CZ2015230A3 - Use of N-furfuryl-N´-1,2,3-thiadiazol-5-yl urea for inhibition of senescence, stress and oxidative damage - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje použití N-furfuryl-N´-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny vzorce I pro inhibici senescence, stresu a/nebo oxidativního poškození rostlinných buněk, rostlinných orgánů a/nebo celých rostlin, a/nebo pro zvýšení výnosu rostlin bez vedlejších účinků inhibice růstu kořene. Popsány jsou i přípravky tuto látku obsahující a způsob ochrany rostlin.The solution provides the use of N-furfuryl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea of formula I for inhibiting senescence, stress and / or oxidative damage to plant cells, plant organs and / or whole plants, and / or for increasing plant yield without side effects of root growth inhibition. Also described are preparations containing this substance and the method of plant protection.

Description

pV 1015' 2-žC1

• · • · · · ·· · · · · · · ·

Použití A/-furfuryl-iV'-l,2,3-thiadiazol-5-yl močoviny pro inhibici senescence, stresu a oxidativního poškození

Oblast techniky

Vynález se týká použití V-furfuryl-V'-l,2,3-thiadiazol-5-yl močoviny pro inhibici senescence, stresu a oxidativního poškození rostlinných orgánů, buněk a celých rostlin, a přípravků tento derivát obsahujících.

Dosavadní stav techniky

Stresem indukovaná senescence je dnes hlavním problémem z agro-ekonomického úhlu pohledu a ohrožuje dostupnost potravin na celém světě. Je známo pouze několik látek, které na hormonální úrovni mají anti-senescenční a/nebo antioxidační vlastnosti, ale řada z nich zároveň vykazuje nežádoucí vedlejší účinky, jako je inhibice růstu kořene. Z tohoto důvodu je potřeba poskytnout nové látky se silnými antistresovými vlastnostmi, které nevykazují nežádoucí vedlejší účinky.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je použití V-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny vzorce I

pro inhibici senescence, stresu a/nebo oxidativního poškození rostlinných buněk, rostlinných orgánů a/nebo celých rostlin, a/nebo pro zvýšení výnosu rostlin bez vedlejších účinků inhibice růstu kořene.

Sloučenina vzorce I podle předkládaného vynálezu nevykazuje nežádoucí inhibiční aktivitu na růst kořenů, která je typická pro jiné anti-senescenční sloučeniny podle dosavadního stavu techniky. I při vysokých koncentracích negativní vliv na růst kořenů není přítomen.

Sloučenina vzorce I se podle předkládaného vynálezu může aplikovat na celé rostliny, rostlinné orgány, nebo na rostlinné buňky, např. v tkáňových kulturách. Je vhodná zejména pro použití v tkáňových kulturách, protože nevykazuje inhibiční efekt na růst a dělení rostlinných buněk při vysokých koncentracích a vykazuje minimální toxicitu pro tyto buňky ve srovnání s jinými anti-senescenčními sloučeninami známými z dosavadního stavu techniky. To umožňuje jejich použití v širokém koncentračním rozmezí bez negativních účinků.

Jedním provedením tohoto vynálezu je použití sloučeniny vzorce I pro oddálení degradace chlorofylu a senescence rostlinných tkání. Tento pozitivní účinek souvisí s jedinečným efektem této látky na peroxidaci membránových lipidů. Sloučenina vzorce I podle předkládaného vynálezu brání peroxidaci membránových lipidů, což dále zvyšuje její anti-senescenční a anti-stresovou aktivitu.

Dalším provedením tohoto vynálezu je použití sloučeniny vzorce I jako inhibitoru stresu a stresem indukované senescence v produkci rostlin. S výhodou jsou rostliny vybrány ze skupina zahrnující zejména obiloviny (pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, žito, oves, čirok a příbuzné druhy), řepu (cukrová řepa a krmná řepa); malvice, peckovice a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody a ostružiny); luštěniny (fazole, čočka, hrách, sójové boby); olejniny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, ricinus, kakaové boby, podzemnice olejná); okurky (dýně, okurky, melouny); vláknité rostliny (bavlna, len, konopí, juta); citrusové plody (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky); zeleninu (špenát, skořicovník, kafr) nebo rostliny, jako je tabák, ořechy, lilek, cukrová třtina, čaj, vinná réva, chmel, banány a přírodní kaučuk a léčivé rostliny, stejně jako okrasné rostliny.

Stresem může být zejména stres způsobený suchem, chladem a salinitou (salinní stres).

Vynález se dále týká způsobu inhibice stresu, nežádoucích oxidativních procesů a/nebo senescence v rostlinách, rostlinných orgánech a/nebo v rostlinných buňkách, kdy se na rostlinu, rostlinný orgán a/nebo rostlinnou buňku aplikuje V-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina. V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina může být připravena známými chemickými způsoby. S výhodou může být připravena způsobem, ve kterém je l,2,3-thiadiazol-5-yl- - isokyanát připraven konvenční metodou (Kurita K. a Iwakura Y., J. Org. Chem. 41, 2070-71 (1976 )) z l,2,3-thiadiazol-5-ylaminu a difosgenu. l,2,3-Thiadiazol-5-ylisoěyanát se pak nechá reagovat s furfurylaminem, čímž se získá požadovaný produkt.

Vynález dále zahrnuje anti-senescenční, antioxidační a/nebo anti-stresové přípravky pro rostliny, rostlinné orgány a rostlinné buňky, obsahující sloučeninu vzorce I a alespoň jednu pomocnou látku. iV-furfuryl-iV-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina se používá v nemodifikované formě nebo výhodně společně s pomocnými látkami běžně používanými pro formulaci přípravků. Za tímto účelem jsou přípravky výhodně formulovány jako koncentráty účinné látky, jakož i suspenze a disperze, s výhodou izotonické vodné roztoky, suspenze a disperze, zředěné emulze, rozpustné prášky, poprašky, granuláty, krémy, gely, olejové suspenze a také obalované formulace, např. polymemími látkami. Stejně jako u typu přípravku, způsoby aplikace, jako je postřik, rozprašování, práškování, rozptyl, natírání nebo zalévání, se volí v souladu se zamýšlenými cíli a převažujícími okolnostmi. Přípravky mohou být sterilizovány a/nebo mohou obsahovat další pomocné látky neutrální povahy, jako jsou konzervační činidla, stabilizátory, smáčedla nebo emulgátory, solubilizační činidla, stejně jako hnojivá, donory stopových prvků nebo jiných prostředků k dosažení speciálních efektů. Přípravky Přípravky obsahující sloučeninu vzorce I (aktivní složka) a pokud je třeba, jednu nebo více pevných nebo kapalných pomocných látek, jsou připraveny známými způsoby, například smísením nebo mletím účinné látky s pomocnými látkami, jako jsou např. rozpouštědla nebo pevné nosiče. Do přípravků mohou být přidávány povrchově aktivní látky (surfaktanty) a smáčedla. Příklady vhodných aniontových, neiontových a kationtových smáčedel jsou shrnuty například ve WO 97/34485.

Také vhodné pro přípravu kompozic, které obsahují sloučeninu vzorce I jsou povrchově aktivní látky běžně používané při formulaci prostředků, které jsou popsány např. v "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual" MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1981, Stache, H., "Tensid- Taschenbuch", Carl Hanser Verlag, MunichNienna, 1981 * « « · « · · I · I « · * ♦ * • · · ψ * * * • · « « · §«···· • · · · * · «····· · · · · - 4 - and Μ. and J. Ash, "Encyclopedia of Surfactants", Vol-111, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81.

Formulace přípravku obsahuje váhově od 0,1 do 99 % (w/w), zejména pak od 0,1 do 95 % (w/w) aktivní složky N-furfuryl-.AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny, přičemž obsahuje i od 5 do 99,9 % směsi přísad či farmaceutických nosičů, a to v závislosti na způsobech aplikace, a popřípadě obsahuje i váhově od 0,1 do 25 % smáčedla. Ačkoliv jsou komerční produkty obvykle připravovány ve formě koncentrátů, konečný uživatel upotřebí naředěný přípravek. Kompozice může proto obsahovat i další přísady, jakými jsou stabilizátory, např. rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný palmový olej 0;1, řepkový nebo olivový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla anebo emulgátory, viskozitní činidla, pojivá, lepidla, a také hnojivá a další aktivní přísady. S výhodou jsou používány přípravky následujícího složení: (% = hmotnostní procento). 1 až 90 %, s výhodou 5 až 20 % 1 až 30 %, s výhodou 10 až 20 % 5 až 94%, s výhodou 60 až 85 %

Emulgované koncentráty: aktivní složka: smáčedlo: kapalný nosič:

Prášky: aktivní složka: 0,1 až 10 %, s výhodou 0,1 až 5 % pevný nosič: 99,9 až 90 %, s výhodou 99,9 až 95 %

Susnenzní koncentráty: aktivní složka: voda: smáčedlo:

Smáčivé prášky: aktivní složka: smáčedlo: pevný nosič: 5 až 75 %, s výhodou 10 až 50 % 94 až 24 %, s výhodou 88 až 30 % 1 až 40 %, s výhodou 2 až 30 % 0,5 až 90 %, s výhodou 1 až 80 % 0,5 až 20 %, s výhodou 1 až 15 % 5 až 95 %, s výhodou 15 až 90 %

Granule: aktivní složka: 0,1 až 30 %, s výhodou 0,1 až 15 % pevný nosič: 99,9 až 70 %, s výhodou 99,9 až 85 %

Kompozice mohou rovněž obsahovat další příměsi, jakými jsou stabilizátory, například rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje (epoxidovaný kokosový olej, řepkový olej nebo sójový olej), odpěňovače, např. silikonový olej, konzervační látky, regulátory viskozity, pojivá, zahušťovadla, a také hnojivá a další aktivní látky. Pro použití sloučeniny vzorce I nebo kompozic je obsahujících, se používají rozdílné metody a technologie, kterými jsou například následující: i) Obalování osiva a) Obalování osiva smáčivou práškovou formulací sloučeninu vzorce I nebo její soli, a to mícháním v nádobě až do stejnorodé distribuce na povrchu semen (suché obalování). b) Obalování osiva emulzifikovaným koncentrátem sloučeninu vzorce I nebo její soli, v souladu s metodou a) (mokré obalování). c) Obalování osiva cestou máčení semen po dobu 1 až 72 h v tekutině obsahující od 100 do 1000 ppm sloučeninu vzorce I nebo její soli, a s výhodou následného usušení semen (imerzní obalování).

Obecně je sloučenina vzorce I nebo její soli používány v množství od 1 do 1000 g, s výhodou od 5 do 250 g, na 100 kg semen, avšak v závislosti na metodice, která rovněž umožňuje přidání dalších aktivních látek nebo mikroživin; určené koncentrační limity se mohou pohybovat nahoru nebo dolů (opakované obalování). ii) Aplikace cisternové směsi

Kapalná formulace je aplikována v množství od 0,005 do 5,0 kg na hektar. Taková cisternová aplikace se provádí před anebo po setí. iii) Aplikace do semenné brázdy

Sloučenina vzorce I nebo její sůl, je zavedena do otevřené brázdy oseté semenem ve formě emulzifíkovaného koncentrátu, smáčivého prášku nebo granulí. Jakmile je semenná brázda zaklopena, je růstový regulátor aplikován cestou obvykle používanou při pre-emergentním procesu. iv) Kontrolované uvolňování aktivních látek

Sloučenina vzorce I nebo její soli, jsou aplikovány v roztoku k minerálním granulovaným nosičům nebo polymerizováným granulím (močovina, formaldehyd) a jsou vysušeny. M · • « « · • · · · • · · I I I · • * · » · • · * « · · · ♦ · · ****** - 6 V případě, že je to žádoucí, tak se provádí obalování, které umožňuje postupné uvolňování látky v měřitelných množstvích po určitou specifickou periodu (obalované granule).

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje účinek thidiazuronu (TDZ) a V-furfurylVV1-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny (ASES) na průměrnou délku kořene Arabiáopsis (A) a pšenice seté Triticum aestivum (B) v kořenovém testu. V experimentu bylo použito 0,01% DMSO jako kontrola a sloučeniny v koncentraci 100 nM. Chybové úsečky představují Sd (n=50). Hvězdičky označují statisticky významné rozdíly oproti kontrolnímu ošetření (studentův t-test, dvěma hvězdičkami: P = 0,001; jedna hvězdička P = 0,05). Příklady provedení vynálezu Výchozím materiálem pro /V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovinu je l,2,3-thiadiazol-5--yl-amin, který byl získán z TCI Europe. l,2,3-Thiadiazol-5-ylamin se převede na 5-- isokyanato-l,2,3-thiadiazol mícháním l,2,3-thiadiazol-5-yl-aminu s nadbytečným množstvím difosgenu v tetrahydroťuranu (THF). yV-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina může být i potom připravena mírným zahříváním 5-isokyanato-l,2,3-thiadiazolu a furfurylaminu (komerčně dostupné od Sigma Aldrich) v přítomnosti katalytického množství triethylaminu v THF.

Elementární analýzy (C, H a N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Fissons Instruments). Analytická tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na destičkách silikagelu 60 WF254 (Merck), v mobilní fázi CHCbrMeOHikonc. NH4OH (8:2:0,2, v/v/v). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10 až 1500 u. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150 °C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvatačního plynu 200 1/hodinu. Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data systém. NMR spektra byla měřena na přístroji Jeol 500 SS při teplotě 300 K a frekvenci 500,13 MHz (*H). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-úk· Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard. » · # 7 — *··< Příklad 1 Příprava 5-isokyanato-1,2,3-thiadiazolu

Syntéza izokyanátů z aminů byla popsána již dříve (Kurita K. a Iwakura Y., J. Org. Chem. 41, 2070-71 (1976)). Detailně, 1,2,3-thiadiazol-5-yl amin (1,01 g, 10 mmol) byl rozpuštěn v THF (40 mL) a přidáván po kapkách do roztoku difosgenu (2,6 g, 13 mmol) v THF (100 mL). ReakČní směs byla míchána po dobu 40 minut při teplotě 0 ° C; pak se reakční směs krátce zahřeje na teplotu 30 °C. Po zahřátí, se rozpouštědlo a přebytek difosgenu odpaří. Žlutý pevný zbytek byl 5-isokyanáto-l,2,3-thiadiazol, který se znovu re-suspenduje v diethyletheru a odfiltruje se. Výtěžek: 95%, 'H NMR (6, ppm, DMSO-76): 7,75 (1H, s, CH). Příklad 2 Příprava V-furfuryl-yV-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny 5-Isokyanato-l,2,3-thiadiazol (1.27 g, 10 mmol) byl rozpuštěn ve 100 mL tetrahydrofuranu (THF). K tomuto roztoku bylo přidáno 100 \\L triethylaminu a přikapán furfurylamin (0.97 g, 10 mmol) ve 20 mL THF při teplotě 30 °C. Směs se nechá reagovat 5 hodin, potom byl THF odpařen na vakuové odparce a k surovému produktu bylo přidáno 50 mL dichlormethanu. Sraženina byla re-suspendována a odfiltrována. Výtěžek: l,2g; 53%, *H NMR (δ, ppm, DMSO-76): 4,32(2H, d, 7=5,5 Hz, CH2), 6,24(1H, d, 7=4,0 Hz, ArH-furfuryl), 6,36(1H, t, 7=2,0 Hz, ArH-furfuryl), 7,52(1H, t, 7=5,5, NH), 7,56(1H, d, 7=4,0 Hz, ArH-furfuryl), 8,47(1H, s, CH), 10,76(1H, s(br),NH).

Tabulka 1

Elementární analýza V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny

Elementární analýza vypočteno/nalezeno V-furfiiryl-ΛΜ ,2,3-- thiadiazol-5-yl-močovina %C %H %N ES MS [Μ+ΗΓ 42,9/43,2 3,6/3,7 25,0/24,8 225,3 Příklad 3

Anti-senescenční aktivita V-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny v senescenčním testu na listových segmentech pšenice kultivovaných ve tmě

Semena ozimé pšenice Triticum aestivum cv. Hereward byla promyta pod tekoucí vodou po 24 hod. a poté vyseta do vermikulitu nasyceného Knopovým živným roztokem. Nádoby se semeny byl umístěny do klimatizované růstové komory s 16/8 hodinovou světelnou periodou (světelná intenzita 50 mmol.m^.s'1) a teplotou 15 °C. Po 7 dnech měly semenáčky vyvinutý první praporcový list a druhý list začínal prorůstat. Z prvních listů vždy od 5 rostlin byly odebrány vrcholové sekce dlouhé přibližně 35 mm, které byly zkráceny tak, aby jejich váha byla přesně 100 mg. Bazální konce těchto 5 listových segmentů byly umístěny do jamek mikrotitračních polystyrénových destiček obsahujících 150 mL roztoku testované látky. Destičky byly umístěny do plastového boxu vystlaného filtračním papírem, který byl nasycen vodou za účelem maximální vzdušné vlhkosti. Po 96 hodinách inkubace ve tmě při 25 °C byly listové sekce vyjmuty a chlorofyl extrahován v 5 mL 80% ethanolu zahřátím při 80 °C po dobu 10 min. Objem vzorku byl poté doplněn na 5 mL přidáním 80% ethanolu. Absorbance extraktů byla měřena při 665 nm. Jako kontroly byly měřeny rovněž chlorofylové extrakty z listů a listových vrcholů inkubované v deionizované vodě. Vypočtené hodnoty jsou průměrem z 5 opakování a celý experiment byl zopakován minimálně 2-krát. Testované látky (6-- benzylaminopurin, trans-zeatin, thidiazuron a V-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina) byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na 10‘3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem v koncentračním rozsahu 10'8 až ΚΓ4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Hodnoty IC50 byly stanoveny pro všechny testované sloučeniny. N-furfuryl-yV1-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina vykazuje pozitivní vliv na oddálení senescence v segmentech listů pšenice ve tmě. V-furfuryl-jV-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina překročila anti-senescenční aktivitu 6-benzylaminopurinu minimálně lOOx, trans-zeatinu a thidiazuronu minimálně lOx. To znamená, že k dosažení stejného antisenescenčního účinkuje třeba lOx menší množství V-furfuryl-V-1,2,3 -thiadiazol-5-yl-močoviny než např. trans-zeatinu nebo thidiazuronu.

Tabulka 2

Vliv V-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivum cv. Hereward ve tmě. Látka Senescenční biotest (IC50, pM)/s.d. 6-benzylaminopurin (BAP) 155 (±22) trans-zeatin 30 (±4,5) thidiazuron 13 (±3,0) A-furfuryl-iVM^S-thiadiazol-S-yl-močovína 1,2 W) - 9 - 9 * · » » · · ···« · · · · • · · · » · · • · * · * ··*··· • « · · · · *·«··· ·· » « Příklad 4

Anti-senescenční aktivita iV-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-rnočoviny v senescenčním testu na listových segmentech pšenice při působení světla

Schopnost V-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny zpomalit degradaci chlorofylu v listech pšenice byla testována také ve světelných podmínkách. Experiment byl proveden, jak je popsáno v příkladu 7 s modifikacemi takto - inkubace listů se sloučeninami byla provedena při periodě osvětlení 8/16 (tma/světlo - mol.m^.s'1) při 22 °C po dobu 7 dnů. Jak je ukázáno v tabulce 3, V-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina má mnohem silnější pozitivní účinky na oddálení senescence v segmentech listů pšenice ve světelných podmínkách ve srovnání s 6-benzylaminopurinem, trans-zeatinem i thidiazuronem. IC50 JV-furfuryl-JV-1,2,3-- thiadiazol-5-yl-močoviny je 40 nmol.

Tabulka 3

Vliv vV-furfuryl-iY-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny na oddálení senescence v dekapitovaných segmentech listů Triticum aestivum cv. Hereward na světle. Látka Senescenční biotest (IC50, pM)/s.d. 6-benzylaminopurin (BAP) 12,5 (±22) trans-zeatin 2,2 (±4,5) thidiazuron 0,5 (±3,0) A-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina 0,03 (±03) Příklad 5

Ochrana před peroxidací membránových lipidů v pšenici

Typickým projevem provázejícím senescenci je zvýšení hladiny reaktivních kyslíkových derivátů a následná peroxidace membránových lipidů. Proto byly stanoveny hladiny malonyldialdehydu (MDA), oxidativního markéru poškození membránových lipidů, v oddělených listech pšenice vystavených působení /V-furfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-- močoviny a thidiazuronu po dobu čtyř dnů v temnu, jak bylo popsáno v příkladu 7. Hladiny MDA byly stanoveny pomocí kyseliny thiobarbiturové (TBA). 100 mg čerstvého rostlinného materiálu bylo homogenizováno pomocí oscilačního mlýna (MM301, Retsch, Germany), s 1 mL 80% metanolu. Surový extrakt byl centrifugo ván při 10,000xg po dobu 5 minut, 100 pL alikvot supematantu byl protřepán se 100 pL 0.5% (w/v) TBA obsahujícími 0.1% (w/v) trichloroctovou kyselinu, a výsledný roztok byl inkubován 30 minut při 95 °C. Vzorky byly - 10 • · • « • · • · »

• · * · I rychle ochlazeny na ledu a centrifugovány 5 minut při lOOOxg. Absorbance supematantu byla změřena při 532 nm s korekcí při 600 nm a množství vzniklého komplexu MDA-TBA bylo vypočítáno z extinkčního koeficientu 155 mM^cm'1. A-furfuryl-vV-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina výrazně snižuje peroxidaci membránových lipidů ve srovnání s neošetřenou kontrolou a vzorky ošetřené thidiazuronem (Tabulka 5 -hodnoty vyjadřují obsah MDA, což je produkt rozkladu membránových lipidů). jV-furfuryl-iV--1,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina snižuje úroveň membránové lipidové peroxidace ve stárnoucích oddělených listech pšenice o 4ΐ|Κ>, zatímco thidiazuron pouze o 27ζ/ο. A-furfuryl-iY-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina má ochrannou funkci před negativním působením reaktivních forem kyslíku, které se hromadí v tkáních během senescence listu.

Tabulka 4

Efekt A-furfuryl-A1-1,2,3 -thiadiazol-5 -yl-močoviny a thidiazuronu na peroxidaci membránových lipidů v průběhu senescence extirpovaných listů Triticum aestivum cv.

Hereward v temnu.

Testovaná látka MDA (nmol/g FW) Neošetřená kontrola 21,5 (±2,8) thidiazuron 15,7 (±1,7) iV-furfuryl-/VM,2,3-thiadiazoI-5-yl-močovina 12,7 (±1,1) Příklad 6 A-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina oddaluje senescenci rostlin pšenice stresovaných suchem

Sucho je jedním z hlavních problémů, který omezuje růst a produkci rostlin. Sucho vede ke stresem-vyvolané senescenci rostlinných orgánů, a může mít za následek smrt rostlin. Oddálením suchem indukované senescence se zvyšuje délka života stresovaných rostlin i jejich produktivita.

Pro zkoumání účinku A-furfuryl-TV-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny na suchem-vyvolanou senescenci, semena ozimé pšenice, Triticum aestivum cv. Hereward, byly promyty pod tekoucí vodou po dobu 24 hodin a pak vysety do táců (30 x 40cm) na perlit nasáklý vodou, nebo 100 nM vodným roztokem N-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny. Tácy byly • · • · · » · * « « · • · · · - η - umístěny v růstové komoře při 25 °C s 16/8 h světlo/tma při intenzitě 100 mol.m^.s'1. 30 Dnů po výsadbě bylo spočítáno kolik % rostlin přežilo na jednotlivých tácech. Výsledkem bylo, že použití V-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny zpomaluje senescenci pšeničných rostlin, které jsou pěstovány ve stresových podmínkách. Rostliny ošetřené V-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močovinou jsou zelenější (obsahují více chlorofylu), a také jich přežívá více (71j% rostlin) proti neošetřeným rostlinám (přežívá jen 37j% rostlin).

Tento in vivo experiment je důkazem toho, že V-furfuryl-AM ,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina prodlužuje fotosyntetickou životnost rostlin pšenice, které byly vystaveny stresu životního prostředí. Příklad 7 jY-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina neinhibuje růst primárních kořenů Arabidopsis thaliana ani pšenice seté Triticum aestivum

Anti-senescenční látky jsou známy jako negativní regulátory prodlužování kořenů a tvorby laterálních kořenů (Werner, T. et al., Proč Nati Acad Sci USA 98, 10487-92, 2001) a jejich exogenní aplikace v koncentraci vyšší než 1 μΜ často způsobují úplnou inhibici růstu kořene. Abychom prozkoumali in vivo účinek A-furfúryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny na růst a vývoj kořene, semena Arabidopsis thaliana (wild-type Col-0) byla sterilizována a zaseta na vertikální desky na 1/2 Murashige-Skoog médium (obohacené o 0,1% sacharózu a 6 g/L phytagel) obsahujícím 100 nM thidiazuron nebo /V-furfuryl-W-1,2,3-thiadiazol-5-yl-- močovinu, nebo 0,01% DMSO (kontrola rozpouštědla). Po vemalizaci (4 dny ve tmě, 4 °C), desky byly převedeny do růstové komory (22 °C, 8/16 světlo/tma). Dva týdny po přenosu, semenáčky byly vyfotografovány a prodloužení kořene a tvorba laterálních kořenů byla hodnocena pomocí Scion image software (Scion Corp., Frederick, MD, USA). Nejméně 40 rostlin bylo měřeno pro každé ošetření.

Zatímco kořeny rostlin, které rostly v přítomnosti thidiazuronu (obr. 1), byly vážně a významně retardované, kořeny rostlin, které rostly v přítomnosti A-furfúryl-ΛΜ ,2,3-_ thiadiazol-5-yl-močoviny se vyvinuly normálně (obr. 1) a délka primárního kořene nebyla zkrácena. To znamená, že A/-furfúryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina nemá negativní vliv na růst a vývoj kořene ve 100 nanomolámí koncentraci na rozdíl od vážného inhibičního účinku thidiazuronu. A-furfúryl-ZV-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina může být s výhodou • 9 9 · 12 • · • » • ·

I I ( použita na semena, sazenice a mladé rostliny v širším rozsahu koncentrací, než thidiazuron a bez nežádoucích inhibičních účinků. Příklad 8 A-ftirfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina není cytotoxická vůči lidským kožním fibroblastům (buněčná linie BJ)

Cytotoxicita jV-furfuryl-iV-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovmy vůči lidským kožním fibroblastům (buněčná linie BJ) byla stanovena ve standardním Calceinovém AM testu. Buňky byly udržovány v plastikových lahvích pro tkáňové kultury a pěstovány v Dulbecco modifikovaném Eagle médiu pro buněčné kultury (DMEM) při teplotě 37 0 C v atmosféře 5% ύ CO2 a 100% vlhkosti. Buňky byly vysety do 96-jamkových mikrotitračních destiček (Nunc, Dánsko) a po 12 hodinách pre-inkubace, byla přidána testovaná látka, aby konečná koncentrace byla v rozmezí od 0 do 100 mM. Buňky byly inkubovány po dobu 72 hodin. Na konci inkubační doby byl přidán Calcein AM v PBS v konečné koncentraci 1 pg / ml. Po další 1 hodině inkubace byla měřena fluorescence pi 485/538 nm (ex/em) pomocí Fluoroskan Ascent (Labsystems, Finsko). Hodnoty IC50, (tj. koncentrace způsobující snížení konverze kalceinu AM na 50%) byly spočítány ze získaných křivek. Všechny experimenty byly opakovány čtyřikrát s maximální odchylkou 15%. Vzhledem k omezené rozpustnosti látek ve vodě, všechny testované sloučeniny byly rozpuštěny v DMSO a zředěny vodou na konečnou koncentraci DMSO 0,6%.

Pomocí tohoto testu bylo zjištěno, že A-furfuryl-A-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina nebyla toxická pro lidské kožní fibroblasty a to až do nej vyšší testované koncentrace 100 mM. Předpokládá se, že V-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina, bude mít praktické využití v zemědělství a tudíž s touto látkou budou lidé moci manipulovat. Je tedy vysoce žádoucí, aby tato látka nebyla toxická. Příklad 9

Aplikace V-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny zvýšila výnos ozimé řepky a jarního ječmene v polních pokusech Všechny polní pokusy byly provedeny v souladu s kritérii pro řádnou experimentální praxi V Λ (Good Experimental Practices). Šest stejných ploch (každá 10 m ), bylo použito na jednu variantu. Polní pokusy nebyly ošetřeny žádnými regulátory růstu ani fungicidy, ale pouze použitou látkou. V-furfuryl-VH ,2,3-thiadiazol-5-yl-močo vina byla aplikována jednou v přesném čase (prodlužovací růst, BBCH 50), listovým postřikem v koncentraci 25 mM. K získání parametrů morfologie bylo použito alespoň 50 rostlin pro každou variantu. Statistické vyhodnocení bylo provedeno v statistický program PAST v. 2.17c.

Aplikace V-íurfuryl-V-l^^-thiadiazol-S-yl-močoviny vedla ke zvýšení výnosu semen ozimé řepky na 120,.9% proti neošetřené kontrole (tab. 5). Zvýšila se také hmotnost tisíce zrn (HTZ), a to na 110% oproti kontrole (tab. 5).

Aplikace A-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny vedla ke zvýšení výnosu semen ječmene jarního na 104,8% oproti kontrole. HTZ zůstala stejná, zvýšil se ovšem počet zrn v klasu a to na 104,6% oproti kontrole (tab. 6).

Tabulka 5

Vliv aplikace iV-furfuryl-jV-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny (ASES) na výnos ozimé řepky

Aplikace výnos semen (t/ha) % HTZ (g) % Kontrola 4,994 100 4,35 100 ASES 6,038 120,9 4,8 110,3

Tabulka 6

Vliv aplikace iV-furfuryl-V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny (ASES) na výnos ozimé řepky

Aplikace výnos semen (t/ha) % HTZ (g) % počet zrn v klasu % Kontrola 7,65 100 45,85 100 23,5 100 ASES 8,02 104,8 45,88 100,06 24,6 104,6 Příklad 10 Přípravky

Aktivní složkou v přípravcích se myslí V-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina AI. Emulgovatelnékoncentrátv a) b) c) d) Aktivní složka 5% 10% 25% 50% dodecylbenzensulfonan vápenatý 6% 8% 6% 8% polyoxyethylovaný ricinový olej (polyglykol ether ricinového oleje) 4% 4% 4% (36 mol ethylen oxid) oktylfenofpolyglykol ether - 2 % - 2 % Λ~ί· ,/ (7^8 mol ethylen oxid) cyklohexanon - - 10 % 20 % směs aromatických uhlovodíků 83% 82% 53% 18% c9-c12

Emulze o vyžadované finální koncentraci mohou být získány z takového koncentrátu zředěním vodou. A2. Roztokv a) b) c) d) Aktivní složka 5% 10% 50% 90% polyethylenglykol MW 400 20% 10% - - N-methyl-2-pyrrolidon - - 30% 10% směs aromatických uhlovodíků 75 % 60 % c9-c12 Roztoky jsou vhodné k aplikaci ve formě mikrokapének. A3. SmáČivé Dráškv a) b) c) d) Aktivní složka 5% 25% 50% 80% ligninsulfonan sodný 4% - 3% - laurylsulfát sodný 2% 3% - 4% diisobutylnaftalensulfonát sodný “ 6% 5% 6% oktylfenol polyglykol ether o 1 (7?8 mol ethylen’ oxid) “ 1 % 2% vysoce disperzní kyselina křemičitá 1 % 3% 5% 10% kaolin 87% 61 % 37% -

Aktivní složka je důkladně promísena s pomocnými látkami a směs je důkladně rozemleta ve vhodném mlýnu. Suspenzi libovolné koncentrace je možné získat smísením vzniklého prachu s vodou. A4. Potahované granule Aktivní složka a)0,1 % b) 5% c) 15% vysoce disperzní kyselina křemičitá 0,9 % 2 % 2 % anorganický nosič 99.0 % 93 % 83 % (0,1 rí mm) např. CaCC>3 nebo S1O2

Aktivní složka je rozpuštěna v methylenchloridu a nasprejována na nosič. Rozpouštědlo je odpařeno ve vakuu. A5. Potahované granule a) b) c) Aktivní složka 0.1 % 5% 15% polyethylenglykol MW 200 1,0% 2% 3% vysoce disperzní kyselina křemičitá 0,9 % 1 % 2% anorganický nosič 98,0 % 92% 80% (AE 0,1 ďmm) např. CaCC>3 nebo S1O2

Jemně rozemletá aktivní složka je v mixéru stejnoměrně nanesena na nosič zvlhčený polyethylenglykolem. Takto jsou získány neprašné granule. A6. Extrudované granule a) b) c) d) Aktivní složka 0,1 % 3% 5% 15% ligninsulfonan sodný 1,5 % 2% 3% 4% karboxymethylcelulosa 1,4% 2% 2% 2% kaolin 97,0 % 93% 90% 79%

Aktivní složka je smí sena a rozemleta s pomocnými látkami a složka je zvlhčena vodou. Směs je extrudována a usušena v proudu vzduchu. A7. Prachv a) b) c) Aktivní složka 0,1 % 1 % 5% talek 39,9 % 49% 35% kaolin 60,0 % 50% 60%

Prachy k přímému použití jsou získány rozemletím aktivní složky s nosičem ve vhodném mlýnu. • * • · · « · · · • · · · · · · - 16 —1 • * ··»· A8. Suspenzní koncentrát a) b) c) d) Aktivní složka 3% 10% 25% 50% ethylen glykol 5% 5% 5% 5% nonylfenol polyglykol ether - 1 % 2% - (15 mol ethylen oxid) lignosulfonát sodný 3% 3% 4% 5 % karboxymethylcelulosa 1 % 1 % 1 % 1% 37'% vodný roztok formaldehydu 0,2 % 0,2 % 0.2 % 0,2% emulse silikonového oleje 0,8 % 0,8 % 0,8 % 0,8% voda 86% 78% 64% 38% * * · · · ··#·«· • · * · · ·

Jemně rozemletá aktivní složka je smíchána s pomocnými látkami. Vzniklý suspenzní koncentrát umožňuje přípravu suspenze o požadované koncentraci zředěním vodou.

pV 1015 '2-jC1

• · · · · · · · · · · · · · · ·

Use of N-furfuryl-N '-1,2,3-thiadiazol-5-yl urea to inhibit senescence, stress and oxidative damage

Technical field

The present invention relates to the use of N-furfuryl-N'-1,2,3-thiadiazol-5-yl urea for the inhibition of senescence, stress and oxidative damage to plant organs, cells and whole plants, and to preparations containing such derivatives.

Background Art

Stress-induced senescence is now a major problem from an agro-economic point of view and threatens the availability of food worldwide. Only a few substances are known to have anti-senescent and / or antioxidant properties at the hormone level, but many of them also exhibit undesirable side effects such as root growth inhibition. Therefore, there is a need to provide novel agents with strong anti-stress properties that do not exhibit undesirable side effects.

SUMMARY OF THE INVENTION

It is an object of the present invention to use N -furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea of formula I

for inhibiting senescence, stress and / or oxidative damage to plant cells, plant organs and / or whole plants, and / or to increase plant yield without side effects of root growth inhibition.

The compound of formula I of the present invention does not exhibit undesirable root growth inhibitory activity typical of other anti-senescent compounds of the prior art. Even at high concentrations, no negative effect on root growth is present.

The compound of formula I according to the present invention can be applied to whole plants, plant organs, or plant cells, e.g. in tissue cultures. It is particularly suitable for use in tissue cultures since it does not have an inhibitory effect on the growth and division of plant cells at high concentrations and shows minimal toxicity to these cells compared to other anti-senescent compounds known in the art. This allows their use over a wide concentration range without negative effects.

One embodiment of the present invention is the use of a compound of Formula I to delay the degradation of chlorophyll and senescence of plant tissues. This positive effect is related to the unique effect of this substance on membrane lipid peroxidation. The compound of formula I according to the present invention prevents the peroxidation of membrane lipids, which further increases its anti-senescent and anti-stress activity.

Another embodiment of this invention is the use of a compound of formula I as a stress inhibitor and stress-induced senescence in plant production. Preferably, the plants are selected from the group consisting mainly of cereals (wheat, barley, rice, maize, rye, oats, sorghum and related species), beet (sugar beet and fodder beet); raspberries, drupes and soft fruits (apples, pears, plums, peaches, almonds, cherries, strawberries and blackberries); legumes (beans, lentils, peas, soybeans); oilseeds (rape, mustard, poppy, olives, sunflower, coconut, ricinus, cocoa beans, groundnuts); cucumbers (pumpkins, cucumbers, melons); fibrous plants (cotton, flax, hemp, jute); citrus fruits (oranges, lemons, grapefruits, mandarins); vegetables (spinach, cinnamon, camphor) or plants such as tobacco, nuts, eggplant, sugar cane, tea, vines, hops, bananas and natural rubber and medicinal plants, as well as ornamental plants.

In particular, stress caused by drought, cold and salinity (saline stress) may be stress.

The invention further relates to a method of inhibiting stress, undesirable oxidative processes and / or senescence in plants, plant organs and / or plant cells, wherein V-furfuryl-AM, 2,3- is applied to the plant, plant organ and / or plant cell. thiadiazol-5-yl-urea. N -furfuryl-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea can be prepared by known chemical methods. It can preferably be prepared by a process wherein 1,2,3-thiadiazol-5-yl isocyanate is prepared by a conventional method (Kurita K. and Iwakura Y., J. Org. Chem. 41, 2070-71 (1976)). ) z, 2,3-thiadiazol-5-ylamine and diphosgene. The 1,2,3-Thiadiazol-5-yl isoyanate is then reacted with furfurylamine to give the desired product.

The invention further includes anti-senescent, antioxidant and / or anti-stress agents for plants, plant organs and plant cells, comprising a compound of formula I and at least one excipient. N -furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea is used in unmodified form or preferably together with excipients conventionally used for formulation. For this purpose, the formulations are preferably formulated as active compound concentrates, as well as suspensions and dispersions, preferably isotonic aqueous solutions, suspensions and dispersions, dilute emulsions, soluble powders, dusts, granules, creams, gels, oily suspensions as well as coated formulations, e.g. polymers. As with the product type, methods of application such as spraying, spraying, dusting, scattering, painting or potting are chosen in accordance with the intended objectives and prevailing circumstances. The compositions may be sterilized and / or may contain other excipients of a neutral nature, such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solubilizing agents, as well as fertilizers, trace element donors or other means for achieving special effects. Formulations Compositions comprising a compound of Formula I (active ingredient) and, if desired, one or more solid or liquid excipients are prepared by known methods, for example, by mixing or grinding the active ingredient with excipients such as solvents or solid carriers. Surfactants and surfactants may be added to the compositions. Examples of suitable anionic, nonionic and cationic surfactants are summarized, for example, in WO 97/34485.

Also suitable for the preparation of compositions containing a compound of Formula I are surfactants commonly used in formulating compositions such as those described in "McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual " MC Publishing Corp., Ridgewood, New Jersey, 1981, Stache, H., " Tensid-Taschenbuch ", Carl Hanser Verlag, MunichNienna, 1981 " * · Μ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -. and J. Ash, " Encyclopedia of Surfactants ", Vol-111, Chemical Publishing Co., New York, 1980-81.

The formulation of the formulation contains from 0.1 to 99% (w / w), in particular from 0.1 to 95% (w / w) of the active ingredient Nfurfuryl.AM, 2,3-thiadiazol-5-yl- Urea, comprising from 5 to 99.9% of a mixture of additives or pharmaceutical carriers, depending on the methods of administration, and optionally also containing from 0.1 to 25% by weight of a wetting agent. Although commercial products are usually prepared in the form of concentrates, the end user will employ a diluted formulation. The composition may therefore also contain other additives such as stabilizers, eg vegetable oils or epoxidized vegetable oils (epoxidized palm oil 0, 1, rapeseed or olive oil), antifoams, eg silicone oil, preservatives, stabilizers, humectants or emulsifiers viscosity agents, binders, adhesives, as well as fertilizers and other active ingredients. Preferably, formulations of the following composition are used: (% = weight percent). 1 to 90%, preferably 5 to 20% 1 to 30%, preferably 10 to 20% 5 to 94%, preferably 60 to 85%

Emulsified concentrates: active ingredient: wetting agent: liquid carrier:

Powders: active ingredient: 0.1 to 10%, preferably 0.1 to 5% solid carrier: 99.9 to 90%, preferably 99.9 to 95%

Dense Concentrates: active ingredient: water: wetting agent:

Wettable powders: active ingredient: wetting agent: solid carrier: 5 to 75%, preferably 10 to 50% 94 to 24%, preferably 88 to 30% 1 to 40%, preferably 2 to 30% 0.5 to 90% , preferably 1 to 80% 0.5 to 20%, preferably 1 to 15% 5 to 95%, preferably 15 to 90%

Granules: active ingredient: 0.1 to 30%, preferably 0.1 to 15% solid carrier: 99.9 to 70%, preferably 99.9 to 85%

The compositions may also contain other ingredients such as stabilizers, for example, vegetable oils or epoxidized vegetable oils (epoxidized coconut oil, rapeseed oil or soybean oil), antifoams such as silicone oil, preservatives, viscosity regulators, binders, thickeners, as well as fertilizers and other active agents. Different methods and technologies are used for the use of a compound of formula I or compositions comprising it, for example the following: i) Seed coating a) Seed coating with a wettable powder formulation of a compound of formula I or a salt thereof by mixing in a container until uniform distribution on surface of seeds (dry coating). b) Seed dressing with an emulsified concentrate of a compound of formula I or a salt thereof, according to method a) (wet coating). c) Seed dressing by soaking the seeds for 1 to 72 h in a liquid containing from 100 to 1000 ppm of the compound of formula I or a salt thereof, and preferably subsequent drying of the seeds (immersion coating).

In general, the compound of formula (I) or a salt thereof is used in an amount of from 1 to 1000 g, preferably from 5 to 250 g, per 100 kg of seed, but depending on the methodology which also allows the addition of other active substances or micronutrients; the specified concentration limits can move up or down (re-coating). ii) Application of tank mix

The liquid formulation is applied in an amount of 0.005 to 5.0 kg per hectare. Such a tank application is carried out before or after sowing. iii) Application to the seed furrow

The compound of formula (I) or a salt thereof is introduced into the open seeded seed furrow in the form of an emulsified concentrate, wettable powder or granules. Once the seed furrow is knocked down, the growth regulator is applied by the route usually used in the pre-emergence process. iv) Controlled release of active substances

The compound of formula I or a salt thereof is applied in solution to mineral granular carriers or polymerized granules (urea, formaldehyde) and dried. · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Coating which allows the sustained release of the substance in measurable amounts for a specific period of time (coated granules).

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Figure 1 shows the effect of thidiazuron (TDZ) and N -furfurylV1-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea (ASES) on the average length of Arabiáopsis (A) and Triticum aestivum (B) root in the root test. 0.01% DMSO as a control and 100 nM compound were used in the experiment. Error bars represent Sd (n = 50). Asterisks indicate statistically significant differences from control treatment (student t-test, two asterisks: P = 0.001; one asterisk P = 0.05). The starting material for N -furfuryl-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea is 1,2,3-thiadiazol-5-yl-amine obtained from TCI Europe. 1,2,3-Thiadiazol-5-ylamine is converted to 5-isocyanato-1,2,3-thiadiazole by stirring 1,2,3-thiadiazol-5-yl-amine with excess diphosgene in tetrahydrofuran (THF). N-furfuryl-1,2,3-thiadiazol-5-yl urea can then be prepared by gently heating 5-isocyanato-1,2,3-thiadiazole and furfurylamine (commercially available from Sigma Aldrich) in the presence of a catalytic amount of triethylamine in THF.

Elemental analyzes (C, H and N) were measured on an EA1108 CHN analyzer (Fissons Instruments). Analytical thin layer chromatography (TLC) was performed on silica gel 60 WF 254 (Merck) plates in a CHCl 3 / MeOHikonc mobile phase. NH 4 OH (8: 2: 0.2, v / v / v). ES + mass spectra were measured using direct injection on a Waters ZMD 2000 mass spectrometer. The measurement interval was 10 to 1500 µ. The spectra were measured using 3.0 second cyclic scans, at 25 V input slit and 150 ° C evaporation temperature, 80 ° C desolvation temperature and 200 L desolvation gas flow. / hour. The data obtained was processed by the MassLynx data system program. NMR spectra were measured on a Jeol 500 SS instrument at 300 K and 500.13 MHz (* H). Samples were prepared by dissolving the compounds in DMSO-Tetramethylsilane (TMS) was used as an internal standard. »# 7 - * ·· < Example 1 Preparation of 5-isocyanato-1,2,3-thiadiazole

The synthesis of isocyanates from amines has been described previously (Kurita K. and Iwakura Y., J. Org. Chem. 41, 2070-71 (1976)). In detail, the 1,2,3-thiadiazol-5-yl amine (1.01 g, 10 mmol) was dissolved in THF (40 mL) and added dropwise to a solution of diphosgene (2.6 g, 13 mmol) in THF ( 100 mL). The reaction mixture was stirred for 40 minutes at 0 ° C; then the reaction mixture was briefly heated to 30 ° C. After heating, the solvent and excess diphosgene are evaporated. The yellow solid residue was 5-isocyanato-1,2,3-thiadiazole, which was re-suspended in diethyl ether and filtered. Yield: 95%, 1 H NMR (6, ppm, DMSO-76): 7.75 (1H, s, CH). Example 2 Preparation of N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea 5-Isocyanato-1,2,3-thiadiazole (1.27 g, 10 mmol) was dissolved in 100 mL of tetrahydrofuran (THF). To this solution was added 100 µL of triethylamine and added furfurylamine (0.97 g, 10 mmol) in 20 mL of THF at 30 ° C. The mixture was reacted for 5 hours, then THF was evaporated in a vacuum evaporator and 50 mL of dichloromethane was added to the crude product. The precipitate was re-suspended and filtered. Yield: 1.2g; 53%, 1 H NMR (δ, ppm, DMSO-76): 4.32 (2H, d, 7 = 5.5 Hz, CH 2), 6.24 (1H, d, 7 = 4.0 Hz, ArH -furfuryl), 6.36 (1H, t, J = 2.0 Hz, ArH-furfuryl), 7.52 (1H, t, J = 5.5, NH), 7.56 (1H, d, 7 = 4.0 Hz, ArH-furfuryl), 8.47 (1H, s, CH), 10.76 (1H, s (br), NH).

Table 1

Elemental analysis of N -furfuryl-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea

Elemental analysis calculated: N -fluorophenyl-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea% C% H% N ES MS [Μ + ΗΓ 42.9 / 43.2 3.6 / 3.7 25 , 0 / 24.8 225.3 Example 3

Anti-senescent activity of N-furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea in senescence test on wheat leaf segments cultivated in the dark

Winter wheat seeds Triticum aestivum cv. Hereward was washed under running water for 24 hours and then planted in vermiculite saturated with Knop's nutrient solution. The seed flasks were placed in an air-conditioned growth chamber with a 16/8 hour light period (light intensity of 50 mmol / m 2 / sec) and a temperature of 15 ° C. After 7 days, the first foliar leaf had developed the seedlings and the second leaf began to grow. Approximately 35 mm long sections were removed from the first leaves of 5 plants each, which were shortened to exactly 100 mg. The basal ends of these 5 leaf segments were placed in wells of microtiter polystyrene plates containing 150 mL of test substance solution. The plates were placed in a plastic box lined with filter paper saturated with water for maximum air humidity. After 96 hours of incubation in the dark at 25 ° C, leaf sections were removed and chlorophyll extracted in 5 mL of 80% ethanol by heating at 80 ° C for 10 min. The sample volume was then made up to 5 mL by adding 80% ethanol. The absorbance of the extracts was measured at 665 nm. Chlorophyll leaf extracts and leaf peaks incubated in deionized water were also measured as controls. The calculated values are the average of 5 replicates and the whole experiment was repeated at least 2-fold. Test substances (6-benzylaminopurine, trans-zeatin, thidiazuron, and N-furfuryl-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea) were dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO) and the stock solution was made up to 10-3 M with water. This stock solution was further diluted with assay medium in a concentration range of 10-8 M. The final concentration of DMSO in the medium did not exceed 0.2% and did not affect the biological activity of the assay at this concentration. IC 50 values were determined for all test compounds. N-furfuryl-1-yl-1,2,2-thiadiazol-5-yl-urea has a positive effect on delaying senescence in wheat leaf segments in the dark. N -furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea exceeded the anti-senescent activity of 6-benzylaminopurine by at least 100x, trans-zeatin and thidiazuron at least 10x. That is, 10x smaller amounts of N -furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea, such as trans-zeatin or thidiazuron, are required to achieve the same antisense effect.

Table 2

Effect of V-furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea on delaying senescence in decapitated leaf segments Triticum aestivum cv. Hereward in the dark. Compound Senescence Bioassay (IC50, pM) / sd 6-Benzylaminopurine (BAP) 155 (± 22) trans-zeatin 30 (± 4.5) thidiazuron 13 (± 3.0) A-furfuryl-iMM-5-thiadiazole-S -yl urea 1.2 W) - 9 - 9 * · »· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Example 4

Anti-senescent activity of N -furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea in senescence test on wheat leaf segments under light

The ability of V-furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea to slow down chlorophyll degradation in wheat leaves was also tested under light conditions. The experiment was carried out as described in Example 7 with modifications such that the incubation of the leaves with the compounds was performed at a lighting period of 8/16 (dark / light - mol.m.s -1) at 22 ° C for 7 days. As shown in Table 3, N -furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea has much stronger positive effects on delaying senescence in wheat leaf segments under light conditions compared to 6-benzylaminopurine, trans-zeatin i thidiazuron. The N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea IC 50 is 40 nmol.

Table 3

Effect of N -furfuryl-1Y-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea on delaying senescence in decapitated leaf segments Triticum aestivum cv. Hereward in the light. Substance Bioassay (IC50, pM) / sd 6-benzylaminopurine (BAP) 12.5 (± 22) trans-zeatin 2.2 (± 4.5) thidiazuron 0.5 (± 3.0) A-furfuryl-AM 2,3-Thiadiazol-5-yl urea 0.03 (± 03) Example 5

Protection against peroxidation of membrane lipids in wheat

A typical manifestation of senescence is an increase in the level of reactive oxygen derivatives and subsequent peroxidation of membrane lipids. Therefore, the levels of malonyldialdehyde (MDA), an oxidative marker of membrane lipid damage, were determined in separate wheat leaves exposed to N -furfuryl- N, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea and thidiazuron for four days in the dark, as described in Example 7. MDA levels were determined using thiobarbituric acid (TBA). 100 mg of fresh plant material was homogenized using an oscillating mill (MM301, Retsch, Germany) with 1 mL of 80% methanol. The crude extract was centrifuged at 10,000xg for 5 minutes, a 100 µL aliquot of the supernatant was shaken with 100 µL of 0.5% (w / v) TBA containing 0.1% (w / v) trichloroacetic acid, and the resulting solution was incubated for 30 minutes at 95 ° C. ° C. Samples were - 10 • • • • • •

They are rapidly cooled on ice and centrifuged for 5 minutes at 100xg. The supernatant absorbance was measured at 532 nm with a correction at 600 nm and the amount of MDA-TBA complex formed was calculated from an extinction coefficient of 155 mM - cm -1. N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea significantly reduces membrane lipid peroxidation compared to untreated control and thidiazuron-treated samples (Table 5 - MDA content, which is a product of membrane lipid degradation). N -furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea reduces the level of membrane lipid peroxidation in aging separated leaves of wheat by 4ΐ | Κ > while thidiazuron only by 27ζ /. A-furfuryl-1Y-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea has a protective function against the negative action of reactive oxygen species that accumulate in tissues during leaf senescence.

Table 4

Effect of A-furfuryl-A1-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea and thidiazuron on membrane lipid peroxidation during senescence of extirpated leaves Triticum aestivum cv.

Hereward in the dark.

Test substance MDA (nmol / g FW) Untreated control 21.5 (± 2.8) thidiazuron 15.7 (± 1.7) N -furfuryl- / VM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea 12, 7 (± 1.1) Example 6 A-furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea delayed senescence of wheat plants stressed by drought

Drought is one of the main problems that restricts plant growth and production. Drought leads to stress-induced senescence of plant organs, and can result in the death of plants. By delaying drought-induced senescence, the life span of stressed plants increases and their productivity increases.

To investigate the effect of N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea on dry-induced senescence, winter wheat seeds, Triticum aestivum cv. Hereward, they were washed under running water for 24 hours and then plated into trays (30 x 40 cm) perlite water-soaked, or 100 nM aqueous N-furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea. The trays were placed in a growth chamber at 25 ° C with 16/8 h light / dark at 100 mol / m 2. 30 Days after planting, how many% of the plants survived on each tray. As a result, the use of N -furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea slows down the senescence of wheat plants that are grown under stress conditions. V-furfuryl-V-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea plants are greener (they contain more chlorophyll), and more (71% of plants) survive against untreated plants (only 37% of plants survive).

This in vivo experiment demonstrates that N -furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea prolongs the photosynthetic life of wheat plants exposed to environmental stress. EXAMPLE 7 γ-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea does not inhibit the growth of the primary roots of Arabidopsis thaliana or Triticum aestivum

Anti-senescent agents are known to be negative regulators of root elongation and lateral root formation (Werner, T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 98, 10487-92, 2001) and their exogenous applications at concentrations greater than 1 µl often cause complete root growth inhibition. In order to investigate the in vivo effect of A-furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea on root growth and development, Arabidopsis thaliana (wild-type Col-0) seeds were sterilized and sown on 1/2-inch vertical plates. Murashige-Skoog medium (enriched with 0.1% sucrose and 6 g / L phytagel) containing 100 nM thidiazuron or N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea, or 0.01 % DMSO (solvent control). After vemalization (4 days in the dark, 4 ° C), the plates were transferred to a growth chamber (22 ° C, 8/16 light / dark). Two weeks after transfer, the seedlings were photographed and root extension and lateral root formation were scored by Scion image software (Scion Corp., Frederick, MD, USA). At least 40 plants were measured for each treatment.

While plant roots that grew in the presence of thidiazuron (Fig. 1) were severely and significantly retarded, plant roots that grew in the presence of A-furfuryl-2,3, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea developed normally ( Fig. 1) and the length of the primary root was not shortened. That is, N -furfuryl- N, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea does not adversely affect the growth and development of the root at 100 nanomolar concentrations as opposed to the severe inhibitory effect of thidiazuron. A-furfuryl-ZV-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea can be advantageously • 9 9 · 12 • · • •

II (applied to seeds, seedlings and young plants in a wider range of concentrations than thidiazuron and without undesirable inhibitory effects. Example 8 A-phthirfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea is not cytotoxic to human skin fibroblasts (cellular line BJ)

The cytotoxicity of N -furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea to human cutaneous fibroblasts (BJ cell line) was determined in a standard Calcein AM assay. Cells were maintained in tissue culture plastic bottles and grown in Dulbecco's modified cell culture Eagle medium (DMEM) at 37 ° C in 5% CO 2 and 100% humidity. Cells were seeded in 96-well microtiter plates (Nunc, Denmark) and after 12 hours pre-incubation, test substance was added to give a final concentration ranging from 0 to 100 mM. Cells were incubated for 72 hours. At the end of the incubation period, Calcein AM in PBS was added at a final concentration of 1 µg / ml. After an additional 1 hour of incubation, fluorescence at 485/538 nm (ex / em) was measured with Fluoroskan Ascent (Labsystems, Finland). IC 50 values (ie, concentrations causing a reduction in calcein AM conversion to 50%) were calculated from the curves obtained. All experiments were repeated four times with a maximum deviation of 15%. Due to the limited solubility of the substances in water, all test compounds were dissolved in DMSO and diluted with water to a final DMSO concentration of 0.6%.

This test found that A-furfuryl-Al, 2,3-thiadiazol-5-yl urea was not toxic to human skin fibroblasts up to the highest tested concentration of 100 mM. It is believed that N -furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea will be of practical use in agriculture and hence, people will be able to manipulate it. It is therefore highly desirable that this substance is not toxic. Example 9

Application of N -furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea increased the yield of winter rape and spring barley in field trials All field trials were conducted in accordance with the criteria for Good Experimental Practice. Six equal areas (10 m each) were used per variant. Field trials were not treated with any growth regulators or fungicides but only with the substance used. N -furfuryl-VH, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea was applied once at the exact time (elongation growth, BBCH 50) by leaf spray at 25 mM. At least 50 plants for each variant were used to obtain morphology parameters. Statistical evaluation was performed in the PAST statistical program v. 2.17c.

The application of N -furfuryl-N-N-thiadiazol-5-yl-urea resulted in an increase in winter rape seed yield to 120.9% against untreated control (Table 5). Also, the weight of thousands of grains (HTZ) increased to 110% over control (Table 5).

Administration of A-furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea resulted in an increase in spring barley seed yield to 104.8% over control. HTZ remained the same, but the number of grains in the ear increased to 104.6% compared to the control (Table 6).

Table 5

Effect of N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea (ASES) on winter rape yield

Application Seed yield (t / ha)% HTZ (g)% Control 4,994 100 4,35 100 ASES 6,038 120,9 4,8 110,3

Table 6

Effect of N-furfuryl-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea (ASES) application on winter rape yield

Application seed yield (t / ha)% HTZ (g)% grain count% Control 7.65 100 45.85 100 23.5 100 ASES 8.02 104.8 45.88 100.06 24.6 104, 6 Example 10 Preparations

The active ingredient in the compositions is N-furfuryl-N-1,2,3-thiadiazol-5-yl-urea A1. Emulsifiable concentrate a) b) c) d) Active ingredient 5% 10% 25% 50% calcium dodecylbenzenesulfonate 6% 8% 6% 8% polyoxyethylated castor oil (polyglycol castor oil ether) 4% 4% 4% (36 mol ethylene oxide) octylphenofpolyglycol ether - 2% - 2% Λ ~ ί ·, / (7 ^ 8 mol ethylene oxide) cyclohexanone - - 10% 20% aromatic hydrocarbon mixture 83% 82% 53% 18% c9-c12

The desired final concentration emulsions can be obtained from such a concentrate by dilution with water. A2. Solution a) b) c) d) Active ingredient 5% 10% 50% 90% polyethylene glycol MW 400 20% 10% - - N-methyl-2-pyrrolidone - - 30% 10% aromatic hydrocarbon mixture 75% 60% c9- c12 Solutions are suitable for application in the form of micro-droplets. A3. Warm Coaster a) b) c) d) Active ingredient 5% 25% 50% 80% sodium ligninsulfonate 4% - 3% - sodium lauryl sulfate 2% 3% - 4% sodium diisobutylnaphthalene sulfonate “6% 5% 6% octylphenol polyglycol ether o 1 (7? 8 mol ethylene oxide)? 1% 2% highly disperse silicic acid 1% 3% 5% 10% kaolin 87% 61% 37% -

The active ingredient is intimately mixed with the excipients and the mixture is thoroughly ground in a suitable mill. Any concentration concentration can be obtained by mixing the resulting dust with water. A4. Coated granules Active ingredient a) 0.1% b) 5% c) 15% highly disperse silicic acid 0.9% 2% 2% inorganic carrier 99.0% 93% 83% (0.1 mm) eg CaCC > 3 or S1O2

The active ingredient is dissolved in methylene chloride and sprayed onto the carrier. The solvent is evaporated in vacuo. A5. Coated granules a) b) c) Active ingredient 0.1% 5% 15% polyethylene glycol MW 200 1.0% 2% 3% highly disperse silicic acid 0.9% 1% 2% inorganic carrier 98.0% 92% 80% ( AE 0.1 dmm) eg CaCC > 3 or S1O2

The finely divided active ingredient is uniformly applied to the carrier moistened with polyethylene glycol in the mixer. Thus, dust-free granules are obtained. A6. Extruded granules a) b) c) d) Active ingredient 0.1% 3% 5% 15% sodium lignin sulfonate 1.5% 2% 3% 4% carboxymethylcellulose 1.4% 2% 2% 2% kaolin 97.0% 93% 90% 79%

The active ingredient is hay and ground with excipients and moistened with water. The mixture is extruded and dried in an air stream. A7. Dust a) b) c) Active ingredient 0.1% 1% 5% talc 39.9% 49% 35% kaolin 60.0% 50% 60%

Dusts for direct use are obtained by grinding the active ingredient with the carrier in a suitable mill. • * • · · · · · · · · · · · - 16 - 1 • * · · · A8. Suspension concentrate a) b) c) d) Active ingredient 3% 10% 25% 50% ethylene glycol 5% 5% 5% 5% nonylphenol polyglycol ether - 1% 2% - (15 mol ethylene oxide) sodium lignosulfonate 3% 3 % 4% 5% carboxymethylcellulose 1% 1% 1% 1% 37 '% aqueous formaldehyde solution 0.2% 0.2% 0.2% 0.2% silicone oil emulsion 0.8% 0.8% 0.8% 0 , 8% water 86% 78% 64% 38% * * · · · ·· · · · · · · ·

The finely divided active ingredient is mixed with excipients. The resulting suspension concentrate allows the suspension to be prepared at the desired concentration by dilution with water.

Claims (6)

- 17 — « * · « · i « « · | « · « · • · » I < • · t · « * · * · · I • i < • · < t < • · · I i • · · · · t 4 • · 4 • 4 4 1 < PATENTOVÉ NÁROKY 1. Použití /V-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močoviny vzorce I- 17 - «*« I < I < i < • · < t < • 4 · 4 · 4 · 4 · 4 · 4 · 4 · 1 · 4 1. The use of N-furfuryl-AM, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea of formula I pro inhibici senescence, stresu a/nebo oxidativního poškození rostlinných buněk, rostlinných orgánů a/nebo celých rostlin, a/nebo pro zvýšení výnosu rostlin bez vedlejších účinků inhibice růstu kořene.for inhibiting senescence, stress and / or oxidative damage to plant cells, plant organs and / or whole plants, and / or to increase plant yield without side effects of root growth inhibition. 2. Použití podle nároku 1, kde inhibice senescence zahrnuje oddálení degradace chlorofylu a senescence rostlinných pletiv a orgánů.Use according to claim 1, wherein the senescence inhibition comprises delaying the degradation of chlorophyll and senescence of plant tissues and organs. 3. Použití podle nároku 1, kde rostliny zahrnují obiloviny, cukrovou řepu, malvice, peckovice a ovoce, luštěniny, olejniny, okurky, citrusové ovoce, zeleninu, tabák, ořechy, lilek, cukrovou třtinu, čaj, vinné hrozny, chmel, banány, přírodní kaučuk, léčivé rostliny, okrasné rostliny.Use according to claim 1, wherein the plants include cereals, sugar beet, pints, drupes and fruits, legumes, oilseeds, cucumbers, citrus fruits, vegetables, tobacco, nuts, eggplant, sugar cane, tea, grapes, hops, bananas, natural rubber, medicinal plants, ornamental plants. 4. Použití podle nároku 1, kde stresem je stres způsobený suchem, chladem nebo salinitou.Use according to claim 1, wherein the stress is stress caused by drought, cold or salinity. 5. Anti-senescenční, antioxidační a/nebo antistresové přípravky pro ošetření rostlin, rostlinných orgánů a/nebo rostlinných buněk, vyznačené tím, že obsahují Ar-furfuryl-/V-l,2,3-thiadiazol-5-yl-močovinu a alespoň jednu pomocnou látku.5. Anti-senescent, antioxidant and / or anti-stress agents for the treatment of plants, plant organs and / or plant cells, characterized in that they contain Ar-furfuryl-N, 2,3-thiadiazol-5-yl-urea and at least one excipient. 6. Způsob inhibice senescence, oxidativního poškození a/nebo stresu v rostlinách, v rostlinných orgánech a/nebo v rostlinných buňkách, vyznačený tím, že se na rostlinu, rostlinný orgán a/nebo rostlinnou buňku aplikuje vV-furfuryl-AM,2,3-thiadiazol-5-yl-močovina.6. A method of inhibiting senescence, oxidative damage and / or stress in plants, plant organs and / or plant cells, characterized in that N-furfuryl-AM, 2.3 is applied to the plant, plant organ and / or plant cell. -thiadiazol-5-yl-urea.