CN114126652A - 抗肿瘤剂和配合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型的抗肿瘤剂和配合剂。本发明提供：与有效量的下述化合物(II)同时给药的、含有谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S‑转移酶抑制剂作为有效成分的抗肿瘤剂；与有效量的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S‑转移酶抑制剂同时给药的、含有下述化合物(II)作为有效成分的抗肿瘤剂；或含有下述化合物(II)和谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S‑转移酶抑制剂作为有效成分的抗肿瘤剂。
Figure DDA0003470372600000011
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素)。

Description

抗肿瘤剂和配合剂
技术领域
本发明涉及抗肿瘤剂和配合剂。
背景技术
在癌症治疗中，对抗癌剂、放射线等的治疗具有抵抗性的细胞存在是复发和转移的原因，妨碍癌症的治疗。作为这样的治疗抵抗性细胞，近年来关注癌干细胞的存在。癌干细胞对于各种应激的耐性高，以癌干细胞为标靶的药剂开发对癌症的根治是当务之急。然而，为开发癌干细胞靶向疗法而对癌干细胞应激耐性的分子机制进行分析才刚刚起步。
上皮性癌干细胞的标记之一CD44已知是参与其应激耐性的分子(CancerCell.2011Mar 8；19(3):387-400)。CD44中存在剪接突变型(以下称为CD44v)，CD44v使胱氨酸转运体xCT在细胞膜上稳定表达。xCT具有向细胞内摄入胱氨酸的功能，由此，摄入的胱氨酸用于谷胱甘肽(GSH)的产生，因此在高表达CD44v的细胞中，GSH的量增加。由于GSH具有很强的抗氧化作用，在减少细胞产生的应激方面发挥作用，所以高表达CD44v的癌干细胞对于治疗具有抵抗性。
另一方面，在用于治疗溃疡性结肠炎和风湿性关节炎的药剂中，有水杨酸偶氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)(別名：柳氮磺胺吡啶、柳氮磺吡啶、柳酸偶氮磺胺吡啶)。水杨酸偶氮磺胺吡啶为磺胺吡啶和5-氨基水杨酸(5-ASA)的酸性偶氮化合物，口服给药时，在肠内由肠内细菌分解为磺胺吡啶和5-氨基水杨酸(5-ASA)。对于上述疾病，特别是5-ASA成为主要的有效成分。
近年来，已知分解之前的未变化体的水杨酸偶氮磺胺吡啶具有xCT抑制作用，作为抗肿瘤剂有效(Leukemia vol.15,pp.1633-1640,2001)。换句话说，对癌细胞添加水杨酸偶氮磺胺吡啶时，会抑制由xCT向细胞内摄入胱氨酸，并减少谷胱甘肽产生量，导致癌细胞的氧化应激耐性降低，对抗肿瘤剂的感受性提高。
对于高表达CD44v的癌干细胞，已知具有xCT抑制作用的水杨酸偶氮磺胺吡啶也能够有效抑制增殖(日本特开2012-144498)。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供一种新型的抗肿瘤剂和配合剂。
用于解决课题的方法
本发明的发明人发现，水杨酸偶氮磺胺吡啶对于几乎为未分化肿瘤细胞的肿瘤在单独使用时就具有抗肿瘤效果，但是，对于包含显示分化形态的肿瘤细胞的分化型肿瘤，虽然使高表达CD44v的癌干细胞减少，但没有看到使肿瘤整体体积减少的效果。为此，对于这样的分化型肿瘤进行了深入研究，试图通过开发一种对于水杨酸偶氮磺胺吡啶没有抗肿瘤效果的肿瘤细胞具有抗肿瘤效果的药物，来获得一种针对这种分化肿瘤的抗肿瘤剂，结果发现，如果将醛脱氢酶抑制剂或奥昔非君与水杨酸偶氮磺胺吡啶或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺联合使用，对于分别单独使用水杨酸偶氮磺胺吡啶或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺时效果弱的肿瘤细胞具有显著的抗肿瘤效果，从而完成了本发明。
本发明的一个实施方式为一种抗肿瘤剂，其含有谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂作为有效成分，且与有效量的醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐同时给药
Figure BDA0003470372580000021
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。)
本发明的另一实施方式为一种抗肿瘤剂，其含有醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐作为有效成分，且与有效量的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂同时给药，
Figure BDA0003470372580000031
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。)
在上述任一抗肿瘤剂中，上述谷胱甘肽浓度降低剂可以为抑制xCT、Thioredoxin-1(硫氧还蛋白-1：TRX-1)、glutamate-cysteine ligase(GCL)(EC6.3.2.2)(也称为γ-谷氨酸-半胱氨酸合成酶)、谷胱甘肽合成酶(EC6.3.2.3)中任一种的活性的药剂。上述药剂可以为xCT或GCL的抑制剂，也可以为水杨酸偶氮磺胺吡啶或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺。上述式(II)所示的化合物可以为奥昔非君(Oxyfedrine)。
本发明的另一实施方式为一种配合剂，其含有醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐和谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂作为有效成分。
Figure BDA0003470372580000032
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。)
在上述配合剂中，上述谷胱甘肽浓度降低剂可以为抑制xCT、Thioredoxin-1(硫氧还蛋白-1：TRX-1)、glutamate-cysteine ligase(GCL)(EC6.3.2.2)(也称为γ-谷氨酸-半胱氨酸合成酶)、谷胱甘肽合成酶(EC6.3.2.3)中任一种的活性的药剂。上述药剂可以为xCT或GCL的抑制剂，也可以为水杨酸偶氮磺胺吡啶或其衍生物、或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺。上述式(II)所示的化合物可以为奥昔非君。
本发明的另一实施方式为含有上述任一配合剂的抗肿瘤剂。
上述任一抗肿瘤剂可以是针对包含对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性的肿瘤细胞的肿瘤的抗肿瘤剂。在上述肿瘤细胞中，可以高表达醛脱氢酶。上述肿瘤可以还包含表达CD44v的肿瘤细胞。
本发明的另一实施方式为一种测定方法，包括：将醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐和谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂在体外(invitro)对肿瘤细胞同时给药的工序；和测定上述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序。
Figure BDA0003470372580000041
(式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。)
在该测定方法中，上述肿瘤细胞可以对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性。
本发明的另一实施方式为一种与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有联合使用效果的药剂的确定方法，包括：将特定的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂和多种醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐分别在体外(in vitro)对肿瘤细胞同时给药的工序；和测定上述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序。
Figure BDA0003470372580000051
(式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。)
本发明的另一实施方式为一种与作为抗肿瘤剂的化合物(III)或其药学上可接受的盐具有联合使用效果的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽-S-转移酶抑制剂的确定方法，包括：将上述化合物(III)和多个谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂在体外(in vitro)对肿瘤细胞同时给药的工序；和测定上述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序。
Figure BDA0003470372580000052
(式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。)
上述化合物(III)可以为化合物(II)。
Figure BDA0003470372580000053
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。)
本发明的另一实施方式为一种实现作为抗肿瘤剂的化合物(III)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的联合使用效果的肿瘤细胞的确定方法，包括：将上述化合物(III)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的特定组合在体外(in vitro)对多种肿瘤细胞同时给药的工序；和测定上述多种肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序。
Figure BDA0003470372580000061
(式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。)
上述化合物(III)可以为化合物(II)。
Figure BDA0003470372580000062
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。)
在上述任一确定方法中，上述肿瘤细胞可以对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性。
本发明的另一实施方式为一种放射线联合使用抗肿瘤剂，其含有醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐作为有效成分，且用于放射线治疗。
Figure BDA0003470372580000071
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。)
上述式(II)所示的化合物可以为奥昔非君。可以为针对包含对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性的肿瘤细胞的肿瘤的抗肿瘤剂。在上述肿瘤细胞中，可以高表达醛脱氢酶。上述肿瘤可以还包含表达CD44v的肿瘤细胞。
本发明的另一实施方式为一种抗肿瘤效果测定方法，包括：在体外(in vitro)，在醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐的存在下对肿瘤细胞照射放射线的工序；和测定上述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序。
Figure BDA0003470372580000072
(式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。)
上述肿瘤细胞可以对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性。
本发明的另一实施方式为一种在体外(in vitro)在肿瘤细胞中具有与放射线照射的协同效果的药剂的确定方法，包括：在体外(in vitro)，在醛脱氢酶抑制剂或多种化合物(III)或其药学上可接受的盐分别存在下对肿瘤细胞进行放射线照射的工序；和测定上述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序。
Figure BDA0003470372580000081
(式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。)
上述化合物(III)可以为化合物(II)。
Figure BDA0003470372580000082
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。)
上述肿瘤细胞可以对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性。
本发明的另一实施方式为一种抗肿瘤作用的增强剂，其是由醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的共同给药所发挥的抗肿瘤作用的增强剂，该抗肿瘤作用的增强剂含有Nrf2的xCT表达增强作用的抑制剂。
Figure BDA0003470372580000083
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。)
上述抑制剂可以为对Nrf2基因的表达抑制物质或Nrf2的抑制剂。上述对Nrf2基因的表达抑制物质可以为针对Nrf2基因的反义NA、miNA、或siNA。上述Nrf2的抑制剂可以为ML385或抗Nrf2抗体。上述抗肿瘤作用可以为针对过量表达Nrf2基因的肿瘤的作用。上述谷胱甘肽浓度降低剂可以为水杨酸偶氮磺胺吡啶。上述式(II)所示的化合物可以为奥昔非君。
本发明的另一实施方式为一种伴随诊断用药剂，其用于预测由醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的共同给药所发挥的抗肿瘤效果，该伴随诊断用药剂包含Nrf2基因表达的检测用试剂。
Figure BDA0003470372580000091
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。)
上述检测用试剂可以为抗体、基因表达检测用探针或基因扩增用引物。上述谷胱甘肽浓度降低剂可以为水杨酸偶氮磺胺吡啶。上述式(II)所示的化合物可以为奥昔非君。
本发明的另一实施方式为一种伴随诊断用药剂，其用于预测由醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的共同给药所发挥的抗肿瘤效果，该伴随诊断用药剂包含Keap1基因或Nrf2基因的突变的检测用试剂。
Figure BDA0003470372580000101
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。)
＝＝与关联文献的交叉引用＝＝
本申请基于令和元年5月14日申请的日本专利申请2019-091358和令和元年11月1日申请的日本专利申请2019-200094主张优先权，该基础专利通过引用也包含在本说明书中。
附图说明
图1是表示在本发明的一个实施例中水杨酸偶氮磺胺吡啶与达克罗宁的联合使用效果的图。
图2是表示在本发明的一个实施例中通过xCT敲除引起的达克罗宁感受性的变化的图。
图3是表示在本发明的一个实施例中各种癌细胞株中水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀(Erastin)或BSO与达克罗宁的联合使用效果的图。
图4是表示在本发明的一个实施例中水杨酸偶氮磺胺吡啶和达克罗宁在体内(invivo)的联合使用效果的图。
图5是表示在本发明的一个实施例中由达克罗宁得到的ALDH活性抑制效果的实验结果的图。
图6是表示在本发明的一个实施例中由水杨酸偶氮磺胺吡啶和达克罗宁的联合使用得到的HNE(4-HNE；4-羟基-2-壬醛烯)的积蓄效果的图。
图7是表示在本发明的一个实施例中水杨酸偶氮磺胺吡啶或BSO与达克罗宁类似物(具有达克罗宁骨架的物质)的联合使用效果的图。
图8是表示在本发明的一个实施例中BSO与达克罗宁类似物(不具有达克罗宁骨架的物质)的联合使用效果的图。
图9是表示在本发明的一个实施例中OSC19细胞或水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性OSC19细胞中的水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀或BSO与达克罗宁的联合使用效果的图。
图10是表示在本发明的一个实施例中HSC4细胞、OSC19细胞或水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性OSC19细胞中的ALDH基因家族的表达的图。
图11是表示在本发明的一个实施例中奥昔非君与水杨酸偶氮磺胺吡啶(SSZ)或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)的联合使用效果的实验结果的图。
图12是表示HNE的代谢通路的图。缩写：HNA，4-羟基-2-壬烯酸；GSH，谷胱甘肽；ALDH，醛脱氢酶；GST，谷胱甘肽S-转移酶
图13是表示在本发明的一个实施例中由水杨酸偶氮磺胺吡啶或BSO引起的肿瘤细胞内GSH浓度降低的图。
图14是表示在本发明的一个实施例中关于细胞内的HNE的积蓄的、水杨酸偶氮磺胺吡啶或BSO与奥昔非君的联合使用效果的图。
图15是表示在本发明的一个实施例中关于体内(in vivo)肿瘤细胞的存活率降低的、水杨酸偶氮磺胺吡啶与奥昔非君的联合使用效果的图。
图16是表示在本发明的一个实施例中关于体内(in vivo)细胞内的HNE的积蓄的、水杨酸偶氮磺胺吡啶与奥昔非君的联合使用效果的图。
图17是表示在本发明的一个实施例中关于肿瘤细胞的存活率降低的、放射线照射与奥昔非君给药的联合使用效果的实验结果的图。
图18是表示在本发明的一个实施例中关于细胞内的HNE的积蓄的、放射线照射与奥昔非君给药的联合使用效果的实验结果的图。
图19是表示在本发明的一个实施例中SSZ耐性肿瘤细胞中的Nrf2和xCT的表达的实验结果的图。
图20是表示在本发明的一个实施例中在含有针对Nrf2基因的siRNA或作为Nrf2的抑制剂的ML385、OXY、SSZ或BSO的培养基中的A549细胞的细胞存活率的实验结果的图。
图21是表示在本发明的一个实施例中关于体内(in vivo)肿瘤细胞的重量增加抑制的、放射线照射与奥昔非君(OXY)给药的联合使用效果的实验结果的图。
具体实施方式
以下，列举实施例对本发明的实施方式进行详细说明。需要说明的是，本发明的目的、特征、优点及其技术思想，根据本说明书的记载，对于本领域技术人员来说是清楚的，只要是本领域技术人员，则能够根据本说明书的记载而容易地再现本发明。以下所记载的发明的实施方式和具体实施例等是例示本发明的优选的实施方式，用于例示或说明，本发明不受其限定。在本说明书中公开的本发明的思想及其范围内，本领域技术人员能够基于本说明书的记载进行各种变更和修改。
此外，实施方式和实施例没有特别说明时，使用标准的操作说明集中所述的方法、或者对其进行了修改或改变的方法。另外，使用市售的试剂盒和测定装置的情况下，在没有特别说明时使用其所带的操作说明书。
＝＝抗肿瘤剂＝＝
本发明的一个实施方式为与有效量的醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐同时给药的、含有谷胱甘肽浓度降低剂作为有效成分的抗肿瘤剂。这里，有效量的醛脱氢酶抑制剂是指作为抗肿瘤活性具有与谷胱甘肽浓度降低剂的联合使用效果的量的醛脱氢酶抑制剂。
另外，本发明的另一实施方式为与有效量的谷胱甘肽浓度降低剂同时给药的、含有醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐作为有效成分的抗肿瘤剂。这里，有效量的谷胱甘肽浓度降低剂是指作为抗肿瘤活性具有与醛脱氢酶抑制剂的联合使用效果的量的谷胱甘肽浓度降低剂。
不拘泥于以下的理论，可以认为，如图12所示，在细胞内存在多个分解HNE的通路，其中，通过同时抑制经由GST的通路和经由ALDH的分解通路这两者，在细胞内积蓄HNE。并且，可以认为，由于HNE具有细胞毒性，所以肿瘤细胞变得无法增殖。因此，通过将醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂同时给药，对于抗肿瘤效果发挥协同效果。
另外，本发明的另一实施方式是用于放射线治疗的、含有醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐作为有效成分的抗肿瘤剂。这里，放射线治疗是指用于肿瘤治疗的治疗方法，根据技术常识，基于肿瘤、患者的状态等，治疗者容易判断并确定其照射量和照射方法等。已知可以利用放射线照射降低细胞内的GSH量，通过在醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐的存在下照射放射线，可以得到两者的联合使用效果。因此，此时，可以对于肿瘤患者投予抗肿瘤剂，在确认到与放射线照射的协同效果的浓度期间进行放射线照射，也可以对肿瘤患者照射放射线，在GSH量降低期间投予抗肿瘤剂。
醛脱氢酶抑制剂为抑制醛脱氢酶2(醛脱氢酶2：ALDH)(EC1.2.1.10)的酶活性的药剂。作为抑制对象的ALDH的类型和亚型没有特别限定，可以是ALDH1～5和它们的亚型中的任一种。抗肿瘤剂中所使用的醛脱氢酶抑制剂没有特别限定，能够例示氯磺丙脲(chlorpropamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、二乙氨基苯甲醛、双硫仑(tetraethylthioperoxydicarbonic diamide)、氨基氰(cyanamide)、奥昔非君、柠檬醛(3,7-dimethyl-2,6-octadienal：3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛)、鬼伞毒素(coprine)、大豆苷(daidzin)、DEAB(4-(Diethylamino)benzaldehyde：4-二乙基氨基苯甲醛)、棉子酚(gossypol)、犬尿氨酸代谢物(3-hydroxykynurenine：3-羟基犬尿氨酸；3-hydroxyanthranilic acid：3-羟基氨基苯甲酸；kynurenic acid：犬尿喹啉酸；和indol-3-ylpyruvic acid：吲哚-3-基-丙酮酸)、草达灭(Molinate)、***油、帕吉林(N-benzyl-N-methylprop-2-yn-1-amine：N-苯基-N-甲基丙-2-炔基-1-胺)和它们的类似物、或它们的药学上可接受的盐。特别优选以下所示的达克罗宁和达克罗宁类似物(I)，更优选图7所示的化合物(BAS00363846、STL327701、PHAR033081、PHAR298639和Aldi-2)。
Figure BDA0003470372580000141
(式中，R1为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。R1优选为C4～5的直链或支链烷基，R2和R3优选为C2的烷基、或R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的六元环的氮杂环烷基。此外，R1为C4的直链烷基且R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的六元环的氮杂环烷基的化合物为达克罗宁。卤素优选为F、Cl、I、Br、I。)
化合物(II)为奥昔非君或其类似物，具有以下的结构式。
Figure BDA0003470372580000142
(式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。)
作为所使用的化合物(II)，优选具有下述(IV)的结构式的奥昔非君，作为其盐优选奥昔非君盐酸盐。
Figure BDA0003470372580000143
此外，就药学上可接受的盐而言，只要是这些化合物和形成盐的物质即可，没有特别限定，具体而言，例如，能够列举盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、高氯酸盐、磷酸盐等无机酸加成盐；草酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐等有机酸加成盐；甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐等磺酸加成盐；氨基酸的加成盐等，优选为盐酸盐、草酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐。另外，这些化合物或其药学上可接受的盐不仅包括无水物，也包括水合物和结晶多形。
谷胱甘肽浓度降低剂是使细胞内的谷胱甘肽浓度降低的药剂。这些抗肿瘤剂中所使用的谷胱甘肽浓度降低剂不受限定，优选为抑制由xCT摄入细胞内的胱氨酸产生谷胱甘肽的通路的药剂，更优选抑制xCT、Thioredoxin-1(硫氧还蛋白-1：TRX-1)、glutamate-cysteine ligase(GCL)(EC6.3.2.2)(也称为γ-谷氨酸-半胱氨酸合成酶)、谷胱甘肽合成酶(EC6.3.2.3)中任一种的活性的药剂，更优选为xCT抑制剂或GCL抑制剂。xCT抑制剂没有特别限定，优选为水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀、索拉非尼、或者这些的衍生物、或抗xCT抗体。GCL抑制剂也没有特别限定，优选L-丁硫氨酸-亚砜亚胺或其衍生物。这里，作为衍生物，只要是谷胱甘肽浓度降低剂即可，没有特别限定，例如，可以列举PEG化体等。
谷胱甘肽S-转移酶抑制剂是抑制谷胱甘肽S-转移酶(EC2.5.1.18)的酶活性的药剂，特别是抑制将HNE(4-HNE；4-羟基-2-壬醛烯)转变为HNE-GSH的活性的药剂。谷胱甘肽S-转移酶抑制剂没有特别限定，谷胱甘肽类似物(例如，WO95/08563、WO96/40205、WO99/54346等)、苯酮苯丙酸、吲哚美辛、依他尼酸、吡前列素(Piroprost)、抗GST抗体、GST的显性负性突变体等。
在本说明书中，将两种或其以上的药剂“同时给药”不仅是指在时间上同时给药，也包括在还残留有一种药剂的效果的期间投予其它药剂，在时间上前后分别单独给药的意思。将两种或其以上的药剂同时给药时，可以将含有一种的药剂以2种以上同时给药，也可以作为配合剂将二种或其以上的药剂形成一个剂型而进行给药。此外，“共同给药”和“进行共同给药”也分别具有与“同时给药”和“进行同时给药”相同的意思。
抗肿瘤剂的给药对象只要是脊椎动物即可，没有特别限定，优选为人类的癌症患者。治疗对象的肿瘤没有特别限定，优选包含对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性的肿瘤细胞的肿瘤。该肿瘤细胞可以高表达醛脱氢酶。谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂优选为xCT抑制剂，更优选为水杨酸偶氮磺胺吡啶。关于具有耐性的肿瘤细胞，在体内(in vivo)时是指对患者以通常治疗浓度给药通常治疗天数时依旧存活的肿瘤细胞，在体外(in vitro)时是指在80％以上的种类的细胞株中存活率为50％以下的浓度时存活率为90％以上的肿瘤细胞。例如，水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性肿瘤细胞，在体内(in vivo)时，是指对患者以AUC 0-24为50～300μg·h/mL给药约2周时依旧存活的肿瘤细胞，在体外(in vitro)时，是指在200μM时存活率为90％以上的肿瘤细胞。另外，L-丁硫氨酸-亚砜亚胺耐性细胞，在体内(in vivo)时，是指对患者以AUC 0-24为10～100μg·h/mL给药约2周时依旧存活的肿瘤细胞，在体外(in vitro)时，是指在100μM时存活率为90％以上的肿瘤细胞。水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性肿瘤细胞和L-丁硫氨酸-亚砜亚胺耐性细胞优选CD44v表达也为低水平或阴性。乙醛脱氢酶过量表达的肿瘤细胞是指ALDH1A1、ALDH2、ALDH1B1、ALDH3A1中的任一个基因表达与OSC19细胞相比以3倍以上、优选为10倍以上的高水平表达的细胞。该治疗对象的肿瘤可以混入有表达CD44v的肿瘤细胞。这是由于对于表达CD44v的肿瘤细胞，水杨酸偶氮磺胺吡啶和L-丁硫氨酸-亚砜亚胺具有有效的抗肿瘤作用。表达CD44v的肿瘤细胞只要是能够检测出CD44v表达的细胞即可，优选为高表达的细胞，此时的高表达只要是与卵巣肿瘤细胞的平均水平相同的程度或者高于其平均水平即可，优选高2倍以上，更优选高4倍以上，更加优选高10倍以上。
肿瘤的种类没有特别限定，优选为实体癌，能够例示大肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、头颈部的扁平上皮癌、卵巣肿瘤、睾丸肿瘤。
抗肿瘤剂可以通过通常的方法制成片剂、粉剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、液剂、乳剂、悬浊剂等。此时，可以使用本领域技术人员已知的药学上可接受的添加剂，例如赋形剂和载体来制造。
抗肿瘤剂可以在有效量的范围内对给药对象以合适的方法进行给药。有效量能够考虑剂型的种类、给药方法、给药对象的年龄和体重、给药对象的病状等，最终根据医师或兽医的判断来适当确定。例如，化合物的给药量优选为每1天为0.1mg/kg以上，更优选为1mg/kg以上，更加优选为10mg/kg以上，优选为1000mg/kg以下，更优选为300mg/kg以下，更加优选为100mg/kg以下。给药方法没有特别限定，例如，可以口服给药，也可以通过对腹腔内、静脉内的注射或点滴来非口服给药，也可以通过注射等对癌内直接给药。
＝＝抗肿瘤剂的抗肿瘤作用增强剂＝＝
本发明的一个实施方式是由醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂和的共同给药发挥作用的抗肿瘤作用的增强剂，其含有Nrf2的xCT表达增强功能的抑制剂。也可以称为上述的抗肿瘤剂的抗肿瘤作用增强剂。该抗肿瘤剂的抗肿瘤作用增强剂与抗肿瘤剂同时给药。
如实施例所示，Nrf2的表达水平与xCT和ALDH的表达水平呈正相关。不拘泥于该理论，可以认为抑制Nrf2的表达水平时，xCT和ALDH的表达被抑制，能够增强抗肿瘤剂的效果。
作为Nrf2的xCT表达增强功能的抑制剂，能够例示对Nrf2基因的表达抑制物质、Nrf2的xCT表达增强功能的抑制剂。即，为了抑制Nrf2的xCT表达增强作用，在肿瘤细胞内，可以抑制Nrf2基因的表达，也可以抑制Nrf2蛋白的xCT表达增强功能。
作为对Nrf2基因的表达抑制物质，能够例示针对Nrf2基因的反义NA、miNA或siNA。分别可以由RNA形成，也可以由DNA形成，也可以为RNA和DNA的嵌合分子。另外，核酸(NA)可以具有各种修饰。这些序列能够根据本领域技术人员的技术常识来容易地设计。另外，作为Nrf2的抑制剂，能够例示如ML385这样的低分子的化合物、抗Nrf2抗体。
作为给药对象的肿瘤细胞没有特别限定，优选为过量表达Nrf2基因的肿瘤。这是由于过量表达Nrf2基因的肿瘤具有对上述抗肿瘤剂的抵抗性。因此，可以在投予抗肿瘤剂的抗肿瘤作用增强剂之前，在给药对象的肿瘤细胞中研究Nrf2基因的表达水平。这样，在Nrf2基因的表达水平正常时，可以仅投予抗肿瘤剂，也可以同时投予抗肿瘤剂的抗肿瘤作用增强剂。在Nrf2基因的表达水平比正常亢进时，优选将抗肿瘤剂和抗肿瘤剂的抗肿瘤作用增强剂共同给药。
＝＝肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的测定方法＝＝
本发明的一个实施方式为一种测定方法，包括：将醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐和谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂在体外(invitro)对肿瘤细胞同时给药的工序；和测定投予了药剂的肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序。
本发明的另一实施方式为一种测定方法，包括：在体外(in vitro)，在醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐的存在下对肿瘤细胞照射放射线的工序；和测定肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序。
本节中的醛脱氢酶抑制剂、谷胱甘肽浓度降低剂、谷胱甘肽S-转移酶抑制剂参照“抗肿瘤剂”一节中详细阐述的物质。化合物(III)具有以下的结构式，优选为化合物(II)。
Figure BDA0003470372580000181
(式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，上述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。)
醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐和谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂对于抗肿瘤活性具有联合使用效果，因此，通过该测定方法能够发现联合使用效果高的药剂的组合，或者对某些药剂的组合发现特别有效的肿瘤细胞。
具体而言，将特定的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂和多种醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐分别在体外(in vitro)对肿瘤细胞同时给药，测定投予了药剂的肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率，由此，能够确定具有与特定的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的联合使用效果的醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐。另外，将特定的醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐与多个谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂在体外(invitro)对肿瘤细胞同时给药，测定投予了药剂的肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率，由此，能够确定具有与特定的醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐的联合使用效果的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂。或者，在体外(in vitro)，在肿瘤细胞中在醛脱氢酶抑制剂或多个化合物(III)或其药学上可接受的盐分别的存在下对肿瘤细胞进行放射线照射，测定肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率，由此，能够确定具有与放射线照射的协同效果的药剂。
另外，将醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的特定的组合在体外(in vitro)对多种肿瘤细胞同时给药，测定投予了药剂的多种肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率，由此，能够确定实现醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的联合使用效果的肿瘤细胞。这些方法中所使用的化合物(III)优选为具有抗肿瘤活性的抗肿瘤剂。
＝＝伴随诊断用药剂＝＝
本发明的一个实施方式是用于预测上述的抗肿瘤剂所得到的抗肿瘤效果的伴随诊断用药剂，其含有Nrf2基因表达的检测用试剂。
近年来，已知Nrf2的表达为肿瘤的恶性化因子。如实施例所示，Nrf2的表达水平高的肿瘤细胞中，抗肿瘤剂的效果比较弱。不拘泥于该理论，Nrf2的表达水平与xCT和ALDH的表达水平呈正相关，上述的抗肿瘤剂同时抑制xCT和ALDH的表达，因此可以认为Nrf2的表达水平高则难以发挥抗肿瘤剂的效果。因此，可以预想，Nrf2基因的表达水平越高，抗肿瘤剂的效果越弱，Nrf2基因的表达水平越低，抗肿瘤剂的效果越强。
Nrf2基因表达能够在直至Nrf2蛋白的最终产物的任何阶段检测出来，例如，可以检测mRNA，也可以检测蛋白质。Nrf2基因表达的检测用试剂没有特别限定，能够根据技术常识容易地选择，例如，可以包含抗体、基因表达检测用探针或基因扩增用引物。本领域技术人员根据技术常识，能够容易地制作抗Nrf2抗体，能够容易地设计基因表达检测用探针、基因扩增用引物。
另外，Nrf2蛋白的稳定表达也与Keap1和Nrf2基因的突变相关，因此，伴随诊断用药剂也是检测公知的Keap1基因或Nrf2基因的突变的试剂。Keap1基因或Nrf2基因的突变的检测能够通过公知的技术进行，例如，可以包括用于扩增Keap1基因或Nrf2基因的基因扩增用引物。
实施例
(实验例1)水杨酸偶氮磺胺吡啶和达克罗宁的联合使用效果
(目的)本实验例中，关于水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞的存活率降低，显示具有xCT抑制效果的水杨酸偶氮磺胺吡啶与达克罗宁实现联合使用效果。
(方法)在96孔板中，将作为水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞株的口腔扁平上皮癌细胞株HSC-4以2000个/孔进行接种，开始培养。培养基使用DMEM。24小时后，更换为含有50μM达克罗宁或等量的DMSO、和0μM(无添加)、50μM、100μM、200μM或400μM的水杨酸偶氮磺胺吡啶的培养基，继续培养48小时。此后，使用Celltiter-Glo(Promega公司)测定细胞存活率，将对照(DMSO添加、水杨酸偶氮磺胺吡啶无添加)的细胞生存数设为100％，算出各情况下的细胞存活率。图1中制作了表示相对于水杨酸偶氮磺胺吡啶的各浓度的存活率的图表。
(结果)HSC4为水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞株，单独使用水杨酸偶氮磺胺吡啶对细胞存活率几乎没有影响。另外，单独使用达克罗宁(达克罗宁添加、水杨酸偶氮磺胺吡啶无添加)也显示80％的存活率。但是，添加达克罗宁和水杨酸偶氮磺胺吡啶双方时，水杨酸偶氮磺胺吡啶为100μM以上时的存活率成为10％以下。
如上所述，关于水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞的存活率降低，水杨酸偶氮磺胺吡啶与达克罗宁实现联合使用效果。
(实验例2)由xCT敲除引起的达克罗宁感受性的变化
(目的)本实验例中，代替具有xCT抑制效果的水杨酸偶氮磺胺吡啶，敲除xCT，显示同样的与达克罗宁的联合使用效果，由此，表示水杨酸偶氮磺胺吡啶与达克罗宁具有联合使用效果是经由水杨酸偶氮磺胺吡啶的xCT抑制效果。
(方法)在96孔板中将作为水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞株的口腔扁平上皮癌细胞株HSC-4细胞以3000个/孔进行接种，将非沉默对照(扰乱(Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGUtt(序列编号1)，Antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAAtt(序列编号2)))siRNA或xCT特异性的siRNA(xCT siRNA#1Sense:AGAAAUCUGGAGGUCAUUAtt(序列编号3)，Antisense:AGAAAUCUGGAGGUCAUUAtt(序列编号4)，xCT siRNA#2Sense:CCAGAACAUUACAAAUAAUtt(序列编号5)，Antisense:AUUAUUUGUAAUGUUCUGGtt(序列编号6))使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher Scientific公司)进行脂质体转染，开始培养。培养基使用DMEM。24小时后，更换为含有50μM达克罗宁(溶剂为DMSO)或等量的DMSO的培养基，继续培养48小时。此后，使用Celltiter-Glo(Promega公司)测定细胞存活率，将对照(非沉默对照、DMSO添加)的细胞存活率设为100％，算出各个细胞存活率。在图2中表示结果。
(结果)HSC-4在单独使用50μM的达克罗宁时具有约60％的细胞存活率，相对于此，在敲除xCT时，在50μM的达克罗宁存在下，仅有约10～20％的细胞存活率。
由此可见，水杨酸偶氮磺胺吡啶与达克罗宁具有联合使用效果是通过水杨酸偶氮磺胺吡啶的xCT抑制效果。
(实验例3)各种癌细胞株中的水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀或BSO与达克罗宁的联合使用效果
(目的)本实验例中，在各种肿瘤细胞株中水杨酸偶氮磺胺吡啶、作为xCT的特异的抑制剂的爱拉斯汀、或作为谷胱甘肽合成抑制剂的BSO显示与达克罗宁实现联合使用效果，同时，显示xCT的抑制是通过谷胱甘肽合成抑制。
(方法)在96孔板中，将图3所示的细胞株以3000个/孔进行接种，开始培养。培养基使用DMEM。24小时后，更换为含有50μM达克罗宁或等量的DMSO、以及0μM(无添加)或400μM的水杨酸偶氮磺胺吡啶、0μM(无添加)或5μM的爱拉斯汀、0μM(无添加)或100μM的BSO的培养基，继续培养48小时。此后，使用Celltiter-Glo(Promega公司)测定细胞存活率，将对照(DMSO添加、达克罗宁无添加)的细胞生存数设为100％，算出各个细胞存活率。在图3中图示各情况下的细胞存活率。
(结果)虽然效果的大小因细胞而异，但在水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀或BSO与达克罗宁的所有组合中均观察到同样的联合使用效果。
由此可见，由水杨酸偶氮磺胺吡啶或爱拉斯汀引起的xCT的抑制通过谷胱甘肽的合成抑制发挥其抗肿瘤效果。因此，能够代替水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀而使用谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂。
(实验例4)水杨酸偶氮磺胺吡啶和达克罗宁在体内(in vivo)的联合使用效果
(目的)本实验例中，显示水杨酸偶氮磺胺吡啶和达克罗宁的联合使用效果在体内(in vivo)也可以观察到。
(方法)将作为水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞株的口腔扁平上皮癌细胞株HSC-2细胞1×10 6个移植到裸鼠皮下，从移植后第4天将生理盐水、水杨酸偶氮磺胺吡啶单独、达克罗宁单独、水杨酸偶氮磺胺吡啶和达克罗宁双方以1天1次，将各药剂以水杨酸偶氮磺胺吡啶400mg/kg、达克罗宁5mg/kg的给药量在腹腔内给药，持续至第22天。每3～4天测定肿瘤的短径、长径，通过以下的式子算出肿瘤体积，将结果在图4中图表化。
肿瘤体积＝(长径×(短径)2)/2
此外，肿瘤体积的统计分析在第22天利用t检验进行。
(结果)如图4所示，各药剂单独给药时减少35％左右的肿瘤体积，双方均给药时，减少70％左右的体积。
由此可见，通过水杨酸偶氮磺胺吡啶与达克罗宁的联合使用给药，能够降低水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性肿瘤的增殖。
(实验例5)达克罗宁对ALDH的抑制
(目的)本实验例显示达克罗宁具有ALDH的抑制活性。
(方法)在10cm细胞培养皿中将口腔届平上皮癌细胞株HSC-4细胞以8×10 5个/皿进行接种，开始培养。培养基使用DMEM。24小时后，更换为含有50μM的达克罗宁(溶剂为DMSO)的培养基，培养24小时。此后，回收细胞，利用ALDEFLUOR kit(STEMCELLTechnologies公司)，对在N,N-二乙基氨基苯甲醛(DEAB)存在下具有ALDH活性的细胞进行染色，用FACS进行分析(图中为Dyclonine)。作为对照，表示对于不添加DEAB、没有用ALDEFLUOR kit染色的细胞(图中为Unstained)的实验结果、更换为不含达克罗宁的等量的DMSO的培养基、用ALDEFLUOR kit染色的细胞(图中为Non-treatment)的实验结果。此外，关于阳性细胞的测定，对在DEAB存在下利用ALDEFLUORkit进行了染色的DMSO处理样品(图中为DEAB)，制作以阳性细胞几乎为0％时的门(Gate)，计算各情况的阳性率。
(结果)如图5所示，在DMSO处理细胞中ALDH活性高的细胞组存在25％左右，在达克罗宁处理细胞和已知的ALDH抑制剂DEAB处理细胞中，ALDH活性高的细胞组抑制至1％左右。
如上所述，达克罗宁具有ALDH的抑制活性。
(实验例6)由水杨酸偶氮磺胺吡啶和达克罗宁联合使用引起的HNE的积蓄
(目的)本实验例显示，通过水杨酸偶氮磺胺吡啶和达克罗宁的联合使用，肿瘤细胞内的HNE的水平、和积蓄HNE的细胞的频度显著增加。
(方法)与实验例1同样，用含有50μM达克罗宁或等量的DMSO以及0μM(无添加)或400μM的水杨酸偶氮磺胺吡啶的培养基培养HSC-4细胞，将处理后的细胞用4％PFA-PBS进行了固定。接着，用0.2％TritonX100-PBS进行了细胞膜通透处理后，利用3％BSA-PBS进行封闭。此后，作为1次抗体使用抗HNE抗体、作为2次抗体使用Alexafluor488标记抗小鼠IgG抗体进行了荧光染色。作为阳性对照，使用以50μMHNE孵育30分钟的细胞，同样地进行抗体染色。在图6中表示荧光显微镜下的观察图像。
(结果)分别单独用达克罗宁或水杨酸偶氮磺胺吡啶进行处理时，以低频度观察到细胞内HNE浓度的增加，通过联合使用水杨酸偶氮磺胺吡啶和达克罗宁，以高频度观察到高浓度的细胞内HNE的积蓄。
由此可见，通过联合使用xCT抑制剂和ALDH抑制剂，将会以高频度观察到高浓度的细胞内HNE的积蓄。作为其理由，可以认为，如上所述，在细胞内存在多条分解HNE的通路(参照图12)，其中，通过同时抑制经由GST的通路和经由ALDH的分解通路这两个通路，在细胞内积蓄HNE。并且，可以认为，由于HNE具有细胞毒性，因此，肿瘤细胞变得无法增殖。
(实验例7)水杨酸偶氮磺胺吡啶或BSO与达克罗宁类似物(具有达克罗宁骨架)的联合使用效果
(目的)显示具有达克罗宁骨架的下述达克罗宁类似物(I)具有与水杨酸偶氮磺胺吡啶或BSO的联合使用效果。
Figure BDA0003470372580000241
(式中，R1为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。R1优选为C4～5的直链或支链烷基，R2和R3优选为C2的烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的六元环的氮杂环烷基。此外，R1为C4的直链烷基且R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的六元环的氮杂环烷基的化合物为达克罗宁。卤素优选为F、Cl、I、Br、I。)
(方法)与实验例1同样，用含有0μM(无添加)、25μM、50μM或100μM的达克罗宁、或12.5μM、25μM、50μM、100μM的达克罗宁类似物BAS00363846、STL327701、PHAR033081、PHAR298639、或Aldi-2(结构式参照图7B)和0μM(无添加)或100μMBSO或300μM水杨酸偶氮磺胺吡啶的培养基培养HSC-4细胞，测定细胞存活率，在图7A中绘制成图表。
(结果)这些化合物全部实现了与BSO或水杨酸偶氮磺胺吡啶的联合使用效果。
由此可见，具有达克罗宁骨架的达克罗宁类似物(I)具有作为xCT抑制剂和抗肿瘤剂的联合使用效果。
(实验例8)BSO与达克罗宁类似物(不具有达克罗宁骨架)的联合使用效果
(目的)显示不具有达克罗宁骨架的达克罗宁类似物不具有与BSO的联合使用效果。
(方法)与实验例1同样，用含有0μM(无添加)、12.5μM、25μM或50μM达克罗宁、或3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM的达克罗宁类似物(4-hydroxyacetpphenone：4-羟基苯乙酮，结构式参照图8B)和0μM(无添加)或100μMBSO的培养基培养HSC-4细胞，测定细胞存活率，在图8A中绘制成图表。
(结果)不具有达克罗宁骨架的达克罗宁类似物无法实现与BSO的联合使用效果。
由此可见，与xCT抑制剂的相互作用中，达克罗宁骨架是重要的。
(实验例9)水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性OSC19细胞中水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀或BSO与达克罗宁的联合使用效果
(目的)在获得对xCT抑制剂的耐性的癌细胞株中，达克罗宁显示与谷胱甘肽合成抑制剂的联合使用效果。
(方法)将水杨酸偶氮磺胺吡啶感受性口腔扁平上皮癌细胞株OSC19在含有水杨酸偶氮磺胺吡啶的DMEM培养基中培养2个月，建立水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性OSC19细胞。将OSC19细胞的母株或OSC19-SSZR细胞在96孔板中以3000个/孔进行接种，培养24小时后，更换为含有图9所示的浓度的水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀或BSO和50μM的达克罗宁(溶剂为DMSO)或等量的DMSO的培养基，培养48小时。此后，利用Celltiter-Glo(Promega公司)测定细胞存活率，将对照(水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀和BSO无添加、DMSO添加)设为100％，算出细胞存活率。
(结果)显示达克罗宁在OSC19-SSZR细胞中也具有与水杨酸偶氮磺胺吡啶、爱拉斯汀或BSO的联合使用效果。
由此可见，达克罗宁在获得对xCT抑制剂的耐性的癌细胞中也显示与谷胱甘肽合成抑制剂的联合使用效果。
(实验例10)水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性OSC19细胞和HSC-4中ALDH基因家族的表达
(目的)显示在具有对xCT抑制剂的耐性的癌细胞中，高表达ALDH基因家族。
(方法)从HSC-4细胞、OSC19细胞和OSC19-SSZR细胞提取信使RNA，进行逆转录，由此合成互补DNA。此后，将所得到的互补DNA作为模板，通过定量RT-PCR法测定ALDHIAl、ALDHIBl、ALDH2、ALDH3Al和RPS17的表达量。参考RPS17的表达量，通过ΔΔCt法对各ALDH家族基因的表达量进行定量，在图10中绘制成图表。
(结果)与OSC19相比，在OSC19-SSZR中ALDHIAl的表达上升。在HSC～4中确认到ALDHIBl和ALDH2的高表达。ALDH3Al在HSC4和OSC19-SSZR中高表达。这样，在xCT低感受性的癌细胞株中，ALDH家族基因的表达呈现高的趋势。
由此可见，在ALDH家族基因的表达高的癌细胞中，即使为了利用ALDH家族基因分解HNE，利用xCT抑制剂抑制向GST的分解，HNE也不发挥毒性，获得对xCT抑制剂的耐性(参照图12)。对这样的细胞投予ALDH抑制剂时，对xCT抑制剂的感受性提高，因此，含有ALDH抑制剂和谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的抗肿瘤剂对ALDH家族基因的表达高的癌细胞也有效地发挥作用。
(实验例11)奥昔非君(OXY)与水杨酸偶氮磺胺吡啶(SSZ)或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)的联合使用效果
(目的)本实验例中，关于水杨酸偶氮磺胺吡啶或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺耐性肿瘤细胞(A549、HCT116、HSC-4)的存活率降低，显示水杨酸偶氮磺胺吡啶或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺与奥昔非君实现了联合使用效果。
(方法)在96孔板中将作为水杨酸偶氮磺胺吡啶或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺耐性细胞株的肺胞基底上皮腺癌细胞株A549、结肠腺癌细胞株HCT116、口腔扁平上皮癌细胞株HSC-4以4000个/孔进行接种，开始培养。关于培养基，对A549使用RPMI，对HCT116和HSC-4分别使用DMEM。24小时后，更换为含有50μM或100μM奥昔非君或等量的DMSO和0μM(水杨酸偶氮磺胺吡啶和L-丁硫氨酸亚砜亚砜均不添加)、400μM的水杨酸偶氮磺胺吡啶、或100μM的L-丁硫氨酸亚砜亚砜的培养基，继续培养48小时。此后，使用Celltiter-Glo(Promega公司)测定细胞存活率，将对照(DMSO添加、水杨酸偶氮磺胺吡啶和L-丁硫氨酸亚砜亚砜均不添加)的细胞生存数设为100％，算出各情况的细胞存活率。在图11中绘制了表示相对于奥昔非君的各浓度的存活率的图表。
(结果)A549、HCT116、HSC4为水杨酸偶氮磺胺吡啶和/或丁硫氨酸亚砜亚砜耐性细胞株，单独使用水杨酸偶氮磺胺吡啶或丁硫氨酸亚砜亚砜对细胞存活率的影响小。另外，单独使用奥昔非君(奥昔非君添加、水杨酸偶氮磺胺吡啶无添加)50μM时，确认不到显著的细胞杀伤效果。但是，添加奥昔非君和水杨酸偶氮磺胺吡啶或丁硫氨酸亚砜亚砜双方时，例如，奥昔非君为100μM时，存活率在水杨酸偶氮磺胺吡啶联合使用下为25％以下，在丁硫氨酸亚砜亚砜联合使用下为5％以下。
由此可见，关于水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞的存活率降低，水杨酸偶氮磺胺吡啶或者丁硫氨酸亚砜亚砜与奥昔非君实现协同的联合使用效果。另一方面，其效果强弱因细胞而异，例如，考虑对患者给药时优选为低浓度，关于奥昔非君50μM时与水杨酸偶氮磺胺吡啶和的联合使用效果，在A549细胞中与单独使用水杨酸偶氮磺胺吡啶的细胞存活率相比几乎没有变化，在HCT116细胞中，细胞存活率为75％，在HSC4细胞中为75％，奥昔非君与水杨酸偶氮磺胺吡啶的联合使用效果在A549中弱于HCT116细胞、HSC-4细胞。
(实验例12)水杨酸偶氮磺胺吡啶(SSZ)或丁硫氨酸亚砜亚砜(BSO)引起的肿瘤细胞内GSH浓度的降低
(目的)本实验例中，显示通过SSZ或BSO降低肿瘤细胞内的GSH浓度。
(方法)使用SSZ耐性肿瘤细胞(HCT116、HSC-4)，与实施例11同样对细胞进行处理，使用GSH-Glo谷胱甘肽分析试剂盒(Promega公司)测定48小时后的细胞内的GSH浓度。在图13中表示测定结果。
(结果)分别单独用SSZ、BSO或奥昔非君(OXY)处理时，单独使用SSZ或BSO时细胞内GSH浓度降低，但是单独使用SSZ时的细胞内GSH浓度降低的效果不大。并且，单独使用OXY时，细胞内GSH浓度不降低。另一方面，联合使用SSZ和OXY时观察到比单独使用SSZ时降低细胞内GSH浓度。
由此可见，SSZ或BSO作为xCT抑制剂发挥作用，使肿瘤细胞内的GSH浓度降低，但是单独使用SSZ时，其效果不充分。
(实验例13)水杨酸偶氮磺胺吡啶(SSZ)或丁硫氨酸亚砜亚砜(BSO)与奥昔非君(OXY)的联合使用引起的HNE的积蓄
(目的)本实验例中，显示通过SSZ或BSO与OXY的联合使用，肿瘤细胞内的HNE的水平和积蓄HNE的细胞的频度显著增加。
(方法)本实验例中，使用水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性肿瘤细胞(HCT116、HSC-4)，与实验例6同样对细胞进行处理，用荧光显微镜进行了观察。在图14中表示荧光显微镜下的观察图像。
(结果)分别单独使用SSZ、BSO或OXY处理时，以低频度观察到细胞内HNE浓度增加的细胞，但是通过SSZ或BSO与OXY的联合使用，以高频度观察到高浓度的细胞内HNE的积蓄的细胞。
由此可见，通过联合使用xCT抑制剂和ALDH抑制剂，以高频度观察到积蓄了高浓度的细胞内HNE的细胞。由此，如实施例11那样，可以认为，关于水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞的存活率降低，xCT抑制剂和ALDH抑制剂实现协同的联合使用效果。
(实验例14)水杨酸偶氮磺胺吡啶(SSZ)与奥昔非君(OXY)在体内(in vivo)的联合使用效果
(目的)本实验例显示，SSZ和OXY的联合使用效果在体内(in vivo)时也可观察到。
(方法)使用SSZ耐性细胞株的口腔扁平上皮癌细胞株HCT-116细胞，与实施例4同样操作，在小鼠体内形成肿瘤，算出肿瘤体积(移植7天后和14天后)和肿瘤重量(移植16天后)，在图15中将结果绘制成图表。此外，肿瘤的照片为肿瘤重量测定时所拍摄。
(结果)如图15所示，单独使用各药剂时，几乎没有肿瘤生长抑制效果，通过SSZ和OXY的联合使用，显著抑制肿瘤的生长。
由此可见，通过SSZ和OXY的联合使用给药，能够抑制源自SSZ耐性细胞的肿瘤生长。
(实验例15)水杨酸偶氮磺胺吡啶(SSZ)与奥昔非君(OXY)的联合使用引起的体内(in vivo)的肿瘤中的HNE积蓄
(目的)本实验例显示，通过SSZ与OXY的联合使用，在体内(in vivo)形成的肿瘤内的HNE的水平和积蓄HNE的细胞的频度显著增加。
(方法)使用作为SSZ耐性细胞株的口腔扁平上皮癌细胞株HCT-116细胞，与实施例4同样操作，在小鼠体内形成肿瘤，对移植16天后的肿瘤如下所述进行免疫组织化学的解析。首先，对肿瘤组织用4％甲醛溶液进行固定，制作石蜡切片。用0.2％TritonX100-PBS进行细胞膜通透处理后，用PBS进行洗浄，用3％BSA-PBS进行进行封闭。此后，作为1次抗体使用Vectastain Elite kit(Vector Laboratories公司)的抗HNE抗体，作为酶的底物使用ImmPACT DAB Peroxidase Substrate(Vector Laboratories公司)，将HNE染色成茶色。在图16中表示显微镜下的观察图像。
(结果)如图16所示，对于体内(in vivo)的肿瘤，通过联合使用SSZ和OXY也以高频度观察到了积蓄有高浓度的细胞内HNE的细胞。由此，可以认为，如实施例14那样，对于SSZ耐性细胞由来的肿瘤的成长抑制，SSZ和OXY实现协同的联合使用效果。
由此可见，关于源自水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞的肿瘤的生长抑制，xCT抑制剂与ALDH抑制剂实现协同的联合使用效果。
(实验例16)在利用放射线的肿瘤的治疗中使用ALDH抑制剂的效果
(目的)本实验例显示，通过在对水杨酸偶氮磺胺吡啶(SSZ)耐性细胞照射放射线的同时使用ALDH抑制剂，关于SSZ耐性细胞的存活率降低和HNE的积蓄，放射线照射与ALDH抑制剂实现协同效果。
(方法)本实验例中，对于SSZ耐性肿瘤细胞(HCT116、HSC-4)在50μM的奥昔非君(OXY)的存在下使用X射线照射装置(日立MBR-1520R-4，设定为150kV、20mA)，照射4、6、10Gy的电离放射线。作为对照，对无OXY的样品和电离放射线非照射(0Gy)的样品也同时进行处理。24小时后，与实验例1同样算出细胞存活率。在图17表示其结果。另外，与实施例6同样使细胞内HNE可视化。在图18中表示其结果。
(结果)如图17所示，与仅放射线照射或者仅OXY处理相比时，在OXY存在下照射放射线照射时，细胞的存活率显著且明显地降低。
另外，如图18所示，通过联合使用放射线处理和OXY处理，以高频度观察到高浓度的细胞内HNE积蓄细胞。
由此可见，可以认为通过联合使用放射线照射和OXY处理，发生细胞内HNE高浓度积蓄，由此，细胞的存活率显著降低。
(实验例17)Nrf2的表达水平与xCT和ALDH的表达水平的相关性
(目的)本实验例显示Nrf2的表达水平与xCT和ALDH的表达水平存在正相关。
(方法)对于SSZ耐性肿瘤细胞(HCT116、HSC-4、A549)的提取物，通过对Nrf2、xCT和β肌动蛋白利用各自的一次抗体和HRP结合二次抗体进行蛋白质免疫印迹，检测Nrf2、xCT和β肌动蛋白的表达。检测使用Chemiluminescence reagent Plus(Perkin-Elmer Japan公司)。在图19(A)中表示其结果。
接着，对A549细胞将针对Nrf2基因的siRNA通过脂质体转染，抑制Nrf2基因的表达。在48小时后得到脂质体转染后的A549细胞的提取物，同样进行蛋白质免疫印迹，研究Nrf2、xCT、ALDH3A1和β肌动蛋白的表达。其中，siRNA使用以下的序列(小写所示的碱基为DNA的突出末端(overhang)。)。
对照:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3'(序列编号7)
5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAtt-3'(序列编号8)
siNrf2:5'-UCCUACUGUGAUGUGAAAUtt-3'(序列编号9)
5'-AUUUCACAUCACAGUAGGAgc-3'(序列编号10)
在图19(B)中表示其结果。
(结果)如图19(A)所示，在A549细胞中Nrf2过量表达，随之，xCT过量表达。
并且，在A549细胞中，通过siRNA抑制Nrf2基因的表达后，也抑制了xCT和ALDH3A1的表达。
由此可见，Nrf2基因的表达水平与xCT和ALDH的表达水平具有正相关，特别是在A549细胞中，Nrf2基因过量表达。
(实验例18)针对Nrf2基因的siRNA、水杨酸偶氮磺胺吡啶(SSZ)或丁硫氨酸亚砜亚砜(BSO)与奥昔非君(OXY)的联合使用效果
(目的)根据图11，将A549的结果与HCT116或HSC4的结果进行比较时，奥昔非君和水杨酸偶氮磺胺吡啶的联合使用效果在A549的情况下较弱。本实验例显示，通过抑制Nrf2基因，在A549中的联合使用效果得到增强。
(方法)对于A549细胞，与实施例17同样，导入针对Nrf2基因的siRNA，或者在培养基中含有Nrf2抑制剂ML385，并且与实施例11同样，在含有50μM的OXY和400μM的SSZ或100μM的BSO的培养基中培养48小时，测定细胞存活率。在图20中表示其结果。此外，作为对照，使用所有成分均不添加的培养基进行实验，在全部情况下以添加的DMSO量成为一定的方式适当添加DMSO。
(结果)根据图20，通过在SSZ+OXY之外还使用针对Nrf2基因的siRNA或Nrf2的抑制剂ML385，在A549细胞中也能够有效地降低细胞存活率。
由此可见，Nrf2基因的表达可以成为SSZ+OXY的共同给药是否对肿瘤增殖的抑制有效的指标。并且，通过在SSZ+OXY以外还投予针对Nrf2基因的siRNA或ML385，能够提高SSZ+OXY的效果。该策略特别是对Nrf2基因过量表达的肿瘤有效。
(实施例19)在利用放射线的肿瘤的治疗中使用ALDH抑制剂的效果
(目的)本实验例显示通过在对裸鼠中所移植的肿瘤细胞照射放射线的同时使用ALDH抑制剂，关于SSZ耐性细胞的存活率降低和HNE的积蓄，放射线照射和ALDH抑制剂实现协同效果。
(方法)将作为水杨酸偶氮磺胺吡啶耐性细胞株的口腔扁平上皮癌细胞株HSC-2的1.5×106个对裸鼠(5只)进行皮下移植。从移植第二天开始进行3天(Day1～Day3)奥昔非君(OXY)(20mg/kg)的腹腔内给药。在Day4进行奥昔非君(30mg/kg)的腹腔内给药，在2小时后对裸鼠照射X射线(4、6、或10Gy)。此后，进一步进行3天(Day5～Day7)奥昔非君(20mg/kg)的腹腔内给药予，在Day7回收肿瘤，测定其重量。在图21中将其结果作为柱状图表示。此外，将通过对移植后的裸鼠同样投予奥昔非君但不照射X射线的组和不投予奥昔非君但同样照射X射线的组作为对照。另外，关于统计处理，对各X射线照射量，对奥昔非君给药组和非给药组之间进行Student t检验，以p＜0.05作为显著。
(结果)如图21所示，随着X射线增强，抑制了肿瘤的重量增加。并且，在无X射线照射的组和X射线4Gy照射组，与奥昔非君非给药组相比，奥昔非君给药组存在抑制肿瘤的重量增加的趋势，X射线6Gy照射组和X射线10Gy照射组与奥昔非君非给药组相比，奥昔非君给药组显著抑制了肿瘤的重量增加。
由此可见，放射线照射与奥昔非君给药对体内(in vivo)的肿瘤的重量增加抑制具有协同效果。
工业上的可利用性
根据本发明，能够提供新型的抗肿瘤剂和配合剂。
序列表
<110> 学校法人庆应义塾
<120> 抗肿瘤剂和配合剂
<130> KO190594
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 1
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 2
acgugacacg uucggagaat t 21
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<211> 21
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<400> 3
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<211> 21
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<220>
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<400> 4
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<211> 21
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<400> 7
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 9
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<210> 10
<211> 21
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<220>
<223> siRNA
<400> 10
auuucacauc acaguaggag c 21

Claims (45)

1.一种抗肿瘤剂，其特征在于：
其含有谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂作为有效成分，且与有效量的醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐同时给药，
Figure FDA0003470372570000011
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。
2.一种抗肿瘤剂，其特征在于：
其含有醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐作为有效成分，且与有效量的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂同时给药，
Figure FDA0003470372570000012
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。
3.如权利要求1或2所述的抗肿瘤剂，其特征在于：
所述谷胱甘肽浓度降低剂为抑制xCT、Thioredoxin-1(硫氧还蛋白-1：TRX-1)、glutamate-cysteine ligase(GCL)(EC6.3.2.2)(也称为γ-谷氨酸-半胱氨酸合成酶)、谷胱甘肽合成酶(EC6.3.2.3)中任一种的活性的药剂。
4.如权利要求3所述的抗肿瘤剂，其特征在于：
所述药剂为xCT或GCL的抑制剂。
5.如权利要求4所述的抗肿瘤剂，其特征在于：
所述药剂为水杨酸偶氮磺胺吡啶或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺。
6.如权利要求1～5中任一项所述的抗肿瘤剂，其特征在于：
所述式(II)所示的化合物为奥昔非君。
7.一种配合剂，其特征在于：
其含有醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐和谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂作为有效成分，
Figure FDA0003470372570000021
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。
8.如权利要求7所述的配合剂，其特征在于：
所述谷胱甘肽浓度降低剂为抑制xCT、Thioredoxin-1(硫氧还蛋白-1：TRX-1)、glutamate-cysteine ligase(GCL)(EC6.3.2.2)(也称为γ-谷氨酸-半胱氨酸合成酶)、谷胱甘肽合成酶(EC6.3.2.3)中任一种的活性的药剂。
9.如权利要求8所述的配合剂，其特征在于：
所述药剂为xCT或GCL的抑制剂。
10.如权利要求9所述的配合剂，其特征在于：
所述药剂为水杨酸偶氮磺胺吡啶或L-丁硫氨酸-亚砜亚胺。
11.如权利要求10所述的配合剂，其特征在于：
所述式(II)所示的化合物为奥昔非君。
12.一种抗肿瘤剂，其特征在于：
其含有权利要求7～11所述的配合剂。
13.如权利要求1～6、12中任一项所述的抗肿瘤剂，其特征在于：
其是针对包含对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性的肿瘤细胞的肿瘤的抗肿瘤剂。
14.如权利要求13所述的抗肿瘤剂，其特征在于：
在所述肿瘤细胞中，乙醛脱氢酶高表达。
15.如权利要求13或14所述的抗肿瘤剂，其特征在于：
所述肿瘤还包含表达CD44v的肿瘤细胞。
16.一种测定方法，其特征在于，包括：
将醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐和谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂在体外对肿瘤细胞同时给药的工序；和
测定所述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序，
Figure FDA0003470372570000031
式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。
17.一种与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有联合使用效果的药剂的确定方法，其特征在于，包括：
将特定的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂和多种醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐分别在体外对肿瘤细胞同时给药的工序；和
测定所述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序，
Figure FDA0003470372570000041
式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。
18.一种与作为抗肿瘤剂的化合物(III)或其药学上可接受的盐具有联合使用效果的谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽-S-转移酶抑制剂的确定方法，其特征在于，包括：
将所述化合物(III)和多种谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂在体外对肿瘤细胞同时给药的工序；和
测定所述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序，
Figure FDA0003470372570000042
式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。
19.如权利要求17或18所述的确定方法，其特征在于：
所述化合物(III)为化合物(II)，
Figure FDA0003470372570000051
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。
20.一种实现作为抗肿瘤剂的化合物(III)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的联合使用效果的肿瘤细胞的确定方法，其特征在于，包括：
将所述化合物(III)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的特定组合在体外对多种肿瘤细胞同时给药的工序；和
测定所述多种肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序，
Figure FDA0003470372570000052
式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。
21.如权利要求20所述的确定方法，其特征在于：
所述化合物(III)为化合物(II)，
Figure FDA0003470372570000061
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。
22.如权利要求16所述的测定方法，其特征在于：
所述肿瘤细胞对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性。
23.如权利要求17～21中任一项所述的确定方法，其特征在于：
所述肿瘤细胞对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性。
24.一种放射线联合使用抗肿瘤剂，其特征在于：
其含有醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐作为有效成分，且用于放射线治疗，
Figure FDA0003470372570000062
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。
25.如权利要求24所述的放射线联合使用抗肿瘤剂，其特征在于：
所述式(II)所示的化合物为奥昔非君。
26.如权利要求24或25所述的放射线联合使用抗肿瘤剂，其特征在于：
其是针对包含对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性的肿瘤细胞的肿瘤的抗肿瘤剂。
27.如权利要求26所述的放射线联合使用抗肿瘤剂，其特征在于：
在所述肿瘤细胞中，醛脱氢酶高表达。
28.如权利要求26或27所述的放射线联合使用抗肿瘤剂，其特征在于：
所述肿瘤还包含表达CD44v的肿瘤细胞。
29.一种抗肿瘤效果测定方法，其特征在于，包括：
在体外，在醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐的存在下对肿瘤细胞照射放射线的工序；和
测定所述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序，
Figure FDA0003470372570000071
式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。
30.如权利要求29所述的抗肿瘤效果测定方法，其特征在于：
所述肿瘤细胞对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性。
31.一种在体外在肿瘤细胞中具有与放射线照射的协同效果的药剂的确定方法，其特征在于，包括：
在体外，在多种醛脱氢酶抑制剂或化合物(III)或其药学上可接受的盐分别存在下对肿瘤细胞进行放射线照射的工序；和
测定所述肿瘤细胞的增殖速度或细胞存活率的工序，
Figure FDA0003470372570000081
式中，X为氢、卤素、-NH2或-CN，Y为C1～6的直链或支链烷基，Z1和Z2分别为氢或卤素、和可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，或者Z1和Z2一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基。
32.如权利要求31所述的确定方法，其特征在于：
所述化合物(III)为化合物(II)，
Figure FDA0003470372570000082
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R2和R3为独立选择的C1～6的直链或支链烷基，或者R2和R3一起形成以它们所结合的N为杂原子的四元环、五元环、六元环或七元环的氮杂环烷基，R4为氢或卤素。
33.如权利要求31或32所述的确定方法，其特征在于：
所述肿瘤细胞对谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂具有耐性。
34.一种抗肿瘤作用的增强剂，其特征在于：
其是由醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的共同给药所发挥的抗肿瘤作用的增强剂，
所述抗肿瘤作用的增强剂含有Nrf2的xCT表达增强作用的抑制剂，
Figure FDA0003470372570000091
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。
35.如权利要求34所述的抗肿瘤效果的增强剂，其特征在于：
所述抑制剂为对Nrf2基因的表达抑制物质或Nrf2的抑制剂。
36.如权利要求35所述的抗肿瘤效果的增强剂，其特征在于：
所述对Nrf2基因的表达抑制物质为针对Nrf2基因的反义NA、miNA或siNA。
37.如权利要求35所述的抗肿瘤效果的增强剂，其特征在于：
所述Nrf2的抑制剂为ML385或抗Nrf2抗体。
38.如权利要求34～37中任一项所述的抗肿瘤效果的增强剂，其特征在于：
所述抗肿瘤作用是针对过量表达Nrf2基因的肿瘤的作用。
39.如权利要求34～38中任一项所述的抗肿瘤效果的增强剂，其特征在于：
所述谷胱甘肽浓度降低剂为水杨酸偶氮磺胺吡啶。
40.如权利要求34～39中任一项所述的抗肿瘤剂，其特征在于：
所述式(II)所示的化合物为奥昔非君。
41.一种伴随诊断用药剂，其特征在于：
其是用于预测由醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的共同给药所发挥的抗肿瘤效果的伴随诊断用药剂，
所述伴随诊断用药剂包含Nrf2基因表达的检测用试剂，
Figure FDA0003470372570000101
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。
42.如权利要求41所述的伴随诊断用药剂，其特征在于：
所述检测用试剂为抗体、基因表达检测用探针或基因扩增用引物。
43.如权利要求41或42所述的抗肿瘤效果的伴随诊断用药剂，其特征在于：
所述谷胱甘肽浓度降低剂为水杨酸偶氮磺胺吡啶。
44.如权利要求41～43中任一项所述的伴随诊断用药剂，其特征在于：
所述式(II)所示的化合物为奥昔非君。
45.一种伴随诊断用药剂，其特征在于：
其是用于预测由醛脱氢酶抑制剂或下述化合物(II)或其药学上可接受的盐与谷胱甘肽浓度降低剂或谷胱甘肽S-转移酶抑制剂的共同给药所发挥的抗肿瘤效果的伴随诊断用药剂，
所述伴随诊断用药剂包含Keap1基因或Nrf2基因的突变的检测用试剂，
Figure FDA0003470372570000111
式中，R5为C1～6的直链或支链烷基，R6为氢或卤素，R7为可以具有取代基的C1～6的直链或支链烷基，所述取代基为羟基或苯基，R8为氢或卤素。
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