testování specifity a rozsahu aktivity podle popisu v následujících příkladech Tyto zahrnují následující podobně připravené peptidy: cykio(Gly-D-Arg-Gly-AspPhe-Val) (SEQ ID No 6) a cyklo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID No 7). Peptidy majici sekvenci aminokyselin Tyr-Thr-Ala-Giu-Cys-Lys-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe (SEQ ID No 8) a cyklo(Arg-Gly-Asp—D-Phe-Asn-MeVal) (SEQ ID No 9) byly také synteticky připraveny. V SEQ ID No 9 označuje v MeVal prefix „Me“, že valin v poloze 6 je methylován.
Inhibice angiogeneze vyvolané růstovým faktorem s aJJs antagonisty podle in vivo stanoveni v modelu králičího oka
Efekt anti-ανβ? antagonistů na angiogenezi vyvolanou růstovým faktorem může být pozorován v přirozeně transparentních strukturách jak bylo dokázáno na oční rohovce. Růst nových krevních cév z okraje rohovky, která má bohaté krevní zásobení, směrem do centra rohovky, které normálně nemá krevní cévy Stimulátory angiogeneze jako třeba VEGF a TGF-a, jsou-h aplikovány na rohovku, indukují růst nových krevních cév z okraje do středu rohovky. Antagonisté angiogeneze, aplikované na rohovku, mhibují růst nových krevních cév z okraje rohovky. Rohovka tak podléhá angiogenezi prostřednictvím invaze buněk endothelu od okraje rohovky do tuhé korneálni tkáně s kolagenem, což je snadno viditelné. Modelové stanovení na králičím oku tedy poskytuje in vivo model pro přímé pozorování stimulace a inhibice angiogeneze, následující po implantaci sloučenin přímo do rohovky oka.
A. In vivo modelové stanoveni na králičím oku
1) Angiogeneze vyvolaná růstovými faktory
Angiogeneze byla indukována in vivo v modelovém stanovení na králičím oku s růstovými faktory a je popsána v následujícím textu.
a) Příprava hydronových pilulek obsahujících růstový faktor a monoklonálni protilátky
Pilulky z polymeru Hydronu obsahující njstový faktor a monoklonálni protilátky (mAbs) byly připraveny podle D’Amato, et al., Proč. Nati. Acad. Set., 91: 4082-4085 (1994) Jednotlivé pilulky obsahují 750 ng růstového faktoru (také nazývaný cytokinem), přesněji buď bFGF nebo
9999 *9 V ·· 99
• 9 • • • « · * •
9 9 9 • • • · • · • 9
• • • 9 • • • ··· • 9
• ♦ • • 9 • • • 9 •
• 9 99 • 9 • «9 99
VEGF, navázaný na sukralfátu (carafátu) (Carafct, Marion Murrrell Dow Corporatioň, Cincinnati, OH) kvůli stabilizaci cytokinů a k zajištění jejich pomalého uvolňování dó obklopujících tkání. Kromě toho byly připraveny hydronové pilulky, obsahující buď 40 gg mAb P1-F6 (anti- ανβ5) nebo kontrolní protilátku LM609 (anti-ανβ.Ο v PBS.
Všechny testované mAbs byly čištěny z kapaliny ascites s použitím Protein-A Sepharóza CL-4B afinitni kolonové chromaťografie podle dobře známých metod. Eiuovaný imunoglóbulin byl poté dialyzován proti PBS a nechán reagovat s Detoxi-gelem (Pierce Chemicáls, Rockford, 11) kvůli odstranění endotoxinu. Ukázalo se, že endotoxin. je silným ángiogenickým a zánětlivým stimulahtem. Byly proto testovány monoklonální protilátky ňa přítomnost endotoxinu s „Chromogenic Limulús Ámebocyté Lysáte Assay“ (BioWhittakcr Wálkersville, MD) a pouze ty mAbs bez dctekovatelného endotoxinu byly použity v modelovém stanoveni na králičím oku.
Pilulky byly zalisóvány do speciálně připravených Teflonových kolíků, které měly do povrchu vyvrtané 2,5 mm jádro. Přibližně 12 μΐ žalispvanéhó.materiálu bylo umístěno do každého kolíku a polýmerizováno přes noc ve sterilní digestoři. Pilulky byly poté sterilizovány UV zaremm. .* I . >
Byla použita série osmi malých živočichů pro zdvojené oční experimenty, kde každé ze zvířat dostalo Hydronový implantát, obsahující předem vybraný cytókin s vybranou protilátkou nebo kontrolním imunoglobulinem. Přesněji byla u každého králíka jedna rohovka chirurgicky implantována Hadronovou pilulkou, obsahující buď bFGF nebo VRGF v konjugaci s mAb P1F6 a druhé rohovce byla aplikována bFGF nebo VEGF v konjugaci sMAb LM609. Jednotlivé pilulky byly implantovány do chirurgicky vytvořených „kapeš“, vytvořených v Centrální části rohovky králíka. Chirurgický výkon byl proveden s pomocí sterilních postupů s využitím operačního mikroskopu Wild model M69, vybaveném děličem paprsků, ke kterému byla přidělána kamera pro fotografické nahrávání jednotlivých rohovek. 3 až 5 mm kapsa byla vytvořena vkorneální stromě vytvořením 3 mm řezu do poloviny tloušťky rohovky s čepelí Beaver 69. Stroma byla rozřezána na okrajích s využitím duhovkové špachtle a byla implantována pilulka s vnějším okrajem 2 mm od limbusu.
Během následujících 12 dnů difundovaly cytokin a mAbs z implantované pilulky do okolní tkáně, což mělo účinek na angiogénezi ód okraje rohovky.
Levá a pravá rohovka jsou v dalším popisovány jako OS a ÓD. Rohovky byly pozorovány 12 dnů. Byly pořízeny fotografie 10. pooperační den, tedy v čase, kdy je néovaskuiarizace největší.
• · · ·
- 29Reprezentativní fotografické výsledky výše popsaného děje se směsí cytokin/mAb jsou ukázány na Obrázku 1A-D Současné kvantifikace mAb inhibice cytokínem-índukované angiogeneze je ukázána v Obrázcích 2A a 2B. Na obrázcích 1Λ a 1D, kde byla rohovka vystavena kombinaci bFGF/PlF6 popr VEGF/LM609, je významná cytokinem vybuzená angiogeneze s edemem, jak je indikováno velkými šipkami. Proto není ανβ< protilátka P1F6 účinná pň inhibici bFGF-mdukované angiogeneze. Podobně, protilátka ανβ5 LM609, není účinná při inhibici VEGF-indukované angiogenezei.
Oproti tomu, pn použití cytokin/mAb kombinace bFGF/LM609 a VEGF/P1F6 na králičím modelu, cytokinem indukovaná angiogeneze byla inhibována protilátkami, jak je shrnuto na obrázcích 1B popr 1C Na těchto obrázcích jsou ukázány normální konjuktivní limbální cévy označené malými šipkami, přičemž indikují efektivitu integrinových protilátek při inhibici jednoho typu cytokiny-indukované angiogeneze.
Učmky specifické mAb mtegnnové imunoreaktivity na výše zmíněnou cytokinyindukovanou angiogenezi je ukázána na Obrázcích 2A a 2B Angiogeneze byla stimulována s bFGF nebo VEGF jak je ukázáno na Obrázcích 2A popr. 2B. Zkoumané oči byly fotografovány denně pomocí Wildova operačního mikroskopu osazeného kamerou Nikon. Fotografie byly zaznamenávány na pozitivní film Kodak Ektachrome 64T a obrázky byly konvertovány pro komputerovou kvantifikaci s využitím softwaru Bioraďs Molccular Analyst 1.1 po akvizici pomoci zobrazovacího denzitometru Model GS670 Histogramy ukazují střední neovaskulárni plochu +/- standardní odchylka (n=8 pro každé dvě série) po vystavení mAbs P1F6 nebo LM609.
Jak ukazuje Obrázek 2A, LM609 snižuje bFGF-indukovanou angiogenezi o 86% (p<0,005, párový t-test), ve srovnání s léčením párového oka stejného zvířete pomocí P1F6. Bylali použita VEGF' pro stimulaci angiogeneze jak je znázorněno na Obrázku 2B, byl získán opačný efekt, kde P1F6 redukoval střední plochu neovaskularizace o 60% (p<0,03, párový t-test), ve srovnání s okem léčeným LM609, který měl minimální efekt na VEGF-indukovanou angiogenezi
Je významné, že pouze nově cytokiny-indukované krevní cévy byly ovlivněny expozicí konkrétní mAb, zatímco již existující perilimbální cévy zůstaly neovlivněny jakoukoliv mAb, což naznačuje, že pozorované účinky jsou omezeny na nově se formující krevní cévy rohovky.
Podobná stanoveni jsou prováděna se syntetickými peptidy připravenými v Příkladu 3, jak je popsáno níže pro použiti v inhibici cytokiny-indukované angiogenezi, která je specificky korelována s ανβ<, expresi • 9
-Ι,ΰAby se potvrdily tyto výsledky, naznačující, že angiogeneze indukovaná určitým cytokinem byla ovlivňována pouze jedním typem anti-integrinové protilátky, přesněji, že ανβ5 integrinový receptor hraje roli ve VEGF-indukované angiogenezi, byl vyhodnocen ještě jeden neovaskulární model kuřecí chorioallantoické membrány (CAM) v kombinaci cytokinů a integrinových protilátek jak je popsáno v následujícím přikladu.
5. Angiogeneze v preparátu kuřecí chorioallantoické membrány (CAM)
A. Charakterizace neléčené CAM
1) Příprava CAM
Angiogeneze může být indukována na kuřecí chorioallantoické membráně (CAM) poté, co normální cmbrionická angiogeneze vymstila ve vznik zralých krevních cév. Bylo ukázáno, že angiogeneze je indukována jako odpověď na určité cytokiny nebo nádorové fragmenty, jak bylo popsáno v Leibovich et al., Nalure, 329: 630 (1987) a v Ausprunk et al., Ani. J. PathoL, 79: 597 (1975) CAM pro následnou indukci angiogeneze a její inhibici byly připraveny z kuřecích embní podle níže uvedeného popisu v Příkladu 6 s ανβ$ antagonisty podle tohoto vynálezu.
Desetidenní kuřecí embrya byla získána od Mclntyre Pouitry (Lakeside, CA) a inkubována při 37 °C a 60% vzdušné vlhkosti. Ve skořápkách na konci vajíček, přímo nad vzdušným vakem, byly udělány malé díry s pomocí malého vrtáku (Dremel, Division of Emerson Elcctric Co., Račme, Wl). Druhá díra byla vyvrtána na široké straně vajíčka v oblasti postrádající embryonické krevní cévy, která byla určena předchozím prosvícením vajíčka. U původní díry byl aplikována negativní tlak, což vedlo k vypuzení CAM z membrány skořápky a vzniku falešného vzdušného vaku nad CAM. Ve skořápce nad stlačeným CAM bylo vyříznuto I x 1 cm čtvercové okno s využitím malého modelu brusného kotouče (Dremel). Malé okno dovolovalo přímý přístup k CAM, ležícímu pod ním.
Vzniklý CAM preparát byl poté použil pro desetidenní embriogenezi, kde ustala angiogeneze. Preparát byl poté použit v tomto vynálezu pro indukování obnovené angiogeneze jako odpovědi na působení cytokinů
2) Histologie CAM
K analýze mikroskopických struktur kuřecího embrya CAM byly nařezány pro imunofluorescenční analýzu 6 jim silné řízky ze zmrzlých bloků na kryostatovém mikrotomu
Typickou pro desetidenní CAM je oblast bez krevních cév. Protože angiogeneze v CAM systému je v tomto stadiu embryogeneze potlačena, systém je vhodný podle tohoto vynálezu pro
stimulaci produkce nové vaskulatury za pomoci cytokinů z již existujících cév v sousedních oblastech do oblastí CAM momentálně postrádajících jakékoliv cévy.
Jak bylo ukázáno v CAM modelu a v následujících Příkladech, zatímco krevní cévy podléhají novému růstu při normální embryogenezi nebo při angiogenezi indukované cytokiny, krevní cévy exprimují av03 a ανβν
B Angiogeneze indukovaná růstovými faktory
Bylo ukázáno, že angiogeneze je indukována cytokiny nebo růstovými faktory jak je popsáno v příkladu 4A u modelu králičího oka. IJ zde popsaných experimentů byla angiogeneze v králičím koj neálním preparátu z Příkladu 4 podobně indukována růstovými faktory, které byly místně aplikovány do CAM krevních cév podle zde uvedeného popisu.
Angiogeneze byla indukována umístěním 5 mm x 5 mm Whatmanova filtračního disku (Whatman Filter páper No. I) saturovaného sHanks Balanced Sak Solution (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) nebo s HBSS obsahujícím předem vybrané cytokiny ve zvolených koncentracích, to jest: k testování vlivu na angiogenezi na desetidenním embryu CAM v oblasti postrádající krevní cévy a okno bylo později zalepeno páskou. Angiogeneze byla monitorována fotomikroskopií po 72 h. CAM byly vyfoceny zmrzlé, poté byly 6 pm kiyostatové řízky fixovány s acetonem a barveny imunoíluorescencí podle popisu v Příkladech 2B a 2C s 10 pg/ml vybraných anti-mtegrinových protilátek, včetně těch namířených proti ανβί podle Příkladu 1
Předcházející studie Brooks et al., Science, 264: 569-571 (1994) ukázaly, že krevní cévy jsou snadno patrné jak v preparátech ošetřených bFGF a TNF-α, ale nejsou přítomny v neošetřeném CAM Autoři také ukázali, že ανβλ exprese byla zesílena následnou bl GFindukovanou angiogenezi Zatímco exprese íntegnnu βι se neliší od té, pozorované v neléčeném CAM, β] byl také snadno detekovatelný u stimulovaných krevních cév.
Tyto publikované závěry naznačovaly, že jak u lidských tak u kuřecích krevních cév zapojených do angiogeneze je pozorována zvýšená exprese α,.βι. V souladu stím byla popsáno, že exprese ανβ3 v kultivovaných buňkách endothelu byla indukována různými cytokiny in viti o, jak bylo popsáno v Janat et al., J. Cell PhysioL, 151: 588 (1992), Enenstein et al , Exp. Cell Res., 203: 499 (1992) a Swerlick et al, J. hivesi. Derm., 99: 715 (1993).
V tomto vynálezu byla určena nová oddělená cytokinem zprostředkovaná reakční cesta pro stimulaci angiogeneze, která je závislá na expresi a aktivaci jiného adhezivního integrinového receptoru ανβ3, angiogeneze a její inhibice s ανβ; antagonistyje popsána v Příkladech provedeni.
• · · · ·»· • ·*·*·«« • · ··· · · · · . *···»«·**·· ····*
- 47 - ····*····· ♦ · · · «* · *·««
C. Angiogeneze indukovaná nádory
K výzkumu úlohy ανβ5 při angiogenezi indukované nádory byly použity různé ανβνnegativní lidské melanomové a karcinomové fragmenty při CAM stanovení, které byly původně pěstovány a izolovány na CAM sedmnástidenních kuřecích embryi podle popisu vBrooks et al, J. Cell Biol., 122: 1351 (1993) a podle popisu uvedeného v tomto vynálezu.
Angiogeneze je indukována v CAM systému přímým přiložením tumorového fragmentu na CAM. Preparát kuřecího embrya CAM je stejný jako ve výše popsaném postupu Namísto disku z filtračního papíruje umístěn na CAM do oblasti bez přítomnosti krevních cév 50 až 55 mg těžký fragment a^í-negativniho tumoru, vzniklého růstem buněčné linie níže popsané suspenze
Pro růst pevných lidských nádorů na CAM kuřecích embryích byly použity buněčné linie rabdomyosarcom, myeloid (HL-60 nebo KG-1) a lymfoid (T buňky - Jurkat, HPB/ALL, PEER a různé B buněčné linie) podle popisu v Pasquahm et al., ,7. Cel! Sci., 105. 101-111 (1993). Suspenze jedné buňky různých buněčných linií je nejdříve aplikována na CAM v celkovém objemu 30 μ] sterilního HBSS. Okna jsou zalepena páskou a embrya jsou inkubována 7 dní, aby došlo k růstu lidské nádorové léze. Po sedmi dnech je embryo sedmnáctidenní, tumory jsou vyříznuty z CAM a odříznuty od okolní CAM tkáně Nádory jsou nařezány na 50 až 55 mg fragmenty pro využiti v angiogenezi. Nádorové fragmenty jsou umístěny do nové sady desetidenních kuřecích CAM embryí podle popisu v Příkladu 5A do oblasti bez výskytu krevních cév.
Nádory narostlé in vivo na kuřecím embryu CAM, s nebo bez lokální intravenosni aplikace avPí-indukujícich cytokinů (VEGF, TGF-α nebo EGF), jsou poté barveny na (χνβ<, expresi s mAbs, P1F6 nebo P5H9 podle dříve uvedeného popisu.
Tyto CAM nádorové preparáty jsou následně zpracovávány podle popisu v Příkladech 6C a 6D pro měřeni účinků protilátek a peptidů na angiogenezi indukovanou nádory.
V jednom provedení byly použity ve výše popsaném CAM stanoveni pro formování melanoinových nádorů buňky melánomu křečka, získané od Dr. Caroline Dámsky z University of California v San Francisku Po přeneseni přibližně 50 mg CS-i nádorového fragmentu na nové desetidenní kuřecí CAM embryo, samostatné preparáty dostaly intravenózni injekce buď 100 pg nebo 300 pg protilátky P1F6, LM609 nebo kontrolní protilátky CSAT (anti-β]). Další kontrola zahrnovala preparát, který byl bez jakéhokoliv ošetření. Výsledky jsou diskutovány dále v příkladu 6D «Ι«« Η • v 4 • 4 t 4 4« 4 4 4» ♦ · « « · · · « 4* · • * ·· « · 4 4 4 4 4 4 4 4« _ C 7 _ ♦··»··· 4 ·» í 4 4 * · · * 4 44 *
6. Inhibicé angiogeneze podle měření při CAM stanoveni
A. Inhibicé angiogeneze indukované růstovým faktorem pomocí intravenózní aplikace inhibitorů
Účinek monokionálních látek intravenózně mjektovaných do CAM preparátu, na ángiogenezi indukovanou růstovým faktorem, byl hodnocen v in vivo modelovém systému podle tohoto vynálezu
Po aktivní neovaskularizaci, poté co se zastavil růst krevních cév, se snižuje exprese ανβί na úroveň, která není detekovatelná imunofluorescenčni analýzou. Tato regulace ανβί exprese v krevních cévách podléhajících ángiogenezi, která je v kontrastu s nepřítomností exprese v dospělých cévách, poskytuje unikátní možnost podle tohoto vynálezu - řídit a ínhibovat ángiogenezi jak je ukázáno níže na modelovém CAM systému angiogeneze
Příprava kuřecího CAM embrya pro intravenózní injekci byla v podstatě stejná jako ve výše uvedeném popisu.
Angiogeneze byla nejdříve indukována na desetidenních kuřecích embryích aplikací disků nasycených růstovým faktorem. Přesněji, v prvním stanovení byla angiogeneze indukována vystavením bFGF nebo VEGF, každý v koncentraci 150 ng/ml.
Pro aplikaci růstových faktorů byly během prosvecovací procedury vybrány nápadné krevní cévy a na vaječné skořápce byly označeny jejich pozice pomoci značek. Do skořápky byly vyvrtány díry, CAM byly vytlačeny a filtrační papíry napuštěné růstovým faktorem byly poté umístěny na CAM podle výše uvedeného postupu. Okénka byla zalepena sterilním páskem a embrya byla přemístěna do inkubátoru
O dvacet čtyři hodin později bylo pečlivě vyříznuto druhé okénko na straně vajíčka přímo nad dříve vybranou nápadnou krevní cévou. Vnější skořápka byla pečlivě odstraněna přičemž embrionická membrána zůstala nedotčena. Membrána skořápky byla pomoci malé kapky minerálního oleje (Perkin-Elmer Corp Norwalk, CT) zprůhledněna, což dovolilo snadné zviditelněni krvních cév Poté byl fosfátový solný pufr (PBS), 75 gg čištěné sterilní antiintegrinové protilátky nebo 75 gg syntetického peptidu (cyklický peptid RGDfV, SEQ ID No 4 a kontrolní cyklický peptid RADfV, SEQ ID No 5) v PBS byl injektován do krevních cév, patrných na CAM indukovaných růstovým faktorem. Okénka byla zalepena páskem a embrya byla ponechána inkubovat až 72 h.
1 l c > ’ I . t
Disky filtračního papíru a reprezentativní okolní CAM tkáně byly fotografovány ve stereomikroskopu (Obrázky 3A-3F a Obrázky 5A-5F) a by! určen angiogenický index +/standarní odchylka pro 12 CAM pro dané podmínky (Obrázky 4A-4B a Obrázky 6A 6B) Angiogeneze byla počítána pro každé embryo dvojitým slepým způsobem analyzováním množství a stupně rozvětvení krevních cév na ploše každého disku Počty se pohybovaly od 1 (nízká) do 4 (vysoká) a angiogenický index byl určen odečtením pozadí (1) od všech dat
Specifita mtegrinové protilátky při inhibici angiogeneze, indukované růstovým faktorem, odráží na CAM modelu totéž co již bylo popsáno výše pro model králičí rohovky Jak )e ukázáno na obrázcích 3 A a 3B, jak bFGF tak i VEGF způsobily angiogcnczi v kontrolním CAM zpracovaném sPBS, Zpracování s avp5-specifickou protilátkou P1F6 vsak vedlo k inhibici VEGF-indukované angiogeneze jak je ukázáno na Obrázku 3D, zatímco pro bFGF-indukovanou angiogenezi nebyla zjištěna žádná inhibice. Oproti tomu LM609 cuPs-specifická protilátka mhibovala bFGF-indukovanou angiogenezi (Obrázek 3E), měla ovšem jen malý vliv na angiogenezi ve VEGE indukovaných CAM (Obrázek 3F)
Tyto výsledky jsou také ukázány na sloupcových grafech v Obrázcích 4A a 4B pro CAM ošetřované bFGF a VEGF, ve kterých je angiogenický index vynesen proti expozici LM609 nebo P1F6 společně se vzorkem neošetřovaným žádnou protilátkou coby kontrolou Inhibice angiogeneze, indukované růstovým faktorem, s využitím íntegrin-specifických protilátek, je závislá na typu růstového faktoru
Expozice peptidům obsahujícím RGD podporuje výše zmíněné výsledky. V přítomnosti PI3S, jak je ukázáno na Obrázku 5A a 5B, vedla expozice bFGF a VEGF k angiogenezi v kontrolním CAM. Oproti tomu cyklický peptidový antagomsta RGDfV (SEQ ID No 4), směřovaný k ανβ? a crvp5, zrušil angiogenezi, indukovanou bFGF nebo VEGF. Cyklicky peptid RADfV (SEQ ID No 5) neovlivňuje angiogenezi jak v bFGF- nebo VEGF léčených CAM preparátů. Výsledky jsou také shrnuty v Obrázku 6A a 6B, kde je angiogenický index v CAM stimulovaných s bFGF vynesen proti expozici a testovanému kontrolnímu peptidu Tyto výsledky společně s výsledky získanými na králičí rohovce, indikují, že bFGF- a VEGF-indukovaná angiogeneze závisí na rozdílných ale homologických av-specifických integrinech, ktcrc jsou však oba inhibovány s cyklickým peptidem RGDfV
Další podobná stanovení jsou prováděna sc syntetickými peptidy připravenými podle popisu v Příkladu 3, aby byly definovány peptidy, které vykazují specifitu k angiogenezi ·«·»«· V· V vv ti • 99 9 · 9 · · ♦ «
9* * 9 9 · 9 9««
9 99« 9 «9 · 9 9 ·♦ 9 * ·
9 9 9 *99 9 9 · • 9 9 9 9 9 · ·· «9 korelované s ανβί a ne s ανβ3 Stanovení jsou také prováděna s organickými molekulami připravenými podle popisu v Příkladu 10.
Speeifita irihibice angiogeneze, vyvolané růstovým faktorem, s pomočí integrinóvých protilátek byla dále potvrzena a upevněna rozšířením indukční analýzy angiogeneze vyvolané růstovým faktorem tak, aby zahrnovala faktor-α nádorové nekrózy (TNF-a), transformační růstový faktor-a, (TGF-σ.) nebo fórbolový éster 4-pďorbolrI2-myriStát-13^acetát (PMA).
Výše uvedené růstové faktory (cytokiny), včetně bFGF a VEGF, byly Odděleně aplikovány při koncentracích 1,0 rig/ml na desetidenní CAM model podlé již uvedeného postupu. PMA byl použit při koncentracích 20 ng/ml.
Po 24 hod od aplikace růstového faktoru byly odděleně aplikovány na CAM model protilátky EM609 a PÍF6 nebo inhibitor proteinkinázy Č (PKC), calphostin C, a to buď jednou mtravaskulární dávkou podle výše uvedeného popisu nebo místní aplikací ják je popsáno níže v následujícím příkladu. Pro mtravaskulární injekce během následujících 3 dnů byly použity protilátky o koncentracích 75 pg na embryo a calphostin C v dávkách 100 hM.
Třináctý den byly disky z filtračního papíru a odpovídající CAM4'tkáně rozřezány a analyzovány na angiogenězi s pomocí stereomikroskopu. Angiogeneze byla zaznamenána dvojitým slepým způsobem analyzováním množství a stupně rozvětvení krevních cev v ploše disků. Skóre se pohybovalo od nízkého (1) do vysokého (4). Angiogenický index byl určen oďečtenini pozadí (1) od všech dat. Experimenty byly opakovány 2x áž 4x s 5-6 embryi na dané podmínky.
Jak je ukázáno v Obrázcích 7A a 7B, anti-avp3 protilátka LM609 blokovala angiogenězi v odpovědi na bFGF a TNF-α, zatímco anti-ouPs protilátka P1F6 měla malý inhibiční efekt. Oproti tomu, jak je ukázáno na Obrázcích 7C-7E, P1F6 byla efektivní při inhibici angiogeneze indukované VEGF, TGF-σ. nebo PMA, zatímco LM609 nebyla účinná.
PMA - silný inhibitor angiogeneze, je schopný aktivace proteinkinázy C (PKC), mtracelulárni rodiny senn-threoninkináz. Proto jsme také zkoušeli účinky calphostinu C (PKC inhibitoru) na angiogenězi v kuřecím CAM. Calphostin C blokoval angiogenězi indukovanou s PMA (Obrázek 7E), stejně jako sVEGF a TNF-α. (Obrázky 7C a 7D), zatímco měl jen minimální efekt na bFGF- nebo TGF-a-mediovanou angiogenězi (Obrázky 7 A a 7B).
Tyto výsledky společně indikují existenci dvou oddělených angiogeriičkých reakčních -cest, kde jedna je závislá na a^-medio váném signálu, který je z velké části nezávislý na PKC (ják bylo • · dríve popsáno vBrooks et al., Science, 264: 569-571 (1994)) a druhá reakční cesta je umožněna transdukcí avp5-mediovaného signálu, který kriticky závisí na PKC aktivaci.
Aby byla určena lokalizace P1F6 a LM609 mAbs v CAM tkáních, které byly naočkovány mtravenózně s LM609, byly kromě výše popsaných experimentů blokovány fixované řezy tkání s 2,5% BSA v HSSS po dobu 1 h při laboratorní teplotě s následným barvením s I 250 naředěnou kozí anti-myší rhodaminem označenou sekundární protilátkou (Tágo). Řezy jsou poté analyzovány s Zeissovým imunofluorcscenčním mikroskopem
B lnhibice angiogeneze, vyvolané růstovým faktorem, pomocí místní aplikace inhibitoru
Aby bylo zjištěno, zda ανβ5 hraje aktivní roli v angiogenezi, výše popsané disky z filtračního papíru nasycené růstovým faktorem jsou umístěny na CAM, aby indukovaly angiogenezi následující po aplikaci P1F6 nebo LM609.
Disky jsou poté ošetřeny s 50 ml HBSS obsahujícím 25 mg mAb v celkovém objemu 25 μ1 sterilního HBSS po 0, 24 a 48 h. Po 72 h jsou CAM ukončeny a umístěny do 35 mm Petriho misky a promyty jednou s I ml PBS. Spodní strana filtračního papíru a CAM tkáně je poté analyzována pod stereomikroskopem Olympus se dvěma pozorováními ve dvojitém slepém uspořádáni. lnhibice angiogeneze se pokládá za významnou, vykazuje-li CAM větší než 50% redukci infiltrace krevních cév pod diskem Experimenty jsou opakovány čtyřikrát pro jednu protilátku, se 6 až 7 embryi na dané podmínky.
Aby byl vyzkoušen účinek integrinových protilátek na již existující krevní cévy přítomné díky normálnímu vývoji cév v místech sousedících s oblastí postrádající cévy, disky z filtračního papíru nasycené s mAb jsou umístěny na vaskularizovanou oblast CAM u desetidenních embryi, která nedostala místní aplikaci cytokinu
CAM stanoveni jsou také prováděna se syntetickými peptidy podle tohoto vynálezu, aby byl určen účinek cyklických a lineanzováných peptidů na angiogenezi indukovanou růstovým faktorem. Osm pg peptidu, připraveného podle výše uvedeného postupu, bylo odděleně rozpuštěno v celkovém objemu 25 μΙ sterilní HBSS. Roztok peptidu je aplikován na CAM preparát bezprostředně a po 24 a po 48 h. Po 72 h byly filtryční papír a okolní tkáně rozříznuty a pozorovány podle výše uvedeného popisu.
Podobná stanovení jsou prováděna s organickými molekulami připravenými podle popisu v Přikladu 10.
4
-O? «· 4 4 4 4 4 4 4 4 · • 4 4 4 · 44444 « » 4 4 4 • 444 «4 4 » «· 1« · «4 ··
C. Inhibice nádorem indukované angiogeneze pomoci místní aplikace
1) Ošetření monoklonálními protilátkami
Kromě výše popsaných stanovení angiogeneze, kde byl vyhodnocován účinek anti-ocvPs protilátky a peptidových antagonistů, byla také zkoumána role ανβί v nádorem indukované angiogenezi. Jako índucer byly použity avPs-negativní lidské tkáně, které byly předtím pěstovány a izolovány z CAM na sedmnáctidenních kuřecích embryích. Fragmenty jsou připraveny podle popisu v Přikladu 5.
Jak bylo popsáno výše, mAb jsou odděleně místně aplikovány na nádorové fragmenty při koncentracích 25 pg ve 25 μ) HBSS a okénka jsou poté zalepena páskou. Poté jsou mAb opět přidány stejným způsobem po 24 a 48 h. Po 72 h jsou nádory a okolní tkáň CAM analyzovány podle výše uvedeného popisu
Jak je popsáno v Příkladu 5C, nádory jsou nejdříve derivovány transplantací lidských buněčných linii, které neexprimují integnn ανβ·>, na CAM desetidenních kuřecích embryi.
Aby byl kvantifikován účinek mAb na nádorem indukovanou angiogenezi, jsou pod stereomikroskopem spočteny krevní cévy vstupující do nádoru v ohniskové rovině CAM pomocí dvou pozorováni ve dvojnásobném slepém pokusu
Syntetické peptidy, připravené v Příkladu 3, a organické molekuly, připravené v Příkladu 10, jsou podobně místně aplikovány při stanoveni nádorem indukované angiogeneze na CAM systému, podle výše uvedeného postupu Efekt peptidů a organických molekul na životaschopnost cév je vyhodnocen podobně.
D Inhibice nádorem indukované angiogeneze pomocí intravenózní aplikace
1) Působení monoklonálních protilátek
Nádorem indukované krevní cévy, připravené podle výše uvedeného popisu, jsou také ošetřeny s mAb, aplikovaným intravenózní injekcí. CS-1 melanomové nádory byly umístěny na CAM podle popisu v Příkladu 5, okénka byla zalepena páskou a o 24 h později bylo očkováno 100 až 300 pg přečištěného mAb jednou intravenózni dávkou do krevních cév kuřecího embrya podle dříve uvedeného popisu. Kuřecí embrya byla poté inkubována 7 dní. Rozsah angiogeneze byl pozorován podle výše uvedeného popisu. Po této časové periodě byly nádory vyříznuty a analyzována jejich hmotnost, aby se určil efekt expozice protilátky na potlačení růstu nádoru.
Výsledky ošetřeni CS-1 nádorů s 300 mg avp<-specifické protilátky P11'6 jsou shrnuty v Obrázku 8. Hmotnost nádoru byla dramaticky redukována na méně než 50 mg ve srovnání s neošetřenými nádory zpracovanými s CSAT. ajT-specifická protilátka LM609 také mhibuje nádorový růst, avšak méně efektivně než je tomu u P1F6. Srovnatelné výsledky byly získány s nádory, které byly ošetřeny se 100 pg P1F6, P1F6 byl tedy u inhibice avp<i-mediované angiogeneze účinný při snížení hmotnosti buněčné masy nádoru.
2) Ošetřeni se syntetickými peptidy nebo organickými molekulami
Ryl také určen účinek peptidů nebo organických molekul na nádorem indukovanou vaskulaturu v CAM systému Nádorový CAM preparát je použit podle výše uvedeného popisu s tou výjimkou, že namísto intravenózní injekce mAb byly separátně mtravenózně mjektovány syntetické peptidy a organické molekuly připravené podle popisu v Příkladu 3 a 10 do viditelných krevních cév
7. Identifikace oupí-specifických antagomstů detekovaných stanovením vázáni ligandového receptoru ajiriinunoreaktivní protilátky a syntetické peptidy připravené podle Příkladů 1 a 3 jsou podrobeny sereeningu měřením jejich schopnosti působit jako antagonisté vazebné aktivity ανβ5, αυβ? a ο^βί receptoru ve stanoveni vázání dvojice čištěný receptor-ligand. Metoda pro tyto vazebné studie byla popsána v Barbas et al., Proč. Naíl. Acad. Sci., USA, 90: 10003-10007 (1993). Smith ei al,.Z Biol. Chenr, 265: 11008-11013 (1990) a PfaíTet al,.}. liiol. Chem., 269 20233-20238 (1994), které jsou zde zahrnuty jako odkazy
Je popsán způsob identifikace antagonistů při zkoušce vázání dvojice ligand-receptor, při kterém je receptor imobilizován na pevném nosiči a ligand a antagomsta jsou rozpustné. Byla také popsána zkouška vázání dvojice ligand-receptor, ve které je ligand imobilizován na pevném nosiči a receptor a antagomsta jsou rozpustné
V krátkosti: vybrané přečištěné integriny jsou odděleně mobilizovány na Titertek mikrotiter plátech v koncentraci 50 ng na prohlubeň. Čištění receptoru použitých ve zkoušce vázáni dvojice ligand-receptor je dobře známé v daném oboru a je snadno dostupné metodami, známými odborníkům v oboru. Po inkubaci 18 h při 4 °C jsou nespecifická vazebná místa na plátech blokovaná s 10 mg/ml albuminu hovězího séra (BSA) v Tris-pufrováném solném roztoku pro inhibični studie jsou testovány ni/.né koncentrace vybraných protilátek nebo peptidu na schopnost blokovat vázání i;,l-vitronektinu nebo jiného značeného ligandu k integrinovým receptorům ανβς, ανβ?, ανβι a
*9 • 4 ·4
4·« ··· ♦4
Ačkoliv tyto Jigandy vykazují optimální vázání pro určitý integrin, vitronectin pro ανβ5 a αυβ3, fibrinogen pro <x^3> studium inhibice vázání, s využitím buď protilátek nebo peptidů k blokování vázání vitronektinu k receptoru, dovoluje přesné stanovení množství peptidu vmikromolech (μΜ), potřebné k poloviční inhibici maximálního vázání receptoru kligandu. Řadiožnacené ligandy jsou použity při koncentracích 1 nM a vázání je prováděno separátně s neznačenými syntetickými peptidy. Po tříhodinové inkubaci je. volný ligand odstraněn promytím a vázaný ligánd je detekován počítačem gama záření.
Zkouška vázání dvojice ligand-receptor, která je zde popsána, je použitá ke screemngu jak cirkulárních ták i lineárních syntetických peptidů společně s monoklonálními protilátkami a organickými molekulami, které vykazují selektivní specifitu pro určitý integrinový receptor, specificky «νβί, protože se při provádění tohoto vynálezu používají aiitágonisté vitronektinového receptoru (ανβί).
8; Jn vivo zpomalení růstu nádorové tkáně s άυβί antagpnisty podle měření na modelové kombinaci myš: člověk
Jn vivo modelová kombinace myš: člověk byla vytvořena náhradou části kůže z SCID myši š lidskou néonatální pokožkou. In vivo modelová kombinace myš;člOvěk byla připravená přesně podle popisu v Yan et al., J Clin. Invesí., 91: 986-996 (1993). V krátkosti: Z 6 až 8 týdnů staré SCID myši byla chirurgicky vyjmuta čtvercová plocha kůže (2 cm2) a nahrazena lidskou pokožkou. Myš byla uspána a bylý oholeny chlupy z plochy 5 cm2 na obou stranách laterální abdominálni oblasti. Dvě knihová lůžka pro transplantáty o plose 2 cm byla připravena odstraněním celé šířky kůže až k fasciu. Dvá transplantáty plné šířky lidské kůže stejné velikosti, získané z lidské néonatální pokožky, byly umístěny na lůžka a přišity na místo. Transplantáty byly pokryty s obvazem, který byl přišit ke kůži. Poranění bylo ještě zakryto páskou z tkaniny Mi cr opore.
Po uchycení transplantátů byla lidská kůže Očkována buňkami melanomu Bylá použita buněčná linie M21L lidského melanomu k vytvoření pevných lidských nádorů na transplantátech lidské kůže u SCID myši. Suspenze jediné buňky 2x1O6 M21L byla injéktováňa mtradermálně do transplantátu lidské kůže. Myš byla poté pozorována 2 až 4 týdny, aby mohlo dojít k růstu měřitelných lidských nádorů.
Po ustavení měřitelných lidských nádorů bylo myši 3 x týdně po dobu 3 týdnů intraperitoneálně injektováno '250 ;pg peptidu (v objemu 100 μΐ), majícího SEQ IĎ No 9 (cyklický *·♦· ·· ( η - ·· *·· ···♦·· «· · « — V/ · · • · · · ·* · · * a
RGD-obsahujíci peptid Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-methylovaný Val) nebo kontrolní peptid cyklo Arg-PAla-Asp-D-Phe-Val. Po této době byly nádory vyříznuty a analyzovány vážením a pomocí histologie.
Výsledky jsou shrnuty na Obrázku 9, kde je objem nádoru v mm3 vynesen na Y ose proti použitému peptidu na ose X. Testovaný peptid mající SEQ ID No 9, označený na obrázku jako peptid 189, významně snižoval objem nádoru na přibližně 25 mm3 ve srovnání s kontrolním peptidem (označeném jako peptid 601), kde byl objem nádoru vetší než 300 mm3.
Blokování ανβ5 receptorů íntravenózní aplikací οινβί antagonisty, prplidu 189, tedy vedlo k regresi melanomu v tomto modelovém systému stejným způsobem jako bylo dříve popsáno u CAM a modelového systému králičího oka
SC1D modelová kombinace myš člověk je také použita pro měřeni efektivity jiných ανβ5 antagonistů podle tohoto vynálezu, jmenovitě protilátek a organických molekul, připravených podle Příkladu 10.
Příprava myšího modelu pro a^rmediovanou retinálni angiógenezí a inhibice této angiogeneze pomocí ανβ; antagomstů
Na základě pozorování ανβ3 a αγβ? exprese v neovaskulární tkáni rohovky z Příkladu 2C, byl použit nový myši model pro studium efektů systematicky podávaných antagonistů obou integrinů na bázi cyklických peptidů na angiógenezí rohovky. U čerstvě narozené myši se vyvíjejí cévy rohovky během prvních dvou týdnů po narozeni, během této doby formuje superficiální vaskuiatura rohovky bohatou, vysoce rozvětvenou síť cév, která má počátek v hlavě optického nervu a rozbíhá se radiálně k pokryti povrchu rohovky podobným způsobem jako bylo pozorováno u savců a lidi v Jiang et al, G/rá, 15: 1-10(1995).
Pokud jde o model, čerstvě narozené myši byly mjektovány subkutánně dvakrát denně po dobu Čtyř dnů počínaje dnem 0 s cyklickým peptidem RGDfV (SEQ ID No 4) (také označovaný jako peptid 203) nebo s kontrolním peptidem RADfV (SEQ ID No 5). Pátý den po narození byly odstraněny oční bulvy a fixovány ve 4,0% paraformaldehydu (PFA) při pokojové teplotě.
Aby bylo možné retinální angiógenezí kvantifikovat, byla měřena vzdálenost mezi hlavou optického nervu a nejvzdáienějšíin bodem jednotlivé cévy, vybrané v každém ze šesti stejných sektorů, vzniklých rozdělením pomyslných hodin (12 hodin). Byla vypočtena střední vzdálenost a zpriiměrována s podobnými daty získanými v celé sadě K měření celkového objemu retinálních krevních cév byl celý vzorek scanován po 2.0 pm sekcích a digitalizován Poté byla použita funkce „seed“ v Bio-Raďs Lasersharp softwaru ke spočtení kubických pixeiů v každé sekci. Bylo vytvořeno makro ke sčítání objemu všech částí a určení hodnot pro všechny vaskulární struktury.
Systematicky podávaný peptidový antagonista 203 inhibovai retinálni vaskulogenezi, vzhledem ke kontrolnímu peptidu o 44% (N-9, p<0,000001, párový t-test), jak bylo zjištěno přímým měřením růstu cév ve dvou dimenzích za pomoci fotografii. Nebyl pozorován žádný statistický rozdíl mezi neléčenou čerstvě narozenou myší a pětidenní myší dostávající peptid 203, takže peptid účine inhibuje vaskulogenezi Kromě toho nebyl pozorován žádný statistický rozdíl mezi neléčenou pětidenní myší a stejně starou myší dostávapci kontrolní peptid Inhibice retinálni vaskulogeneze v myších dostávajících RGDfV je 100% účinná v porovnáni se stejnými neléčenými myšmi.
S použitím více kvantitativní analýzy, za použití třídimensionální povahy cévního růstu, bylo pozorováno 78% snížení v rctinálním vaskulárním objemu u jedinců léčených peplidem 203 při srovnáni s kontrolním vzorkem. Střední objem cév u postnatálních pětidenních živočichů, léčených speptidem 203, byl 3,6 x ΙΟ6 μπ? a u kontrolních zvířat byl 15,7 x 106 μπι' Objem zabraný retinálními krevními cévami u neléčených čerstvě narozených myší byl neodlišitelný od pětidenních myší, kterým byl podáván peptid 203.
Výše získané výsledky ukazuji, že antagonisté specificky blokují formaci nových krevních cév s žádným efektem na cévy již vytvořené. Výsledky naznačují, že pathologie retinálni neovaskulární nemoci je odlišná od pathologie pozorované u subretínální neovaskulární nemoci a že antagonisté α,.β<, jsou účinné pro léčení pacientů s oční slepotou spojenou s angiogenezí
Podobná stanoveni byla prováděna s organickými mimetiky α,.β-, antagonistů podle popisu v Příkladu 10
10. Příprava organických molekul ανβ? antagonistů
Syntéza organických αυβ} antagonistů, sloučenin 7, 9, 10, 12, 14, 16, 17 a 18, je popsána níže a je také ukázána ve zmíněných obrázcích. Vzniklé organické molekuly, označované podle tohoto vynálezu jako organická mimetika, byly poté použity v metodách inhibicc ανβ5mediovaných angiogenezí.
Pro každou níže popsanou syntézu platí, že optické rotace byly měřeny na Perkin-Elmer 241 spektrofotometru, UV a VIS spektra byla zaznamenána na spektrometru Beckmann DU-70 'H a 10 * * I3C NMR spektra byla měřena na 400 a 500 MHz spektrometrech Bruker AMX-400 a AMX-500. Spektra s vysokým rozlišením (HRMS) byla změřena na hmotovém spektrometru VG ··*,···* · · *· * I 1 φ · «|··*« · · ♦ φ · • « * t · · 4 · · * • · ·· «· · Φ* ··
ZAB-ZSE za podmínek fast atom bombardment (FAB). Kolonové chromatografie byly prováděny na Silikagelu 70-230 mesh. Preparativní TLC byly prováděny s Měrek Art. 5644 (0,5
-nim). Body tání byly naměřeny na přístroji Thomas Hóověr.
A. Sloučenina 1: t-Boc-L-tyrosin benzylester podle popisu na obrázku 10
K roztoku N-(terc butoxykarbonyl)-L-tyrosin (t-Boc-L-tyrosin) (1,0 ekvivalent Aidách) v 0,10 M méthyienchlondu byl přidán dicyklóhexylkarbodiimid (DCC) ( 1,5 ekvivalent) při 25 °C a směs byla míchána 1 h. Pote byl přidán 1;5 ekvivalent benzýlalkohoju a směs byla míchána dalších 12 h při 25 °C Reakční směs byla póté naředěna ethylacetátem (0,10 M) a promyta dvakrát s vodou, jednou s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušéna nad síranem horečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno za. vakua a surový produkt byl poté čištěn pomocí sloupcově chromatografie na silikagelu. Sloučenina 1, t-Boc-L-tyrosinbenzylester může být získána také komerčně od fy. Sigma.
B. Sloučenina 2: Benzylester (S)-3-(4-(4-brombutyloxy)fenyl)-2-N-terc. butyloxykarbonyl propionové kyseliny podle popisu na Obrázku 10, krok i
Směs t-Boc-L-lyrosin benžylesteru (2 g, 5,38 mmol, syntetizovaný podle výše uvedeného popisu), 1,4-dibrómbůtanu (1,9 ml, 16,2 mmol, Aldričh), uhličitanu draselného (5 g) a 18-crown6 (0,1 g, Aldrich) byla zahřívána 12 h při 80 °C. Po ochlazení byla sraženina zfiltrována a reakční směs byla odpařena dosucha ve vakuu. Surový produkt byl poté přečištěn krystalizačí s použitím 100% hexanu za vzniku 2,5 g (92%) sloučeniny 2.
♦ 6 · · 4 4 * * <<
*•6 »644 · 4>4 • 4 4 4 4 4·»·· · 444 4«
4 4 4 * 44»6
4· 44 44 4 ··44
C. Sloučenina 3; Benžylester (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl)-2-N-tcrc. butyloxykařbonyl propionové kyseliny podle.popisu na Obrázku 10, krok ii
Sloučenina 2 (2,5 g, 4,9 mmol) byla míchána s azidem sodným (1,6 g, 25 mmol) ve 20 ml dimethylformamídu (DMF) 12 h při 25 °C. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno, zbytek byl náředěn s vodou (10 ml) a extrahován dvakrát s ethylacetátem. Organické vrstvý byly spojeny, sušeny nad MgSO4 a odpařeny za vzniku 2,0 g (90%) sloučeniny 3 jako bezbarvého sirupu (FABMS: 469 (M+FT))
Sloučenina 4: Benžylester (S)-3-(4-(4-az]dobutyloxy)fenyl)-2-aminopropionové kyseliny podle popisu na Obrázku 10, krok iii
I •i)
Sloučenina 4
Sloučenina 3 (2,0 g, 4,4 mmol) byla rozpuštěna v trifluoroctové kyselině (TFA, 2 ml) a míchána 3 h při pokojové teplotě. Odpařeni ve vakuu poskytlo 1,6 g (kvantitativně) sloučeniny 4 jako bezbarvého sirupu, ktéiý byl použit v dalším kroku bez dalšího čistění. FAB-MS: 369 (Μ+Ι-Γ)
E. Sloučenina 5: Benžylester (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl)-2-butylsulfonamidopropionové kyseliny podle popisu ná Obrázku 10, krok iv
• ·. · • · • « · • •
* • * * * · • * ··
• • •ir • · « ·♦·· • ··· • •
• * « « • •
♦ · ·· 9 »* • ·
Směs sloučeniny 4 (1,6 g, 4,3 mmol), Chloridu butansulfonové kyseliny (0,84 ml, 6,6 mmol) a triethylaminu (1,5 ekvivalentu) byla míchána ve 20 ml methylénchloridu 12 h při laboratorní teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, promýt ředěnou HC1, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou; Po odpaření do sucha byl surový produkt přečištěn flash chromatografií (silikágel, toluen/ethylacetát 15:1) za vzniku 1,4 g (67%) sloučeniny 5 ve formě amorfní látky.
F. Sloučenina 6: Kyselina (S)-3-(4-(4-aminobulyloxy)fenyl)-2-butylsulfonamidopropionová podle popisu ná Obrázku 10, krok v
Sloučenina 5 (1,3 g, 2,6 mmol) byla rozpuštěna ve 20 ml směsi ethylacetát/methanol/voda
5/3/1 á 0,2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA) a byla hydrogénována pod vodíkovou atmosférovou (Γ atm, Parr Shakerova aparatura) při 25 °C v přítomnosti 100 mg paladia (10% ňa uhlíku), po 3 h byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno za vzniku sloučeniny 6 jako olejového zbytku. Po lyofilizaci z vody byl získáni 1,0 g (kvantitativně) sloučeniny 6 ve formě bílého prášku. FAB-MS: 373 (M+H’).
G Sloučenina 7: Kyselina (S)-3-(4-(4-guanidinobutylpxy)fenyl)-2-butylsuIfonamidopropionová podle popisu na Obrázku 10, krok vi
Směs sloučeniny 6. (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-diméthylpyrazol-l-karboxamidin nitrátu (DPFN) (170 mg, 0,8 mmol, Aldrich Chemical Company) a triethylaminu (0,15 ml, 1,0 mmol) v 5 ml dimethylformamidu byla zahřívána 12 h při 60 °C. Po ochlazení bylo rozpouštědlo odpařeno ve vakuu a žbyték byl. čištěn pomocí HPLC (Ljchrocart RP-18, gradient acetonitrii/voda +0,3%
TFA 99:1 až 1:99) za vzniku 50 mg (25%) sloučeniny 7 ve formě bílého amorfního prášku po lyofilizaci. FAB-MS 415 (M+HQ, m p70 °C.
H. Sloučenina 8: Kyselina (S)-3-(4-(4-aminobutyloxy)fenyl)-2-N-terc. butyloxykarbonylpropionová podle popisu na Obrázku 11, krok iii
Sloučenina 3 (0,5 g, 1,07 mmol) byla rozpuštěna v 10 ml směsi ethylacetát/methanol/voda 5/3/1 a 0,1 ml tníluoroctové kyseliny (TFA) a hydrogenována pod vodíkovou atmosférou (1 atm, Pan Shakerova aparatura) při 25 UC v přítomnosti 30 mg paladia (10% na aktivním uhlí). Po 3 h byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno za vzniku sloučeniny 8 ve formě olejového zbytku. Po lyoftlizaci z vody bylo získáno 370 mg (kvantitativně) sloučeniny 8 vc formě bílého prášku FAB-MS: 353 (M+H ).
Sloučenina 9: Kyselina (S)-3-(4-(4-guanidinobutyloxy)fenyl)-2-N-terc. butyloxykarbonylpropionová podle popisu na Obrázku 11, krok iv
Směs sloučeniny 9 (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-dimcthylpyrazol-l-karboxamtdin nitrátu (DPFN) (170 mg, 0,8 mmol, Aldrich Chemical Company) a tnethylaminu (0,15 ml, 1,0 mmol) v 5 ml dimethylformamidu byla zahřívána 12 h při 60 °C. Po ochlazení bylo rozpouštědlo odpařeno vc vakuu a zbytek byl čištěn pomocí HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda +0,3% TFA 99.1 až 1:99) za vzniku 160 mg (90%) sloučeniny 9 ve formě bílého amorfního prášku po lyofilizaci. FAB-MS: 395 (M+H’).
J. Sloučenina 10: Kyselina (R)-3-(4-(4-guanidmobutyloxy)fenyl)-2-butylsulfonamidopropionová podle popisu na Obrázku 12, kroky i-vi
Stejná reakční sekvence jako pro přípravu sloučeniny 7 byla použita k syntéze Dtyrosinového analogu sloučeniny 10 a bylo získáno 250 mg bílého amorfního materiálu (FABMS: 415 (M+H’)) s použitím intermediálních sloučenin 100-600 podle následujícího postupu
1) Sloučenina 100: t-Boc- D-tyrosin benzylester podle popisu na Obrázku 12
K roztoku N-(tcrc. butoxykarbonyl)-D-tyrosin (t-Boc-D-tyrosm) (1,0 ekvivalent, Aldnch) v 0,10 M methylenchloridu byl přidán dicyklohexylkarbodiimid (DCC) (1,5 ekvivalent) při 25 °C a směs byla míchána 1 h Poté byl přidán 1,5 ekvivalent benzylalkoholu a směs byla míchána dalších 12 h při 25 °C. Reakční směs byla poté naředěna ethylacetátem (0J0 M) a promyta dvakrát s vodou, jednou s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odstraněno za vakua a surový produkt byl poté čištěn pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu.
2) Sloučenina 200: Benzylester (R)-3-(4-(4-brombutyloxy)fenyl)-2-N-terc. butyloxykarbonyl propionové kyseliny podle popisu na Obrázku 12, krok i
Směs t-Boc-D-tyrosin benzylesteru (2 g, 5,38 mmol, syntetizovaný podle výše uvedeného popisu), 1,4-dibrombutanu (1,9 ml, 16,2 mmol, Aldnch), uhličitanu draselného (5 g) a 18-crown57 (OJ g, Aldrich) byla zahřívána 12 h při 80 °C. Po ochlazení byla sraženina zfiltrována a reakční směs byla odpařena dosucha ve vakuu. Surový produkt byl poté přečištěn krystalizací s použitím 100% hexanu za vzniku 2,5 g (92%) sloučeniny 200.
3) Sloučenina 3: Benzylester (R)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl)-2-N-terc butyloxykarbonyl propionové kyseliny podle popisu na Obrázku 12, krok ii
Sloučenina 200 (2,5 g, 4,9 mmol) byla míchána s azidem sodným (1,6 g, 25 mmol) ve 20 ml dimethylformamidu (DMF) 12 li ph 25 °C Rozpouštědlo bylo poté odpařeno, zbytek byl nareděn s vodou (10 ml) a extrahován dvakrát s ethylacetátem. Organické vrstvy byly spojeny, sušeny nad MgSO4 a odpařeny za vzniku 2,0 g (90%) sloučeniny 300 jako bezbarvého sirupu (FAB-MS: 469 (MHF)).
Sloučenina 400: Benzylester (R)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl)-2aininopropionové kyseliny podle popisu na Obrázku 12, krok iii
Sloučenina 300 (2,0 g, 4,4 mmol) byla rozpuštěna v tnlluoroctové kyselině (TFA, 2 ml) a míchána 3 h ph pokojové teplotě Odpaření ve vakuu poskytlo 1,6 g (kvantitativně) sloučeniny 400 jako bezbarvého sirupu, který byl použit v dalším kroku bez dalšího čištění. FAB-MS 369 (M+H+).
5) Sloučenina 500: Benzylester (R.)'3J4-(4-azidobutyloxy)fenyl)-2-butyisulfonamidopropionové kyseliny podle popisu na Obrázku 12, krok iv * » · · »· » · * * * · · · ♦«· ···· • · · ( ♦' to ·♦«··· to · to to » · to « · · · · ·* · to · i»· ·· to· · ·· ··
Sloučenina 500
Směs sloučeniny 400 (1,6 g, 4,3 mmol), Chloridu butansulfonové kyseliny (0,84 ml, 6,6 mmóJ) a triethylaminu (1,5 ekvivalentu) byla míchána ve 20 ml měthýlenchloridu 12 h při laboratorní teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt ředěnou HCi, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Po odpařeni do suchá byl surový produkt přečištěn flash chromatografií (silikágel, toluen/ethyiacetát 15:1) za vzniku 1,4 g (67%) sloučeniny 500 ve formě amorfní látky.
.6) Sloučenina .600. Kyselina (R)-3-(.4-(4-aminobutyloxy)fenyr)-2-butylsulfonamidopropionová podle popisu na Obrázku 12, krok v
Sloučenina 500 (1,3 g, 2,6 mmol) byla rozpuštěna ve 20 ml směsi ethylacetát/methanol/voda 5/3/1 a 0,2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA) a byla hvdrogenována pod vodíkovou atmosférovou (1 atm, Parr Shakerova aparatura) při 25 CC v přítomnosti 100 mg paladia (10% na Uhlíku). Po 3 h byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno za vzniku sloučeniny 600 jako olejového zbytku/ Po Jyofilizaci z vody byl získán 1,0 g (kvantitativně) sloučeniny 600 ve formě bílého prášku. FAB-MS: 373 (M+H).
7) Sloučenina 700: Kyselina (R)-3-(4-(4-guanidinobutyloxy)feny!)-2-butylsulfonainidopfopionová podlé popisu na Obrázku 12, krok vi
Směs sloučeniny 600 (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-dimethylpyrazol-l-karboxamidin nitrátu (DPFN) (170 mg, 0,8 mmol, Aldričh Chemical Company) a triethylaminu (0,15 ml, 1,0 mmol) v 5 ml dimethylformamidu byla zahřívána 12 h při 60 °C. Po ochlazení bylo rozpouštědlo odpařeno ve vakuu a zbytek byl čištěn pomočí HPLC (Lichrocárt RP-18. gradient acetonitril/voda +0,3%
• • 9 ♦ •
• • * • •
• • Φ 4
• · • • • 4
·♦ Φ4 ··
• v V v v • * » · *» »»·* · ··♦ « * • 4 · · • ♦ · «·
TFA 99:1 až .1:99) za vzniku 50 mg (25%) sloučeniny TO ve formě bílého amorfního prášku po lyofilizaci. FAB-MS. 415 (M+H+), m .p.: 70 °C.
K. Sloučenina 11: Benzylester (S)-3-(4-(4-azidobutyloxv)fenyl)-2-(10-kamforsulfonamidb) propionové kyseliny podle popisu na Obrázku 13
Směs sloučeniny 4 (1,0 g. 2,7 mmol), lO-kamforsulfonylchloridu (6,6 mmol, Aldrich Chemical Company) a triethylaminu (1,5 ekvivalent) bylá míchaná ve 20 ml dichlormethanu 12 h při pokojové teplotě. Reakční směs byla poté odpařena, zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt ředěnou HC1, vodným roztokem bydrogenuhličítanu sodného a vodou Po odpaření do sucha byl surový produkt čištěn flash chromatografií (silikagel, toluen/cthylacctát 15:1) za vzniku 1,4 g (67%) sloučeniny 11 ve formě bílé amorfní tuhé látky
L. Sloučenina 12: Kyselina (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyI)-2-(10-kamforsulfQnamido) propionová podle popisu na Obrázku 13, kroky i-ii
Součepina 12 byla získánapo hydrogenaci a guanylaci sloučeniny 11 podle následujících postupů:
Krok i: Sloučenina 11 (1,3 g, 2,6 mmol) byla rozpuštěna, ve 20 ml směsi ethýlacetát/methanoi/vodá 5/3/1 a 0,2 ml trifluoroctové kyseliny (TFA) a byla hvdrogenována pod vodíkovou atmosférovou (l atm, Parr Shakerova aparatura) při 25 °C v přítomnosti 100 mg paladia (10% na uhlíku). Po 3 h byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno za
Hlil * « »« « 1 1 I « » ·4
4 1» ' ’ * ·» » » ‘ 1 * *4 * *4
I «« t vzniku meziproduktu jako olejového zbytku. Po lyofilizaci z vody byl získán 1,0 g (kvantitativně) meziproduktu ve formě bílého prášku, se kterým bylo pokračováno následovně:
Krok ii: Výše připravený intermediátni aminový derivát (200 mg, 0,5 mmol), 3,5dimethylpyrazol-l-karboxamidin nitrátu (DPFN) (170 mg, 0,8 mmol, Aldrich Chemical Conipany) a tnethylammu (0,15 ml, 1,0 mmol) v 5 ml dimethylformamidu byla zahřívána 12 h při 60 °C. Po ochlazeni bylo rozpouštědlo odpařeno ve vakuu a zbytek byl čištěn pomoci HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda r0,3% TFA 99:1 až 1:99) za vzniku 50 mg (25%) sloučeniny 12 ve formě bílého amorfního prášku po lyofilizaci. FA13-MS: 509,6 (Μ+1Γ)
M. Sloučenina 13: Benzylester (S)-3-(4-(5-brompentyloxy)fenyl)-2-N-terc. butyloxykarbonyl propioriové kyseliny podle popisu na Obrázku 13
Směs t-Boc-L-tyrosin benzylesteru (4,5 g, 12,1 mmol, sloučenina 1 syntetizovaná podle výše uvedeného popisu), 1,5-dibrompentanu (5 ml, 36,7 mmol, Aldrich), uhličitanu draselného (10 g) a 18-crown-6 (0,25 g, Aldrich) byla zahřívána 12 h při 80 °C. Po ochlazení byla sraženina zfiltrována a reakční směs byla odpařena dosucha ve vakuu Surový produkt byl poté přečištěn krystalizaci s použitím 100% hexanu za vzniku 5,35 g (85%) sloučeniny 13.
N. Sloučenina 14: Kyselina (S)-3-(4-(5-biOmpentyloxy)fenyl)-2-butylsulfonarmdo propionová podle popisu na obrázku 13, kroky i-v
Reakční sekvence složená z 5 kroků: výměna bromidu za azíd, odštěpení Boc, sulfonylace s butansulfonylchlondcm, hydrogenace a guanylace s DPFN byla provedena identicky jako ve výše popsaných přípravách sloučeniny 7 s využitím intermediátů 1-6 nebo sloučeniny 10
s využitím intermediátů 100-600. Sloučenina 14 byla získána jako bílý pražek FAB-MS. 429
O. Sloučenina 15: 3-(4-amidinofenyl)-5“(4-(2-karboxy-2-aminoethyl)fenoxy)methyl-2oxazolidinon dichlorid podle popisu na obrázku 14
i) Syntéza výchozí látky pro sloučeninu 15: 2-N-Boc-amino-3-(4-hydroxyfenyl)- propionátu
„COOH
Výchozí -materiál2-N-Boc-ainino-3-(4-hydroxyfenyl)propionát byl získán eštenfikací (D nebo L) N-(terc. butoxykarbonyl)-L(D)-tyrosinu (t-BocrL(D)-tyrosin) (1 ekvivalent, Sigma) v 0,10 M methanolu a ředěné 1% HC1. Reakční směs byla míchána 12 h při 25 °C a poté neutralizována s uhličitanem draselným a poté naředěna s ethýlacetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl čištěn pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu za vzniku 2-N-Boc-amino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu
2) Syntéza výchozího materiálu 3-p-N-BOC-amidinophenyl-5-methansulfbnyloxymethyl2-oxazolidinonu pro sloučeninu 15: trikroková syntéza podle následujícího předpisu:
p-aminobenzOnitril (1 ekvivalent, Aldrich) v methylenchloridu (0,10 M) byl míchán 12. h s
2,3-epoxyprópanoIem (1 ekv., Aldrich) při 25 CC. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno ve vakuu a surový 4-(2,3-dihydroxypropylámino)benzónitril byl použit v následujícím stupni.
4-(2,3-dihydroxypropylajnino)benzonitril (1,0 ekvivalent, viz výše) v diméthylformamidu (0,10 M) byl při HO °C míchán 6 h s diethylkarbonátem (1,1 ekvivalentu, Aldrich) a terč, butanolátern draselným (1,1 ekvivalent, Aldrich). Poté byla reakční směs naředěna s ethýlacetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx s nasyceným roztokem soli a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován sloupcovou chromatografií na silikagelu za vzniku 3-(4-kyanofenylý5-hydroxymethyl-2-oxazo!idin a použit do dalšího kroku.
···· ·« ·· * *· ,, ··· * * · · · * , ··· » · · · , ,, • · · · · · ··*» «,, , • · · · ··· * « , *» ·· ·» · ·· ,,
3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxyrnethyE2-oxazolidin (1,0 ekvivalent, viz. výše) vniethylenchloridu (0,10 M) byl míchán při 25 °C s 1,1 ekvivalentem H2S, 1,1 ekvivalentem methyljodidu a
1,1 ekvivalentem octanu amonného. Reakční směs byla míchána 6 h a poté naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x svodou, Ix s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4 RozpuŠtědlo bylo odpařeno ve vakuu a surový produkt byl poté izolován sloupcovou chromatografií na silikagelu za vzniku amidinu, který byl použit v dalším kroku ekvivalent amidinu, připraveného výše, byl ochráněn reakcí s 1,1 ekvivalentu BOC-ON (2-(Boc-oxyimino)-2-fenylacetonitnl, Aldncb) v methylenchloridu (0,10 M) 6 h při 25 °C. Reakční směs byla poté naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, ix nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl esterifikován v 0,10 M methylenchloridu a 1,1 ekv. methansulfonylchloridu Reakční směs byla míchána 6 h při 0 °C, rozložena vodou (5 ekv.), naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován na sloupci silikagelu za vzniku 3-p-N-BOC-amidinophenyl-5-methansulfonyloxymethyl-2-oxazolidinonu.
3) Reakce intemiediátu 2-N-Boc-amino-3-(4-liydroxyfenyl)propionátu s 3-p-N-BOCamidinophenyl-S-methansulfonyloxymethyl-2-oxazolidinoriem za vzniku chráněné formy 15,
3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2-niethoxykarbonyl-2N-BOC-aminoethyl)fenoxymcthyl-2oxazolidinonu
Směs 1,9 g 2-N-Boc-aniino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu (viz. popis výše), 20 ml dimethylformamídu (DME) a NaH (1 ekv.) byla míchána 30 mm při laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 1,8 g 3-p-N-BOOamidinophenyl-5-methansulfonyloxymethyl-2-oxazolidinonu v 10 ml DMF a směs míchána dalších 15 min při laboratorní teplotě. Reakční směs byla poté naředěna ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, Ix nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován kolonovou chromatografií na silikagelu za vzniku ochráněné formy Sloučeniny 15: 3-(4-BOC-anndmofenyl)-
5-(4-(2-methoxykarbonyl-2N-BOC-aminoethyl)fenoxyniethyl-2-oxazolidinonu, který byl použit do dalšího kroku
4) Deprotekce ochráněné formy sloučeniny 15 za vzniku Sloučeniny 15: 3-(4amidinofenyl-5-(4-(2-karboxy-2-aininoethyl)fenoxy)methyl-2-oxazolidinon dichlondu, Obrázek 14
Reakce ochráněné formy sloučeniny 15, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2methoxykarbonyl-2N-BOC-aminoethyl)fenoxymethyl-2-oxazolidinonu (1 ekvivalent), se 4 ml 2N NaOH po dobu 4 h při laboratorní teplotě. Ke směsi pak bylo při 0 °C během 3 h přikapáno 40 ml 2N roztoku HC1 v dioxanu. Reakční směs byla poté rozložena s hydrogenuhličitanem sodným (5 ekvivalent) a poté naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, Ix nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSCh. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu za vzniku sloučeniny 15 3-(4-amidinofenyl-5-(4-(2-karboxy-2-aminoethy!)fenoxy)methyl-2-oxazolidinon dichlondu, s teplotou tání 165 °C (d).
P. Sloučenina 16: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-N-butylsulfonylaminoethyl)fenoxy)methyi-2-oxazolidinon dichloridu podle obrázku 14
I) Syntéza výchozí látky pro sloučeninu 16: 2-N-butylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionatu
Výchozí materiál 2-N-butylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-propJonátu byl získán estenfikací (I) nebo I.) tyrosinu (1 ekvivalent, Sigma) v 0,10 M inethanolu a ředěné 1% HCI. Reakční směs byla míchána 12 h při 25 °C, neutralizována s uhličitanem draselným a poté naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSCL. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl podroben následujícím reakcím:
Směs výše popsané látky (4,3 mmol), butansulfonylchloridu (6,6 mmol) a triethylaminu (1,5 ekvivalentu) byla míchána 12 h v methylenchlondu (20 ml) při laboratorní teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt ředěnou HCI, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, Po odpaření do sucha byl surový produkt izolován pomocí flash chromatografie (silikagel, toluen/ethylacetát 15:1) za vzniku titulní látky.
2) Syntéza výchozího materiálu pro sloučeninu 16, 3-p-N-BOC-amidinophcnyl-5methansulfonyloxymethyl-2-oxazolidinonu: třikroková syntéza podle následujícího předpisu · · · • · · · · • · * · ···· · ·
p-aminobenzonitril (1ekvivalent, Aldrich) v méthylenchloridu (0,10 M) byl míchán 12 h s 2,3Lepoxypropanolem (1 ekv., Aldrich.) při 25 °C. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno ve vakuu a surový 4-(2i3-dihydroxypropylaminó)benzonitril byl použit v následujícím stupni.
4-(2,3-dihydroxyprópylamino)benzonitril (1,0 ekvivalent, viz výše) v diniethylforraamidu (0,10 Ní) byl při 110 °C míchán 6 h s diethylkarbonátem (1,1 ekvivalentu, Aldrich) a terč, butanolátem draselným (1,1 ekvivalent; Aldrich). Poté byla reakční směs naředěna s ethylácetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx s nasyceným roztokem soli a sušena nad MgSO.t Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován sloupcovou chřomatografií na silikagelu za vzniku 3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyj-2-oxazolidin a použit do dalšího kroku.
3-(4-kyanofeny!)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidin (1,0 ekvivalent, viz. výše) v methylenchloridu (0,10 M) byl míchán při 25 °C s 1,1 ekvivalentem H2S, 1,1 ekvivalentem méthyljodidu a
1,1 ekvivalentem octanu amonného. Reakční směs byla míchána 6 h a poté naředěna s ethylacetátehi (0,10 Ní) a promyta.2x s vodou, lx s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4 Rozpuštědlo bylo odpařeno ve vakuu a surový produkt byl poté izolován sloupcovou chroiriatografií na silikagelu za vzniku amidinu, který byl použit v dalším kroku.
ekvivalent amidinu, připraveného výše, byl ochráněn 6.h reakcí s Γ,Ι ekvivalentu BOCON (2-(Boc-oxyimino)-2-fenylacetonitril, Aldrich) v méthylenchloridu (0,10 Ní) při 25 °C. Reakční směs byla poté naředěna s ethylácetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl esterifikován v 0,10 M méthylenchloridu a 1,1 ekv methansulfonylchloridu Reakční sriiěs byla míchána 6 h při 0 9C, rozložena vodou (5 ekv), naředěna s ethylácetátem (0,10 M) á promyta 2x vodou, lx nasyceným, roztokem chloridu sodného a sušena nad NlgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován na sloupci silikagelu za vzniku 3-p-N-BOC-amidinopheny!-5-methansulfonyloxymethyh2-oxazolidinonu.
3) Reakce intcrmediátu 2-N-butyisufonylamino-3-(4-hydroxyfcnyl)propionátu s 3-p-NBOC-amidinophenyl-5-methan.sulfonyloxymethyl-2Oxazolidinonem za vzniku chráněné formy 16, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2-methoxykarbonyl-2N-butylsuifonylaminoethyi)fenoxyniethyl-2-oxazo!idincmu . Směs 1,9 g 2-N-butylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu (viz. popis výše), 20 ml dimethylformamidu (DMF) a NaH (1 ekv): byla míchána 30 min .při laboratorní teplotě Poté bylo .přidáno 1,8 g 3-p-N-BOC-amid]nophenyi-5-niethanšulfonyloxymcthyl-2-Oxazolidinonu v 10 ml
DMF a směs míchána dalších 15 min při laboratorní teplotě. Reakční směs byla poté naředěna ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován kolonovou chromatografií na silikagelu za vzniku ochráněné formy Sloučeniny 16: 3-(4-BOC-amidinofenyl)-
5-(4-(2-methoxykarbony)-2N-butylsulfonylaminoethyl)fenoxyjnethyl-2-oxazolidinonu, který byl použit do dalšího kroku.
4) Deprotekce ochráněné formy sloučeniny 16 za vzniku Sloučeniny 16: 3-(4amidinofenyb5-(4-(2-karboxy-2-butylsulfonylaminoethyl)fenoxy)methyl-2-oxazolidinon dichloridu, Obrázek 14
Reakce ochráněné formy sloučeniny 16, 3-(4-BOC-arnidinofenyl)-5-f4-(2methoxykarbonyl-2N-butylsulfonylanunocthyl)fenoxymethyl-2-oxazolidinonu (1 ekvivalent), se 4 ml 2N NaOH po dobu 4 li při laboratorní teplotě. Ke směsi pak bylo při 0 až 25 °C během 3 h přikapáno 40 ml 2N roztoku HCI v dioxanu. Reakční směs byla poté rozložena s hydrogenuhličitanem sodným (5 ekvivalent) a poté naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu za vzniku sloučeniny 16. 3-(4-amidinofeiiyl-5-(4-(2-karboxy-2-Nbulylsulfonylaminoetliyl)fenoxy)methyí-2-oxazolidinonu, s teplotou tání 236-237 °C (d)
Q. Sloučenina 17: 3-(4-amidinofcnyl)-5-(4-(2-karboxy-2-N-propylsulfonylaminoethyl)fenoxy)njethyl-2-oxazolidinon dichloridu podle obrázku 14
1) Syntéza výchozí látky pro sloučeninu 17: 2-N-propylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu:
Výchozí materiál 2-N-propylsu]fonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)-propionátu byl získán esterifikaci (D nebo L) tyrosinu (1 ekvivalent, Sigma) v 0,10 M methanolu a ředěné 1% HCI. Reakční směs byla míchána 12 h při 25 °C, neutralizována s uhličitanem draselným a poté naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO*. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl . podroben následujícím reakcím:
Směs výše popsané látky (4,3 mmol), propansulfonylchlbridu (6,6 mmol) a triethylaminu (1,5 ekvivalentu) byla míchána 12 h v methýleňchlóridu (20 ml) při laboratorní teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt ředěnou FICI, vodným roztokem hydrogénuhličitanu sodňéhů a vodou, Po odpaření do sucha byl surový produkt izolován pomocí flash čhromatografie (silikagel, toluen/ethyiačětáť 15:1) za vzniku titulní látky.
2) Syntéza výchozího materiálu pro sloučeninu 17, 3-p-N-BOC-anndinophenyi-5~ methansulfonyloxymethyl-2-oxazolidinonu: tříkroková syntéza podle následujícího předpisu:
p-aminobenzónitril (1 ekvivalent, Aldrich) v methýleňchlóridu (0,10 M) byl míchán 12 h s
2,3-epoxypropanolem (1 ekv., Aldrich) při 25 °C. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno ve vakuu a surový 4-(2,3?dihydroxýprppylamino)bénzpnitril byl použit v následujícím stupni.
4-(2,3-d]hydroxypropylamino)benzonitnl (1,0 ekvivalent, viz výše) v dimcthylformamidu (0,10 M) byl při 110 °C míchán 6 h s diethylkarbonátem (1,1 ekvivalentu, Aldrich) a terč, butanol átem draselným (1,1 ekvivalent, Aldrich). Poté byla reakční směs naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx s nasyceným roztokem soli a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován sloupcovou chromatógráfií na silikagelu za vzniku 3-(4-kyanofenyi)-5-hydroxymethyl-2~oxazolidjnu. který byl použit do dalšího kroku.
3-(4-kyanofcnyl)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidm (1,0 ekvivalent, viz. výšejvmetbylenchlondu (0,10 M) byl míchán při 25 °C s 1,1 ekvivalentem HjS, 1,1 ekvivalentem methyljodidu a
1,1 ekvivalentem octanu amonného. Reakční směs byla míchána 6 ha poté naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena riád MgSO*: Róžpuštědlo bylo odpařeno ve vakuu a surový produkt byl poté izolován sloupcovou chromatografií na silikagelu za vzniku amidinu, který byl použit v dalším kroku.
ekvivalent amidinu, připraveného výše, byl ochráněn 6 h reakcí s 1,1 ekvivalentu BOC. ON (2-(Boc-óxyimino)-2-fenylacetonitrilj Aldrich) v methýleňchlóridu (0,10 M) při 25 °C. Reakční směs byla poté naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSOj. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl esterifikován v 0,10 M methýleňchlóridu a 1,1 ekv. methansulfonylchloridu. Reakční směs byla míchána 6 h při 0 °C, rozložena vodou (5 ékv.), naředěna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad· MgSCú.
Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován na sloupci silikagelu za vzniku 3-p-N-BOOamidinophenyl-5-methansuifonyioxymethyl-2-oxazolidinonu.
3) Reakce intermediátu 2-N-propylsufonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu s 3-p-NBOC-amidinophcnyl-5-methansuJfonyloxymethyl-2-oxazobdinonem za vzniku chráněné formy sloučeniny 17, 3-(4-BOC-amidinofeny])-5-(4-(2-methoxykarbonyl-2N-propylsulfonylaminoethyl)fenoxy-methyl-2-oxazolidinonu
Směs 1,9 g 2-N-propylsulfonylannno-3-(4’hydroxyfenyl)piOpionátu (viz. popis výše), 20 ml dimethylformamidu (DMF) a Mali (1 ekv.) byla míchána 30 min pří laboratorní teplotě. Poté bylo přidáno 1,8 g 3-p-N-BOC-amidinophenyl-5-mcthansulfonyloxymethyF2-oxazolidinonu v 10 ml DMI7 a směs míchána dalších 15 min při laboratorní teplotě. Reakční směs byla poté naředěna ethylacctátcm (0,10 M) a promyta 2x vodou, Ix nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován kolonovou chromatografii na silikagelu za vzniku ochráněné formy Sloučeniny 17: 3-(4-BOC-amidinofenyI)~
5-(4-(2-methoxykarbonyl-2N“piOpylsulfonylaminoethyl)fenoxymcthyl-2-oxazolidmonu, který byl použit do dalšího kroku
4) Deprotckcc ochráněné formy sloučeniny 17 za vzniku Sloučeniny 17 3-(4- aniidinofenyl-5-(4-(2-karboxy-2-piOpylsulfbnylaminocthyl)fcnoxy)mcthyl-2-oxazolidinonu Obrázek 14
Reakce ochráněné formy sloučeniny 17, 3-(4-I3OC-amidinofenyl)-5-(4-(2methoxykarbonyl-2N-propylsu]fonylaminoethyl)fenoxymethyl-2-oxazolidinonu (1,0 ekvivalent), se 4 ml 2N NaOH po dobu 4 h při laboratorní teplotě. Ke směsi pak bylo při 0 až 25 °C během 3 h přikapáno 40 ml 2N roztoku 1ICI v dioxanu. Reakční směs byla poté rozložena s hydrogenuhličitanem sodným (5 ekvivalent) a poté naředěna s ethyl acetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, Ix nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4 Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován pomocí sloupcové chrornalografie na silikagelu za vzniku sloučeniny 17: 3-(4-amidinofenyl-5-(4-(2-karboxy-2-Npropylsulfonylam)noethyl)fenoxy)methyl-2-oxazo!idinonu, s teplotou tání 200 °C (d)
R. Sloučenina 18: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-N-ethylsulfonylaminoethyl)fcnoxy)methyl-2-oxazolidinon dichioridu podle obrázku 14
» · * • · ··
• ♦ • • • • • •
♦ « * » * • · • * • ·
« • · * • * · « · ♦ • * •
• · • * 9 • • •
• · 9 9 • • · • ·
1) Syntéza výchozí látky pro sloučeninu 18: 2-N-ethylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenýl)própionatu:
Výchozí materiál 2-N-ethylsulfonylamino-3-(Oydroxyfeny])propionátu byl získán esterifikaci (D nebo L) tyrósinu (1,0 ekvivalent, Sigma) v 0,10 M methanolu a ředěné 1% říČl. Reakční směs byla míchána 12 h při 25 °C, neutralizována s uhličitanem draselným a poté naředěna s ethylácetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, Ix s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSCh. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl podroben následujícím reakcím:
Směs výše popsané látky (4,3 mmol), ethansulfonylchloridu (6,6 mmol) a triethylaminu (1,5 ekvivalentu) byla míchána 12 h v mcthylenchioridu (20 ml) při laboratorní teplotě. Reakční směs byla poté odpařena a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu, promyt ředěnou HC1, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, Po odpaření do sucha byl surový produkt izolován pomocí flash chromatográfie (šilikagel, tóluen/éthylacetát 15:1) za vzniku titulní látky.
2) Syntéza výchozího materiálu pro Sloučeninu 18, 3-p-N-BOC-amidinopbenyl-5methansulfonylpxymethyl-2-óxazolidinbnu: třikroková syntéza podle následujícího předpisu:
p-aminobenzonitri! (1 ekvivalent, Aldrich) v mcthylenchioridu (0,10 M) byl míchán 12 h s
2,3-epoxypropariolem (1 ekv., Aldrich) při 25 °C. Rozpouštědlo bylo potě odpařeno ve vakuu a surový 4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril byl použit v následujícím stupni.
4-(2,3-dihydroxypropylámino)benzoriitril (1,0 ekvivalent, viz výše) v dimethylformamidu (0,10 M) byl při 110 °C míchán 6 h s diethylkarbonátem (1,1 ekvivalentu, Aldrich) a těrc. butanolátem draselným (1,1 ekvivalent, Aldrich); Poté byla reakční směs naředěna s ethylácetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx s nasyceným roztokem soli a sušená nad MgSO.i Rozpouštědlo bylo poté odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován Sloupcovou chromatografií na silikagelu za vzniku 3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethyl-2-oxazolidinu: který byl použit do dalšího kroku
3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymethy!-2-oxazolrdin (1,0 ekvivalent, viz. výše) vmethylen Chloridu (0,10 M) byl míchán při 25 °C s 1,1 ekvivalentem ÍHS, 1,1 ekvivalentem methyljodidu a
1,1 ekvivalentem octanu amonného. Reakční směs byla míchána 6 h a poté nareděna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x s vodou, lx s nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4 Rozpuštědlo bylo odpařeno ve vakuu a surový produkt byl poté izolován sloupcovou chromatografú na silikagelu za vzniku amidinu, který byl použit v dalším kroku.
1,0 ekvivalent amtdtnu, připraveného výše, byl ochráněn 6 h reakcí s 1,1 ekvivalentu BOC-ON (2-(Boc-oxyimino)-2-fenylacetonitnl, Aldrich) v methylenchloridu (0,10 M) při 25 °C Reakční směs byla poté nareděna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgS()4 Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl esterifikován v 0,10 M methylenchloridu a 1,1 ekv. methansulfonylchloridu. Reakční směs byla míchána 6 h při 0 °C, rozložena vodou (5 ekv), nareděna s ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSCB Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován na sioupet silikagelu za vzniku S-p-N-BOC-amidinophenyl-S-mcthansulfonyloxymcthyl^-oxazolidinonu.
3) Reakce intermediátu 2-N-etbylsufonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)piOpionátu s 3-p-NBOC-am)dinophenyl-5-methansulfonyloxymethyl-2-oxazolidinonem za vzniku chráněné formy sloučeniny 18, 3-(4-BOC-amidinofeny])-5-(4-(2-methoxykarbonyl-2N-cthylsulfonylaminoethyl)íěnoxy-metliyl-2-oxazolidinonu
Směs 1,9 g 2-N-ethylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu (viz popis výše), 20 ml dimethylformamidu (DMF) a NaH (I ekv) byla míchána 30 mm při laboratorní teplotě Poté bylo přidáno 1,8 g 3-p-N-BOC-amidinophcnyl-5-methansulfonyloxymethyl-2-oxazolidinonu v 10 ml DMF a směs míchána dalších 15 min při laboratorní teplotě Reakční směs byla poté nareděna ethylacetátem (0,10 M) a promyta 2x vodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt byl izolován kolonovou chromatografií na silikagelu za vzniku ochráněné formy Sloučeniny 18: 3-(4-BOC-amidinofenyl)-
5-(4-(2-methoxykarbonyl-2N-ethylsulfonylaminoethyl)fenoxymethyl-2-oxazolidinonu, který byl použit do dalšího kroku
4) Deprotekce ochráněné formy sloučeniny 18 za vzniku Sloučeniny 18: 3-(4amjdinofenyl-5-(4-(2-karboxy-2-ethyIsulfonylaminoethyl)fenoxy)metliyD2-oxazolidinonu Obrázek 14
Reakce ochráněné formy sloučeniny 18, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2methoxykarbonyl-2N-etliylsuHbnylaminoethyl)fenoxymethyl-2-oxazolidinonu (1,0 ekvivalent), se φ φ φ · φ φ · ·φ * • · · · Φ 4 Φ *· Φ « *« · · · !·<♦! · ···· · ·····♦ Φ «9 • 9 ·« ·· ♦ ·· Φ · ml 2Ν NaOH po dobu 4 h při laboratorní teplotě. Ke směsi pak bylo při 0 až 25 °C během 3 h přikapáno 40 ml 2N roztoku HCJ vďioxanu. Reakční směs byla poté rozložena š hydrogenuhličitanem sodným (5 ekvivalent) a poté narcděna s ethylacetátem (0,10 M) a .prómyta 2x svodou, lx nasyceným roztokem chloridu sodného a sušena nad MgSO4. Rozpouštědlo bylo odstraněno ve vakuu a surový produkt, byl izolován pomocí sloupcové chromatografic na silikagelu za vzniků sloučeniny 18: 3-(4-amidiůofěňyl-5-(4-(2-kářboxy-2-Nethylsulfonylaminoethyl)fénoxy)methyl-2-oxazolidinonu, s teplotou tání 212 °Č (d).
Předcházející psané specifikace jsou považovány zá dostatečné, aby odborník vdaném oboru mohl provádět tento vynález. Samozřejmě, kromě specifikací již ukázaných v tomto vynálezu, jsou možné další modifikace, které budou odborníkům zřejmé z uvedeného popisu a které také spadají do pole působnosti nároků tohoto vynálezu.
*« · · · ·«
Přehled sekvenci (1) Obecné informace:
(i) Aplikant: The Sci ipps Research Institute (li) Název vynálezu: Způsoby inhibice a přípravky užitečné pro inhibici ανβί zprostředkované angiogeneze (iii) Počet sekvenci: 9 (iv) Computenzovaná forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Computer: IBM PC compatible (C) Operační systém PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Verze #1.25 (v) Současná data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: PCT/US96/ (B) Datum podání 13. října 1996 (C) Klasifikace:
(ví) Předchozí data přihlášky:
(A) Číslo přihlášky: US 08/514,799 (B) Datum podání 14. října 1995 (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Topologie: lineární (ů) Molekulární typ: peptid (iii) Typ fragmentu: interní (ix) Znaky:
(A) Jméno/Klič: Peptid (B) Umístění: 1 (D) Další informace: /označení - BOC (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: Pepud (B) Umístění: 4 (C) Další informace: /označení = D-Phe /poznámka^ „Předpona „D“ v D-Phe znamená, že fenylalamn v poloze 4 je Daminokyselinou.“ (ix) Znaky:
(A) Jméno/Klíč: Peptid (B) Umístění: 5 (C) Další informace: /označení- OMe (xi) Označeni sekvence: SEQ ID NO: 1:
Arg Gly Asp Phe Val
5 (2) Informace o SEQ ID NO:2:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ. aminokyseliny (D) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ. peptid (iii) Typ fragmentu: interní (ix) Znaky:
(A) Jméno/Klíč. Peptid (B) Umístěni: 1 (D) Další informace: /označení - BOC (ix) Znaky:
(A) Jméno/kiíč: Peptid (B) Umístění: 4 (C) Další informace: /označení D-Phe /poznámka= „Předpona „D“ v D-Phe znamená, že fenylalamn v poloze 4 je Daminokyselinou.“ (ix) Znaky:
(A) Jméno/Klíč Peptid (B) Umístění: 5 • 99 9 9·
• ·* • ♦ ♦· • 9 9 ·9 · • ·9 • 99 ·· · · 9 • « « • · ♦· (C) Další informace: /označení- OH (xi) Označení sekvence: SEQ FD NO 2:
Arg Gly Asp Phe Val
I5 (2) informace o SEQ ID NO:3 (i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Topologie: lineární (n) Molekulární typ: peptid (in) Typ fragmentu: interní (ix) Znaky:
(A) Jméno/KJíč: Peptid (B) Umístění: 1 (D) Další informace: /označení H (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč. Peptid (B) Umístění: 4 (C) Další informace: /označeni = D-Phe /poznámka „Předpona „D“ v D Phe znamená, že fenylalanm v poloze 4 je Daminokyselinou.“ (ix) Znaky:
(A) Jmcno/Klíč: Peptid (B) Umístění: 5 (C) Další informace /označeni- OH (xi) Označení sekvence. SEQ ID NO.3
Arg Gly Asp Phe Val
5 (2) Informace o SEQ ID NO:4:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Topologie: cirkulární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Typ fragmentu: interní (ix) Znaky:
(A) Jméno/Klíč: Peptid (B) Umístění: I (D) Další informace' /označeni - cyklo (ix) Znaky:
(A) Jméno/kiíČ: Peptid (B) Umístění: 4 (C) Další informace: /označení = D-Phe /poznámka- „Předpona „D“ v D-Phe znamená, že fenylalanin v poloze 4 je Dami no kysel inou. “ (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:4:
Arg Gly Asp Phe Val
5 (2) Informace o SEQ ID NO:5:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 5 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Topologie: cirkulární (ii) Molekulární typ: peptid (in) Typ fragmentu: interní (ix) Znaky:
(A) Jméno/KliČ: Peptid (B) Umístění: I (D) Další informace: /označení = cyklo (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: Peptid
Ί5
9999 99 99 9 9999
9 9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9 999
9 9 9' 9 9 9999 9 99 9 99
9 9 9 9 9 9 9 99
99 ·· · «·· (B) Umístění: 4 (C) Další informace: /označení = D-Phe /poznámka= „Předpona „D“ v D-Phe znamená, že fenylalanin v poloze 4.je Daminokyselinou.“ (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO: 5:
Arg Ala Asp Phe Val (2) Informace o SEQ ID NO:6:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Topologie: cirkulámí (ií) Molekulární typ: peptid (lil) Typ fragmentu: interní (ix) Znaky:
(A) Jméňo/Klíč: Peptid (B) Umístění: 1 (D) Další informace:/označení = cykló (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: Peptid (B) Umístění: .2 (C) Další informace: /označení = D-Arg /poznámka= „Předpona ,?D“ v D-Arg znamená, Že arginin v poloze 2 je Daminókyselinou.“ (xi) Označení sekvence: SĚQ ID NO:6:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5 (2) Informace o SEQ ID NO:7:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 5 aminokyselin
«I la * · · φ φ · « « · φ φ · φφ φ φ «« φ ♦ · · • φφφ • φ φφφφ • φ φ ·♦ « ·♦ ·· • · · · ··♦ · » • · · ·· φφ (Β) Typ: aminokyseliny (C) Topologie: cirkulámí (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Typ fragmentu: interní (ix) Znaky:
(A) Jméno/Klíč: Peptid (B) Umístění: 1 (D) Další informace /označeni - cyklo (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: Peptid (B) Umístění: 5 (C) Další informace: /označení - D-Val
7poznámka= „Předpona „D“ v D-Val znamená; že valiň v poloze 5 je Daminokyšelinou.“ (xi) Označení sekvence: SEQ ID NO:7:
Arg Gly Asp Phe Val (2) Informace o SEQ ID NO:8:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny (C) Topologie: lineární (ii) Molekulární typ: peptid (xij Označení sekvence: SEQ ID NO:8:
Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gin Val Thr Arg Gly Asp Val Phe
5 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO:9:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 6 aminokyselin (B) Typ: aminokyseliny *
··♦ v «9 99 9 99 99
• • · • 9 * • * 9 •
. • 9 9 9 • · •
• 9 • ·; 9 · 9 9 9 9 • 9 9 • • •
• 9 9 9 9 9 9 9 9 9
a· • « 9 9 • 9 * »♦
(C) Topologie: linární (ii) Molekulární typ: peptid (iii) Typ fragmentu: interní (ix) Znaky:
(A) Jméno/KlíČ: Peptid (B) Umístění: 4 . (D) Další informace: /označení = D-Phe /poznámka^ „Předpona „D- v D-Phc znamená, že fenylalariin v poloze 4 je Daminokyselinou.“ (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíČ: Peptid (B) Umístění: 6 (O) Další informace: /označení = MeVal /poznámka= „Předpona „Me“ v MeVal znamená, že valin v pozici 6 je methylovaný valin:“ (xi) Označení sekvence: SE.Q ID NO:9:
Arg Gly Asp Phe Asn Val
5
Průmyslová využitelnost
Vynález popisuje způsoby inhibice angiogeneze ve tkáních za použití vitronektinových ανβί antagonistů, což má zvláštní význam v léčení neovaskulárních očních nemocí, nádorového růstu a léčení žáhětlivých podmínek. Vynález se také zabývá syntézou látek vhodných pro inhibici angiogeneze.
- 78. .Wr““^T
PATE N T 0 V É N Á í S Z 7 ť 7/ -> -> R OKY Y 0 · / '7
1. Použití antagonisty anbs pro výrobu prostředků, schopných
irihibovat angiogenezi v tkán ích.

Claims (2)

  1. 2. Použiti podle nároku 1, kde zmíněný anbí> antagonista jf monoklonálni protilátka imunospeci f ická na an^b, ale ne píro anbi, anb3 nebo anbba.
  2. 3. Použití podle nároku 2 kde zmíněná monoklonálni protilátka (íla imunureakční charakte risti ky monok1oná1n í prot i 1 átky označeni..
    A. Použiti podle nároku 1 kdo zmíněný anbb antagonista je polypeptid obsahující RGD
    3. Použití podle nároku 4. kde uvedeny po 1ypeptid jo vybrán skupiny obsahující eyklo(Arq Gly Asp <-yklo(Gly D Ary Gly Asp - Phe ·· Va 1 ) ( SEQ ID NO 6) .
    ,/l·. 1 ‘ Ai y Gly Asp-Phe-D Val) (SEQ ID no ?)
    TyrThrA1 a G1u-Cys Lys Pro Gin Val-Thr-Arg Gly-Asp·Val-Phe (SEQ ID NO 8) a cyklo(Arg-Gly Asp-D-Phe Asn HcVal (SEQ ID NO 91 ti i e j ich sol i .
    é. Použití Použití ,i: i g i o g e n i? z c podle nar podle nái o .1· .i·;. .; oku ‘. >. k do kd<- u ...•i.. 11 Véd ó i i o vrděná ené i. ti a o 1 l.káři i i sou liydrodiloi idy k-j i · * r i ·.·· 1 i *? : i ná .i 3. Použití j>od 1 é nár t ) k ‘ j - ’. kde Í'l ČOil.i t k Λη ) 1 · artr j t 1 Cliá . 9 Použití podle náru k. kde- ii'.' C r j o ..i r tritii r ·. tk.iíl vjsk.luie u rJ : Li ΤΠ 3 j Í i ·. h >. evm a k '>> i- t liti iu i 11 i '( >už I t 1 pU 1.1 1 rj l l -JLÍ l. ku 1 , 1 1 tx ' .i » 1 i' t.-< : ·'.· i J J i;. . ; V .. ; u i - i · j ‘ · r 11 a , Tilu J I · i Ho ;,/· Γ3 í 0111'10’ : í.MC'I'í 1 . .J b Uď Π *' i:.· -,kL i}· i ny ' .>·‘“Ti i : nt.-m* <<. i , z a hrnu jící·: H diabét i· kón r t_-1.. i n< ip a t h i i , maku i árn d< gerierac i vyvol irio j vc k o m . d i mn o 1 < 1 u očn í h 11 ;t op 1 a srnčí: .11 i. v L 11 iop.it.. h i 1 U íiedriin.i St*1 i .1. -iět. í ' nu· o v rj kii 1 .Ar n i g1aukum. 11 I1 ...ó i t. í i·.*;. ? dui t . HP i · · . · r.· η Λ ang i»’ i li- Z· ) . i i1!' i * . l Ί i. i . Z>. i i ·. · : Ih.j k i 11 1 L· lilií ri -.-o v i .‘j k i.j 1 1 ' i un 1 pi r T ' U< ' liU v/branuii
    skupiny poruch, zahrnující korneální transplantaci, herpetickou keratitiďu, luetickou keratitidu, pterygium a neovaskulární panus spojený s užíváním kontaktních čoček. n
    12. Použití podle nároku 1, kde řečená tkáň je hemangiom.
    13. Použití podle nároku 1, kde řečená tkáň je pevný nádor nebo pevná nádorová metastáze a řečená angiogeneze je nádorová angiogeneze.
    14. Použití podle nároku 1, kde řečená angiogeneze je indukována cytok lnem.
    15. Použití podle nároku 14, kde řečený cytokin je vybraný ze skupiny obsahující vaskulární endoteliální růstový faktor, transformační růstový faktor-a a epidermální růstový faktor.
    16. Použití podle nároku 15, kde řečený cytokin je vaskulární endoteliální růstový faktor a řečená angiogeneze je vybrána ze skupiny obsahující retinální angiogene2i, korneální angiogenezi, nádorovou angiogenezi a angiogenezi zapálené tkáně.
    17. Použití podle nároku 1, kde uvedené angiogenezi-inhibující množství je od 2 uM do 5 mM.
    18. Použití podle nároku 1, kde zmíněný anbs antagonista je
    19. Použití podle nároku 1, kde zmírněný reprezentován následující strukturou:
    anbs antagonista je
    20. Použití podle nároku 1, kde zmíněný anbs antagonista je reprezentován následující strukturou:
    21. Použiti podle nároku 1, kde zmíněný ante antagonista je reprezentován následující strukturou:
    22. Použití podle nároku 1, kde zmíněný anbs antagonista je reprezentován následující strukturou-
    23. Použiti pudl·.' nároku 1, kde zmíněný anb>> antagonista je repreaenlúván následující struklmou
    Sloučenina 15 /ji ι Ί .
    24. Použiti podle nároku 1, kde zmíněný anbs antagonista representován následující strukturou:
    25. Použití podle nároku 1, kde zmíněný anbs antagonista je representován následující strukturou -
    26. Použití podle nároku 1, kde zmíněný anbs antagonista je representován následující strukturou:
CZ98409A 1995-08-14 1996-08-13 Použití antagonisty anb5 pro výrobu prostředků, schopných inhibovat angiogenezi v tkáních CZ40998A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51479995A 1995-08-14 1995-08-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ40998A3 true CZ40998A3 (cs) 1998-09-16

Family

ID=24048748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ98409A CZ40998A3 (cs) 1995-08-14 1996-08-13 Použití antagonisty anb5 pro výrobu prostředků, schopných inhibovat angiogenezi v tkáních

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0844874B1 (cs)
JP (2) JP4903921B2 (cs)
KR (1) KR100516322B1 (cs)
CN (2) CN101053561A (cs)
AT (1) ATE308981T1 (cs)
AU (1) AU726793B2 (cs)
CA (2) CA2754102C (cs)
CZ (1) CZ40998A3 (cs)
DE (1) DE69635417T2 (cs)
DK (1) DK0844874T3 (cs)
ES (1) ES2250996T3 (cs)
HU (1) HUP9802675A3 (cs)
MX (1) MX9801228A (cs)
NO (1) NO319264B1 (cs)
RU (1) RU2214268C2 (cs)
SK (1) SK18898A3 (cs)
UA (1) UA84665C2 (cs)
WO (1) WO1997006791A1 (cs)
ZA (1) ZA966886B (cs)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0907661A4 (en) * 1996-05-31 2000-07-26 Scripps Research Inst METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING ALPHA-V-BETA5 MEDIATED ANGIOGENESIS.
DE69720062D1 (de) * 1996-12-09 2003-04-24 Lilly Co Eli Integrin antagonisten
US6245809B1 (en) 1996-12-09 2001-06-12 Cor Therapeutics Inc. Integrin antagonists
US6228985B1 (en) 1998-05-21 2001-05-08 Schering Corporation Derivatives of aminobenzoic and aminobiphenylcarboxylic acids useful as anti-cancer agents
IL140084A0 (en) * 1998-06-05 2002-02-10 Astra Ab Oxazolidinone derivatives, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
GB9812019D0 (en) * 1998-06-05 1998-07-29 Zeneca Ltd Chemical compounds
US7387779B2 (en) 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US6962974B1 (en) 1998-06-17 2005-11-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US6759047B1 (en) 1998-06-17 2004-07-06 Beth Israel Deaconess Hospital Corp. Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof
US6235877B1 (en) 1999-08-04 2001-05-22 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Peptido-mimetic compounds containing RGD sequence useful as integrin inhibitors
US6160099A (en) 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
US6344484B1 (en) 1999-02-12 2002-02-05 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Tyrosine alkoxyguanidines as integrin inhibitors
EP1028114A1 (en) 1999-02-13 2000-08-16 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel guanidine derivatives as inhibitors of cell adhesion
CN1374863A (zh) 1999-07-21 2002-10-16 惠氏公司 αvβ3整联蛋白的双环选择性拮抗剂
DE60021521D1 (de) 1999-09-29 2005-09-01 Ortho Mcneil Pharm Inc Isonipecotamide zur behandlung von integrin vermittelten störungen
GB9928568D0 (en) 1999-12-03 2000-02-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
DK1272507T3 (da) 2000-04-12 2005-10-03 Amersham Health As Integrinbindende peptidderivater
GB0009803D0 (en) 2000-04-25 2000-06-07 Astrazeneca Ab Chemical compounds
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US6486174B2 (en) 2000-08-07 2002-11-26 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid alkoxyguanidines as integrin antagonists
NO20004795D0 (no) 2000-09-26 2000-09-26 Nycomed Imaging As Peptidbaserte forbindelser
US6855722B2 (en) 2001-01-29 2005-02-15 Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Substituted indoles and their use as integrin antagonists
US7081460B2 (en) 2001-04-09 2006-07-25 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Quinazoline and quinazoline-like compounds for the treatment of integrin-mediated disorders
US6872730B2 (en) 2001-04-27 2005-03-29 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Substituted benzofurans and benzothiophenes, methods of making and methods of use as integrin antagonists
KR100932827B1 (ko) 2001-07-10 2009-12-21 지이 헬스케어 에이에스 펩티드계 화합물
JP2005504757A (ja) * 2001-08-01 2005-02-17 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 眼の疾患の治療用インテグリン阻害剤
WO2005053683A1 (en) 2003-11-26 2005-06-16 Duke University A method of preventing or treating glaucoma
AU2012216372B2 (en) * 2004-04-02 2015-01-22 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alphaVbeta5 integrin
ES2411965T3 (es) * 2004-04-02 2013-07-09 The Regents Of The University Of California Métodos y composiciones para tratar y prevenir enfermedad asociada con integrina alfa V beta 5
WO2010075058A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Ge Healthcare Limited Application of 99mtc peptide-based compound as a bone marrow imaging agent
EP2822598A4 (en) 2012-03-05 2016-04-13 Univ Ramot POLYMERS HAVING THERAPEUTICALLY ACTIVE AGENTS CONJUGATED THERETO, METHODS FOR THE PREPARATION OF SAID POLYMERS AND USES THEREOF
KR101597327B1 (ko) 2014-04-24 2016-02-24 동아에스티 주식회사 옥사졸리딘계 화합물 및 이를 포함하는 선택적 안드로겐 수용체 효능제
WO2017145164A1 (en) 2016-02-24 2017-08-31 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Polymeric conjugates and uses thereof
RU2646125C1 (ru) * 2016-09-20 2018-03-01 Константин Николаевич Руссков Способ профилактики рецидива птеригиума
RU2653814C1 (ru) * 2017-06-01 2018-05-14 Федеральное государственное автономное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ профилактики рецидивов птеригиума после хирургического лечения

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5135919A (en) * 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US5235919A (en) * 1991-07-01 1993-08-17 Robuck Norman F Picnic table and flying insect control apparatus
UA43823C2 (uk) * 1992-07-06 2002-01-15 Мерк Патент Геселлшафт Міт Бесшренктер Хафтунг ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ІНГІБУВАННЯ ІНТЕГРИН <font face="Symbol">a</font><sub>V</sub><font face="Symbol">b</font><sub>3</sub>-ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ КЛІТИННОЇ АДГЕЗІЇ КЛІТИН ССАВЦІВ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ЗАХВОРЮВАННЯ, АСОЦІЙОВАНОГО З ПОРУШЕННЯМ АДГЕЗІЇ КЛІТИН, СПОСІБ БЛОКУВАННЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ ФІБРИНОГЕНОМ ІНТЕГРИНУ, КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ЗАГОЄННЯ РАН
US5981478A (en) * 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5753230A (en) * 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
CN1226172A (zh) * 1996-05-31 1999-08-18 斯克里普斯研究学院 用于抑制血管发生的方法和组合物

Also Published As

Publication number Publication date
KR19990036426A (ko) 1999-05-25
CA2227265C (en) 2012-01-03
CN1198667A (zh) 1998-11-11
AU6846696A (en) 1997-03-12
NO980622D0 (no) 1998-02-13
JPH11511171A (ja) 1999-09-28
HUP9802675A3 (en) 2000-09-28
EP0844874A4 (en) 2001-02-14
DE69635417D1 (de) 2005-12-15
EP0844874A1 (en) 1998-06-03
DK0844874T3 (da) 2006-01-16
ES2250996T3 (es) 2006-04-16
JP2007262073A (ja) 2007-10-11
CN1313146C (zh) 2007-05-02
UA84665C2 (ru) 2008-11-25
ZA966886B (en) 1997-04-24
NO980622L (no) 1998-04-07
MX9801228A (es) 1998-05-31
WO1997006791A1 (en) 1997-02-27
ATE308981T1 (de) 2005-11-15
RU2214268C2 (ru) 2003-10-20
KR100516322B1 (ko) 2005-12-26
CN101053561A (zh) 2007-10-17
CA2754102C (en) 2012-12-18
NO319264B1 (no) 2005-07-11
JP4903921B2 (ja) 2012-03-28
EP0844874B1 (en) 2005-11-09
JP4544639B2 (ja) 2010-09-15
AU726793B2 (en) 2000-11-23
HUP9802675A2 (hu) 1999-03-29
SK18898A3 (en) 1998-07-08
CA2227265A1 (en) 1997-02-27
CA2754102A1 (en) 1997-02-27
DE69635417T2 (de) 2006-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ40998A3 (cs) Použití antagonisty anb5 pro výrobu prostředků, schopných inhibovat angiogenezi v tkáních
RU2195312C2 (ru) СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ αvβ5-ОПОСРЕДОВАННОГО АНГИОГЕНЕЗА
WO1997045447A9 (en) METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR INHIBITION OF αvβ5 MEDIATED ANGIOGENESIS
WO1997006791A9 (en) METHODS AND COMPOSITIONS USEFUL FOR INHIBITION OF αvβ5 MEDIATED ANGIOGENESIS
CA2256543C (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
JPH10500398A (ja) 脈管形成の抑制に有用な方法および組成物
US20060165703A1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of alpha v beta 5 mediated angiogenesis
US20060270710A1 (en) Methods for inhibition of angiogenesis
US20030176334A1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
MXPA98009944A (en) Methods and useful compositions for medium angiogenesis inhibition by alfavbe

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic