CZ306009B6

CZ306009B6 - Use of N-furfuryl-N´-1,2,3-thiadiazol-5-yl urea for inhibition of senescence, stress and/or oxidative damage

Info

Publication number: CZ306009B6
Application number: CZ2015-230A
Authority: CZ
Inventors: Jaroslav Nisler; Marek Zatloukal; Radoslav Koprna; Lukáš Spíchal; Miroslav Strnad; Karel Doležal
Original assignee: Ústav experimentální botaniky AV ČR, v. v. i.
Priority date: 2015-04-02
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2016-06-15
Also published as: CZ2015230A3

Abstract

The present invention provides the use of N-furfuryl-N´-1,2,3-thiadiazol-5-yl urea of the general formula I for inhibition of senescence, stress and/or oxidative damage of plant cells, plant organs and/or the complete plants and/or for the increase of the plant yield without the inhibition effects of the root growth. In the invention, there are also described formulations in which the substance is comprised as well as a plant protection method.

Description

Použití AHurfuryl-TV-El^-thiadiazol-S-yl močoviny pro inhibici senescence, stresu a oxidativního poškozeníUse of AHurfuryl-N-N-thiadiazol-5-yl urea to inhibit senescence, stress and oxidative damage

Oblast technikyField of technology

Vynález se týká použití A-furfuryl-A^r-l,2,3-thiadiazol-5-yl močoviny pro inhibici senescence, stresu a oxidativního poškození rostlinných orgánů, buněk a celých rostlin, a přípravků tento derivát obsahujících.The invention relates to the use of ^A-furfuryl-N -l, 2,3-thiadiazol-5-yl ureas for the inhibition of senescence, stress and oxidative damage plant organs, cells and whole plants, and compositions containing this derivative.

Dosavadní stav technikyPrior art

Stresem indukovaná senescence je dnes hlavním problémem z agro-ekonomického úhlu pohledu a ohrožuje dostupnost potravin na celém světě. Je známo pouze několik látek, které na hormonální úrovni mají anti-senescenční a/nebo antioxidační vlastnosti, ale řada z nich zároveň vykazuje nežádoucí vedlejší účinky, jako je inhibice růstu kořene. Z tohoto důvodu je potřeba poskytnout nové látky se silnými antistresovými vlastnostmi, které nevykazují nežádoucí vedlejší účinky.Stress-induced senescence is today a major problem from an agro-economic point of view and threatens the availability of food worldwide. Only a few substances are known to have anti-senescence and / or antioxidant properties at the hormonal level, but many of them also show undesirable side effects, such as inhibition of root growth. For this reason, it is necessary to provide new substances with strong anti-stress properties which do not have undesirable side effects.

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Předmětem předloženého vynálezu je použiti A-furfuryl-jV-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny vzorce IThe present invention relates to the use of N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea of the formula I

pro inhibici senescence, stresu a/nebo oxidativního poškození rostlinných buněk, rostlinných orgánů a/nebo celých rostlin, a/nebo pro zvýšení výnosu rostlin bez vedlejších účinků inhibice růstu kořene.to inhibit senescence, stress and / or oxidative damage to plant cells, plant organs and / or whole plants, and / or to increase plant yield without the side effects of inhibiting root growth.

Sloučenina vzorce 1 podle předkládaného vynálezu nevykazuje nežádoucí inhibiční aktivitu na růst kořenů, která je typická pro jiné anti-senescenční sloučeniny podle dosavadního stavu techniky. I při vysokých koncentracích negativní vliv na růst kořenů není přítomen.The compound of formula 1 of the present invention does not exhibit the undesirable root growth inhibitory activity that is typical of other anti-senescence compounds of the prior art. Even at high concentrations, a negative effect on root growth is not present.

Sloučenina vzorce 1 se podle předkládaného vynálezu může aplikovat na celé rostliny, rostlinné orgány, nebo na rostlinné buňky, např. v tkáňových kulturách. Je vhodná zejména pro použití v tkáňových kulturách, protože nevykazuje inhibiční efekt na růst a dělení rostlinných buněk při vysokých koncentracích a vykazuje minimální toxicitu pro tyto buňky ve srovnání s jinými antisenescenčními sloučeninami známými z dosavadního stavu techniky. To umožňuje jejich použití v širokém koncentračním rozmezí bez negativních účinků.The compound of formula 1 according to the present invention can be applied to whole plants, plant organs, or to plant cells, e.g. in tissue cultures. It is particularly suitable for use in tissue cultures because it does not have an inhibitory effect on the growth and division of plant cells at high concentrations and has minimal toxicity to these cells compared to other antisenescent compounds known in the art. This allows their use in a wide concentration range without negative effects.

Jedním provedením tohoto vynálezu je použití sloučeniny vzorce I pro oddálení degradace chlorofylu a senescence rostlinných tkání. Tento pozitivní účinek souvisí s jedinečným efektem této látky na peroxidaci membránových lipidů. Sloučenina vzorce I podle předkládaného vynálezu brání peroxidaci membránových lipidů, což dále zvyšuje její anti-senescenční a anti-stresovou aktivitu.One embodiment of the present invention is the use of a compound of formula I for delaying chlorophyll degradation and plant tissue senescence. This positive effect is related to the unique effect of this substance on the peroxidation of membrane lipids. The compound of formula I according to the present invention prevents the peroxidation of membrane lipids, which further increases its anti-senescence and anti-stress activity.

- 1 CZ 306009 B6- 1 CZ 306009 B6

Dalším provedením tohoto vynálezu je použití sloučeniny vzorce I jako inhibitoru stresu a stresem indukované senescence v produkci rostlin.Another embodiment of the present invention is the use of a compound of formula I as an inhibitor of stress and stress-induced senescence in plant production.

S výhodou jsou rostliny vybrány ze skupiny zahrnující zejména obiloviny (pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, žito, oves, čirok a příbuzné druhy), řepu (cukrová řepa a krmná řepa); malvice, peckovice a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody a ostružiny); luštěniny (fazole, čočka, hrách, sójové boby); olejniny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, ricinus, kakaové boby, podzemnice olejna); okurky (dýně, okurky, melouny); vláknité rostliny (bavlna, len, konopí, juta); citrusové plody (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky); zeleninu (špenát, skořicovník, kafr) nebo rostliny, jako je tabák, ořechy, lilek, cukrová třtina, čaj, vinná réva, chmel, banány a přírodní kaučuk a léčivé rostliny, stejně jako okrasné rostliny.Preferably, the plants are selected from the group comprising in particular cereals (wheat, barley, rice, maize, rye, oats, sorghum and related species), beets (sugar beet and fodder beet); malvaceae, stone fruit and soft fruits (apples, pears, plums, peaches, almonds, cherries, strawberries and blackberries); legumes (beans, lentils, peas, soybeans); oilseeds (rape, mustard, poppy, olives, sunflower, coconut, ricinus, cocoa beans, groundnuts); cucumbers (pumpkins, cucumbers, melons); fibrous plants (cotton, flax, hemp, jute); citrus fruits (oranges, lemons, grapefruits, tangerines); vegetables (spinach, cinnamon, camphor) or plants such as tobacco, nuts, eggplant, sugar cane, tea, vines, hops, bananas and natural rubber and medicinal plants, as well as ornamental plants.

Stresem může být zejména stres způsobený suchem, chladem a salinitou (salinní stres).Stress can be mainly stress caused by drought, cold and salinity (saline stress).

Vynález se dále týká způsobu inhibice stresu, nežádoucích oxidativních procesů a/nebo senescence v rostlinách, rostlinných orgánech a/nebo v rostlinných buňkách, kdy se na rostlinu, rostlinný orgán a/nebo rostlinnou buňku aplikuje V-furfuryl-N-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina.The invention further relates to a method for inhibiting stress, undesired oxidative processes and / or senescence in plants, plant organs and / or plant cells, which comprises applying V-furfuryl-N1,2,3-α to the plant, plant organ and / or plant cell. thiadiazol-5-yl-urea.

V-furfuryNV-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina může být připravena známými chemickými způsoby. S výhodou může být připravena způsobem, ve kterém je l,2,3-thiadiazol-5-yl-isokyanát připraven konvenční metodou (Kurita K. a Iwakura Y., J. Org. Chem. 41, 2070-71 (1976 )) z l,2,3-thiadiazol-5-laminu a difosgenu. l,2,3-Thiadiazol-5-yl-isokyanát se pak nechá reagovat s furfurylaminem, čímž se získá požadovaný produkt.N-FurfuryN-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea can be prepared by known chemical methods. Advantageously, it can be prepared in a manner in which 1,2,3-thiadiazol-5-yl isocyanate is prepared by a conventional method (Kurita K. and Iwakura Y., J. Org. Chem. 41, 2070-71 (1976)). zl, 2,3-thiadiazole-5-lamin and diphosgene. The 1,2,3-thiadiazol-5-yl isocyanate is then reacted with furfurylamine to give the desired product.

Vynález dále zahrnuje anti-senescenční, antioxidační a/nebo anti-stresové přípravky pro rostliny, rostlinné orgány a rostlinné buňky, obsahující sloučeninu vzorce I a alespoň jednu pomocnou látku.The invention further comprises anti-senescence, antioxidant and / or anti-stress preparations for plants, plant organs and plant cells, comprising a compound of formula I and at least one excipient.

V furfuryl-V⁷ 1,2,3-thiadiazol 5-yl-močovina se používá v nemodifikované formě nebo výhodně společně s pomocnými látkami běžně používanými pro formulaci přípravků. Za tímto účelem jsou přípravky výhodně formulovány jako koncentráty účinné látky, jakož i suspenze a disperze, s výhodou izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, zředěné emulze, rozpustné prášky, poprašky, granuláty, krémy, gely, olejové suspenze a také obalované formulace, např. polymemími látkami. Stejně jako u typu přípravku, způsoby aplikace, jako je postřik, rozprašování, práškování, rozptyl, natírání nebo zalévání, se volí v souladu se zamýšlenými cíli a převažujícími okolnostmi. Přípravky mohou být sterilizovány a/nebo mohou obsahovat další pomocné látky neutrální povahy, jako jsou konzervační činidla, stabilizátory, smáčedla nebo emulgátory, solubilizační činidla, stejně jako hnojivá, donory stopových prvků nebo jiných prostředků k dosažení speciálních efektů.In furfuryl-V ⁷ 1,2,3-thiadiazol 5-yl-urea is used in unmodified form or preferably together with excipients commonly used for the formulation of preparations. For this purpose, the preparations are preferably formulated as active compound concentrates as well as suspensions and dispersions, preferably isotonic aqueous solutions, suspensions and dispersions, dilute emulsions, soluble powders, dusts, granules, creams, gels, oil suspensions and also coated formulations, e.g. polymeric substances. As with the type of preparation, the methods of application, such as spraying, atomizing, dusting, dispersing, painting or pouring, are chosen in accordance with the intended purposes and the prevailing circumstances. The preparations may be sterilized and / or may contain other excipients of a neutral nature, such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solubilizing agents, as well as fertilizers, trace element donors or other means to achieve special effects.

PřípravkyPreparations

Přípravky obsahující sloučeninu vzorce I (aktivní složka) a pokud je třeba, jednu nebo více pevných nebo kapalných pomocných látek, jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty) a smáčedla.Formulations containing a compound of formula I (active ingredient) and, if necessary, one or more solid or liquid excipients are prepared by known methods, for example by mixing or grinding the active ingredient with excipients such as solvents or solid carriers. Surfactants and wetting agents may be added to the formulations.

Příklady vhodných aniontových, neiontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve WO 97/34485.Examples of suitable anionic, nonionic and cationic wetting agents are summarized, for example, in WO 97/34485.

Také vhodné pro přípravu kompozic, které obsahují sloučeninu vzorce I jsou povrchově aktivní látky běžně používané při formulaci prostředků, které jsou popsány např. v „McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual“ MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, Stache, H., „Tensid- Taschenbuch“, Carl Hanser Verlag, MunichNienna, 1981 and M. and J. Ash, „Encyclopedia of Surfactants“, Vol—111, Chemical Publishing Co., New York, 1980—81.Also suitable for the preparation of compositions containing a compound of formula I are the surfactants commonly used in the formulation of compositions which are described, for example, in McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, Stache, H., Tensid-Taschenbuch, Carl Hanser Verlag, MunichNienna, 1981 and M. and J. Ash, Encyclopedia of Surfactants, Vol-111, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81.

-2CZ 306009 B6-2GB 306009 B6

Formulace přípravku obsahuje váhově od 0,1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w) aktivní složky AMurfuryNV-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny, přičemž obsahuje i od 5 do 99,9 % směsi přísad či farmaceutických nosičů, a to v závislosti na způsobech aplikace, a popřípadě obsahuje i váhově od 0,1 do 25 % smáčedla.The formulation contains by weight from 0.1 to 99% (w / w), in particular from 0.1 to 95% (w / w) of the active ingredient AMurfuryNV-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea, wherein it also contains from 5 to 99.9% of a mixture of excipients or pharmaceutical carriers, depending on the methods of application, and optionally also contains from 0.1 to 25% by weight of a wetting agent.

Ačkoliv jsou komerční produkty obvykle připravovány ve formě koncentrátů, konečný uživatel upotřebí naředěný přípravek. Kompozice může proto obsahovat i další přísady, jakými jsou stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný palmový olej 0;l, řepkový nebo olivový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, viskozitní činidla, pojivá, lepidla, a také hnojivá a další aktivní přísady. S výhodou jsou používány přípravky následujícího složení: (% = hmotnostní procento).Although commercial products are usually prepared in the form of concentrates, the end user will use a diluted preparation. The composition may therefore also contain other additives, such as stabilizers, for example vegetable oils or epoxidized vegetable oils (epoxidized palm oil 0.1, rapeseed or olive oil), defoamers, for example silicone oil, preservatives, stabilizers, humectants or emulsifiers. viscosity agents, binders, adhesives, as well as fertilizers and other active ingredients. Preferably, preparations of the following composition are used: (% = weight percentage).

Emulgované koncentráty:Emulsified concentrates:

aktivní složka: active ingredient: 1 až 90 %, s výhodou 5 až 20 % 1 to 90%, preferably 5 to 20% smáčedlo: wetting agent: 1 až 30 %, s výhodou 10 až 20 % 1 to 30%, preferably 10 to 20% kapalný nosič: liquid carrier: 5 až 94 %, s výhodou 60 až 85 % 5 to 94%, preferably 60 to 85%

Prášky:Pills:

aktivní složka: active ingredient: 0,1 až 10 %, s výhodou 0,1 až 5 % 0.1 to 10%, preferably 0.1 to 5% pevný nosič: solid support: 99,9 až 90 %, s výhodou 99,9 až 95 % 99.9 to 90%, preferably 99.9 to 95%

Suspenzní koncentráty:Suspension concentrates:

aktivní složka: active ingredient: 5 až 75 %, s výhodou 10 až 50 % 5 to 75%, preferably 10 to 50% voda: water: 94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 % 94 to 24%, preferably 88 to 30% smáčedlo: wetting agent: 1 až 40 %, s výhodou 2 až 30 % 1 to 40%, preferably 2 to 30%

Smáčivé prášky:Wettable powders:

aktivní složka: active ingredient: 0,5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 % 0.5 to 90%, preferably 1 to 80% smáčedlo: wetting agent: 0,5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 % 0.5 to 20%, preferably 1 to 15% pevný nosič: solid support: 5 až 95 %, s výhodou 15 až 90 % 5 to 95%, preferably 15 to 90%

Granule:Granule:

aktivní složka: active ingredient: 0,1 až 30 %, s výhodou 0,1 až 15 % 0.1 to 30%, preferably 0.1 to 15% pevný nosič: solid support: 99,9 až 70 %, s výhodou 99,9 až 85 % 99.9 to 70%, preferably 99.9 to 85%

Kompozice mohou rovněž obsahovat další příměsi, jakými jsou stabilizátory, například rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný kokosový olej, řepkový olej nebo sójový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, pojivá, zahušťovadla, a také hnojivá a další aktivní látky. Pro použití sloučeniny vzorce I nebo kompozic je obsahujících, se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující:The compositions may also contain other additives, such as stabilizers, for example vegetable oils or epoxidized vegetable oils (epoxidized coconut oil, rapeseed oil or soybean oil), defoamers, e.g. silicone oil, preservatives, viscosity regulators, binders, thickeners, and also fertilizers. and other active substances. To use a compound of formula I or compositions containing them, various methods and technologies are used, such as the following:

i) Obalování osivai) Seed coating

a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulací sloučeninu vzorce I nebo její soli, a to mícháním v nádobě až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování).a) Coating the seeds with a wettable powder formulation of a compound of formula I or a salt thereof, by stirring in a container until uniform distribution on the surface of the seeds (dry coating).

b) Obalování osiva emulzifíkovaným koncentrátem sloučeninu vzorce I nebo její soli, v souladu s metodou a) (mokré obalování).b) Coating the seeds with an emulsified concentrate of a compound of formula I or a salt thereof, in accordance with method a) (wet coating).

c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 100 do 1000 ppm sloučeninu vzorce I nebo její soli, a s výhodou následného usušení semen (imerzní obalování).c) Coating the seeds by soaking the seeds for 1 to 72 hours in a liquid containing from 100 to 1000 ppm of a compound of formula I or a salt thereof, and preferably subsequently drying the seeds (immersion coating).

Obecně je sloučenina vzorce I nebo její soli používány v množství od 1 do 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g, na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin; určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování).In general, the compound of the formula I or its salts is used in an amount of from 1 to 1000 g, preferably from 5 to 250 g, per 100 kg of seeds, but depending on the methodology which also allows the addition of further active substances or micronutrients; the specified concentration limits can move up or down (repeated coating).

ii) Aplikace cisternové směsiii) Application of the tank mixture

Kapalná formulace je aplikována v množství od 0,005 do 5,0 kg na hektar. Taková cisternová aplikace se provádí před anebo po setí.The liquid formulation is applied in an amount of from 0.005 to 5.0 kg per hectare. Such tank application is carried out before or after sowing.

iii) Aplikace do semenné brázdyiii) Application to the seminal furrow

Sloučenina vzorce I nebo její sůl, je zavedena do otevřené brázdy oseté semenem ve formě emulzifikovaného koncentrátu, smáčivého prášku nebo granulí. Jakmile je semenná brázda zaklopena, je růstový regulátor aplikován cestou obvykle používanou při pre-emergentním procesu.The compound of formula I, or a salt thereof, is introduced into an open furrow sown with seeds in the form of an emulsified concentrate, wettable powder or granules. Once the seed furrow is closed, the growth regulator is applied by the route commonly used in the pre-emergence process.

i v) Kontrolované uvolňování aktivních láteki v) Controlled release of active substances

Sloučenina vzorce I nebo její soli, jsou aplikovány v roztoku k minerálním granulovaným nosičům nebo polymerizovaným granulím (močovina, formaldehyd) a jsou vysušeny.The compound of formula I, or a salt thereof, is applied in solution to mineral granular carriers or polymerized granules (urea, formaldehyde) and dried.

V případě, že je to žádoucí, tak se provádí obalování, které umožňuje postupné uvolňování látky v měřitelných množstvích po určitou specifickou periodu (obalované granule).If desired, coating is performed which allows a gradual release of the substance in measurable amounts over a specific period of time (coated granules).

Objasnění výkresuExplanation of the drawing

Obrázek 1 ukazuje účinek thiadiazuronu (TDZ) a A-furfuryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny (ASES) na průměrnou délku kořene Arabidopsis (A) a pšenice seté Triticum aestivum (B) v kořenovém testu. V experimentu bylo použito 0,01% DMSO jako kontrola a sloučeniny v koncentraci 100 nM. Chybové úsečky představují Sd (n=50). Hvězdičky označují statisticky významné rozdíly oproti kontrolnímu ošetření (studentův t-test, dvěma hvězdičkami: P = 0,001; jedna hvězdička P = 0,05).Figure 1 shows the effect of thiadiazuron (TDZ) and N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea (ASES) on the average length of Arabidopsis root (A) and Triticum aestivum (B) wheat in a root test . In the experiment, 0.01% DMSO was used as a control and compounds at a concentration of 100 nM. Error bars represent Sd (n = 50). Asterisks indicate statistically significant differences from control treatment (student's t-test, two asterisks: P = 0.001; one asterisk P = 0.05).

Příklady uskutečnění vynálezuExamples of embodiments of the invention

Výchozím materiálem pro 7V-furfuryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovinu je 1,2,3-thiadiazol5-yl-amin, který byl získán z TCI Europe. l,2,3-Thiadiazol-5-ylamin se převede na 5-isokyanáto-l,2,3-thiadiazol mícháním l,2,3-thiadiazol-5-yl-aminu s nadbytečným množstvím difosgenu v tetrahydrofuranu (THF). 7V-furfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-mo0ovina může být potom připravena mírným zahříváním 5-isokyanato-l,2,3-thiadiazolu a ftirfurylaminu (komerčně dostupné od Sigma Aldrich) v přítomnosti katalytického množství triethylaminu v THF.The starting material for N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea is 1,2,3-thiadiazol-5-yl-amine, which was obtained from TCI Europe. 1,2,3-Thiadiazol-5-ylamine is converted to 5-isocyanato-1,2,3-thiadiazole by stirring 1,2,3-thiadiazol-5-ylamine with an excess of diphosgene in tetrahydrofuran (THF). N-furfuryl-N, 1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea can then be prepared by gentle heating of 5-isocyanato-1,2,3-thiadiazole and phthirfurylamine (commercially available from Sigma Aldrich) in the presence of a catalytic amount of triethylamine in THF.

Elementární analýzy (C, H a N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Fissons Instruments). Analytická tenkovrstvá chromatografíe (TLC) byla prováděna na destičkách silikagelu 60 WF254 (Merck), v mobilní fázi CHCfí.MeOH.konc. NH4OH (8:2:0,2, v/v/v). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometElemental analyzes (C, H and N) were measured on an EA1108 CHN analyzer (Fissons Instruments). Analytical thin layer chromatography (TLC) was performed on silica gel 60 WF254 plates (Merck), in the mobile phase CHCl 3 / MeOH.conc. NH 4 OH (8: 2: 0.2, v / v / v). ES + mass spectra were measured using direct injection on a Waters ZMD 2000 mass spectrometer

-4CZ 306009 B6 ru. Hmotnostní interval při měření byl 10 až 1500 u. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150 °C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvatačního plynu 200 1/hodinu. Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data systém. NMR spektra byla měřena na přístroji Jeol 500 SS při teplotě 300 K a frekvenci 500,13 MHz ('H). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-7₆. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard.-4CZ 306009 B6 ru. The mass interval during the measurement was 10 to 1500 u. The spectra were measured using cyclic scans with a length of 3.0 seconds, at an inlet slit voltage of 25 V and an evaporator block temperature of 150 ° C, a desolvation temperature of 80 ° C and a desolvation gas flow of 200 l. / hour. The obtained data were processed using the program MassLynx data system. NMR spectra were measured on a Jeol 500 SS instrument at a temperature of 300 K and a frequency of 500.13 MHz (1 H). Samples were prepared by dissolving the compounds in DMSO-7 _6th Tetramethylsilane (TMS) was used as an internal standard.

Příklad 1Example 1

Příprava 5-isokyanáto-l ,2,3-thiadiazoluPreparation of 5-isocyanato-1,2,3-thiadiazole

Syntéza izokyanátů z aminů byla popsána již dříve (Kurita K. a Iwakura Y., J. Org. Chem. 41, 2070-71 (1976)). Detailně, 1,2,3-thiadiazol-5-yl amin (1,01 g, 10 mmol) byl rozpuštěn v THF (40 mL) a přidáván po kapkách do roztoku difosgenu (2,6 g, 13 mmol) v THF (100 mL). Reakční směs byla míchána po dobu 40 minut při teplotě 0° C; pak se reakční směs krátce zahřeje na teplotu 30 °C. Po zahřátí, se rozpouštědlo a přebytek difosgenu odpaří. Žlutý pevný zbytek byl 5isokyanáto-l,2,3-thiadiazol, který se znovu resuspenduje v diethyletheru a odfiltruje se. Výtěžek: 95%, 'H NMR (δ, ppm, DMSO-^6): 7,75 (1H, s, CH).The synthesis of isocyanates from amines has been described previously (Kurita K. and Iwakura Y., J. Org. Chem. 41, 2070-71 (1976)). In detail, 1,2,3-thiadiazol-5-yl amine (1.01 g, 10 mmol) was dissolved in THF (40 mL) and added dropwise to a solution of diphosgene (2.6 g, 13 mmol) in THF ( 100 mL). The reaction mixture was stirred for 40 minutes at 0 ° C; then the reaction mixture is briefly warmed to 30 ° C. After heating, the solvent and excess diphosgene are evaporated. The yellow solid residue was 5-isocyanato-1,2,3-thiadiazole, which was resuspended in diethyl ether and filtered off. Yield: 95%, 1 H NMR (δ, ppm, DMSO-d 6): 7.75 (1H, s, CH).

Příklad 2Example 2

Příprava A-furfuryl-jV-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močovinyPreparation of N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea

5-Isokyanato-l,2,3-thiadiazol (1,27 g, 10 mmol) byl rozpuštěn ve 100 mL tetrahydrofuranu (THF). K tomuto roztoku bylo přidáno 100 μί triethylaminu a přikapán furfurylamin (0,97 g, 10 mmol) ve 20 mL THF při teplotě 30 °C. Směs se nechá reagovat 5 hodin, potom byl THF odpařen na vakuové odparce a k surovému produktu bylo přidáno 50 mL dichlormethanu. Sraženina byla re-suspendována a odfiltrována. Výtěžek: l,2g; 53%, 'H NMR (δ, ppm, DMSO-J6): 4,32(2H, d, J=5,5 Hz, CH2), 6,24(IH, d, 7=4,0 Hz, ArH-furfuryl), 6,36(IH, t, 7=2,0 Hz, ArHfurfuryl), 7,52(1 H, t, 7=5,5, NH), 7,56(1 H, d, 7=4,0 Hz, ArH-furfuryl), 8,47(IH, s, CH), 10,76(IH, s(br), NH).5-Isocyanato-1,2,3-thiadiazole (1.27 g, 10 mmol) was dissolved in 100 mL of tetrahydrofuran (THF). To this solution was added 100 μL of triethylamine and furfurylamine (0.97 g, 10 mmol) in 20 mL of THF was added dropwise at 30 ° C. The mixture was allowed to react for 5 hours, then the THF was evaporated on a vacuum evaporator and 50 mL of dichloromethane was added to the crude product. The precipitate was resuspended and filtered. Yield: 1.2 g; 53%, 1 H NMR (δ, ppm, DMSO-J 6): 4.32 (2H, d, J = 5.5 Hz, CH 2), 6.24 (1H, d, δ = 4.0 Hz, ArH -furfuryl), 6.36 (1H, t, J = 2.0 Hz, ArHfurfuryl), 7.52 (1H, t, 7 = 5.5, NH), 7.56 (1H, d, 7 = 4.0 Hz, ArH-furfuryl), 8.47 (1H, s, CH), 10.76 (1H, s (br), NH).

Tabulka 1Table 1

Elementární analýza Λ-furfuryl-V-l ,2,3-thiadiazol-5-yl-močovinyElemental analysis of N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea

Elementární analýza vypočteno/nalezeno Elemental analysis calculated / found V-furfuryl-M-1,2,3- thiadiazol-5-yl-močovina N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea %C %C %H % H %N % N ES MS [M+H]⁺ ES MS [M + H] ^{< + >.} 42,9/43,2 42.9 / 43.2 3,6/3,7 3.6 / 3.7 25,0/24,8 25.0 / 24.8 225,3 225.3

Příklad 3Example 3

Anti-senescenční aktivita V-furfuryl-M-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny v senescenčním testu na listových segmentech pšenice kultivovaných ve tměAnti-senescence activity of V-furfuryl-M-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea in a senescence test on leaf segments of wheat cultivated in the dark

Semena ozimé pšenice Triticum aestřvum cv. Hereward byla promyta pod tekoucí vodou po 24 hod. a poté vyseta do vermikulitu nasyceného Knopovým živným roztokem. Nádoby se semeny byly umístěny do klimatizované růstové komory s 16/8 hodinovou světelnou periodou (světelná intenzita 50 mmol.m ².s *) a teplotou 15 °C. Po 7 dnech měly semenáčky vyvinutý první praporcový list a druhý list začínal prorůstat. Z prvních listů vždy od 5 rostlin byly odebrány vrchoSeeds of winter wheat Triticum aestřvum cv. Hereward was washed under running water for 24 hours and then seeded in vermiculite saturated with Knop's nutrient solution. The seed pots were placed in an air-conditioned growth chamber with a 16/8 hour light period (light intensity 50 mmol.m ² .s *) and a temperature of 15 ° C. After 7 days, the seedlings had developed the first flag leaf and the second leaf began to grow. The tops were taken from the first leaves of 5 plants each

-5CZ 306009 B6 lové sekce dlouhé přibližně 35 mm, které byly zkráceny tak, aby jejich váha byla přesně 100 mg. Bazální konce těchto 5 listových segmentů byly umístěny do jamek mikrotitračních polystyrénových destiček obsahujících 150 mL roztoku testované látky. Destičky byly umístěny do plastového boxu vystlaného filtračním papírem, který byl nasycen vodou za účelem maximální vzdušné vlhkosti. Po 96 hodinách inkubace ve tmě při 25 °C byly listové sekce vyjmuty a chlorofyl extrahován v 5 mL 80% ethanolu zahřátím při 80 °C po dobu 10 min. Objem vzorku byl poté doplněn na 5 mL přidáním 80% ethanolu. Absorbance extraktů byla měřena při 665 nm. Jako kontroly byly měřeny rovněž chlorofylové extrakty z listů a listových vrcholů inkubované v deionizované vodě. Vypočtené hodnoty jsou průměrem z 5 opakování a celý experiment byl zopakován minimálně 2-krát. Testované látky (6-benzylaminopurin, trans-zeatin, thidiazuron a N-furfuryl-TVl,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina) byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10”³ M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10 ⁸ až 10 ⁴ M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Hodnoty IC₅₀ byly stanoveny pro všechny testované sloučeniny. 7V-furfuryl-.V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina vykazuje pozitivní vliv na oddálení senescence v segmentech listů pšenice ve tmě. V-furfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-ylmočovina překročila anti-senescenční aktivitu 6-benzylaminopurinu minimálně lOOx, transzeatinu a thidiazuronu minimálně lOx. To znamená, že k dosažení stejného antisenescenčního účinkuje třeba lOx menší množství V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny než např. trans-zeatinu nebo thidiazuronu.-5GB 306009 B6 sections approximately 35 mm long that have been shortened to exactly 100 mg. The basal ends of these 5 leaf segments were placed in the wells of microtiter polystyrene plates containing 150 mL of test substance solution. The plates were placed in a plastic box lined with filter paper, which was saturated with water for maximum humidity. After 96 hours of incubation in the dark at 25 ° C, the leaf sections were removed and the chlorophyll was extracted in 5 mL of 80% ethanol by heating at 80 ° C for 10 min. The sample volume was then made up to 5 mL by adding 80% ethanol. The absorbance of the extracts was measured at 665 nm. Chlorophyll extracts from leaves and leaf tips incubated in deionized water were also measured as controls. The calculated values are the average of 5 replicates and the whole experiment was repeated at least 2 times. Test substances (6-benzylaminopurine, trans-zeatin, thidiazuron and N-furfuryl-TV1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea) were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and the stock solution was made up to 10 ” ³ M with water. the stock solution was further diluted with assay medium in the concentration range 10 ⁸ to 10 ⁴ M. The final concentration of DMSO in the medium did not exceed 0.2% and at this concentration did not affect the biological activity of the assay. IC ₅₀ values were determined for all test compounds. N-furfuryl-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea has a positive effect on delaying senescence in segments of wheat leaves in the dark. N-furfuryl-N, 1,2,3-thiadiazol-5-yl urea exceeded the antisense activity of 6-benzylaminopurine by at least 100x, transzeatin and thidiazuron by at least 10x. This means that, for example, 10 times less N-furfuryl-1H, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea than, for example, trans-zeatin or thidiazuron acts to achieve the same antisenescent effect.

Tabulka 2Table 2

Vliv V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivum cv. Hereward ve tmě.The effect of V-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea on the delay of senescence in decapitated leaf segments of Triticum aestivum cv. Hereward in the dark.

Látka Substance Senescenční biotest (IC₅₀, pM)/s.d.Senescence bioassay (IC ₅₀ , pM) / sd 6-benzylaminopurin (BAP) 6-benzylaminopurine (BAP) 155 155 (±22) (± 22) trans-zeatin trans-zeatin 30 30 (±4,5) (± 4.5) thidiazuron thidiazuron 13 13 (±3,0) (± 3.0) /V-furfuryL/VM^S-thiadiazoi-S-yl-močovina N-furfuryl / VM-S-thiadiazol-5-yl-urea 1,2 1.2 (±03) (± 03)

Příklad 4Example 4

Anti-senescenční aktivita V-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny v senescenčním testu na listových segmentech pšenice při působení světlaAnti-senescence activity of V-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea in a senescence test on wheat leaf segments under light

Schopnost V-furfuryl-N-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny zpomalit degradaci chlorofylu v listech pšenice byla testována také ve světelných podmínkách. Experiment byl proveden, jak je popsáno v příkladu 7 s modifikacemi takto - inkubace listů se sloučeninami byla provedena při periodě osvětlení 8/16 (tma/světlo - mol.m ².s^-1) při 22 °C po dobu 7 dnů. Jak je ukázáno v tabulce 3, /V-furfúryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny má mnohem silnější pozitivní účinky na oddálení senescence v segmentech listů pšenice ve světelných podmínkách ve srovnání s 6benzylaminopurinem, trans-zeatinem i thidiazuronem. IC₅o jV-furfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5yl-močoviny je 40 nmol.The ability of V-furfuryl-N1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea to retard chlorophyll degradation in wheat leaves was also tested under light conditions. The experiment was performed as described in Example 7 with modifications as follows - incubation of the leaves with the compounds was performed under an illumination period of 8/16 (dark / light - mol.m ² .s ^-1 ) at 22 ° C for 7 days. As shown in Table 3, N-furfuryl-1 H, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea has much stronger positive effects on delaying senescence in wheat leaf segments under light conditions compared to 6-benzylaminopurine, trans-zeatin and thidiazuron. . The IC ₅₀ of N-furfuryl- N, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea is 40 nmol.

-6CZ 306009 B6-6GB 306009 B6

Tabulka 3Table 3

Vliv V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivum cv. Hereward na světle.The effect of V-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea on the delay of senescence in decapitated leaf segments of Triticum aestivum cv. Hereward in the light.

Látka Substance Senescenční biotest (IC₅₀, pM)/s.d.Senescence bioassay (IC ₅₀ , pM) / sd 6-benzylaminopurin (BAP) 6-benzylaminopurine (BAP) 12,5 12.5 (±22) (± 22) trans-zeaún trans-zeaún 2,2 2.2 (±4,5) (± 4.5) thidiazuron thidiazuron 0,5 0.5 (±3,0) (± 3.0) jV-furfuryI-jV-l,23-thiadiazol-5-yl-močovina N-furfuryl-N-1,23-thiadiazol-5-yl-urea 0,03 ^d 0.03 ^d (±0,3) (± 0.3)

Příklad 5Example 5

Ochrana před peroxidací membránových lipidů v pšeniciProtection against peroxidation of membrane lipids in wheat

Typickým projevem provázejícím senescenci je zvýšení hladiny reaktivních kyslíkových derivátů a následná peroxidace membránových lipidů. Proto byly stanoveny hladiny malonyldialdehydu (MDA), oxidativního markéru poškození membránových lipidů, v oddělených listech pšenice vystavených působení 7V-furfiiryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny a thidiazuronu po dobu čtyř dnů v temnu, jak bylo popsáno v příkladu 7. Hladiny MDA byly stanoveny pomocí kyseliny thiobarbiturové (TBA). 100 mg čerstvého rostlinného materiálu bylo homogenizováno pomocí oscilačního mlýna (MM301, Retsch, Germany), s 1 mL 80% metanolu. Surový extrakt byl centrifugován při 10,000xg po dobu 5 minut, 100 pL alikvot supematantu byl protřepán se 100 pL 0.5% (w/v) TBA obsahujícími 0.1% (w/v) trichloroctovou kyselinu, a výsledný roztok byl inkubován 30 minut při 95 °C. Vzorky byly rychle ochlazeny na ledu a centrifugovány 5 minut při 1000xg. Absorbance supematantu byla změřena při 532 nm s korekcí při 600 nm a množství vzniklého komplexu MDA-TBA bylo vypočítáno z extinkčního koeficientu 155 mM’¹ cm’¹.A typical manifestation accompanying senescence is an increase in the level of reactive oxygen derivatives and subsequent peroxidation of membrane lipids. Therefore, levels of malonyldialdehyde (MDA), an oxidative marker of membrane lipid damage, in separate wheat leaves exposed to N-furfiryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea and thidiazuron for four days in the dark were determined as was described in Example 7. MDA levels were determined using thiobarbituric acid (TBA). 100 mg of fresh plant material was homogenized using an oscillating mill (MM301, Retsch, Germany), with 1 mL of 80% methanol. The crude extract was centrifuged at 10,000xg for 5 minutes, a 100 μL aliquot of the supernatant was shaken with 100 μL of 0.5% (w / v) TBA containing 0.1% (w / v) trichloroacetic acid, and the resulting solution was incubated at 95 ° for 30 minutes. C. The samples were rapidly cooled on ice and centrifuged at 1000xg for 5 minutes. The absorbance of the supernatant was measured at 532 nm with correction at 600 nm, and the amount of MDA-TBA complex formed was calculated from an extinction coefficient of 155 mM ^-1 cm ^-1 .

7V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny výrazně snižuje peroxidaci membránových lipidů ve srovnání s neošetřenou kontrolou a vzorky ošetřené thidiazuronem (Tabulka 5 - hodnoty vyjadřují obsah MDA, což je produkt rozkladu membránových lipidů). JV-furfuryl-V -1,2,3thiadiazol-5-yl-močoviny snižuje úroveň membránové lipidové peroxidace ve stárnoucích oddělených listech pšenice o 41 %, zatímco thidiazuron pouze o 27 %.N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea significantly reduces membrane lipid peroxidation compared to untreated controls and samples treated with thidiazuron (Table 5 - values represent MDA content, which is the product of membrane lipid degradation). N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea reduces the level of membrane lipid peroxidation in aging detached wheat leaves by 41%, while thidiazuron only by 27%.

N— furfuryl—N—1,2,3—thiadiazol—5—yl—močoviny má ochrannou funkci před negativním působením reaktivních forem kyslíku, které se hromadí v tkáních během senescence listu.N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea has a protective function against the negative effects of reactive oxygen species that accumulate in tissues during leaf senescence.

Tabulka 4Table 4

Efekt V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny a thidiazuronu na peroxidaci membránových lipidů v průběhu senescence extirpovaných listů Triticum aestivum cv. Hereward v temnu.Effect of V-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea and thidiazuron on membrane lipid peroxidation during senescence of extorted leaves of Triticum aestivum cv. Hereward in the dark.

Testovaná látka Test substance MDA (nmol/g FW) MDA (nmol / g FW) Neošetřená kontrola Untreated control 21,5 (±2,8) 21.5 (± 2.8) thidiazuron thidiazuron 15,7 (±1,7) 15.7 (± 1.7) JV-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močovma N-furfuryl-N, 2,3-thiadiazol-5-yl-ureas 12,7 (±1,1) 12.7 (± 1.1)

Příklad 6Example 6

AMurfuryl-N-l,2,3-thiadiazol-5--yl-močovina oddaluje senescenci rostlin pšenice stresovaných suchemAMurfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea delays the senescence of drought-stressed wheat plants

Sucho je jedním z hlavních problémů, který omezuje růst a produkci rostlin. Sucho vede ke stresem-vyvolané senescenci rostlinných orgánů, a může mít za následek smrt rostlin. Oddálením suchem indukované senescence se zvyšuje délka života stresovaných rostlin i jejich produktivita.Drought is one of the main problems that limits plant growth and production. Drought leads to stress-induced senescence of plant organs, and can result in plant death. Delaying drought-induced senescence increases the lifespan of stressed plants and their productivity.

Pro zkoumání účinku AMurfuryl-V-l ,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny na suchem-vyvolanou senescenci, semena ozimé pšenice, Triticum aestivum cv. Hereward, byly promyty pod tekoucí vodou po dobu 24 hodin a pak vysety do táců (30 x 40cm) na perlit nasáklý vodou, nebo 100 nM vodným roztokem A-furfuryl~/V-l ,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny. Tácy byly umístěny v růstové komoře při 25 °C s 16/8 h světlo/tma při intenzitě 100 mol.m².s \ 30 dnů po výsadbě bylo spočítáno kolik % rostlin přežilo na jednotlivých tácech.To investigate the effect of AMurfuryl-V1, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea on drought-induced senescence, winter wheat seeds, Triticum aestivum cv. Hereward, they were washed under running water for 24 hours and then seeded in trays (30 x 40 cm) on perlite soaked in water or 100 nM aqueous solution of N-furfuryl-β1,3,3-thiadiazol-5-yl-urea. The trays were placed in a growth chamber at 25 ° C with 16/8 h light / dark at an intensity of 100 mol.m ^2. 30 days after planting, the number of% of plants surviving on the individual trays was counted.

Výsledkem bylo, že použití AMůrfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny zpomaluje senescenci pšeničných rostlin, které jsou pěstovány ve stresových podmínkách. Rostliny ošetřené Nfurfúryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovinou jsou zelenější (obsahují více chlorofylu), a také jich přežívá více (71 % rostlin) proti neošetřeným rostlinám (přežívá jen 37 % rostlin).As a result, the use of N-fururyl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea slows down the senescence of wheat plants that are grown under stress conditions. Plants treated with N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea are greener (contain more chlorophyll) and also survive more (71% of plants) compared to untreated plants (only 37% survive).

Tento in vivo experiment je důkazem toho, že AMurfuryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina prodlužuje fotosyntetickou životnost rostlin pšenice, které byly vystaveny stresu životního prostředí.This in vivo experiment is evidence that AMurfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea prolongs the photosynthetic life of wheat plants that have been exposed to environmental stress.

Příklad 7Example 7

A-furfuryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina neinhibuje růst primárních kořenů Arabidopsis thaliana ani pšenice seté Triticum aestivumA-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea does not inhibit the growth of primary roots of Arabidopsis thaliana or common wheat Triticum aestivum

Anti-senescenční látky jsou známy jako negativní regulátory prodlužování kořenů a tvorby laterálních kořenů (Werner, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 98, 10487-92, 2001) a jejich exogenní aplikace v koncentraci vyšší než 1 μΜ často způsobují úplnou inhibici růstu kořene. Abychom prozkoumali in vivo účinek AMurfuryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny na růst a vývoj kořene, semena Arabidopsis thaliana (wild-type Col-0) byla sterilizována a zaseta na vertikální desky na 1/2 Murashige-Skoog médium (obohacené o 0,1% sacharózu a 6 g/L phytagel) obsahuj íAnti-senescence agents are known to be negative regulators of root elongation and lateral root formation (Werner, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 98, 10487-92, 2001) and their exogenous applications at concentrations higher than 1 μΜ often cause complete inhibition of root growth. To investigate the in vivo effect of AMurfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea on root growth and development, Arabidopsis thaliana seeds (wild-type Col-0) were sterilized and sown on vertical plates at 1/2 Murashige-Skoog medium (enriched with 0.1% sucrose and 6 g / L phytagel) contains

-8CZ 306009 B6 dm 100 nM thidiazuron nebo 7V-furfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovinu, nebo 0,01% DMSO (kontrola rozpouštědla). Po vernal izaci (4 dny ve tmě, 4 °C), desky byly převedeny do růstové komory (22 °C, 8/16 světlo/tma). Dva týdny po přenosu, semenáčky byly vyfotografovány a prodloužení kořene a tvorba laterálních kořenů byla hodnocena pomocí Scion image software (Scion Corp., Frederick, MD, USA). Nejméně 40 rostlin bylo měřeno pro každé ošetření.-8EN 306009 B6 dm 100 nM thidiazuron or N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea, or 0.01% DMSO (solvent control). After vernalization (4 days in the dark, 4 ° C), the plates were transferred to a growth chamber (22 ° C, 8/16 light / dark). Two weeks after transfer, seedlings were photographed and root elongation and lateral root formation were assessed using Scion image software (Scion Corp., Frederick, MD, USA). At least 40 plants were measured for each treatment.

Zatímco kořeny rostlin, které rostly v přítomnosti thidiazuron u (obr. 1), byly vážně a významně retardované, kořeny rostlin, které rostly v přítomnosti 7V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny se vyvinuly normálně (obr. 1) a délka primárního kořene nebyla zkrácena. To znamená, že 7V-furfuryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina nemá negativní vliv na růst a vývoj kořene ve 100 nanomolámí koncentraci na rozdíl od vážného inhibičního účinku thidiazuronu. 7V-furfuryl/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina může být s výhodou použita na semena, sazenice a mladé rostliny v širším rozsahu koncentrací, než thidiazuron a bez nežádoucích inhibičních účinků.While plant roots that grew in the presence of thidiazuron (Fig. 1) were severely and significantly retarded, plant roots that grew in the presence of N-furfuryl-1H, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea developed normally ( Fig. 1) and the length of the primary root was not shortened. This means that N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea has no negative effect on root growth and development at 100 nanomolar concentrations in contrast to the severe inhibitory effect of thidiazuron. N-furfuryl / N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea can be advantageously applied to seeds, seedlings and young plants in a wider range of concentrations than thidiazuron and without adverse inhibitory effects.

Příklad 8Example 8

7V-furfuryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina není cytotoxická vůči lidským kožním fibroblastům (buněčná linie BJ)N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea is not cytotoxic to human skin fibroblasts (BJ cell line)

Cytotoxicita jV-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny vůči lidským kožním fibroblastům (buněčná linie BJ) byla stanovena ve standardním Calceinovém AM testu. Buňky byly udržovány v plastikových lahvích pro tkáňové kultury a pěstovány v Dulbecco modifikovaném Eagle médiu pro buněčné kultury (DMEM) při teplotě 37 °C v atmosféře 5% CO₂ a 100% vlhkosti. Buňky byly vysety do 96-jamkových mikrotitračních destiček (Nunc, Dánsko) a po 12 hodinách preinkubace, byla přidána testovaná látka, aby konečná koncentrace byla v rozmezí od 0 do 100 mM. Buňky byly inkubovány po dobu 72 hodin. Na konci inkubační doby byl přidán Calcein AM v PBS v konečné koncentraci 1 pg / ml. Po další 1 hodině inkubace byla měřena fluorescence pi 485/538 nm (ex/em) pomocí Fluoroskan Ascent (Labsystems, Finsko). Hodnoty IC50, (tj. koncentrace způsobující snížení konverze kalceinu AM na 50%) byly spočítány ze získaných křivek. Všechny experimenty byly opakovány čtyřikrát s maximální odchylkou 15%. Vzhledem k omezené rozpustnosti látek ve vodě, všechny testované sloučeniny byly rozpuštěny v DMSO a zředěny vodou na konečnou koncentraci DMSO 0,6%.The cytotoxicity of N-furfuryl-N1,3,3-thiadiazol-5-yl-urea against human skin fibroblasts (BJ cell line) was determined in a standard Calcein AM assay. Cells were maintained in plastic tissue culture flasks and grown in Dulbecco's modified Eagle Cell Culture Medium (DMEM) at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ and 100% humidity. Cells were seeded in 96-well microtiter plates (Nunc, Denmark) and after 12 hours of preincubation, test substance was added to a final concentration ranging from 0 to 100 mM. The cells were incubated for 72 hours. At the end of the incubation period, Calcein AM in PBS was added at a final concentration of 1 pg / ml. After another 1 hour of incubation, the fluorescence was measured at 485/538 nm (ex / em) using Fluoroskan Ascent (Labsystems, Finland). IC50 values (i.e., the concentration causing the reduction in calcein AM conversion to 50%) were calculated from the curves obtained. All experiments were repeated four times with a maximum deviation of 15%. Due to the limited solubility of the substances in water, all test compounds were dissolved in DMSO and diluted with water to a final DMSO concentration of 0.6%.

Pomocí tohoto testu bylo zjištěno, že V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina nebyla toxická pro lidské kožní fibroblasty a to až do nejvyšší testované koncentrace 100 mM. Předpokládá se, že /V-furfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina, bude mít praktické využití v zemědělství a tudíž s touto látkou budou lidé moci manipulovat. Je tedy vysoce žádoucí, aby tato látka nebyla toxická.Using this assay, V-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea was found to be non-toxic to human skin fibroblasts up to the highest concentration tested at 100 mM. It is expected that N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea will have practical use in agriculture and will therefore be able to be handled by humans. It is therefore highly desirable that this substance be non-toxic.

Příklad 9Example 9

Aplikace /V-furfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny zvýšila výnos ozimé řepky a jarního ječmene v polních pokusechApplication of N-furfuryl- N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea increased the yield of winter rape and spring barley in field trials

Všechny polní pokusy byly provedeny v souladu s kritérii pro řádnou experimentální praxi (Good Experimental Practices). Šest stejných ploch (každá 10 m²), bylo použito na jednu variantu. Polní pokusy nebyly ošetřeny žádnými regulátory růstu ani fungicidy, ale pouze použitou látkou. Nfurfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina byla aplikována jednou v přesném čase (prodlužovací růst, BBCH 50), listovým postřikem v koncentraci 25 mM. K získání parametrů morfologie bylo použito alespoň 50 rostlin pro každou variantu. Statistické vyhodnocení bylo provedeno v statistický program PAST v. 2.17c.All field trials were performed in accordance with the criteria for Good Experimental Practices. Six identical areas (10 m ^{2 each} ) were used for one variant. Field trials were not treated with any growth regulators or fungicides, but only with the substance used. Nfurfuryl-β1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea was applied once at the exact time (extension growth, BBCH 50), by leaf spray at a concentration of 25 mM. At least 50 plants for each variant were used to obtain morphology parameters. Statistical evaluation was performed in the statistical program PAST v. 2.17c.

-9CZ 306009 B6-9EN 306009 B6

Aplikace A-furfuryI-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny vedla ke zvýšení výnosu semen ozimé řepky na 120,9% proti neošetřené kontrole (tab. 5). Zvýšila se také hmotnost tisíce zrn (HTZ), a to na 110% oproti kontrole (tab. 5).Application of A-furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea led to an increase in winter rapeseed seed yield to 120.9% compared to the untreated control (Table 5). The weight of a thousand grains (HTZ) also increased, to 110% compared to the control (Table 5).

Aplikace A-furfuryl-7V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny vedla ke zvýšení výnosu semen ječmene jarního na 104,8% oproti kontrole. HTZ zůstala stejná, zvýšil se ovšem počet zrn v klasu a to na 104,6% oproti kontrole (tab. 6).Application of N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea increased the yield of spring barley seeds to 104.8% compared to the control. HTZ remained the same, but the number of grains in the spike increased to 104.6% compared to the control (Table 6).

Tabulka 5Table 5

Vliv aplikace A-furfuryl-V-l,2,3 thiadiazol-5-yl-močoviny (ASES) na výnos ozimé řepkyEffect of A-furfuryl-V-1,2,3 thiadiazol-5-yl-urea (ASES) application on winter rape yield

Aplikace Application výnos semen (t/ha) seed yield (t / ha) % % HTZ (g) HTZ (g) % % Kontrola Control 4,994 4,994 th most common 100 100 4,35 4.35 100 100 ASES ASES 6,038 6,038 th most common 120,9 120.9 4,8 4.8 110,3 110.3

Tabulka 6Table 6

Vliv aplikace V-furfuryl/V-1 ,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny (ASES) na výnos ozimé řepkyEffect of V-furfuryl / V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea (ASES) application on winter oilseed rape yield

Aplikace Application výnos semen (t/ha) seed yield (t / ha) % % HTZ (g) HTZ (g) % % počet zrn v klasu number of grains in a spike % % Kontrola Control 7,65 7.65 100 100 45,85 45.85 100 100 23,5 23.5 100 100 ASES ASES 8,02 8.02 104,8 104.8 45,88 45.88 100,06 100.06 24,6 24.6 104,6 104.6

Příklad 10 PřípravkyExample 10 Formulations

Aktivní složkou v přípravcích se myslí A-furfurylV-l,2Jthiadiazol5-yl-močovinaThe active ingredient in the preparations is A-furfuryl-N, 1,2-thiadiazol-5-yl-urea.

Al. Emulgovatelné koncentráty Al. Emulsifiable concentrates a) and) b) b) c) C) d) d) Aktivní složka Active folder 5% 5% 10% 10% 25% 25% 50% 50% dodecylbenzensulfonan vápenatý calcium dodecylbenzenesulfonate 6% 6% 8% 8% 6% 6% 8% 8% polyoxyethylovaný ricinový olej (polyglykolether ricinového oleje) polyoxyethylated castor oil (polyglycol ether of castor oil) 4% 4% - - 4% 4% 4% 4% (36 mol ethylenoxid) oktylfenolpolyglykolether (36 mol ethylene oxide) octylphenol polyglycol ether - - 2% 2% - - 2% 2% (7 až 8 mol ethylenoxid) cyklohexanon (7 to 8 mol ethylene oxide) cyclohexanone - - - - 10% 10% 20% 20% směs aromatických uhlovodíků a mixture of aromatic hydrocarbons 83% 83% 82% 82% 53% 53% 18% 18%

Cg—CpCg — Cp

Emulze o vyžadované finální koncentraci mohou být získány z takového koncentrátu zředěním vodou.Emulsions of the required final concentration can be obtained from such concentrate by dilution with water.

-10CZ 306009 B6-10GB 306009 B6

A2. Roztoky A2. Solutions a) and) b) b) c) C) d) d) Aktivní složka Active folder 5% 5% 10% 10% 50% 50% 90% 90% polyethylenglykol MW 400 polyethylene glycol MW 400 20% 20% 10% 10% - - - - N-methyl-2-pyrrolidon N-methyl-2-pyrrolidone — - - - 30% 30% 10% 10% směs aromatických uhlovodíků a mixture of aromatic hydrocarbons 75% 75% 60% 60% Cq—C|2 Cq — C | 2

Roztoky jsou vhodné k aplikaci ve formě mikrokapének.The solutions are suitable for application in the form of microdroplets.

A3. Smáčivé prášky A3. Wettable powders a) and) b) b) c) C) d) d) Aktivní složka Active folder 5% 5% 25% 25% 50% 50% 80% 80% ligninsulfonan sodný sodium ligninsulfonate 4% 4% - - 3% 3% - - laurylsulfát sodný sodium lauryl sulfate 2% 2% 3% 3% - - 4% 4% diisobutylnaftalensulfonát diisobutylnaphthalenesulfonate - - 6% 6% 5% 5% 6% 6% sodný sodium oktylfenol polyglykol ether octylphenol polyglycol ether - - 1 % 1% 2% 2% - - (7 až 8 mol ethylenoxid) (7 to 8 moles of ethylene oxide) vysoce disperzní kyselina křemičitá highly disperse silicic acid 1 % 1% 3% 3% 5% 5% 10% 10% kaolin kaolin 87% 87% 61 % 61% 37% 37% — -

Aktivní složka je důkladně promísena s pomocnými látkami a směs je důkladně rozemleta ve vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou.The active ingredient is thoroughly mixed with the excipients and the mixture is thoroughly ground in a suitable mill. A suspension of any concentration can be obtained by mixing the resulting dust with water.

A4. Potahované granule A4. Coated granules a) and) b) b) c) C) Aktivní složka Active folder 0,1 % 0.1% 5% 5% 15% 15% vysoce disperzní kyselina křemičitá highly disperse silicic acid 0,9 % 0.9% 2% 2% 2% 2% anorganický nosič inorganic carrier 99,0 % 99.0% 93% 93% 83% 83%

(0,1 až 1 mm) např. CaCO₃ nebo SiO₂ (0.1 to 1 mm) eg CaCO ₃ or SiO ₂

Aktivní složka je rozpuštěna v methylenchloridu a nasprejována na nosič. Rozpouštědlo je odpařeno ve vakuu.The active ingredient is dissolved in methylene chloride and sprayed onto the carrier. The solvent is evaporated in vacuo.

A5. Potahové granule a) A5. Coating granules a) b) b) c) C) Aktivní složka 0,1 % Active ingredient 0.1% 5% 5% 15% 15% polyethylenglykol MW 200 1,0% polyethylene glycol MW 200 1.0% 2% 2% 3% 3% vysoce disperzní kyselina křemičitá 0,9 % highly disperse silicic acid 0.9% 1 % 1% 2% 2% anorganický nosič 98,0 % inorganic carrier 98.0% 92% 92% 80% 80%

(AE 0,1 až 1 mm) např. CaCO₃ nebo SiO₂ (AE 0.1 to 1 mm) eg CaCO ₃ or SiO ₂

Jemně rozemletá aktivní složka je v mixéru stejnoměrně nanesena na nosič zvlhčený polyethylenglykolem. Takto jsou získány neprašné granule.The finely ground active ingredient is uniformly applied in a mixer to a carrier moistened with polyethylene glycol. Thus, dust-free granules are obtained.

-11CZ 306009 B6-11EN 306009 B6

A6. Extrudované granule A6. Extruded granules a) and) b) b) c) C) d) d) Aktivní složka Active folder 0,1 % 0.1% 3 % 3% 5% 5% 15% 15% ligninsulfonan sodný sodium ligninsulfonate 1,5% 1.5% 2% 2% 3% 3% 4% 4% karboxymethylcelulóza carboxymethylcellulose 1,4% 1.4% 2% 2% 2% 2% 2% 2% kaolin kaolin 97,0 % 97.0% 93% 93% 90% 90% 79% 79%

Aktivní složka je smísena a rozemleta s pomocnými látkami a složka je zvlhčena vodou.The active ingredient is mixed and ground with excipients and the ingredient is moistened with water.

Směs je extrudována a usušena v proudu vzduchu.The mixture is extruded and dried in a stream of air.

A7. Prachy A7. Dust a) and) b) b) c) C) Aktivní složka Active folder 0,1 % 0.1% 1 % 1% 5% 5% talek talc 39,9 % 39.9% 49% 49% 35% 35% kaolin kaolin 60,0 % 60.0% 50% 50% 60% 60% Prachy k přímému použití jsou získány rozemletím aktivní složky Ready-to-use powders are obtained by grinding the active ingredient s nosičem ve vhodném mlýnu. with the carrier in a suitable mill. A8. Suspenzní koncentrát A8. Suspension concentrate a) and) b) b) c) C) d) d) Aktivní složka Active folder 3% 3% 10% 10% 25% 25% 50% 50% ethylenglykol ethylene glycol 5 % 5% 5% 5% 5% 5% 5% 5% nonylfenolpolyglykolether nonylphenol polyglycol ether - - 1 % 1% 2% 2% — - (15 mol ethylenoxid) (15 mol ethylene oxide) lignosulfonát sodný sodium lignosulfonate 3 % 3% 3% 3% 4% 4% 5% 5% karboxymethylcelulóza carboxymethylcellulose 1 % 1% 1 % 1% 1 % 1% 1% 1% 37% vodný roztok formaldehydu 37% aqueous formaldehyde solution 0,2 % 0.2% 0,2 % 0.2% 0,2 % 0.2% 0,2% 0.2% emulze silikonového oleje silicone oil emulsion 0,8 % 0.8% 0,8 % 0.8% 0,8 % 0.8% 0,8% 0.8% voda water 86% 86% 78% 78% 64% 64% 38% 38%

Jemně rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspenzní koncentrát umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.The finely divided active ingredient is mixed with excipients. The resulting suspension concentrate allows the preparation of a suspension of the desired concentration by dilution with water.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS

1. Použití jV-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny vzorce IUse of N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea of the formula I

2. Použití podle nároku 1, kde inhibice senescence zahrnuje oddálení degradace chlorofylu a senescence rostlinných pletiv a orgánů.The use of claim 1, wherein inhibiting senescence comprises delaying chlorophyll degradation and senescence of plant tissues and organs.

3. Použití podle nároku 1, kde rostliny zahrnují obiloviny, cukrovou řepu, malvice, peckovice a ovoce, luštěniny, olejniny, okurky, citrusové ovoce, zeleninu, tabák, ořechy, lilek, cukrovou třtinu, čaj, vinné hrozny, chmel, banány, přírodní kaučuk, léčivé rostliny, okrasné rostliny.Use according to claim 1, wherein the plants include cereals, sugar beet, malvice, stone fruit and fruit, legumes, oilseeds, cucumbers, citrus fruits, vegetables, tobacco, nuts, eggplant, sugar cane, tea, grapes, hops, bananas, natural rubber, medicinal plants, ornamental plants.

4. Použití podle nároku 1, kde stresem je stres způsobený suchem, chladem nebo salinitou.Use according to claim 1, wherein the stress is stress caused by drought, cold or salinity.

5. Anti-senescenční, antioxidační a/nebo antistresové přípravky pro ošetření rostlin, rostlinných orgánů a/nebo rostlinných buněk, vyznačený tím, že obsahují A-furfuryl-Al,2,3-thiadiazol-5-yl-močovinu a alespoň jednu pomocnou látku.5. Anti-senescence, antioxidant and / or anti-stress preparations for the treatment of plants, plant organs and / or plant cells, characterized in that they contain A-furfuryl-Al, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea and at least one auxiliary substance.

6. Způsob inhibice senescence, oxidativního poškození a/nebo stresu v rostlinách, v rostlinných orgánech a/nebo v rostlinných buňkách, vyznačený tím, že se na rostlinu, rostlinný orgán a/nebo rostlinnou buňku aplikuje 7V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina.6. A method for inhibiting senescence, oxidative damage and / or stress in plants, plant organs and / or plant cells, characterized in that N-furfuryl-VL, 2,3 is applied to the plant, plant organ and / or plant cell. -thiadiazol-5-yl-urea.